（应用化学专业论文）可降解改性大豆蛋白凝胶的制备工艺与应用研究.pdf

摘要 摘要 本论文用乙二胺四乙酸二酐( e r a d ) 对大豆分离蛋白( s p i ) 进行酰化改 性，制备出改性大豆蛋白酰化物，再将酰化物通过戊二醛交联制备成改性大豆蛋 白凝胶。研究了改性大豆蛋白凝胶的溶胀平衡及溶胀过程规律，研究了凝胶在酶 与微生物作用下的降解，并对凝胶的金属离子螯合能力进行了探讨。 s p i 溶液经预处理后，用e d t a d 进行改性，再用戊二醛交联制得改性大豆 蛋白凝胶。探讨了s p i 预处理的工艺条件，结果表明将s p i 溶液p h 调至1 2 ，于 6 5 下水浴3 0 m i n 后在5 5 0 n m 处的透光率最大，即s p i 在溶液中充分分散，有利 于与e d t a d 进行酰化反应。研究了e d t a d 用量与戊二醛用量对改性大豆蛋白 凝胶溶胀率的影响，发现当m e o t a o ：m s p t 为o 3 ，m s p i ：m 虎二醛为9 0 ：2 时制得的凝胶 溶胀率最大，为9 7 7 3 9 g 。研究了e d t a d 与s p i 之间的酰化反应，发现 m e d t a d ：m s p i _ - - 0 3 时，酰化反应中，大豆蛋白肽链上每酰化一个氨基则引入三个羧 基。通过红外光谱表征发现酰化反应后蛋白质分子在1 6 3 0c m 1 、1 5 3 8c m 1 和 1 4 0 0 c m 1 处的吸收增强，显示酰胺基的量增多；从s e m 表征结果可观察到e d t a d 和戊二醛使凝胶网络结构变得规整有序；对凝胶进行拉伸性能测试，发现凝胶的 断裂应力和断裂伸长率随酰化程度的增大而增大。 研究了改性大豆蛋白凝胶的溶胀率和溶胀过程，结果显示溶液p a 值和离子 强度对改性大豆蛋白凝胶的溶胀率有明显的影响；温度对凝胶的溶胀性能影响微 小；对凝胶在p h l o 0 4 和4 3 0 的溶胀一消溶胀行为进行研究，显示改性大豆蛋白 凝胶具有p h 敏感性。研究了改性大豆蛋白凝胶在不同p h 和不同离子强度的溶液 中的溶胀行为，发现凝胶在去离子水中溶胀扩散过程为f i c k i a n 扩散，在生理赫水 中为n o n - f i e k i a n 扩散，在碱性的缓冲溶液中为f i e k i a n 扩散，而在中性和酸性缓 冲溶液为n o n - f i c k i a n 扩散。 改性大豆蛋白凝胶对c a 2 + ，z n 2 + , p b 2 + f f lc u 2 + 金属离子都有一定的螯合能力， 最大螫合量分别为o 7 1m m o l ，g ，0 6 5m m o l g ，0 7 5m m o l g ，和o 5 8 舢l g 。 凝胶的金属离子螯合能力的大小与金属离子浓度、溶液p h 值、温度和凝胶的羧 基含量有关。 广东工业大学硕士学位论文 研究了改性大豆蛋白凝胶的酶降解、微生物降解与土壤降解情况。用 s d s p a g e 电泳和g p c 研究了改性大豆蛋白凝胶的酶降解性，发现改性大豆蛋白 凝胶可降解为分子量1 0 0 0 以下的肽或更小的氨基酸。研究还发现改性大豆蛋白凝 胶在培养基上和土壤中会逐步溶解并被微生物降解，吸收，最终代谢成二氧化碳 和水，说明改性大豆蛋白凝胶有良好的生物降解性。 关键词：大豆分离蛋白；凝胶；乙二胺四乙酸二酐( e 咖) ；改性；溶胀性； 金属离子螯合；生物降解 i i a b s t r a c t i nt h et h e s i s ，am o d i f i e ds o yp r o t e i ng e lw a ss y n t h e s i z e db yf i r s t l y a c y l a t i n gt h es o yp r o t e i ni s o l a t e ( s p i ) w i t he t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i c d i a n h y d r i d e ( e d t a d ) ，f o l l o w e db yc r o s s l i n k i n gw i t hg l u t r a r a l d e h y d e t h e s w e l l i n g r a t i oa n d s w e l l i n gb e h a v i o r , m e t a lc h e a t i n g c a p a c i t y a n d b i o d e g r a d a b i l i t yw e r es t u d i e d am o d i f i e ds o yp r o t e i ng e lw a ss y n t h e s i z e db yp r e t r e a t i n gs p is o l u t i o n ， a c y l a t i n gw i t he d t a da n df o l l o w e db yc r o s s l i n k i n gw i t hg l u t r a r a i d e h y d e t h ep r e t r e a t m e n to fs p is o l u t i o nw a ss t u d i e d ，t h er e s u r ss h o w e dt h a tt h e s p is o l u t i o nh a dt h eh i g h e s tt r a n s m i t t a n c ea t5 5 0 n mw h e nh e a t i n ga t p h 12 6 5 f o r3 0m i n t h ee f f e c t so fc o n c e n t r a t i o no fe d t a da n d g l u t a r a l d e h y d eo ns w e l l i n gr a t i oo fs o yp r o t e i ng e l sw e r er e s e a r c h e d ，t h e o p t i m a ls w e l l i n gr a t i ow a s9 7 7 3 9 ga tm e d t a d ：m s p l 2 0 3a n dm s p l ；m g i u = 9 0 ：2 t h ea c y l a t i o nr e a c t i o nw a sc a r r i e do u ta sf o l l o w s ：c o n s u m i n go n el y s i n e r e s i d u ea v e r a g e l yi n c o r p o r a t e dt h r e ec a r b o x y l si ns p im o l e c u l e sw h e n m e d t a d ：m s p i s 0 3 t h ei rs h o w e dt h a tt h en u m b e ro fa m i d oi n c r e a s e da f t e r a c y l a t e dw i t he d t a d ；t h es e mp h o t o g r a p h ss h o w e dt h a tm o d i f i e ds o y p r o t e i ng e l sh a dh i g h l yo r d e r e dm i c r o s t r u c t u r e ；t h er e s u l t so ft e n s i l et e s t s h o w e dt h a tt h eb r e a k i n gs t r e n g t ha n de l o n g a t i o na tb r e a ko fg e l sg r e wa s t h ed e g r e eo fa c y l a t i o ni n c r e a s e d t h ee q u i l i b r i u ms w e l l i n gr a t i oa n ds w e l l i n gb e h a v i o ro fm o d i f i e ds o y p r o t e i ng e l sw e r es t u d i e d t h ee f f e c t so fp ha n di o n i cs t r e n g t ho nt h e s w e l l i n gr a t i oo fg e l sw e r eo b v i o u s ；a n dt h ee f f e c to ft e m p e r a t u r eo nt h e s w e l l i n gr a t i o no fg e l sw a sn e g l e c t a b l e t h es w e l l i n ga n dd e s w e l l i n g p r o c e s si np hlo 0 4a n d4 3 0b u f f e rs o l u t i o no fm o d i f i e ds o yp r o t e i ng e lw a s s t u d i e d ，t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h eg e la p p e a r e d p h s e n s i t i v i t y t h e s w e l l i n gb e h a v i o ro fm o d i f i e ds o yp r o t e i ng e l sw a ss t u d i e da n dt h er e s u l t s w e r ea sf o l l o w s ：t h e g e l sa p p e a r e d f i c k i a n sd i f f u s i o nb e h a v i o ri n l 广东工业大学硕士学位论文 d e i o n i z e dw a t e r ；a p p e a r e dn o n - f i c k i a n d i f f u s i o nb e h a v i o ri nn o r m a l s a l i n e ； a p p e a r e df i c k i a n sd i f f u s i o nb e h a v i o ri na l k a l i n eb u f f e rs o l u t i o n ；a p p e a r e d n o n f i c k i a n d i f f u s i o nb e h a v i o ri na c i d i ca n dn e u t r a lb u f f e rs o l u t i o n t h em o d i f i e ds o yp r o t e i ng e l sh a dam e t a lc h e l a t i n gc a p a c i t yt op b ”， z n ”，c u 2 + a n dc a 2 + i o n s t h eb e s tc h e l a t i n gc a p a c r i e so f t h eg e lw e r e0 7 1 o 6 5 ，o 7 5a n do 5 8m m o l ep e rg r a mo fd r yg e l ，r e s p e c t i v e l y t h ee f f e c t so f m e t a lc o n c e n t r a t i o n 、t e m p e r a t u r e 、p ha n dc a r b o x y l g r o u po nt h em e t a l c h e l a t i n gc a p a c i t yo fg e lw e r er e s e a r c h e d t h em o d i f i e ds o yp r o t e i ng e l sw e r ec o m p l e t e l yd e g r a d a b l eb yt r y s i o n a n dp e p s i n s d s p a g ee l e c t r o p h o r e s i sa n dg p cs h o w e dt h a tt h em o l e c u l a r w e i g h to fe n z y m a t i ch y d r ol y z e dp r o d u c t sw a sb e l o w10 0 0 g e l sw e r e d i s s o l v e da n dh y d r o l y z e db yf u n g a lo nc u l t u r em e d i u m so ri ns o i l ，t h e h y d r o l y z e dp r o d u c t sw e r ea b s o r b e da n dc h a n g e dt ow a t e ra n dc o zb y m e t a b o l i z i n g t h er e s u l t sh a dp r o v e df u l l yb i o d e g r a d a b i l i t yo f m o d i f i e ds o y p r o t e i ng e l s k e y w o r d ：s o yp r o t e i ni s o l a t e ( s p i ) ：g e l ；e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i c d i a n h y d r i d e ( e d t a d ) ；m o d i f y ；s w e l l i n gb e h a v i o r ；m e t a lc h e l a t i n g ； b i o d e g r a d a b i l i t y 广东工业大学硕士学位论文 独创性声明 秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本人声明所呈交的论文是我个人在 导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以 标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，不包 含本人或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中作了明确地说明，并表示了谢意。 本学位论文成果是本人在广东工业大学读书期间在导师的指导下取得的，论 文成果归广东工业大学所有。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任，特此声明。 论文作者签字品岛 艚= 2 辫母蝴码画u 第一章绪论 1 1 蛋白质凝胶 第一章绪论 1 1 1 凝胶的定义及形成机理 蛋白质有形成凝胶的能力，胶凝性是蛋白质重要功能特性之一。当 变性的分子聚集以形成一个有规则蛋白质网时，此过程被称为凝胶作用。 蛋白质网形成是蛋白质一蛋白质和蛋白质一溶剂( 水) 相互作用之间及 相邻多肽链吸引力和推斥力之问一个平衡的结果【l 】。 蛋白质凝胶化是一个复杂的过程，一般包括蛋白质分子链的展开、 分裂、结合及聚集等几个历程，蛋白质是通过充分伸展的肽链之问的相 互交联而形成凝胶的。蛋白质在受热的情况下，球状的蛋白质分子开始 伸展开来，原来包埋在卷曲的分子链内部的功能基团如二硫基，疏水基 团暴露出来，为减少体系的能量，相邻的通过二硫键、氢键、疏水作用、 静电引力以及范德华力交联形成具有网络状三维空问结构，将水和其他 成分包络起来，形成凝胶【2 】。 在凝胶态，多肽链问以及多肽链与水分子之间通过疏水键、静电力、 氢键和二硫键形成的作用力达到平衡。静电力( 尤其在远离等电点的p h 范围) 和疏水键显示出排斥力的作用，能将多肽链保持在分离状态，有 助于折叠的多肽链分开，形成均匀凝胶基质1 3 1 。相比较而言，在蛋白凝 胶形成过程中，这些作用力中的二硫键使凝胶过程不可逆1 4 5 】；而氢键控 制的凝胶过程是可逆的1 6 】。 许多凝胶中蛋自质以高度膨胀和水合的形式存在，并且蛋白质网络 中的水不易被挤压出来。有人【7 】曾对蛋白质凝胶具有很大的持水能力作 出假设，认为在二级结构热变性后，未被掩蔽的肽键中的c o 和n h 基分 别成为沿着多肽链捧布的负的和正的极化中心，因而可能建立一个广泛 的多层水体系，冷却时这种蛋白质通过重新形成的氢键而相互作用，并 广东工业大学硕士学位论文 提供固定自由水所必须的结构。这些假设为日后蛋白质凝胶在吸水凝胶 等方面的应用研究提供了理论基础。 1 1 2 影晌蛋白质凝胶性的因素 1 1 2 1 蛋白质组成 大豆分离蛋白主要包括7 s 和1 1 s 球蛋白两种组分，已经有人分别研究 这两种蛋白凝胶性质。由于这两种蛋白结构存在很大不同，因结构不同 导致它们对凝胶形成影响不同。大豆球蛋白分子六对亚基均为一个酸性 亚基和一个碱性亚基以一个二硫键连接，且各个亚基上还分别含有2 到3 个半胱氨酸和胱氨酸侧链残基f 。】。整个分子显得较紧密，分子刚性较强， 其受热变性所需能量较高，一旦分子变性蛋白质侧链伸展开后，相互之 间可形成较牢固二硫共价键，从而使形成凝胶有较强硬度和脆性。 g e r m a n 等1 9 发现，大豆球蛋白热转变温度是7 2 ( 2 ，但大豆球蛋白热力学 行为与蛋白质浓度、p h 、离子强度等相关。在高浓度下，n a c i 和n a b r 可明显提高大豆球蛋白在溶液中变性温度至1 0 0 左右，而d 一大豆伴球 蛋白亚基( 7 s 球蛋白) 含半胱氨酸残基很少，只有q 和o 亚基分别含有 一个s h ，以及本身只能通过静电力和盐键连接，因此即使在凝胶过程中， 蛋白分子伸展开，也只能形成很少二硫共价交联。为了能形成自支持凝 胶，6 一大豆伴球蛋白所需浓度要比大豆球蛋白高许多，如在0 5 m 离子 强度下，6 一大豆伴球蛋白凝胶浓度为7 5 ，而大豆球蛋白仅为2 5 。 1 1 2 2 温度 温度是影响凝胶性质主要因素之一。对于b 一大豆伴球蛋白( 1 0 ， p h 7 5 ) ，加热温度低于6 2 时，凝胶的储能模量( g ) 几乎不变，只 有在温度超过6 5 时，凝胶的g 会随加热时间延长而增加，且在7 0 时达最大值。由于d s c 测定出凝胶吸热峰也是出现在7 0 ，因此只有在 达到这个变性温度条件下，凝胶才能形成较好网络。有研究表明，预热 处理对大豆分离蛋白凝胶性质也有影响，经预热处理，其凝胶形成能力 2 第一章绪论 会得到提高，但预热对于大豆球蛋白和b 一大豆伴球蛋白凝胶性质影响 却不相同。两种不同比例大豆分离蛋白溶液先用1 4 0 水蒸汽加热2 0 秒， 在7 5 8 0 喷雾干燥。其溶液( 1 2 p h 7 ) 在没有n a c i 存在时，8 一大豆 伴球蛋白含量高的溶液形成凝胶的g 高于大豆球蛋白含量高的溶液。 当加入2 5 n a c i 后，两种分离蛋白凝胶的g 明显增加，推测可能是与 在预热处理中蛋白质形成“融球态”结构相关【阳】。 1 1 2 3 盐和溶剂 盐和溶剂可改变蛋白质功能基团电离作用和双电层厚度，影响蛋白 质一蛋白质相互作用。王飞镝等】研究了有机溶剂乙醇和盐c a c l 2 对大 豆蛋白凝胶性的影响，发现乙醇和c a c l 2 均可增强大豆蛋白的凝胶性，使 大豆蛋白凝胶的抗宏观形变能力明显增强，并提高了凝胶的吸水能力， 原因是乙醇通过羟基与蛋白质分子形成氢键，而c a c l 2 中的c a ”通过钙桥 与蛋白质极性基团发生作用。 盐的种类对大豆蛋白凝胶性质有着不同的影响，n a c i 和n a b r 能提高 凝胶时蛋白质变性温度，而n a c l 0 4 和n a s c n 则可降低蛋白变性温度。盐 对蛋白质凝胶性能影响可能有两方面原因，在低离子强度时，盐可通过 屏障蛋白质上电荷从而减少蛋白质分子间静电斥力，但随着盐浓度增加， 蛋白质上电荷饱和，在此情况下，由于溶剂水的性质因盐的存在而改变 并导致疏水相互作用增强成为主导效应【1 2 1 。 1 1 3 蛋白质凝胶的性能研究 1 1 3 1 溶胀性 溶胀性是凝胶的最大特性。蛋白凝胶具有低交联吸水性的三维空间 网络结构，能吸收水，盐水和生理液，并具有一定的持水能力，在加热 或受压下不易失水。在凝胶的吸水溶胀过程中，一方面，水通过扩散、 毛细管作用进入到凝胶网络空隙中，网络随之不断伸展并往外扩散，另 一方面，水受到了来自凝胶网络因为伸展而产生的收缩应力。随着水分 广东t 业大学硕士学位论文 子进入凝胶所受到的网络收缩应力不断增加，溶胀过程开始变慢，最后 达到溶胀平衡【”1 平衡点取决于凝胶与溶剂的相互作用，即使是同一凝 胶网络，其溶胀平衡点对于温度、p h 、溶剂的组成、静水压和外部电场 等条件也十分敏感。而且，若在网络上加上固定离子，溶胀率会明显的 增大。同时，还会因网络或溶剂组成变化导致体积相变现象，在相变点， 只要外部条件稍微变化，凝胶体积则变化l o 1 0 0 0 倍。在固体中，除凝 胶外，未发现这种现象【1 4 】。 1 1 3 2 力学性能 蛋白凝胶作为一种天然高分子材料，对比合成材料，其力学性能比 较差，达不到应用的一定要求。因此，对蛋白质的力学性能的测试是研 究蛋白质凝胶性能的一个重要方面。流变仪和质构仪是研究蛋白质力学 性能主要工具。通过流变仪可研究蛋白质凝胶的小幅形变特性。流变仪 可准确的测定凝胶的储能模量g 和损耗模量g 。储能模量g 反映 的是机械性质消耗的部分，反映凝胶的弹性性质；损耗模量g 反映 的是机械性质未消耗的部分，反映凝胶的黏性性质【”】。质构仪则是研究 蛋白质凝胶大幅形变特性的工具，采用质构仪进行质构分析( t p a ) 是 模拟口腔的咀嚼运动，对样品进行两次压缩，给出力一时间曲线，通过 计算机处理分析出质构特性参数，包括硬度、弹性、内聚性、胶粘性、 咀嚼性、破裂性等【1 6 】。 1 1 3 3 热力学性质 差示扫描量热法( d s c ) 1 1 7 是研究蛋白质凝胶热力学性质的重要方 法之一，通过与标准物质参比测定蛋白质溶液在程序升温降温而形成凝 胶过程中，吸热、放热峰形的变化，从而可推断凝胶形成时蛋白变性以 及蛋白聚集体形成与解聚的情况。j a e o b a m s r e n k e m a l l i 】等用d s c 研究 了p h 对热变性和凝胶形成的影响，结果显示p h 从7 6 下降到3 8 ，变性温 度也不断下降，而且纯的l l s 组分的变性温度比大豆分离蛋白中的l l s 组 分的变性温度低。差示扫描量热法也可用于研究蛋白质凝胶中水的状态。 4 第一章绪论 进而得到凝胶中高分子网络与水之间的相互作用，为确定蛋白质凝胶结 构提供了重要的信息。d s c 被认为是在总水含量下讨论冻结水和非冻结 水的细分最方便的方法1 1 9 】。王飞镝2 0 1 等用d s c 研究了大豆蛋白凝胶中水 的状态及氯化钙、氯化钾对大豆蛋白凝胶中“三态水”的影响，d s c 谱 图显示氯化钾和氯化钙对大豆蛋白凝胶中“三态水”的含量有影响。k + 的引入打破了凝胶中高分子与水作用力的平衡，使“三态水”分布产生 波动。c a 2 + 促进大豆蛋白的凝胶性，增加大豆蛋白凝胶的平衡水含量和 非冻结水含量。c a 2 + 对大豆蛋白凝胶的作用强于k + 。此外，热重法( t g ) 也是研究蛋白质凝胶中水的状态、分布和含量的重要方法。 1 1 3 4 微观结构 通过各种波谱直接观察到蛋白质构象的变化，从而更深入地了解蛋 白质疑胶形成过程中结构的变化。通过红外谱图上酰胺键特征吸收峰的 变化，可推测蛋白质分子的改性程度和交联情况。利用核磁共振法能够 测定溶液中蛋白质分子构象，研究各种因子，如温度、p h 等对蛋白质分 子构象变化的影响，此外，还可用来研究蛋白质分子的构象动力学等1 2 。 圆二色光谱可以推算蛋白质分子的d 一螺旋、1 3 一折叠和1 3 一转角以及 无规卷曲的含量。蛋白质变性时，常常发生d 一螺旋和1 3 一折叠的减少 或消失，以及无规卷曲的增加，因此，通过圆二色光谱可以跟踪蛋白质 的变性程度1 2 。运用各种显微镜，如电子扫描显微镜、激光共聚焦显微 镜、原子力显微镜等，除了可直接观察蛋白质凝胶的微观表面形貌，还 可观测到蛋白质分子的聚集过程和空间网络结构的动态形成过程。这些 技术将有利于对蛋白质凝胶的微观结构、凝胶过程中蛋白质分子的构象 变化和蛋白质分子的聚集情况作更深入的研究【2 3 埘】。十二烷基苯磺酸钠 一聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) 是目前用于分离蛋白质及测定其 分子量的一种最好的方法之一。此外，s d s p a g e 也是目前测定蛋白质 亚基分子质量最好的方法，可判断蛋白质凝胶形成前后亚基分布变化， 以及推测哪些成分在凝胶形成时发生变化【2 矾。 5 广东工业大学硕士学位论文 1 1 4 蛋白质凝胶在非食品领域的应用前景 大豆蛋白凝胶可作为土壤的保水剂。研究表明【2 6 1 ，保水剂能显著提 高土壤的含水量、体积膨胀率、液相百分率、总孔隙度和毛管孔隙度百 分率，改善土壤结构，缓和地温变化，促进微生物活动，提高土壤肥力， 特别是在缺水干旱地区，使用保水剂具有显著地节水效果。因此，土壤 的保水剂要求保水剂在吸水膨胀后能形成凝胶物质，在干燥条件下又能 将水分缓慢释放【27 1 。大豆蛋白凝胶正是具备这种性能。大豆蛋白凝胶也 可以应用在生理卫生用品上，比如一次性尿布、尿垫、卫生巾等。此外， 大豆蛋白凝胶具有良好的生物降解性和生物相容性，可通过物理、化学 改性使之成为一种对外界刺激能产生敏感响应的智能型凝胶，智能型凝 胶可运用在药物缓释、蛋白质的分离提纯、人工肌肉等医药方面。可见， 大豆蛋白凝胶在这方面的应用前景是相当广阔的。 1 2 大豆蛋白与e d t a d 的结构与性能 1 2 1 大豆蛋白组成及结构 大豆蛋白是指存在于大豆种子中诸多蛋白质的总称。大豆的蛋白质 含量很高，通常每1 0 0 9 含蛋白质3 0 4 0 9 ，相当于米、面等粮食的4 倍、鸡 蛋的3 倍、瘦猪肉的2 3 倍。富含1 9 种以上的氨基而且包括8 种人体必需的 氨基酸，还含有大量对人体健康有益的必需脂肪酸、磷脂和丰富的钙、 磷等矿物质，且不含胆固醇，它对维系人类的生命和保证人类的健康起 着不可替代的作用【2 引。 大豆分离蛋白( s p i ) 是从低温脱脂豆粕中通过碱提酸沉、膜分离等 方法制取的一种高纯度的大豆蛋白产品，其蛋白含量在9 0 以上，是大 豆蛋白产品中蛋白质含量最高的产品。大豆分离蛋白的主要成分是7 s 和 l l s 球蛋白，次要成分则具有很大的不均匀性，主要有v 伴球蛋白、7 s 碱性球蛋白、脂肪氧合酶、p 一淀粉酶、植物凝集素以及胰蛋白酶抑制剂 等【2 9 3 叭 和其他高分子一样蛋白质的分子结构分为四级，如图1 1 所示，蛋白 6 第一章绪论 质的分子一级结构是指氨基酸如何连接成肽键即氨基酸在肽键中的种 类、数目和排列顺序；在生物体中，多肽键并不是成为长的线性结构， 而是以折叠和螺旋连接的方式存在，这就是蛋白质的二级结构，它是多 肽链间以氢键结合而形成的展开的、部分展开的或螺旋状卷曲的多肽链 间的空间关系；蛋白质或构成蛋白质分子的亚基内所有原子之间相互作 用使得蛋白质中肽链折叠、盘曲成内有袋形空穴的空间排列，链的卷曲、 折叠力量来自肽链中氨基酸的支链性质，包括二硫键或疏水性相互作用、 范德华力、离子键或氢键，称为三级结构：几条多肽链以非共价键缔合 在一起，形成蛋白质的四级结构3 。 a m i m a u dr w k l u 矗# - l 救如概嘲t i d e 曲曲i | 钟m b m 嘲h 瞄k 擐结构= 缓结构三幻瞄构四暖结构 图1 1 大豆蛋白质的分子结构 f i gl ls t r u c t u r eo fs p im o l e c u l e a 瑚a 由a a ba b ba b b b b b b 伴璩蛋白7 个主要三聚体 1 1 s 球蛋白分子中的亚基组威 r l a b i a 庐i b 2 8 1 崛 扔 1 1 5 球蛋自5 个主要亚基 亚基的连接方式 n s _ 卜 图i 27 s 和l i s 球蛋白组成与结构 f i gl 2c o m p o s ea n ds t r u c t u r eo f 7 s a n d1 1 s 7 s 球蛋白是由理化性质不同的三个主要部分所组成，即d 一伴球蛋 7 广东工业大学硕士学位论文 自，丫一伴球蛋白和碱性7 s 球蛋白，而b 伴球蛋白是7 s 球蛋白的主要组成 部分，因此许多研究学者所称的7 s 球蛋白实际上就是b 一伴球蛋白。是三 个亚基( a ，a 和1 3 ) 的不同结合形成的三聚体，三个亚基之间通过疏水 键和氢键结合。 1 l s 球蛋白是寡聚蛋白，每个蛋白分子由两个原体组成，每个原体由 3 个亚甲基构成，而每一个亚基又由两个多肽链通过二硫键连接而成。其 中一条多肽链的等电点在酸性范围，故称为酸性多肽( a c i d ，a ) ，另一 条多肽链的等电点在碱性范围，故称为碱性多肽( b a s i c ，b ) 。l l s 球蛋 白含有多中酸、碱性多肽链。目前确认的至少有5 种酸性多肽( a 1 5 ) 和 4 种碱性多肽( b 1 4 ) 。1 l s 球蛋白的等电点为4 6 4 ，其分子间至少含有2 0 个二硫键和2 个巯基 3 2 1 。 1 2 2 大豆蛋白的功能性 功能性是指食品在加工、贮藏和消费过程中，决定蛋白质行为表现 的性质，如持水、持油能力、凝胶、乳化、结构形成和黏连等【3 孙。决定 蛋白质功能性质的蛋白质的物理和化学性质包括：大小，形状，氨基酸 组成和顺序，净电荷和电荷的分布，疏水性和亲水性之比，二级、三级 和四级结构，分子柔性和刚性，蛋白质分子问相互作用和同其他组分作 用的能力。由于蛋白质具有很多物理和化学性质，因此很难描述这些性 质中的每一种在指定的功能性质中所起的作用。 在经验水平上，蛋白质的各种功能性质可以被认为时蛋白质两类分 子性质的表现形式：l 、流体动力学性质；2 、与蛋白质表面有关的性质。 诸如黏度凝胶作用和组织化这样的功能性质取决于蛋白质分子的大小形 状和柔性；诸如湿润性分散性溶解性起泡乳化以及脂肪与风味物的结合 这样的功能性质取决于蛋白质表面的化学性质和地形性质【3 4 1 。 1 2 3e d t a d e d t a d 是乙二胺四乙酸( e d t a ) 的酸酐，如图1 3 1 3 5 1 所示蛋白 质是由多个肽键结合而成的高分子含氮化合物，分子链上带有氨基、羟 0 第一章绪论 基、硫氢基和羧基等多种活性基团。e d t a d 能与蛋白质肽链上赖氨酸 片段上的e 氨基发生反应，从而将- - c o o 引入蛋白分子链。这些被引 入的一c o o 增加分子内静电排斥作用，破坏蛋白分子规整的折叠结构， 大幅度提高肽链与水分子亲和力【3 6 1 。 图1 - 3e d t a d 分子结构 f i g u r ei 一3s t r u c t u r eo fe d t a d 水溶液中e d t a 逐步电离，而以h 4 y ( y 表示e d t a 阴离子) 、h a y l h 2 y 厶、h y 3 和y 4 。五个组分存在，e d t a 的逐步电离常数分别为： p k a l = 2 0 0 、p k l 2 = 2 6 7 、p k 4 3 = 6 1 6 、p k a 4 = 1 0 2 6 【3 7 j 。 e d t a 是一种常用的金属离子螯合剂，当e d t a 与金属离子发生反 应时，由于e d t a 分子含有2 个氨基氮和4 个羧基氧，共有6 个配位原 子，易于与金属离子形成多基螯合的螯合物，而且所形成的螯合物立体 结构中具有多个五元环，故螯合物稳定性高；此外，e d t a 几乎能与所 有金属离子螯合且螫合反应速度快，水溶性大1 3 s 。 1 3 大豆蛋白的改性方法及对其凝胶性的影响 1 3 1 交联 交联剂可使大豆蛋白分子问发生交联而促使蛋白形成凝胶。交联剂 分子两端各有一个相同或者不同的活性基团，它们可与蛋白质侧链上的 氨基、巯基、羟基等发生共价键合作用，在相隔较近的两个氨基酸残基 间搭桥，形成多肽链内链间或者蛋白质分子间的交联，而不引起蛋白质 构象的重大改变f 3 叭。戊二醛是理想的交联剂，戊二醛可与蛋白质分子中 的e 一氨基、肽链n 一端氨基等伯胺基、杂环上亚胺基、巯基、及酰胺 基反应，其中与赖氨酸e 一氨基结合最为牢固1 4 0 1 。 在适当p h 下，多价离子或一些聚电解质能促进蛋白质分子问离子交 联的形成，在中性或碱性条件下，钙离子通过蛋白质电离的羧基形成交 9 广东工业大学硕士学位论文 联蛋白质，加热会形成凝胶4 。王飞镝等【川研究了乙醇和氯化钙对大豆 蛋白凝胶性的影响，发现乙醇和钙离子均增大了大豆蛋白凝胶的交联密 度，从而增强了凝胶强度和提高了凝胶的吸水性能。 1 _ 3 2 引入亲水基 通过改性，在蛋白质分子上引入亲水基团，改变蛋白质的电负性， 提高了蛋白质分子间的静电斥力，使之在体系中更易于分散，相互排斥， 因而能够提高分离蛋白的溶解性和聚结稳定性，并降低了等电点。 大豆蛋白的酰化反应是酰化试剂与大豆蛋白质分子上面的羟基、氨 基进行的加成反应，反应后在蛋白质分子的羟基、氨基上引入亲水的羧 基基团。常用的酰化试剂是乙酸酐和琥珀酸酐。e d t a d 也是一种使蛋 白质分子电荷密度增加的酰化剂，d e r c h y a nw a n g 3 6 】用e d t a d 对大豆 分离蛋白进行酰化改性制备成改性大豆蛋白凝胶，凝胶的平衡溶胀率达 到1 0 0g h 2 0 g 。 大豆分离蛋白磷酸化就是有选择地利用蛋白质侧链活性基团，如 s e r ，t h r 的o h 及赖氨酸的c n h ，分别接入一个磷酸根基团，从而大量 引进磷酸根基团 4 2 1 。田少君等【4 3 1 人采用三氯氧磷对大豆分离蛋白进行磷 酸化改性，发现改性后大豆分离蛋白在碱性环境下( p h = 9 ) 凝胶性得 到了较大地提高。 1 3 3 酶改性 大豆蛋白的酶法改性是指通过酶部分降解蛋白质，增加其分予内或 分子问交联或连接特殊功能基团，改变蛋白质的功能性质特别是凝胶性 1 4 4 】。转谷酰胺酶( t g ) 、过氧化酶( p o d ) 和多酚氧化酶( p p o ) 。都可 以用于蛋白质的酶法交联。 转谷氨酰胺酶是一种酰基转移酶，可以催化相同或不同蛋白质分子 之问的交联与聚合，形成新的共价键。目前有关转谷氨酰胺酶的研究已 相当广泛徐幸莲等【4 5 l 研究了转谷氨酰胺酶对蛋白质凝胶性能的影响， 结果表明转谷氨酰胺酶添加浓度在1 0 4 0 u g 时，可以提高大豆分离蛋白 l o 凝胶能力以及凝胶性能，表现在形成凝胶蛋白质极限浓度的降低以及凝 胶硬度的提高。 1 4 研究目的和意义 1 4 1 研究内容 本课题利用物理、化学手段对大豆蛋白进行处理，制备成大豆蛋白 凝胶，对凝胶样品进行仪器分析和性能测试。具体研究内容主要包括以 下几个方面： l 、用乙二胺四乙酸二酐与大豆分离蛋白进行酰化反应，制备出改性 大豆蛋白酰化物，将酰化物通过戊二醛交联制备出改性大豆蛋白凝胶； 确定酰化改性的工艺条件；用化学分析法和s d s p a g e 电泳对酰化物进 行研究，分析改性程度以及e d t a d 与蛋白质之间的反应方式；用红外 ( i r ) 研究酰化物的官能团变化；扫描电镜( s e m ) 观察凝胶断面形貌； 拉伸试验机测试凝胶的拉伸性能。 2 、研究改性大豆蛋白凝胶在去离子水、n a c l 溶液、生理盐水和不 同p h 值缓冲溶液中的溶胀能力和溶胀行为，探讨凝胶的p h 敏感性、温 度敏感性和离子敏感性。 3 、用微生物法、土埋法和酶降解法测定改性大豆蛋白凝胶的生物降 解能力。观察降解过程中微生物在凝胶表面的覆盖情况和凝胶的形状变 化，通过测定土壤中凝胶被微生物降解所释放出二氧化碳的量，从而确 定凝胶在土壤中的降解程度和降解速度。将大豆蛋白凝胶放入酶溶液中 进行消化降解，用紫外分光光度计测溶液吸光率的变化，用凝胶渗透色 谱法( g p c ) 测定凝胶降解后的分子量，评价各种酶对凝胶的消化降解 能力。 4 、研究改性大豆蛋白凝胶对c a ”，z n 2 + ，p b 2 + 和c u 2 + 金属离子的螫 合能力，探讨金属离子浓度、温度、p h 值和羧基含量等对凝胶金属离子 螯合能力的影响。 广东工业大学硕士学位论文 1 4 2 创新之处 蛋白质的功能性研究具有很长历史，人们对蛋白质的改性研究主要 集中在热、碱、磷酸化、酰化等方面。而采用e d t a d 对大豆蛋白进行 改性在国内鲜有报道。本论文研究将对e d t a d 改性大豆蛋白凝胶这一 体系进行讨论，探讨了酰化反应方式，研究了改性大豆蛋白凝胶的溶胀 及溶胀过程规律，金属离子螯合能力和生物降解能力。 1 4 3 研究意义 目前合成高分子水凝胶材料主要以石油资源为基础，这些材料使用 后在自然界中很难被降解，给环境带来了污染。另外石油资源越用越少， 所以，我们有必要寻找一种可再生原料代替石油资源制备可生物降解， 具有环境友好特征的新型高分子水凝胶材料。大豆蛋白凝胶以天然高分 子大豆分离蛋白为原料，具有良好的生物降解性，不管是在土壤环境还 是在海洋环境中，均可很快降解转化成为二氧化碳、水和低分子含氮物 h 6 1 ，是石油基水凝胶材料的理想替代品。改性大豆蛋白凝胶具有p h 敏感 性及溶胀一消溶胀性能，可以将其作为智能型凝胶应用到药物的控制释 放中，用e d t a d 改性大豆蛋白，由于在其侧链上接上了能与金属离子形 成络合物的分子团，因此具有能与金属离子结合的能力，e d t a d 改性大 豆蛋白凝胶在废水处理工业上能够得到很好的应用1 4 7 1 。最后，利用大豆 分离蛋白制备水凝胶应用于非食品领域，是拓宽大豆蛋白应用范围，提 高大豆产品附加值和提高农民收入的有效途径。 1 2 第二章改性大豆蛋白凝胶的制备及表征 2 1 前言 胶凝性是大豆蛋白重要功能特性之一，在大豆蛋白凝胶制备过程中，用 e d t a d 对大豆分离蛋白进行化学改性将一c 0 0 引入蛋白分子链。从改性大豆蛋 白分子结构看，引入肽链的一c o o 增加肽链分子内静电排斥作用，破坏蛋白分 子规整的折叠结构；由于- - c o o 。是亲水基，可提高肽链与水分子亲和力1 3 6 1 。本章 着重探讨的是对大豆蛋白经预处理，e d t a d 酰化改性和戊二醛交联制备出改性 大豆蛋白凝胶的制备工艺及其对蛋白质和凝胶结构、性能的影响。研究了预处理 工艺对蛋白质分子伸展状态的影响；探讨e d t a d 改性对蛋白质分子中氨基、羧 基含量和亚基分布状态影响；研究e d t a d 用量与戊二醛用量对凝胶溶胀率及微 观结构的影响，并以红外定性，s e m 对凝胶结构表征；通过力学性能测试，研究 e d t a d 改性对大豆蛋白分子链间作用力的影响，从而研究e d t a d 改性对大豆蛋 白分子结构与构象的影响及对凝胶性能的影响，为深入研究大豆蛋白凝胶结构规 律及与性能的关系提供参考。 2 2 实验部分 2 2 1 仪器与试剂 大豆分离蛋白( s p i )食品级 乙二胺四乙酸二酐( e d t a d ) 氢氧化钠分析纯 盐酸分析纯 d l 一赖氨酸单羟基氯化物分析纯 戊二醛分析纯 2 ，4 ，6 一三硝基苯磺酸( t n b s ) 分析纯 山东禹王植物蛋白有限公司 根据文献 4 8 】自制 天津市百世化工有限公司 广州东红化工厂 a l f aa e s a rc o 天津市福晨化学试剂厂 s i g m a - a l d r i c hc h e m i c a lc o 广东工业大学硕士学位论文 2 - - 辛醇 化学纯北京金龙化学试剂有限公司 盐酸胍 分析纯国药集团化学试剂有限公司 苯二甲酸氢钾 分析纯广州化学试剂厂 电泳试剂盒上海升正生物技术有限公司 标准蛋白上海升正生物技术有限公司 聚乙二醇化学纯天津市科密欧化学试剂开发中心 透析袋，截留分子量1 4 0 0 0 + _ 2 0 0 0上海源聚生物科技有限公司 规格巾2 7 m m , p h 计p h s j 3 f 型上海精密科学仪器有限公司 可见分光光度计 v i s - 7 2 2 0 型北京瑞利仪器公司 电子天平 f a 2 1 0 4 型上海良平仪器仪表有限公司 定时电动搅拌器 j j - l 型江苏常州国华仪器厂 恒温水浴锅 s s y - 2 型北京泰克仪器有限公司 扫描电子显微镜 j s m 5 9 1 0 型日本 红外光谱仪b r u k e rv e c t o r 3 3 型 美国 电泳仪d y y - 3 5 型北京六一仪器厂 电泳槽d y c z 2 3 a 型北京六一仪器厂 数码照相机s o n y w l 型日本 氮气纯度9 5 上海医疗器械四厂 真空干燥箱d z f 6 0 5 0 型上海一恒科技有限公司 电子拉伸试验机u t 2 0 6 0 型台湾u c a n 公司 2 2 2 实验方法 2 2 2 1 改性大豆蛋白凝胶的制备 ( 1 ) 大豆分离蛋白的预处理 称取一定量的s p i ，配制成2 水溶液，电动搅拌均匀，用2 5 m o l l 的n a o h 溶液将其p h 至所需值，恒温水浴搅拌3 0 m i n 。 ( 2 ) 酰化反应 1 4 第二章改性大豆蛋白凝胶的制各及表征 经过预处理的s