补体溶血实验.ppt

实验三补体溶血实验,补体溶血实验,补体：一组存在于人和脊椎动物血清中及组织液中具有酶样活性，不耐热和功能上连续反应的糖蛋白，是抗体发挥溶细胞作用的必要补充条件，在正常情况下，血清中的补体大多以无活性酶前体形式存在。,物理性质：不稳定，易受各种理化因素的影响，加热，紫外线照射，机械震荡，酸碱和酒精等因素均可破坏补体。灭活：56加热30min即可灭活,补体系统的生物学功能,（1）溶菌和溶细胞作用：补体系统激活后，在靶细胞表面形成MAC，从而导致靶细胞溶解。（2）调理作用：补体激活过程中产生的C3b、C4b、iC3b都是重要的调理素，可结合中性粒细胞或巨噬细胞表面相应受体，因此，在微生物细胞表面发生的补体激活，可促进微生物与吞噬细胞的结合，并被吞噬及杀伤。,（3）引起炎症反应：在补体活化过程中产生的炎症介质C3a、C4a、C5a。它们又称为过敏毒素，与相应细胞表面的受体结合，激发细胞脱颗粒，释放组胺之类的血管活性物质，从而增强血管的通透性并刺激内脏平滑肌收缩。C5a还是一种有效的中性粒细胞趋化因子。,（4）清除免疫复合物：机制为：补体与Ig的结合在空间上干扰Fc段之间的作用，抑制新的IC形成或使已形成的IC解离。循环IC可激活补体，产生的C3b与抗体共价结合。IC借助C3b与表达CR1和CR3的细胞结合而被肝细胞清除。,（5）免疫调节作用：C3可参与捕捉固定抗原，使抗原易被APC处理与递呈。补体可与免疫细胞相互作用，调节细胞的增殖与分化。参与调节多种免疫细胞的功能。,补体激活的途径：,经典途径旁路途径MBL途径相同点：三条途径有共同的末端通路，即形成膜攻击复合物溶解细胞。,1、补体经典途径(classicalpathway)：是指以抗原抗体复合物为主要刺激物，使补体固有成分以C1、C4、C2、C3、C5C9顺序发生酶促连锁反应，产生一系列生物学效应和最终发生细胞溶解作用的补体活化途径。,2、替代途径（旁路途径）:是指不经C1、C4、C2活化，而是在B因子、D因子和P因子参与下，直接由C3b与激活物结合启动补体酶促连锁反应，产生一系列生物学效应和最终发生细胞溶解作用的补体活化途径。在感染早期可为机体提供有效的防御机制。其激活物是病原微生物等提供接触表面,3、MBL途径：在感染早期，体内分泌甘露聚糖结合凝集素(MBL)和C反应蛋白。MBL与细菌表面的甘露糖残基结合，然后与丝氨酸蛋白酶结合形成MASP（MBL相关的丝氨酸蛋白酶），MASP继而水解C4和C2启动后序的酶促连锁反应，产生一系列生物学效应和最终发生细胞溶解作用的补体活化途径。激活物（或激活剂）是炎症期产生的蛋白和病原体。,三条途径的区别见下表,补体的来源、采集,实验室常用豚鼠、兔的新鲜血清作为补体的来源。补体的采集：一般选用3-5只健康未妊娠的豚鼠或兔子，以无菌操作采集血液，采集好的血液置4冰箱过夜，次日离心分离血清即可分离到补体。,溶血素（抗绵羊红细胞抗体）：是以SRBC作为抗原免疫家兔所得到的兔抗血清，无需进一步提纯，但试验前应先56加热30min或者603min灭活补体。溶血反应：由于抗原（红血球）和抗体（溶血素）进行特异性的结合，在电解质存在时能发生凝集，若再有补体参与，红血球则被溶解。,实验目的,掌握补体测定方法加深了解补体的作用和激活条件,材料与试剂,试剂1.抗原：2%绵羊红细胞2.抗体：溶血素3.补体：实验室常以健康豚鼠血清作为补体材料:小试管，生理盐水，水浴箱,实验方法,取试管4支，按下表加入各物,实验方法,将上述试管放在37水浴箱内30分钟观察有无溶血现象。将不溶血试管离心，3000rpm，5min，使红细胞沉淀。将2、3号管上清液分别移入5、6管，按下表加入试剂,实验方法,将上述5支试管放入37水浴箱内30min观察有无溶血现