（食品科学专业论文）海洋微生物的分离、鉴定与保藏.pdf

学位论文独创性声明及使用授权声明 论文独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文 不包含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本论文的研 究做出重要贡献的个人静集体，均已在文中作了明确说明并表示了谢 意。 学位论文作者答名至鸯融一 目期御6 0 1 1 r 学位论文使用授权声明 本人完全了解上海水产大学有关保留、使用学位论文的规定，同 惹学校保留并向有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅。本人授权上海水产大学将本学位论文的内容编入有 关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段和汇编学 位论文。保密的论文在解密后遵守此规定。 本学位论文保密口，在一年解密后适用本授权书。本学位论文 属于不保密口。 ( 请在以上方框内打“ ”) 学位论文作者签名：l 匐盘 日期2 婴：旦：纩 导师签名 盖缁卜日期蝉 上海水产大学硕士学位论文 海洋微生物的分离、鉴定与保藏 摘要 本文比较了国内外常用分离海洋细菌的培养基的分离效果，对上海 奉贤海湾的海洋细菌进行分离，得出2 2 1 6 e 培养基与# 2 培养基较为适宜 分离海洋细菌。通用培养基、葡萄糖培养基、营养琼脂培养基、# 2 培养 基中海洋细菌的生长速度较快。上海奉贤海湾的海泥中细菌总数在 1 0 3 - 1 0 8 g 之间，总菌数变化不受海水温度影响；海水中的细菌总数在 1 0 2 - 1 0 5 m l 之间，总数变化受海水温度影响。 对海洋细菌的培养条件作了研究，研究表明海洋中存在大量的嗜碱 细菌，但培养时间较长，且较难分离出。拌4 、# 5 与 6 培养基中撑5 对嗜碱 细菌的分离效果较好。对于海洋中的芽孢杆菌的分离，可以选择样品预加 热的方法。在培养基的制作方面，用陈海水或人工海水配置的培养基更有 利于海洋细菌的分离。培养基的盐度在3 5 时海洋细菌分离效果最好， 当盐度在7 与1 1 时，高盐度会刺激部分海洋细菌的生长。 分离出的4 9 6 株海洋细菌分别属于：葡萄球菌属( s t a p h y l o c o c c u s ) 、 微球菌属( m i c r o c o c c u s ) 、芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) 、梭状芽孢杆菌属 ( c l o s t r i d i u m ) 、乳杆菌属( l a c t o b a c i l l u s ) 、气单孢杆菌属( a e r o m o n a s ) 、 弧菌属( 1 布b r i o ) 、发光杆菌属( p h o t o b a c t e r i u m ) 、假单孢杆菌属 ( p s e u d o m o n a s ) 、黄杆菌属( f l a v o b a c t e r i u m ) 、肠道杆菌属 ( e n t e r o b a c t e r i a c e a e ) 。海洋环境中，革兰氏阴性杆菌为优势菌群，存在 比例为8 0 9 0 。其中气单孢杆菌属( a e r o m o n a s ) 所占比例最大，其次 为弧菌属( f t b r i o ) 与假单孢杆菌属( p s e u d o m o n a s ) 。 2 上海水产大学硕士学位论文 细菌保藏在4 。c 冰箱中有4 5 株海洋细菌失活，处于休眠状态，不能 复壮培养。 关键词海洋细菌，分离，鉴定，保藏 上海水产大学硕士学位论文 i s o l a t i o n ，i d e n t i f i c a t i o na n dc o n s e r v i n go f m a r i n eb a c t e r i a a b s t r a c t i m ss t u d yi sf c l c u s e do nd i f f e r e n tm e d i aw h i c hw e r eu s e dt oi s o l a t e m a r i n eb a c t e r i ai ns e aa r e ao f f e n g x i a n s h a n g h a i 2 2 1 6 em e d i aa n d 拌2m e d i a a r eg o o da ti s o l a t i o nm a r i n eb a c t e r i a m a r i n eb a c t e r i ag r o wf a s t e ri nt o n g y o n g c u l t u r e ，g l u c o s ec u l t u r e ，n u t r i t i o na g a rc u l t u r ea n d 2m e d i a t h en u m b e ro f t h eb a c t e r i ai ns e am u di sb e t w e e n10 5w i t h10 8 。t h en u m b e ro ft h eb a c t e r i ai n s e aw a t e ri sb e t w e e n1 0 2w i t h1 0 6 t h en u m b e ro ft h eb a c t e r i ai ns e aw a t e ri s c h a n g e dw i t ht h et e m p e r a t u r e t h i sp a p e ri sa l s of o c u s e do nt h ec o n d i t i o no ft h ec u l t u r e t h e r ei sm u c h b a s o p h i li ns e a ，b u ti ti sm u c hd i f f i c u l tt oi s o l a t et h e mf r o ms e aw a t e ra n ds e a m u d i ta l s ot a k e sl o n gt i m et oc u l t u r e a m o n g 拌4 ，# 5 a n d 拌6m e d i a ，# 5 m e d i ai st h eb e s t t oi s o l a t et h eb a c i l l a c e a ef r o ms e aa r e a , h e a t e ds a m p l e b e f o r eh a n di sb e t t e rt oi s o l a t e w h e nm e d i ai sp r e p a r e d ，m a n m a d es e a w a t e ro r o l ds t o c ks e a w a t e ri si m p o r t a n t w h e nt h em e d i a ss a l i n i t yi sb e t w e e n3 w i t h 5 ，m a r i n eb a c t e r i ag r o w sw e l l w h e nt h es a l i n i t yr e a c h e s7 a n d1 1 ，i tc a n s t i m u l a t es o m eo f m a r i n eb a c t e r i a 4 9 6m a r i n eb a c t e r i ai si d e n t i f i c a t e dt os t a p h y l o c o c c u s , m i c r o c o c c u s , b a c i l l u s ，c l o s t r i d i u m ，l a c t o b a c i l l u s , a e r o m o n a s ，v i b r i o ，p h o t o b a c t e r i u m , p s e u d o l r l o h a s , f z n v o b a c t e r i u m , e n t e r o b a c t e r i a c e a e i ns e aa r 4 e at h e r ea r e g r e a tn u m b e ro ft h eg r a m n e g a t i v eb a c t e r i a , t h ep r o p o r t i o ni s8 0 t o9 0 m o s tg r a m n e g a t i v eb a c t e r i ai sa e r o m o n a s , t h en e x tp l a c ei sv i b r i oa n d p s e u d o m o n a s ， 、h e nm a r i n eb a c t e r i ai sc o n s e r v e da t4 s o m eo fm a r i n eb a c t e r i ai si n 4 上海水产大学硕士学位论文 d o r m a n c y t h e ya r ev i a b l e - - b u t - - n o n c u l t u r a b l e k e y w o r d s m a r i n eb a c t e r i a ，i s o l a t i o n ，i d e n t i f i c a t i o n ，c o n s e r v i n g 5 上海水产大学硕士学位论文 第一章绪论 1 1 海洋微生物的多样性 海洋微生物多样性( m a r i n em i c r o b i a lb i o d i v e r s i t y ) 是指所有海洋微生物种类、 种内遗传变异和它们的生存环境的总称。它包含3 个水平，即种的多样性、生态系统 多样性和遗传多样性。 自从2 0 世纪8 0 年代中期海洋技术兴起以来，世界各国对海洋微生物的研究和开 发利用都很重视“。由于海洋环境的特殊性导致海洋微生物在物种和生态功能上的多 样性，许多种类尚缺少适当的培养方法，对其多样性了解较少。现在普遍认为，海洋 环境的微生物能在实验室条件下培养出来的还不到1 。“ 目前，对海洋细菌的研究可分为两个方向：( 1 ) 可培养细菌的研究：( 2 ) 尚不能培养 的细菌的研究，可培养细菌的研究是根据不同研究目的，对环境中的细菌进行分离培 养，研究其形态、结构、生理、生化、遗传、生态、分类鉴定、系统发育等，以及对 具有特殊功能的海洋微生物进行开发利用等。随着分子生物学的飞速发展，为微生物 多样性的研究带来了研究手段的革命。自1 9 8 5 年p a c e 等利用核酸测序来研究微生物 的进化问题以来，对微生物的多样性的研究进入了一个崭新的阶段，使对尚不能培养 的细菌的研究成为当前非常活跃的研究方向，拓展了微生物多样性的研究范围，特别 是对于起步较晚、培养方法研究欠缺的海洋微生物的研究，具有特殊的意义，对开发 海洋微生物中的特殊功能基因莫定了基础。但是，由于海洋微生物的研究起步较晚， 因此，对海水环境中可培养细菌区系的基础研究，仍然是海洋微生物研究中不可缺少 的重要组成部分。 中国对海洋细菌的研究开始于2 0 世纪5 0 年代，5 0 年代后期报道了中国黄海近岸 海水和沉积物中的两个属t h i o b a c i l l u s 和m i c r o c o c c u s ，1 9 6 1 1 9 7 3 年间，对东海进行了 海洋细菌的调查，在2 3 个站位分离了1 3 0 0 多株异养菌，报道了1 1 个属一一s e u d o m o n a s , f b r i o , a e r o m o n a 8 , a l c a l i g e n e s , c a u l o b a c t e r , f l a v o b a c t e r i u m m i c r o c o c c u s b a c i l l u s 、b r e v i b a c t e r i u m - a r t h r o b a c t e r 和c o r y n e b a c t e r i u m o 。1 9 7 5 年，中国细菌学家在编写的第一部海洋调查规范 9 上海水产大学硕士学位论文 “1 中撰写了海洋细菌调查规范部分，再版的海洋调查规范于1 9 9 0 年出版，对其中海洋 细菌调查规范部分进行了修订。 1 2 影响海洋细菌分离的因素。 海洋微生物检测受海水理化成分及海洋特殊环境的影响，检验效果不佳。因此针 对海洋生态环境特点，分离海洋菌，有必要在培养基内加一些化合物，选择适合的培 养基为其提供适宜的繁殖条件，并抑制海洋耐盐自生菌丛生长速度，才能提高检出率。 不良生存环境会使微生物产生应激状态，使微生物失去原有正常生长能力，有部分微 生物待一定时间后能在鉴别培养基恢复生长，而另一些则要求较丰富的营养和无抑制 剂培养基提供其生长。对海水中微生物的监测刘秀梅”1 等报道，改变碱性蛋白胨中氯 化钠含量，将其提高到2 5 将有利于麦氏弧菌的检出。罗文新。1 等也对从海水中分离 的链霉菌属，其抑制活性作了研究。结果表明：用海水( 含3 5 n a c i ) 制各的培养 基，表现出抑菌活性的菌株最多，但减少培养基的营养成分，改变氮源、n a c i 浓度， p h 值和培养基温度，部分菌株可表现新的抑菌活性，或使原有的抑菌活性有很大提高。 新表现或提高的抑菌活性绝大部分都是针对g + 菌和白色假丝酵母菌而言。由此可知， 在检测海水中微生物时，必须提供合适的繁殖条件，针对海水特点选择适宜的培养基， 不仅可增菌，也可抑制其他非治病微生物生长，或在培养基内加入一些化合物，以提 高海洋微生物的检出率，同时改变培养基成分或培养条件，无疑也会影响微生物检出 率及检出种类。 1 3 海洋细菌的生态分布 众所周知，海洋细菌可以分为自养菌和异养菌两大类型。现在报道的海洋微生物 生态分布，多限于需氧菌方面的调查，主要是对异养菌方面的调查研究资料，极少进 行自养菌或厌氧菌的生态分布调查。1 9 9 6 1 9 9 8 年，谢秋宏、薛德林等人对黄、渤海 i 0 上海水产大学硕士学位论文 辽宁沿海8 个地区1 0 2 个定位点的海泥和海水样品进行了采集和研究，结果如表卜1 所示。“” 从表卜1 中可以看出，在海泥中的海洋细菌的平均含量明显高于海水中海洋细菌 的平均含量，海泥中含菌量约是海水中含菌量的1 5 - 5 0 倍。这与海底沉积物中有机 质明显高于海水中的有机质，以及海泥微颗粒的吸附作用等因素有关。表1 1 中直接 镜检法测得的海洋细菌数明显高于平皿培养法测得的海洋细菌，这是由于显微镜直接 镜检法不可避免地将活菌、死菌以及真菌和放线菌的孢子或菌丝断片都计算在内了， 所以直接镜检法得出检样中的细菌数目一般要比平皿培养法大的多，通常大1 0 0 1 0 0 0 倍左右。 表1 1 中国辽宁海洋细菌的数量分布 f i g1 - 1t h en u m b e r o f m a r i n e b a c t e r i a i n l i a o n i n g + ( 个g 海泥) ；+ + ( 个m l 海水) ；a ：直接镜检法；b ：平皿培养法。 1 4 海洋细菌的研究历史、现状及前景 上海水产大学硕士学位论文 细菌作为一类生命实体，由于其中一些能使人致病，在3 0 0 年前就开始被人们所 认识，并开始注意到它在生物圈中无处没有的广泛存在性。1 5 0 年前人们开始用富集 培养法( e n r i c h m e n tc u l t i v a t i o nm e t h o d ) ，第一次分离并描述了一种海洋细菌，即 折叠螺旋体( s p i r o c h a e t ap l i c a t i l i 曲。6 0 年前的“伯杰氏鉴定手册”中记载有8 6 种海洋细菌，它们仅占当时己确认的所有细菌种数的6 4 ( 8 6 1 3 3 5 ) 。4 0 年前， 人们推测凡是陆上发现的细菌所属目，海洋中均有其代表存在，它们分布于至少6 7 个属中。我国虽然海域辽阔，但直至上世纪9 0 年代前期，记录在案的海洋细菌种( 包 括变种、生物型、系) 仅约3 3 个属中的7 9 个种，它们只占中国海记录到的所有物种 总数的0 3 9 ( 7 9 3 0 2 7 8 ) 。其他的微生物尚有1 8 种放线菌、1 3 1 种蓝细菌、6 1 种酵母、 1 2 7 种其他菌物“。如果说中国海洋生物占全球海洋生物1 1 0 的话，那么我国海洋细 菌等微生物迄今的记录显然就太少了。 这些年来，世界陆续发现了一些新的细菌，我国也有新的细菌被发现“2 。“3 。但总 的来讲，尤其是与浩大的未知菌数比仍是很少的，其原因是：( 1 ) 海洋，尤其是远洋、 深海及极端环境，对大多数人来讲是难以到达的，更要有先进的设备和合适方法。( 2 ) 局限于历代海洋细菌学的发展状况，即基本上没有脱离过富集培养法的研究程序，人 们主要借助非常有限的特定培养基在设定的条件下培养出一定类型的细菌菌落、显微 镜鉴别形态、生理生化性状测定等方法确认分类特征，得出另一结论是迄今世界充其 量能培养出的海洋微生物不多于1 0 。虽然这无疑是以往海洋细菌学坚实发展的关 键，但人们为其制备的培养条件、培养基类型比起浩瀚海洋、复杂生态和缤纷类别等 状况，这些手段毕竟是非常有限的，即使是单一的高压或热泉环境，一般实验室也都 难以创造，更何况许多因子结合成的复杂多样生境。因而难以去界定庞杂类别，包括 一些处于非可培养状态中的原核生物，而迄今这些非可培养状态的种类占自然环境中 的绝大多数”“。 从9 0 年代开始以来，分子生物学方法的应用，即基于遍及所有细菌的d n a 序列 方法，得以有效而又准确的鉴定自然样品中细菌的基因类型。基因序列在漫长的进化 岁月中发生着缓慢的变化，可将其分出高度保守区和相对的可变区，后者的序列往往 1 2 上海水产大学硕士学位论文 专一( 特化) 而成为各个细菌类型差别的指示器。凭借分子探针，识别可变区中合适的 信号部位，结合其他工具，直接鉴定从简单到复杂的自然或人为环境中的各类型细菌， 同样也是研究细菌的多样性及各种生态学问题最有效的方法。分子生物学的方法在海 洋细菌多样性探索中己有并将仍有广阔的用武之地，如b e j a o ”等在r n a 的反转录作用 后用p c r 特定的分子技术，鉴定未知菌活跃的光合作用活动，从海洋中发现了以往从 未认识的光合作用基因簇，发现了以往实验室从未培养出来的1 1 类新菌种，即好气、 厌氧光合生物( a e r o b i oa n o x y g e n i c p h o t o t r p h s ，缩写为a a n p 或a a p ) 。这类菌估计 占大洋表面光合电子转运的5 。总微生物群系的1 1 ( b e j ae ta l ，2 0 0 2 ) 。分子技术 的应用和发展将大大丰富海洋细菌的多样性，并改变以往人们对海洋生态系的传统观 念和估计。 在刚刚开始的新世纪中，海洋细菌学家在分子生物学家的通力协作中将有关方法 和技术的研究转变成应用的研究，透过进一步打开的海洋细菌世界新窗口，能不断扩 展新视野，提高认知和开发海洋细菌的效率。中国加入w t o ，无疑为中国学者展开了 与国际接轨千载难逢的大好时机，缩短这一领域与世界先进水平不大的差距，可能提 升中国海洋微生物学的基础和应用研究水平。 1 5 细菌分类和鉴定 目前依据细菌分类鉴定中运用的技术可分为四个水平： 1 5 1 细胞的形态和习性水平“” 这是经典的研究方法，主要内容如下。 15 1 1 细胞形态特征的观察” 包括个体形态和群体形态的观察。个体形态指菌体大小、菌落形态、排列、鞭毛、 革兰氏染色反应、芽孢和荚膜等。群体形态指在一定培养基上的培养特征，如菌落大 小、形态、颜色及在半固体或液体培养基上的生长情况等。 1 5 1 2 生理生化特征o ” 指生长所需要的营养要求，如碳源、氮源和能源的利用能力；生长因子的需求等； 1 3 上海水产大学硕士学位论文 产生酶的种类和反应特性；代谢产物的种类和数量等。 1 5 1 3 生态学特性1 包括对氧的需求，生长温度，适宜的p h 值，寄生、共生关系和致病性等。 1 5 1 4 血清学反应 在微生物分类鉴定中，有时可以用血清反映来进行未知菌的鉴定和抗原组成的分 析，例如用已知的抗体来检测抗原。 1 5 1 5 噬菌反应 噬菌体侵染细菌有专一性，它不仅对某一种细菌的寄生有专一性，就是同种细菌 的不同类型也有特异性。因此，噬菌体不仅可用于细菌种的鉴定，而且可以进一步用 于分型。 1 5 2 细胞组分水平 包括细胞组成成分，如细胞壁成分、脂类、醌类、光合色素和氨基酸库的分析 等，通常需要用到红外光谱、气相色谱和质谱分析等技术。 1 5 3 蛋白质水平 包括氨基酸序列分析、蛋白质凝胶电泳和血清学反应等技术。 1 5 4 基因水平。”1 1 包括核酸分子杂交( d n a d n a 杂交或d n a r n a 杂交) ，( g + c ) 值的测定，1 6 s r r n a 寡核苷酸组分分析，以及d n a 或r n a 的核苷酸序列分析等。 2 本文研究目的 本文从多个国内外科研工作者用来分离海洋细菌培养基中选出的分离效果最 好的培养基，选出分离效果较好的培养基，并对培养基的各种成分与条件作了改变， 从中得到分离海洋细菌的最适条件。在分离的同时，对分离得到的海洋细菌作了一系 列的菌种鉴定，研究海洋细菌区系，为开发海洋微生物资源及生态环境保护提供可 靠的数据。 1 4 上海水产大学硕士学位论文 第二章海洋细菌菌群比较 浩瀚的海洋是地球上生命的摇篮，目前的研究表明。1 ，海洋微生物不仅在海 洋生态环境和物质循环中具有及其重要的作用，也是各种新型生物活性物质的潜在来 源。“。海洋微生物的开发，极其关键的一步就是将特定环境里的资源菌株分离出来。 分离海洋细菌的方法很多，但所用的方法都有其优缺点或一定的局限性。稀释 平板法是分离纯化海洋细菌活的纯培养物及计算样品中活菌数量最常用的一种方法。 这一方法简便，而且可以从样品中同时得到较多种、属的海洋微生物，因此，被国内 外海洋微生物分离纯化时所通用。 前苏联的细菌学家设计的z o b e l l2 2 1 6 e 培养基，是培养海洋好气性异养细菌 较好的培养基，用它所培养出来的菌落和细菌种类较多。”1 本文选取各种培养基对海洋细菌进行分离，这些培养基曾经被人用来分离培养 海洋细菌。在对各种培养基分离效果进行比较的同时，对培养基作了多种改变，从而 总结出分离海洋细菌的最佳条件。 2 1 试验材料与方法 21 1 样品采集 奉贤海湾地处东经1 2 1 、北纬3 0 度，见图2 一l 。在上海市南部郊区奉贤区的最 南端，距奉贤中心新城7 公里。海湾东临上海深水港城，距深水港城3 0 公里，西接 上海化学工业区，南部面临东海( 杭州湾) ，杭州湾面积1 0 0 0 平方公里，区内海岸线 长1 3 ，7 公里，与浙江省临海相望，海滩主要由长江和钱塘江带来的泥沙经波浪与潮 汐的动力推移成淤泥质海岸，土壤属粉沙质，质地较细，含养丰富，见图2 2 ，海泥 的含盐量约l 一3 ，海水含盐约3 ，主要为氯化物。 上海水产大学硕士学位论文 12 试验仪器 图2 - 1 上海卫星地图 f i g2 - 1 t h es a t e l l i t i cm a po fs h a n g h a i 图2 - 2 上海奉贤海湾 f i g2 - 2t h eb a yo ff e n g x i a ni ns h a n g h a i 上海水产大学硕士学位论文 y x 2 8 0 a 电热手提高压消毒器 电热恒温水浴锅 m p 2 0 0 b 型电子天平 p h s 一2 5 型p h 计 超净工作台 温度计 2 1 3 培养基 ( 1 ) 通用培养基：葡萄糖l o g ，蛋白胨 海水6 0 0 m l ，琼脂1 5 2 0 9 ，p h 值7 5 。 ( 2 ) 葡萄糖培养基：葡萄糖l o g ，酵母膏 p h 值7 2 。 2 9 ，酵母膏1 9 ，蒸馏水4 0 0 m l ，人工 l o g ，人工海水1 0 0 0 m l ，琼脂1 5 2 0 9 ， ( 3 ) 2 2 1 6 e 培养基：蛋白胨5 9 ，磷酸铁0 1 9 ，酵母膏l g ，琼脂1 5 2 0 9 ，人 工海水1 0 0 0 m l ，p h 值7 6 - 7 8 。 ( 4 ) # 1 培养基：蛋白胨l o g ，n a c l5 9 ，n a 2 h p 0 48 9 ，k 2 h p o 。2 9 ，琼脂1 5 2 0 9 ， 人工海水1 0 0 0 m l ，p h 值7 卜7 3 。 ( 5 ) # 2 培养基：牛肉膏4 9 ，酵母膏1 9 ，蛋白胨4 9 ，葡萄糖l o g ，n a c l2 5 9 ， 琼脂1 5 2 0 9 ，人工海水1 0 0 0 m l ，p h 值7 0 。 ( 6 ) # 3 培养基：可溶性淀粉4 0 9 ，酵母膏5 9 ，琼脂1 5 - 2 0 9 ，人工海水1 0 0 0 m ， p h 值6 5 7 0 。” ( 7 ) 合成营养琼脂培养基：p h 值7 2 。 ( 8 ) 人工海水的组成：n a c l2 4 4 7 7 9m g c l ：6 h 2 0 4 9 8 1 0 9 n a 2 s 0 4 3 9 1 7 0 9 c a c l 2 h 2 0 1 1 0 2 0 9 k c l 0 6 6 4 0 9 n a h c 0 3 0 1 9 2 0 9 k b r 0 0 9 6 0 9 h 。b 0 3 0 0 2 6 0 9 1 7 上海水产大学硕士学位论文 s r c l z 0 0 2 4 0 9 n a f 0 0 0 3 9 9 蒸馏水1 0 0 0 m 为了避免沉淀的产生，人工海水的各成分需要分别溶解，然后再混合，p h 为7 5 。 用l m o l l 氢氧化钠或l m o l l 盐酸来调节。 2 1 4 样品处理 将采集到的海水l m t 与海泥l g 分别用无菌水逐级稀释为1 0 ，1 0 4 ，1 0 一，等不 同梯度，每个稀释度再进行下一步稀释前，要涡旋震荡3 5 分钟。取海水1 0 4 稀释度 与海泥l o 。各0 2 m 1 分别加入以上各培养基的固体平板上，用涂布棒涂布均匀，放 2 8 c 培养箱倒置培养。每个处理设3 个平行试验。随后的l 至7 天，观察并挑取不同 类型的单菌落进一步划线分离，待确定为纯的单一菌落时，编号并转至相应培养基斜 面上，保存于4 。c 下，待下一步的生理生化试验。同时，称此海泥样品1 9 ，于称量瓶 ( 记录准确重量) ，在6 5 烘箱中烘干，置于干燥器中，待冷却后称重，按公式( 1 ) 、 ( 2 ) 计算海泥含水量的百分数。 湿海泥重一干海泥重 海泥含水量= 磊磊磊；_ 1 0 0 ( 1 ) 湿海泥重 u 菌落平均数x 稀释倍数 每克千海泥中的菌数= 耳羁磊高广￥1 0 0 ( 2 ) 215 细菌培养、菌落计数及保藏 培养温度为2 8 c 。 在各种培养基平板上培养3 5 天后。“，选择3 个连续的、平板上菌落数量合适的 平板计数( 即培养后，每个平板上的菌落数应介于3 0 3 0 0 之间) 。采用随机挑取菌落 法，每个培养基挑取1 0 个菌落，平板划线分离法转移到新鲜的2 2 1 6 e 平板上，进行 1 8 上海水产大学硕士学位论文 分离、纯化。 纯化后的菌株保存于相对应的斜面上，49 c 保存备用。 2 2 结果与分析 221 不同季节细菌数量的比较 221 1 奉贤海湾的气候与环境的变化 从上海水产大学到奉贤海湾单程约3 5 小时，上海周边海区当中奉贤海湾距离上 海水产大学最近。海洋细菌的分离，要求当海水与海泥被采集回来之后的4 小时内分 离完毕，所以选择奉贤海区作为采样对象。 一年中进行了6 次采样，一年当中采样时的气温的变化在一1 一3 2 之间，海水 温度变化在5 1 一2 5 7 c 之间。其中第四次采样的气温最高。海水温度也达到最高值。 海水的p h 值在7 1 0 一7 4 5 之间，p h 的变化与季节无关。 表2 1 采样环境的条件因素 t a b2 - lt h ec o n d i t i o no ff e n gx i a n 1 9 上海水产大学硕士学位论文 2212 季节与海水海泥中的细菌数 22121 海水 如图2 - 3 、2 - 4 海水的细菌数量表现出随温度升高而上升，随温度下降而下降的 趋势。海水的细菌数量在1 0 2 1 0 5 之间，细菌数量随水温变化而变化，第四次采样的 温度最高，海水中的细菌数量也最大。其中2 2 1 6 e 培养基与# 2 培养基的细菌数量最多。 l23456 批次 一2 2 1 6 e + 营养琼脂 + 通用 t 葡萄糖 图2 - 3 海水中的细菌数量图( 1 ) f i 醴- 3t h eb a c t e r i a ln u m b e ri ns e a w a t e r ( 1 ) l23456 批次 图2 4 海水中的细菌数量图( 2 ) f i 醇_ 4t h eb a c t e r i a ln u m b e ri ns e a w a t e r ( 2 ) - 一# 1 一# 2 ， # 3 6 5 4 3 2 c 凹_ 8 7 6 5 4 3 2 e 等 上海水产大学硕士学位论文 2 2 1 2 ，2 海泥 海泥中的细菌数量在1 0 3 1 0 8 之间，温度的影响不明显，见图2 5 、2 6 。因为海 泥的温度相对与海水来说比较稳定，所以细菌数量没有随温度变化而变化。 12345 6 批次 图2 - 5 海泥中的细菌数量图( 1 ) f i g2 - 5 t h eb a c t e r i a ln u m b e ri ns e d i m e n t ( 1 ) 2 2 2 海洋细菌的分离 l23456 批次 一2 2 1 6 e + 营养琼脂 + 通用 + 葡萄糖 一# 1 _ # 2 - # 3 图2 - 6 海泥中的细菌数量图( 2 ) f i g2 - 6 t h eb a c t e r i a ln u m b e ri ns e d i m e n t ( 2 ) 2 1 o 9 8 7 6 5 上海水产大学硕士学位论文 实验采用了2 2 1 6 e 培养基、营养琼脂培养基、通用培养基、葡萄糖培养基、# 1 培养基、# 2 培养基、# 3 培养基作为常规培养基对采集回来的海水与海泥中的细菌进 行分离培养。一年中共采样6 次，每次各培养基的分离效果雷同。以2 0 0 5 年3 月2 3 日采样的分离结果为例进行比较。 2 22 1 各培养基中细菌生长速度的比较 样品涂布完毕之后，平板倒放在2 8 c 的培养箱中培养，待培养2 4 h 、4 8 h 与7 2 h 之后取出观察菌落形态并计数。 观察试验结果发现海泥中的海洋细菌在培养2 4 h 后，在上述7 种培养基中没有 发现有菌落生长。4 8 h 之后，在2 2 1 6 e 培养基、通用培养基、葡萄糖培养基、营养琼 脂培养基与# 2 培养基上有少量菌落生长，见图2 7 。其中通用培养基、葡萄糖培养基、 营养琼脂培养基与# 2 培养基中的菌落数较多。菌落形态大多以乳白色、透明与黄色 为主，菌落表面光滑、湿润、边缘整齐、圆形。7 2 h 之后，各培养基的菌落形态数与 菌落数都有明显的增长，2 2 1 6 e 培养基与# 2 培养基的菌落形态数与菌落总数较多，细 菌生长速度最快。 海水中的海洋细菌相较于海泥中的细菌生长速度较慢，见图2 8 通常在7 2 h 之 后才有菌落成长，且菌落的形态较为单一，大多以乳白色与透明为主。菌落数量较少。 2 2 上海水产大学硕士学位论文 图2 7 海泥中海洋细菌在各培养基中培养4 8 h r f i g2 - 7m a r i n eb a c t e r i ap l a n t e df o r4 8 h ri nd i f f e r e n tc u l t u r e 图2 - 8 海泥中海洋细菌在各培养基中培养7 2 h r f i g2 - 8m a r i n eb a c t e r i ap l a n t e df o r7 2 h ri nd i f f e r e n tc u l t u r e 上海水产大学硕士学位论文 22 22 海洋细菌群数量比较 海洋细菌在采集分离完毕之后，放入2 86 c 培养箱中培养5 d ，取出观察培养结 果。菌落形态如表2 2 中所示。2 2 1 6 e 培养基、营养琼脂培养基、通用培养基与葡萄 糖培养基的对海泥的分离能力相近，其中2 2 1 6 e 培养基对海水的分离效果明显好于其 余6 种培养基，如图2 1 0 所示。所以分离海洋细菌时，2 2 1 6 e 培养基应当作为主要分 离基质。菌落形态见图2 - 9 。 上海水产大学硕士学位论文 图2 - 9 海洋细菌在各培养基平板上的生长情况 f i g2 - 9t h em a r i n eb a c t e r i ai nd i f f e r e n tc u l t u r e 表2 - 2 各培养基中的菌落生长情况 t a b2 2t h ec o n d i t i o no fb a c t e r i ai nd i f f e r e n tm e d i a s 上海水产大学硕士学位论文 “+ ”表示有菌落生长；“w ”表示海水；“s ”表示海泥 上海水产大学硕士学位论文 2 3 结论 图2 1 0 各培养基中菌落种类数量 f i g2 - 1 0t h ek i n do f b a c t e r i ai nd i f f e r e n tm e d i a s ( 1 ) 奉贤海湾的海洋细菌总数随着季节的变化而变化，当温度升高时，海洋细菌的 总数也随之增加。 ( 2 ) 海泥中的细菌总数约为海水中细菌总数的1 5 5 0 倍之间。海水中的细菌生长 速度较慢，菌落种类不如海泥中的菌落种类多。 ( 3 )比较2 2 1 6 e 培养基、营养琼脂培养基、通用培养基、葡萄糖培养基、# 1 培养基、 # 2 培养基、# 3 培养基对海洋细菌的分离能力，2 2 1 6 e 与# 2 培养基分离出来的 细菌总数与菌落种类最多。通用培养基、葡萄糖培养基、营养琼脂培养基与# 2 培养基中海洋细菌的生长速度较快。2 2 1 6 e 与# 2 培养基作为分离海洋细菌有明 显的优势。 上海水产大学硕士学位论文 第三章培养条件对分离海洋细菌的影响 由于海洋环境有别于陆生环境，分离条件直接影响到海洋细菌的繁殖，所以有必 要研究海洋细菌的分离条件。 3 1 对嗜碱海洋细菌的分离 3 11 培养基的制备 # 4 培养基：# l 培养基1 0 0 m + l gn a 。c o 。分开灭菌乜田 # 5 培养基：# 2 培养基l o o m l + l gn a 。c o 。分开灭菌。” # 6 培养基：# 3 培养基l o o m l + l gn a ：c o 。 分开灭菌 在制备嗜碱细菌培养基时，通常会出现在培养基凝固后有结晶体，形似雪花。或 有絮状沉积物，但在分离培养时不影响试验结果。 3 1 2 嗜碱细菌的生长情况 # 4 、# 5 、# 6 培养基中分别加入了n a ：c o 。，大多数种类的细菌不能在上面生长， 且这3 种培养基的对海洋嗜碱细菌的分离培养时间都较长，通常在涂布完毕之后的4 d 才有少数菌落生长，培养1 4 d 后可以观察试验结果。3 种培养基的分离情况如表3 - 1 、 图3 一l 所示，海泥中的嗜碱细菌要多于海水中的嗜碱细菌。且海水中的嗜碱细菌很难 分离培养。# 5 培养基对嗜碱细菌的分离效果明显要好于其余2 种培养基。 上海水产大学硕士学位论文 “+ ”表示有菌落生长 图3 - 1 嗜碱细菌的菌落形态 f i g3 - 1 t h ef o r m o fb a s o p h i l 上海水产大学硕士学位论文 3 2 热处理对分离海洋芽孢杆菌的影响 对采集的海水与海泥进行梯度稀释后，在8 0 。c 的恒温水浴中持续加热2 0 分钟， 然后在2 2 1 6 e 培养基、葡萄糖培养基、营养琼脂培养基、通用培养基与# 2 培养基的平 板上进行涂布。在2 8 。c 的培养箱中培养，5 d 后观察实验结果。 芽孢杆菌相对于其它的细菌具有耐热性，所以对采集的海水与海泥进行加热，有 利于筛选海洋环境中的芽孢杆菌，从表3 2 中可以看出，海泥中存在的芽孢杆菌要远 多于海水中的芽孢杆菌。经过对样品加热后培养出的菌落数比常规法单一，如图3 2 。 但是分离出来的芽孢杆菌占绝大多数，说明加热对杀灭海洋中的芽孢细菌没有太大的 作用，可以用加热的方法来分离芽孢杆菌。 表3 - 2 芽孢杆菌的分离 t a b3 - 2t h ei n f e c t i o no fh e a tt om a r i n eb a c t e r i a 上海水产大学硕士学位论文 图3 - 2 加热对分离海洋细菌的影响 f i g3 - 2t h ei n f e c t i o no f h e a tt om a r i n eb a c t e r i a 3 3 人工海水与蒸馏水对分离效果的比较 3 3 1 培养基的制备 选用2 2 1 6 e 培养基作为比较对象。配置2 种2 2 1 6 e 培养基：2 2 1 6 e a 、2 2 1 6 e b 。 在2 2 1 6 e a 中加入人工海水，在2 2 1 6 e b 中加入蒸馏水。梯度稀释完毕的海泥分别在 以上2 种培养基中涂布，至于2 8 的培养箱中进行培养，5 d 后取出观察实验结果。 3 l 上海水产大学硕士学位论文 332 分离结果 从图3 - 3 中我们可以看出，用人工海水配置的培养基其分离出的菌落种类比较 多样，菌落的形态各异。用蒸馏水配置的培养基其分离出的菌落种类比较单一，主要 以乳白色与桃红色、菌落表面光滑湿润、圆形、边缘整齐的菌落为主，这两种细菌在 蒸馏水培养基上大量生长，而在人工海水培养基中不能繁殖。所以分离海洋细菌的培 养基一定要选用人工海水或陈海水配置。人工海水与陈海水中存在海洋细菌生长所必 需的微量元素与海水盐度，这些元素对分离海洋细菌至关重要，海水盐度对海洋细菌 的生长也有很大的影响。 因为采样地点离陆地很近，用蒸馏水制作的培养基更有利于陆生细菌的生长繁殖 3 i 】，由此也可以看出分离海洋细菌一定要采用人工海水或陈海水制作的培养基。 图3 3 人工海水与蒸馏水对分离海洋细菌的影响 f i g3 - 3 t h ei n f e c t i o no fm a n m a d es e aw a t e ra n dd i s t i l l e dw a t e rt os e p a r a t i o n 3 4 培养基中营养物质浓度对分离海洋细菌的影响 3 4 1 培养基的制备 选用2 2 1 6 e 培养基作为研究对象，配置3 种不同营养成分的培养基如表3 - 3 。 3 2 上海水产大学硕士学位论文 表3 - 3 培养基的成分配比 t a b3 - 3 t h ec o m p o n e n to fc u l t u r e 3 4 2 分离结果 从图3 - 4 中可以看出，海水中的细菌总数随着营养成分的减少而有所增加，当 营养成分减少到原来的5 0 时，b 培养基中的细菌总数略有增加，但基本与培养基a 中的细菌总数相近，当营养成分减少到原来的2 5 时，培养基c 中的细菌总数较培 养基a 有比较大幅度的增长。而海泥中的细菌总数随着营养成分的减少而减少，如图 3 - 5 。在培养基c 中的菌落形态大多以透明无色、菌落表面光滑湿润、圆形、边缘整 齐的菌落为主，菌落的直径在1 5 6 1 7 1 m m 之间。 由于海水是一个寡营养环境，在海水中存在着大量的寡营养细菌口“，过多的营 养成分反而会抑制寡营养细菌的生长；海泥中的营养成分多于海水中的，所以当培养 基中的营养成分减少时，细菌总数也相应的减少。 上海水产大学硕士学位论文 图3 4 营养成分对海水中海洋细菌的分离影响 f i g3 - 4t h ei n f l u e n c eo f c o m p o n e n tt os e p a r a t em a r i n eb a c t e r i ai ns e a w a t e r 图3 5 营养成分对海泥中海洋细菌的分离影响 f i g3 - 5t h ei n f l u e n c eo fc o m p o n e n tt os e p a r a t em a r i n eb a c t e r i ai ns e d i m e n t 3 5 盐度对分离海洋细菌的影响 3 5 1 培养基的制备 上海水产大学硕士学位论文 鉴于2 2 1 6 e 与# 2 培养基分离出的海洋细菌总数最多，选用他们2 种培养基作为 实验对象。由于撑2 培养基的成分中已有2 5 的n a c l ，配置用的人工海水中也有2 5 n a c l 浓度，所以在配置培养基时应该予以考虑。分别配置2 2 1 6 e 与# 2 培养基的3 、 5 、7 、1 1 的盐度梯度。 3 5 2 分离结果 如图所示，2 2 1 6 e 培养基与# 2 培养基的盐度在3 到5 之间，分离出的细菌总 数最多，当盐度小于3 或大于5 时，细菌总数就会相应的减