（生物化学与分子生物学专业论文）瑞氏木霉cbhⅠ的糖苷合成性质探讨.pdf

摘要 摘要 通过非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，从瑞氏木霉( t r i c h o d e r m ar e e s e 0 天然纤维 素水解酶中分离纯化到外切葡萄糖苷酶c b hi ( c e l l o b i o h y d r o l a s ei ) ，以该酶为 研究对象，初步探讨了对不同底物的活性。以蔗糖和对硝基酚纤维二糖( p n p c ) 为底物，检测出该酶的水解活性。4 5 c ，p h 5 5 时，c b hi 对蔗糖的水解酶米氏 常数k i n = 5 2 9 m g m l ，v r a a x = 0 4 2 0 u g m i m 对p n p c 的水解酶米氏常数k i n = 2 9 5 m g m l ，v m a x = 0 0 4 1 u g m i n 。在长时间内，用d n s 法和对硝基酚法分别检 测了蔗糖反应体系还原糖生成量变化和p n p c 反应体系对硝基酚生成量变化。结 果表明在两个反应体系中都有明显的可逆反应存在，水解产物生成量出现周期性 振荡特征。还原糖生成量振荡周期为2 1 6 7 + 2 8 9 分钟；对硝基酚生成量振荡周期 为2 3 7 5 4 - 2 5 分钟。 用d n s 法分别检测了长时间内c b hl 与木糖、果糖反应的体系中还原糖含 量变化。结果显示，在封闭的反应体系中有明显的可逆反应存在，还原糖含量出 现周期性振荡特征。还原糖含量振荡周期分别为3 3 3 3 + 5 7 7 分钟和4 1 7 5 4 - 9 0 7 分钟。 同时，为了证实该酶是否有糖苷合成活性，对木糖与c b hi 反应5 分钟后 的产物做乙酰化处理，进行g c m s 分析。试验结果证实了产物中有二糖结构类 型成分，说明了c b hi 对木糖有糖苷合成活性。 关键词： t r i c h o d e r m ar e e s e i ，c b hi ，蔗糖，p n p c ，木糖，果糖，周期振荡，糖苷合成 a b s t r a c t b yp a g e ，c b hi ( c e l l o b i o h y d r o l a s ei ) w a sp u r i f e df r o mc o m m e r c i a lc c l l u l a s e ， w h i c hw a se x t r a c t e df r o mt r i c h o d e r m ar e e s e i t h ea c t i v i t yo ft h i se n z y m ew a s r e s e a r c h e dw i t hk i n d so fs u b s t r a t e s t h eh y d r o l y t i ca c t i v i t yo fc b hiw a sd e t e c t e d a t4 5 1 2p h 5 5 i t sk mw a s5 2 9 m g m l ，a n dt h ev m a xw a s0 4 2 0 u g m i nw i t hs u c r o s e 弱s u b s t r a t e ；i t sk mw a s2 9 5 m g m l ，a n dt h ev m a xw a s0 0 41u g m i nw i t h 4 一n i t r o p h e n y l - p - d - c c l l o b i o s i d e ( p n p c ) a ss u b s t r a t e t h eq u a n t i t yc h a n g eo ft h e r e d u c i n gs u g a ri ns u c r o s eh y d r o l y s i sr e a c t i o na n dt h ep - n i t r o p h e n o li np n p c h y d r o l y s i sr e a c t i o nw e r ed e t e c t e di nal o n gt i m e i tw a sd e m o n s t r a t e dt h a tt h e r ew e r e a b s o l u t er e v e r s i b l er e a c t i o n si nt h et w oc l o s er e a c t i o n s y s t e m s t h ep e r i o d i c o s c i l l a t i o ni nt h eq u a n t i t yc h a n g eo ft h er e d u c i n gs u g a ra n dp - n i t r o p h e n o lw e r ef o u n d ， a n dt h eo s c i l l a t i o np e r i o d sw e r e2 1 6 7 士2 8 9 m i na n d2 3 7 5 士2 5 m i nr e s p e c t i v e l y d n sm e t h o dw a su s e dt oa n a l y z et h eq u a n t i t yc h a n g eo ft h er e d u c i n gs u g a rw h e n c b hir e a c t e dw i t hx y l o s ea n df r u c t o s er e s p e c t i v e l yi nal o n gt i m e t h er e s u l t s h o w e dt h a t i nt h ec l o s er e a c t i o ns y s t e m , t h er e d u c i n gs u g a rq u a n t i t yc h a n g e d r e g u l a r l y 诵mp e r i o d i c r a i s ea n dd e c r e a s e ，a n dt h eo s c i l l a t i o n p e r i o d sw e r e 3 3 3 3 士5 7 7 m i na n d4 1 7 5 + 9 0 7 m i nr e s p e c t i v e l y t h ea c e t y l a t e d p r o d u c t s w e r e d e t e e e db yc - c m s ，l i s i i 坞x y l o s e 嬲s u b s t r a t ea f t e r5 r a i n - r e a c t i o nt i m e i tw a s c o n f i r m e dt h a tak i n do fd i s a c c h a r i d ee x i s t e di nt h er e a c t i o np r o d u c t s ，a n di ts u p p o r t e d t h eh y p o t h e s i st h a tt r i c h o d e r m ar e e s e ic b hih a dt h eg l y c o s i d es y n t h e s i sa c t i v i t yt o x y l o s e t r i c h o d e r m ar e e s e i ，c b hi ，s u c r o s e ，p n p c ，x y l o s c ，f r u c t o s e ，p e r i o d i co s c i l l a t i o n , g l y c o s i d es y n t h e s i s 学位论文独创性声明 本人郑重声明： 1 、坚持以“求实、创新 的科学精神从事研究工作。 2 、本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究 成果。 3 、本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。 4 、本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构 已经发表或撰写过的研究成果。 5 、其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示 了谢意。 作者签名： 日期： 学位论文使用授权声明 本人完全了解南京师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索；有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在 解密后适用本规定。 作者签名：逊 日 期： 旦星：21 2 引言 己f 旨 ，1日 自1 9 0 6 年s e i l l i e v e 在蜗牛的消化液中发现了分解纤维素的纤维素酶后，纤 维素酶就受到世界各国生物界的重视，其应用前景十分广阔，已扩展到医药、纺 织、日用化工、造纸、食品发酵、工业洗涤、烟草、石油开采、废水处理及饲料 等各个领域。 至今为止，科学界对瑞氏木霉( t r i c h o d e r m ar e e s e i ) 纤维素酶的研究比较多。 纤维素酶能催化纤维素分解产生纤维二糖或葡萄糖，所以对其的研究方向大多集 中在对糖苷键的水解活性及机理上；在结构研究中，已经对纤维素酶的结构域进 行拆分解析、确定了功能氨基酸、探讨了分子折叠及催化机制。 糖苷化合物是自然界中一类广泛存在的物质，在人体内发挥着重要的作用。 研究表明，糖蛋自在胞内的迁移和分泌、细胞间的相互作用、细胞的癌变以及细 胞表面与噬菌体的相互作用都与寡糖有关。而很多糖苷化合物也具有特殊的生物 活性，担负着重要的生理功能。糖苷水解酶被广泛应用于各类糖苷化合物的合成， 可以催化形成寡糖，也可以将直链醇或芳香醇糖基化，还能催化多肽、萜类、酚 类、生物碱以及抗生素等物质的糖基化。作为糖苷水解酶，纤维素酶的糖苷合成 活性鲜有报道，最近仅有瑞氏木霉外切葡萄糖苷酶c b hi ( c e l l o b i o h y d r o l a s ei ) 以葡萄糖为底物合成二糖的报道。 在本研究中，利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对天然的瑞氏木霉制剂进行分 离纯化，回收蛋白条带得到单一组分c b hi ，以不同的糖苷化合物和单糖为底 物，对天然状态下单一组分酶的糖苷合成活性进行研究。 1 1 i 第一章纤维素酶的研究进展 第一章纤维素酶的研究进展 纤维素酶指的是能水解纤维素p 1 ，4 葡萄糖苷键，使纤维素变成纤维二糖和 葡萄糖的一组酶的总称。因此纤维素酶又有纤维素酶复合物之称，是一个由多种 水解酶组成的复杂酶系 1 】。 1 纤维素酶来源 生产纤维素酶的微生物有细菌、放线茵和真菌。2 0 世纪6 0 年代以来，据 不完全统计，国内外共记录了产纤维素酶的菌株大约已有5 3 个属的几千个菌株 2 】。大多细菌和真菌的纤维素酶多是胞内酶，有少数可以产生胞外酶，能降解 结晶纤维素 3 】。从传统意义上讲，纤维素酶的重要来源是真菌。其中研究最多 的是木霉，如瑞氏木霉( t r i c h o d e r m ar e e s e 0 、绿色木霉( zu i r i d e ) 和康氏木霉( z k o n i n g l i ) 等。瑞氏木霉产出的纤维素酶由于能够有效地降解结晶区纤维素而被熟 知。 + 2 纤维素酶的组分、分类 2 1 纤维素酶的组分 腐生性丝状真菌产生三种类型的纤维素酶： ( 1 ) 内切葡萄糖苷酶( e n d o - l ，4 - b d - g l u c a n a s e ，e c 3 2 1 4 ，来自真菌的简称e g ， 来自细菌的简称c e i l ) ，又称为c x 酶。该类酶能随机地在纤维素分子内部降解 p 1 ，4 糖苷键，将长链纤维素分子截短，使纤维素的聚合度降低，同时产生大量 非还原性末端； ( 2 ) 外切葡萄糖苷酶( e x o - l ，4 - p - d g l u c a n a s e ，e c 3 2 1 1 9 ，来自真菌的简称 c b h ，来自细菌的简称c e x ) ，也称纤维二糖水解酶( c e u o b i o h y d r o l a s e ) ，又称为 c 1 酶。c b h 从纤维素的一端降解糖苷键，它可以作用于纤维素的结晶区，能从 纤维素分子的还原或非还原端切割糖苷键，酶解主要生成纤维二糖。 ( 3 ) 纤维二糖酶( p - 1 ，4 一g l u e o s i d a s e ，e c 3 2 1 2 1 ，简称b g ) ，它把纤维二糖解离 成单个的葡萄糖分子【4 】。 不同的产酶微生物产生有不同降解能力的酶系。能够降解无定型区纤维素和 结晶纤维素的酶系叫完全酶系，仅能降解无定型区纤维素的叫不完全酶系。不是 第一章纤维素酶的研究进展 所有的产酶微生物都可以产生上述三类纤维素酶，如褐腐真菌只产生内切酶系。 不同的产酶微生物所产生的三类酶的含量、活力也是不同的。如木霉c b hi 的 产量很高，约占茵体外分泌蛋白总量的6 0 ，它和底物的亲和性较高，但活性较 低。c b h i i 所占比例比c b hi 少，但特异性强，活力高。c b h i i 降解微晶纤维 素产生还原糖的能力比c b hi 约高2 倍。 2 2 纤维素酶的分类 纤维素酶属于糖苷水解酶。根据氨基酸序列的相似性可将糖苷水解酶分为 8 2 个族，纤维素酶占其中的1 3 个族。h c n r i s s a t 又在纤维素酶内部将三种酶细分， 其中内切葡萄糖苷酶可分为1 3 个族，外切葡萄糖苷酶分为5 个族，纤维二糖酶 分为2 个族 5 】。 3 纤维素酶分子结构 1 9 8 6 年t i l b e u r g h 6 用木瓜蛋白酶有限酶切t r i c h o d e r m ar e e s e i 的c b h l 分 子，得到具有独立活性的两个结构域：一个是具有催化功能的催化域( c a t a l y t i c d o m a i n ，c d ) ，另一个是具有纤维素结合功能的纤维素结合( 吸附) 域( c e l l u l o s e b i n d i n gd o m a i n ，c b d ) 。c b d 在纤维素酶中位于氨基端或羧基端，它通过一段高 度糖基化的连接肽( 1 i n k e rp e p t i d e ) 与催化区相连。之后用类似的方法在多种细菌 和真菌的纤维素酶中发现类似的结构。 3 1 催化域( c d ) 的结构 迄今为止，所有已知的纤维素酶的催化域根据其氨基酸序列的相似性可分为 7 0 个家族，在同一个家族内具有相似的分子折叠模式和保守的活性位点。因此 在同一家族内，其反应机制和对底物的特异性都可能相同。最先被阐明的c d 是 t r e e s e ic b h i i 的c d ，它是由吖p 组成的桶状结构：由5 个a 螺旋和7 条p 链组 成，活性部位是由两个延伸至表面的环( 1 0 0 p ) 形成的一个隧道状( t u n n e l ) 结构，长 度大约2 r i m ，包含4 个结合位点，水解糖苷键发生在第2 和第3 结合位点之间。 t h e r m o m o n o s p o r a f u s c a 的e g i i 尽管和t r e e s e i 的c b h i i 属于同一家族，但活性 部位的组织结构却有一点显著的不同，它的活性位点表面没有一个由环覆盖的结 构，因此它更象是一个沟槽( g r o o v e ) 而不是一个“隧道”。所有属于e g 家族的环 结构都缺失，而属于c b h 一家族的正好相反，都有一个环结构。正是由于c b h 和e g 在结构上的不同，导致它们在底物专一性上的差异。e g 的活性位点位于 2 第一章纤维素酶的研究进展 一个开放的沟槽中，可与纤维素链的任何部位结合并切断纤维素链：c b h 的活 性位点位于一个长环所形成的隧道里面，它只能从纤维素链的末端切下纤维二糖 【刁。1 9 9 5 年m e i n k e 8 利用蛋白质工程的方法将c f i m i 的外切酶c b h a 分子的“环 删除后，发现该酶的内切酶活性果然提高。这进一步证实了上述分析。 3 2 纤维素结合域( c b d ) 的结构 c b d 在纤维素酶中位于肽链的氨基端或羧基端，通过连接肽与c d 相连。 c b d 不具备水解纤维素的功能，但有助于纤维素酶与底物的结合，它的三维结 构极其复杂，对酶的催化活力起决定作用。 c b d 调节酶对可溶和非可溶性底物的活力，不同的c b d 以不同的拓扑学 结构与结晶纤维素结合，都具有相似的刚性支柱结构，以便进行识别和结合所需 的侧链能正确定位。只有少数微生物和高等植物产生的纤维素酶不具有这类结构 域，如t r e e s e i 的e g i i i 就没有c b d ；热纤梭菌纤维素酶并没有c b d ，是依靠纤 维素酶系中的纤维小体吸附纤维素的。通常认为c b d 对高效降解纤维素起到关 键的作用，但实验证明，在有些c b h 和e g 中c b d 的结构可能不是必需的。z r e e s e i 的e g i 在没有c b d 的情况下仍具有水解纤维素的活性【9 】。 c b d 的作用机制目前仍未完全清楚，一种观点认为它有助于增加c d 在固 体纤维素表面的浓度；另一种观点认为它能促使单链纤维素分子从结晶纤维素中 释放，以便c d 能接近它【1 0 】。人们推测，c b d 可能通过芳香环与葡萄糖环的堆 积力吸附到纤维素上，由c b d 上其余的氢键形成残基与相邻葡萄糖链形成氢键， 将单个葡萄糖链从纤维素表面脱离开来；以利于c d 的水解作用。 3 3 纤维素酶连接肽 纤维素酶的c b d 和c d 通过一段高度糖基化的连接肽相连。糖基化不是 纤维素酶水解纤维素活力所必需的。外切酶的连接肽是糖基化的，内切酶的连接 肽不是糖基化的。外切酶的连接肽中含有一些可能的蛋白酶酶切位点，而内切酶 中却几乎没用。所以，糖基化的作用应该是防止蛋白酶酶切 1 1 】。这种作用对纤 维素酶的功能可能是很重要的。 真菌纤维素酶的连接肽富含s e t ，g l y ，t h r ；c b d 和c d 夹角为1 8 0 度。某 些连接肽序列含有羟基氨基酸连续重复序列，还有一些富含a s p 和或g l u 。 3 第一章纤维素酶的研究进展 连接肽可保持c d 和c b d 之间的距离，可能有助于不同酶分子间形成较为 稳定的聚集体 1 2 】。 4 第一章纤维素酶的研究进展 参考文献 【1 t o m m ep ，w a r r e na j & g i l k e snr c e l l u l o s eh y d r o l y s i sb yb a c t e r i aa n d 如i 酒川 a d v m i c r o b p h y s w l ，1 9 9 5 ( 3 7 ) ：1 - 8 1 【2 】张传富，顾文杰，彭科峰等生物纤维素酶的研究现状叨生物信息学，第一期第五 卷：3 4 3 6 【3 b h a tm a n db h a ts c e l l u l o s ed e g r a d i n ge n z y m e sa n dt h e i rp o t e n t i a li n d u s t r i a l a p p l i c a t i o n s 叨b i o t e c h n 0 1 a d v ，1 9 9 7 ，1 5 ：5 8 3 6 2 0 【4 】梁敏，邹东恢，王少艳纤维素酶的研究进展与前景展望叨食品研究与开发2 0 0 5 ， v o1 2 6 ，n o 6 ：2 0 2 - 2 0 4 【5 y e 巧兰，郭刚，林范学纤维素酶研究综述阴湖北农业科学，2 0 0 4 ，4 ：1 4 1 9 【6 t i l b e u r g hh ，t o m m ep ，c l a e y s s e n sm e ta 1 l i m i t e dp r o t e o l y s i so ft h e e e l l o b i o h y d r o l a s ef r o m t r e e s e i 叨f e b s l e t t , 1 9 8 6 ，2 0 4 ( 2 ) ：2 2 3 - 2 2 7 7 j u ym ，a m i ta ga l z a r ime t 讲c r y s t a ls t r u c t u r eo fat h e r m o s t a b l eb a c t e r i a l c e l l u l o s ed e g r a d i n ge n z y n l e 阴n a t u r e ，19 9 2 ，( 35 7 ) ：8 9 - 91 【8 m e i n k ea ，d a m u d ehg t o m m epe ta 1 e n h a n c e m e n t o f t h ee n d o - b e t a 1 , 4 - g l u c a n a s e - a c t i v i t yo f a ne x o e e l l o b i o h y d r o l a s eb yd e l e t i o no f as u r f a c el o o p 叨j 召f dc h e m ，1 9 9 5 ，2 7 0 ( 9 ) ：4 3 8 3 - 4 3 8 6 - 【9 杨永彬，黄谚谚，林跃鑫纤维素酶的结构及分子多样性叨生命的化 学，2 0 0 4 ，= 2 4 ( 3 ) ：2 11 - 2 1 3 【1 0 l i n d e rm d b i o t e c h n o l ，1 9 9 7 ，5 7 ：1 5 2 8 【1 1 高培基纤维素酶降解机制及纤维素酶分子结构与功能研究进展叨自然科学 进展，2 0 0 3 ，1 ( 1 3 ) ：2 1 2 9 。 【1 2 】赵容乐纤维素酶研究进展阴喀什师范学院学报，2 0 0 5 ，2 6 ( 6 ) ：5 1 5 4 第二章糖苷酶的研究进展 第二章糖苷酶的研究进展 1 糖苷化合物概述 1 1 糖苷化合物及其主要生物学活性 糖苷是单糖与醇、酚等含羟基的化合物形成的缩醛。如果含羟基的化合物是 另一分子的单糖，这样形成的物质就是双糖；从这点理解，寡糖、多糖也可以看 做是一种糖苷化合物。 糖苷化合物作为构成生命体的最基本物质之一，在生命过程中起着极为重 要的作用。最近3 0 年来，随着分子生物学，特别是细胞生物学的高速发展，糖， 尤其是寡糖的诸多生物学功能不断被人们揭示和认识。寡糖的生物学活性主要 有： 1 1 1 胃肠道活性 寡糖( 如乳果糖，果聚糖，大豆低聚糖，异麦芽糖等) 可作为一种促双歧杆菌 生长因子( b i f i d u sf a c t o r ，b f ) 【1 】，促进双歧杆菌生长繁殖，使肠道内p h 值下降， 抑制肠道有害菌生长；产生b 族维生素，分解致癌物质，提高人体免疫力。 1 1 2 增强造血功能活性，促有丝分裂活性 近几年从中药中提取出的寡糖有效成分有很多，其中地黄多糖，甘草及巴戟 天中的多糖研究尤其引人瞩目。地黄低聚糖僻p 所册，l 面砌伽o l i g o s a c c h a r i d e ， r o o s ) 是从地黄多糖中进一步分离提取的有效成分，实验研究证明r g o s 能增 强小鼠的造血功能【2 】。甘草( g l y c y r r h i z au r a l e n s i s ) 根的果胶多糖类中提取出的中 性低聚糖多羟糖酸组分，具有抗补体和促有丝分裂活性【3 】。 1 1 3 抗菌抗病毒活性 许多天然寡糖提取物具有重要的药理活性。研究者根据它们的作用机理和构 效关系进行合理的结构改造修饰，可以得到一些有更好药理活性，更低毒副作用， 更适于作为药物使用的化合物。k a l l a m ek a t s u r a y a 等合成的磺酸化的寡糖有很好 的抗h i v 活性 4 】。 z i r a c i n 也是一种寡糖类药物，它是由2 个原酸酯，1 个硝基糖，1 个亚甲基 二氧基团和芳香酯残基构成的化合物。它不但对抵抗革兰氏阳性菌有很高的活 6 第二章糖苷酶的研究进展 性，而且对耐甲氧谣林的葡萄球菌，耐万古霉素的肠球菌也有很高的抑制活性 【5 】- 1 2 糖苷化合物的获取 1 2 ，1 现今获取糖苷化合物的方式 现今获取糖苷化合物的方式主要有三种，即直接从生物体中提取，化学合成 和酶法合成。由于目标化合物一般在生物体中含量较低，所以直接从生物体中提 取的做法不够经济，而化学合成法的过程要经历繁琐的保护和去保护过程。酶法 合成以其温和的反应条件，反应的特异性逐步得到关注。 1 2 2 酶法合成糖苷化合物的方式 在酶法合成糖苷的过程中，主要用到两种酶：糖基转移酶和糖苷酶。糖基转 移酶催化的合成反应通常需要活化的中间体作为糖基供体，特异性地催化糖基从 活性中间体转移到目标产物分子上，具有高度的选择性和催化效率，但这类酶分 离困难，来源有限，而且需要极其昂贵的核苷磷酸糖作为辅助底物。因此只有当 完善了核苷磷酸糖的再生系统，在反应器中大规模生产糖苷化合物才具有可行 性。另外糖基转移酶的高度专一性也使得它在合成应用中缺乏足够的灵活性。相 对地，糖苷酶催化的合成反应途径简单，不需要其他辅助因子；糖苷酶来源广泛， 比较稳定，能接受不同结构的底物，可直接以非保护的糖作为底物，因此广泛用 于酶促糖苷化反应。 2 糖苷酶概述 糖苷酶一般指糖苷水解酶( g l y c o s i d eh y d r o l a s e s ) ，是类水解糖苷键的酶，在 糖和糖缀合物的水解与合成过程以及其他相关生命活动中起着重要作用。目前已 知的糖苷水解酶约2 5 0 0 种。 2 1 糖苷酶分类方式 比较传统的命名方式是国际酶学委员会的命名方式，是根据底物特异性和分 子作用机理将糖苷酶分为3 类：o 糖苷水解酶，s 糖苷水解酶及n 糖苷水解酶。 1 9 9 1 年h e n r i s s a t 基于酶的结构特征的考虑，又提出了另一种分类法 6 】。按 氨基酸序列的同源性分为8 2 个家族( 这个数字随新酶的发现不断增多) ，同时每 个家族中根据更细微的结构和机理关系分为亚族或超家族，即将家族中折叠方式 和催化机理相一致的归为一组。同一家族当中有时包含有不同的底物特异性的糖 7 第二章糖苷酶的研究进展 苷酶；另一方面，具有同一底物特异性的糖苷酶可能分在不同家族，如g h 2 5 ， g h 2 6 ，g h 2 1 2 ，g h 2 1 6 家族中都有纤维素酶。 2 2 糖苷酶的水解机理 2 2 1 一般催化水解机理 通常糖苷键的断裂需要两个关键的残基参与广义酸( 碱) 催化反应。其催化作 用是通过糖苷化合物的异头碳形成正碳离子中间体( i n t e r m e d i a t e ) ，然后离去完成 反应。根据水解过程异头碳的构象是否发生改变可将糖苷酶分为保持型和翻转型 两种。 保持型糖苷酶活性中心有两个羧基，一般来自于谷氨酸或天冬氨酸，在催化 机制中起着重要作用。一对羧基大约相隔0 5 5 n m ，分别作为广义酸碱( g e n e r a l a r i d - b a s e ) 和亲核体( n u c l e o p h i l e ) ，通过双置换机制完成水解催化作用。比如g h - 2 6 家族的p 甘露糖苷酶的活性位点由两个谷氨酸( g l u ) 残基组成。其中一个g l u 提 供质子给底物，利于底物c o 键断裂，同时酶与底物共价结合形成酶一底物正 碳离子中间体；另一个非质子化的g l u 羧基可稳定正碳离子，紧接着第一个g l u 羧基辅助亲核基团如水分子，乙醇或单糖从离去基团离去的位置进攻正碳离子， 羧基还原为羧酸，从而保持异头碳中心原有的构象 7 】。保持型的a 糖苷酶的催 化机理与p 一糖苷酶相似，只是由于它们立体结构的差异，形成中间体为p 型构象， 而且活性位点羧酸基团的位置相反【8 】。 翻转型糖苷酶活性中心的两个羧基残基之间的平均距离大约为1 0 - 士0 2 r i m ， 可允许底物和水分子同时与酶结合，形成正碳离子型过渡态( t r a n s i t i o ns t a t e ， t s d ，。因而只需一步置换即可裂解糖苷键完成水解反应。大多数翻转型糖苷酶 的活性中心非常相似。 8 第二章糖苷酶的研究进展 h o a o 一 迎稍1 一 芏 一 凹h o r -一 o h 。 i 图1 保持型糖苷酶( 曩) 和翻转型糖苷酶( b ) 的水解催化机理【9 】 2 2 2 糖苷酶活性位点的结构特征 不同水解特性的糖苷酶活性中心的空间结构不同。 外切型糖苷酶的活性位点为1 ：3 袋型或洞穴型，这种形状适于识别寡糖的末 端。大多数单糖外切酶的活性位点结构具有这种形状。代表酶类有半乳糖苷酶， 葡萄糖苷酶等。还有一些多糖外切酶的活性位点也具有这种结构特征，象葡糖淀 粉酶和p 淀粉酶，这些外切多聚糖苷酶底物的特点是具有很多非还原链末端。 内切型糖苷酶的活性位点为裂缝或凹槽型，这种开放的结构能够结合多聚体 底物的几个糖单元，代表的酶类有溶菌酶、几丁质酶、木聚糖酶等。 还有一种特殊的“隧道型刀活性位点。具有这种酶活性中心构造的酶目前只 发现有外切葡萄糖苷酶一种。这种结构是从裂缝型或凹槽型活性位点进化而来 的，酶的裂缝处只被部分覆盖而形成了环型通道，保证多聚体糖链能够从此处通 过，这种环形结构使酶活性中心位于隧道内侧，保证酶在释放产物后仍牢固结合 于多糖链上，从而使酶的催化反应得以继续进行。这种酶反应的可继续性是保证 外切葡萄糖苷酶能有效降解不可溶的微晶体纤维素的关键因素【1 0 】。 第二章糖苷酶的研究进展 2 2 3 糖苷酶作用机理的研究方法 目前研究糖苷酶作用机理的方法主要是x 射线晶体衍射法和定点突变技术。 x 射线晶体衍射技术可使酶底物中间体的结构得以确定。定点突变技术不但可 以确定与酶活性密切相关的氨基酸残基，而且对于揭示酶作用机理，改变酶作用 机制和底物特异性及酶的定向优化有重要作用。 ， 目前随着对糖苷酶作用机理的深入认识，糖苷酶的应用价值愈加显现出来。 筛选高催化活性，能识别不同底物或抑制剂的糖苷酶，改造和扩大其催化应用范 围，为生产有治疗意义的抑制剂及设计有用的合成工具开辟了道路。 2 3 糖苷酶催化的糖苷合成反应模式 糖苷酶用于糖苷合成有两种模式。第一种逆水解反应。于1 9 1 3 年首次报道 的单糖与醇的缩合反应就是逆水解反应，其中水是离去基团，又被称为“直接糖 基化 。第二种是转糖基反应，离去基团通常是( 单) 糖基，而且反应受动力学控 制。 2 3 1 逆水解【1 1 】 逆水解反应受热力学控制，最终产率受平衡限制，由于反应的平衡常数偏向 于水解方向，因此必须通过热力学的方法促使反应向合成方向进行。通过加入高 浓度的单糖和亲核部分( 醇) ，可使反应向合成方向进行。同样，水活度也会对反 应产率和反应速度产生影响，挑选一个合适的水活度，才可将糖苷酶的合成效率 发挥到最大。由于反应受平衡限制，因此可通过选择性地吸附产物，推动反应向 合成方向进行，从而提高总产率。 2 3 2 转糖基反应 利用已形成的糖苷，在糖苷酶的催化作用下与亲核试剂作用生成另一种糖苷 产物，这种方法被称为“转糖基反应 。此时与酶糖苷中间体作用的亲核试剂是 醇，而不再是水；而一般利用的糖基供体，其糖基配体部分也具有适合转糖基反 应的特性( 亲核性较弱) 。良好的糖基供体包括：糖基氟化物、糖基叠氮化物、芳 香基糖苷、乙烯基糖苷和烷基糖苷【1 2 】。 2 4 糖苷酶的改造 糖苷酶催化的糖类合成具有严格的立体选择性和一定的区域选择性，反应途 径简单，底物价格便宜，且酶较易获得，性质稳定，因而在大规模合成糖类方面 1 0 第二章糖苷酶的研究进展 优于其他方式。但糖苷酶所催化的反应处于水解与合成的动态平衡状态，合成产 物也可以作为底物被酶重新水解，产量一般较低，通过优化反应条件，也只能在 一定程度上促使反应平衡向糖苷键合成的方向进行，不能改变酶催化可逆反应的 本质，产物产量只能在一定范围内提高。另一方面，糖苷酶并不具有严格的区域 选择性，导致产物中存在异构体，分离有一定难度。近年来，科学家采用各种分 子生物学手段对糖苷酶进行改造，优化糖苷酶的区域选择性，改善糖苷酶的酶学 性质。 2 4 1 催化位点的突变 糖苷酶催化位点氨基酸的突变产生了三类酶： 2 4 1 1 糖苷合成酶 1 9 9 8 年，加拿大的w i t h e r s 研究室第一次报道了糖苷合成酶。他们通过点 突变，把土壤杆菌( a g r o b a c t e r i u ms p ) 的p 葡萄糖苷酶( e c 3 2 1 2 1 ) 催化中心 第3 5 8 位谷氨酸用丙氨酸取代，造成亲核体羧基变成非亲核体甲基，改变了糖苷 酶的作用机制，使其失去了寡糖水解活性，但当加入氟代糖时，能以多种硝基苯 单糖苷和双糖苷作为糖基受体进行转糖基反应，合成二糖和三糖。w i t h e r s 首次 把这种亲核体氨基酸突变糖苷酶称为糖苷合成酶【1 3 】。 目前，国际上已经报道的糖苷合成酶共有1 3 种，分别为p 葡糖苷合成酶、p 甘露糖苷合成酶、p 半乳糖苷合成酶、p 葡聚糖苷合成酶、仅葡糖苷合成酶等。 它们来源于1 2 种不同的微生物( 细菌、真菌和古细菌) 及植物，由7 种不同糖 苷酶家族( g h l 、g h 2 、g h 7 、g h l 6 、g h l 7 、g h 2 6 和g h 3 1 ) 的酶改造获得 1 4 。目前获得的糖苷合成酶一般都遵循翻转型糖苷酶的作用机制。 2 4 1 2 硫代糖苷酶 2 0 0 3 年，j a h n 等【1 5 】发现a g r o b a c t e r i u ms p 的p 一葡糖苷酶一种突变酶能有效 合成硫代糖苷，其催化中心酸碱功能氨基酸被突变成了丙氨酸。这类酶因缺少酸 碱功能氨基酸，使酶失去了碱激活作用，需要亲核性更强的巯基糖作为糖基受体， 受体分子中巯基的位置决定反应的区域选择性。硫代糖苷酶是制备硫代糖苷的有 力工具。 2 4 1 3 硫代糖苷合成酶 最近，w i t h e r s 研究室将糖苷合成酶和硫代糖苷酶的突变方式相结合，发 第二章糖苷酶的研究进展 展了双突变酶硫代糖苷合成酶。他们将a g r o b a c t e r i u ms p 的p 葡糖苷酶催化 中心酸碱功能氨基酸和亲核体氨基酸同时突变去除，形成双突变酶。硫代糖苷合 成酶因缺少亲核体氨基酸，不会像硫代糖苷酶那样缓慢水解糖基供体，而且受体 k m 值很低，因此在应用昂贵又有价值的糖基受体时有突出优势 1 2 1 。 2 4 2 催化位点以外氨基酸位点的突变 糖苷酶的氨基酸组成中，活性中心中结合部位一些氨基酸与糖苷合成活性 有着密切联系。例如，芳香族氨基酸如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸通过非极性叠 加作用稳定酶与寡糖底物的结合，并且通过该底物与水形成的氢键来间接固定水 分子。当这类氨基酸被非芳香族氨基酸取代后，酶结合的寡糖底物的几何学特征 会发生改变，从而影响水分子的定位及稳定性，不利于水解反应，而促进糖苷合 成反应。 2 5 糖苷酶的应用 2 5 1 糖苷酶在天然产物改性中的应用 许多天然生物活性分子是糖苷化合物，在对人类疾病的治疗中具有抗病毒、 抗肿瘤等药理学意义。但令人遗憾的是天然型野生的植物中，一些糖苷化合物往 往因水溶性或脂溶性过大，导致其不是生物活性最佳的分子形式，需要定向改造 它们的糖基部分，以生成高活性的糖苷化合物。 如甘草酸是甘草中一种主要的有效成分，经过g l u c u r o n i d a s e 的作用，水解 p 1 ，2 糖苷键脱去1 个葡萄糖醛酸，产生的产物p d 单葡糖醛酸基甘草次酸是更 加安全有效的成分。 人参中的主要有效成分人参皂甙，可分为齐墩果酸型皂甙，人参二醇型皂甙 和人参三醇型皂甙3 大类。但并非所有的人参皂甙都有很高的生物活性。通过糖 苷酶水解低活性的r 9 3 1 6 、r b l 1 7 ，可以得到高活性的r h 2 和r d 。 2 5 2 糖苷酶在蛋白质糖基化工程中的应用 通过基因工程手段可以改变细胞内糖基化途径中糖苷酶和糖基转移酶的表 达，即可改变在该系统中表达的糖蛋白的糖基化形式。通过糖基化工程可以增加 重组蛋白药物的半衰期，提高重组蛋白药物的靶向性，提高抗体分子的效应功能， 提高蛋白质分子对于蛋白酶的抗性等 9 】。 2 5 3 糖苷酶在糖苷合成中的应用 1 2 第二章糖苷酶的研究进展 糖苷作为一类很有价值的化合物，目前它的获得仍然主要依靠天然物提取， 如果能应用酶法生产高附加值的糖苷化合物，必将极大地丰富这一类化合物的供 应。来自a s e r g i l l u so r y z e a e 的甘露糖苷酶可以合成很难连接的甘露糖苷键 1 8 1 。 c 小组，以杏仁b 葡萄糖苷酶为催化剂，在叔丁醇、乙腈等体系和无溶剂体系 中合成了烷基葡萄糖苷i 烯丙基葡萄糖苷、苄基葡萄糖苷和烯丙基半乳糖苷 【1 9 】【2 0 】【2 1 】。随着生物学技术在糖苷酶领域的进一步应用，糖苷酶的作用将继续 延伸，极大地丰富合成的糖类和药物的种类，推动糖生物学和制药业的迅速发展。 第二章糖苷酶的研究进展 参考文献 1 】杜昱光，白雪芳，虞星炬等寡聚糖类物质生理活性的研究阴中国生化药物杂志， 1 9 9 7 ，1 8 ( 5 ) ：2 6 8 - 2 7 1 【2 】刘福君，赵修南，汤建芳等地黄低聚糖对快速老化模型小鼠造血功能的影响们 中国药理学通报，1 9 9 7 ，1 3 ( 6 ) ：5 0 9 5 1 2 【3 】张军，李宗友译甘草根中的果胶多糖类叨国外医学，中医中药分册，1 9 9 7 ，1 9 ( 4 ) ： 5 0 5 0 4 弛a m m ek a t s u r a y a , h i d e k in a k a s h i m a , n a o k iy a m a m o t oe ta 1 s y n t h e s i so fs u l f a t e d o l i g o s a e c h a r i d eg l y c o s i d e sh a v i n gh i g l aa n t i h i va c t i v i t ya n dt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e n a c t i v i t ya n dc h e m i c a ls t r u c t u r e 叨c a r b o h y d rr e s ，1 9 9 9 ，3 1 5 ( 3 - 4 ) ：2 3 4 2 4 2 【5 g a n g u l ya k z i r a c i nan o v e lo l i g o s a c c h a r i d ea n t i b i o i c j j a n t i b i o t ，2 0 0 0 ，5 3 ( 1 0 ) ： 10 3 8 1 0 4 4 【6 h e n r i s s a tb ac l a s s i f i c a t i o no fg l y c o s y l h y d r o l a s e sb a s e do n a m i n oa c i ds e q u e n c e s i m i l a r i t i e s 阴b i o c h e mz 1 9 9 1 ，2 8 0 ( p t 2 ) ：3 0 9 ， 【7 m ec a r t e rjd ，w i t h e r ssg m e c h a n i s m so fe n z y m a t i cg l y c o s i d eh y d r o l y s i s j c u r t 印切s t r u c tb i o 厶19 9 4 ，4 ( 6 ) ：8 8 5 【8 z e c h e ld ，w i t h e r ss g l y c o s i d a s e m e c h a n i s m s ：a n a t o m yo faf i n e l yt u n e dc a t a l y s t 阴a c cc h e mr e s , 2 0 0 0 ，3 3 ( 1 ) ：1 1 9 】冯世江，李春，曹竹安糖苷酶及其在糖基化合物改性中的研究叨生物加工过程， 2 0 0 6 ，4 ( 3 ) ：1 6 2 0 【l o i 髓，杨凌，杨胜利糖苷酶序列分类法和作用机理的研究进展明药物生物技 术，2 0 0 6 ，1 3 ( 1 ) ：6 6 7 0 【l1 v i cg t h o m a sd ，g r o u tdhgs o l v e n te f f e c to ne n z y m e c a t a l y z e ds y n t h e s i so f p d g l u c o s i d c su s i n gt h er e v e r s eh y d r o l y s i sm e t h o d ：a p p l i c a t i o nt ot h ep r e p a r a t i v e s