（发酵工程专业论文）从尖吻蝮蛇中仿生亲和纯化新型类凝血酶及其性质研究.pdf

摘要 摘要 蛇毒中含有多种蛋白，近年来它们的应用价值得到了世界各地研究者的高度重视， 进行了大量的分离纯化和性质研究。尤其是尖吻蝮蛇的蛇毒，由于对人血液凝聚系统有 作用，具有很高的医用价值，国内外的研究者都开展了广泛的研究。但是由于纯化手段 的局限性，进展不大。近年来医用蛋白的发现和生产对于纯化方法的效率提出更高的要 求，需要方便快速、经济、高通量的筛选方法的出现。传统的纯化方法现在正在被高选 择性、针对目的产物而设计的人工亲和层析色谱代替。化学合成配基在蛋白质层析色谱 中已经应用多年。尤其是组合化学技术的出现使得金属螯合配基在融合蛋白的纯化中广 泛应用。 本研究主要方法如一f ： 一、采用仿生亲和的方法对尖吻蝮蛇蛇毒蛋白进行了分离纯化。经过仿生亲和平台 4 0 0 多种仿生配基的筛选，选择出几种在2 0 3 0 k d a 附近有较好专一性吸附的配基，然后 进行纯化条件的优化，得到纯度较高的蛋白样品。 二、得到的纯化蛋白进行一系列生物化学性质的检验，包括生物活性，热稳定性等， 并运用先进的质谱和肽谱分析手段得到纯化蛋白的更多有用信息。 主要研究成果如下： 一、筛选出配基a t l 4 作为纯化使用介质，该配基对蛇毒蛋白中分子量为2 2 0 0 0 d a 的蛋白有特异性吸附。 二、经过吸附条件优化，发现在p h 7 ，离子强度k = 1 1 1 0 3 u s c m 的条件下吸附性能 最好。经过洗脱条件优化，发现在p h 8 ，离子强度k = 4 0 1 0 3u s c m 条件下洗脱特异性 最好。 三、通过h p l c 检测，纯化蛋白纯度在9 5 以上。s d s p a g e 电泳分析，发现蛋白 表观分子量为2 2 3 8 0 d a ，具有两个亚基，具有类凝血酶的活性，能完全降解纤维蛋白原 的q 链，部分降解链。e d t a 和巯基乙醇能完全抑制其活性，p m s f 和c u “部分抑制 活性。说明它是一种金属蛋白酶。基质辅助激光解析电离质谱测定分子量为2 9 2 2 9 3 8 d a ， 经过全肽谱分析和n c b i 数据库检索，未发现匹配蛋白。 结论：成功应用仿生亲和配基库对尖吻蝮蛇蛇毒进行筛选，得到配基a t l 4 ，该配 基能专一性吸附2 2 0 0 0 d a 附近的蛋白。通过纯化条件优化，得到了h p l c 检测纯度9 6 的蛋白样品，通过一系列性质研究，确定该蛋白为类凝血酶，数据库检索结果说明此蛋 白属于新发现的蛋白，值得进一步研究。 关键词：尖吻蝮蛇亲和层析蛋白纯化金属蛋白酶类凝血酶 兰查矍三查兰堡主兰堡丝苎 a b s t r a c t s n a k ev e n o mi sac o m p l e xm i x t u r eo fb i o l o g i c a l l yp r o t e i n sa n dp e p t i d e s ，t h ev a l u eo f w h i c ha r e h i g h l yr e c o g n i z e db ys c i e n t i s t s a l lo v e rt h ew o r l d n u m e r o u sr e s e a r c h e sa r e c o n c e r n e dw i t ht h e i r p u r i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o n f o rv e n o mo fa g k i s t r o d o na c u i u s c o u l dh a v ee f f e c to nb l o o d - c l o t t i n gs y s t e m ，i ts h o w e dh i g hp h a r m a c e u t i c a lv a l u e ，h o w e v e r , l o we f f e c t i v e p u r i f i c a t i o n m e t h o d sl e a d e dt ol i t t l e d e v e l o p m e n t n e wc h a l l e n g e s i nt h e d i s c o v e r ya n dp r o d u c t i o no ft h e r a p e u t i cp r o t e i n sh a v en e c e s s i t a t e dar a d i c a lr e t h i n ko ft h e c h o i c eb e i n gl a r g e l yd i c t a t e db yt h e i rs p e e do fi n t r o d u c t i o n ，e f f e c t i v e n e s s ，r o b u s t n e s sa n d e c o n o m i c s c o n v e n t i o n a l p u r i f i c a t i o np r o t o c o l s a r en o wb e i n gs u b s t i t u t e dw i t h h i g h l y s e l e c t i v ea n ds o p h i s t i c a t e ds t r a t e g i e sb a s e do na f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y t h er o l eo fs y n t h e t i c c h e m i c a ll i g a n d si np r o t e i nc h r o m a t o g r a p h yh a sb e e nw e l le s t a b l i s h e do v e rm a n y y e a r s o fu s e c o m b i n a t o r i a lc h e m i c a lt e c h n i q u e sw e r eb e g i n n i n gt oh a v ea l li m p a c to nt h em e t a l b i n d i n g l i g a n d si nt h ep r o t e i ns e p a r a t i o n a r e a m a i n p r o c e d u r e sa n d m e t h o d s ： l ，b i o m i m e t i ca f f i n i t yc h r o m a t o g r a p hw a su s e di ni s o l a t i n gv e n o mp r o t e i no fa g k i s t r o d o n a c u t u sf r o mc h i n a a f t e rs e l e c t i n gt h eb i o m i m e t i ca f f i n i t yf i g a n dl i b e r a r y , w h i c hh a d4 0 0 d i f f e r e n tl i g a n d s ，w eg o ts o m el i g a n d st h a ts h o w e da f f i n i t yo n2 0 3 0 k d ap r o t e i n s a f t e r s e p a r a t i o no p t i m i z a t i o n ，t h es a m p l ee m z y m e c o u l db eg o t 2 w ew o u l dd oas e r i e so fb i o c h e m i s t r yc h a r a c t e r i z a t i o no ns a m p l ep r o t e i n ，i n c l u d i n g b i o l o g i c a la c t i v i t y , s t a b i l i t y t oh e a t , a n dw ew a n t e dt ou s em a l d i f r o fa n dp e p t i d e d a t a b a s et oi d e n t i f yt h es a m p l e p r o t e i n m a i nr e s u l t ： 1 l i g a n d a t l 4w a sf o u n dt oh a v es p e c i f i ca f f i n i t yw i t ht h ep r o t e i nw h o s em w w a sa r o u n d 2 2 0 0 0 d aa se s t i m a t e db ys d s p a g eu n d e rn o n r e d u c e dc o n d i t i o n s 2t h e o p t i m i z a t i o n o ft h e l o a d i n gp a r a m e t e r s w e r ep h 7a n dk = i 1 4 1 0 3 u s c m t h e o p t i m i z a t i o no f t h ee l u t ep a r a m e t e r sw e r ep h 8a n dk = 4 0 41 0 3 u s e r a 3t h e p u r i t yo fp r o t e i nw a s a b o v e9 5 a sh p l ct e s t e d t h em ww a s2 2 3 8 0 d aw i t ht w o p o l y p e p t i d ec h a i n sb ys d s p a g e d e t e r m i n e d t h ee n z y m ew a sb e l o n g 幻t h r o m b i n l i k e e n z y m e i tn o to n l yt o t a l l yh y d r o l y z e d ac h a i n s ，s l o w l yp a r t l yh y d r o l y z e d 1 3c h a i n s t h ef i b r i n o l y t i c a c t i v i t yw a st o t a l l y i n h i b i t e db ye d t aa n d 1 3 一m e r e a p t o e t h a n o la n d p a r t l yi n h i b i t e db yp m s f o rc u “，i ts h o w e di tw a sak i n do fm e t a l l o e n d o p e p t i d a s e s t h e m ww a s2 9 2 2 9 3 8 d ab ym a l d i f r o fa n dt h ee n z y m ew a sa n a l y z e db ye s i l c m s t h ed a t ew a sn o ts e a r c h e di nd a t a b a s eo fn c b i i tm a y b e an o v e lp r o t e i n t i a b s t r a c t c o n c l u s i o n ： w es u c c e s s f u l l yu s e db i o m i m e t i c a f f i n i t y l i g a n dl i b r a r y i n s c r e e n i n gc r u d ev e n o mo f a g k i s t r o d o na c u t u s ，a n da t l 4 w a sb ec h o o s c ds i n c ei th a d a f f i n i t yo n2 2 0 0 0 d ap r o t e i n a f t e r h e o p t i m i z a t i o no fs e p a r a t i o np a r a m e t e r s ，s a m p l ep r o t e i nw a s w e l ls e p a r a t e di n9 6 p u r i t ya s t e s t e db yh p l c as e r i e so fc h a r a c t e r i z i n g ，w ec o n c l u d e dt h a tt h i ss a m p l ep r o t e i nw a sak i n d o fn o v e lt h r o m b i n - l i k ee n z y m e ，i tn e e d e df o l l o w e dr e s e a r c h k e y w o r d s ：a g k i s t r o d o n a c u t u s a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h yp r o t e i np u r i f i c a t i o n m e t a u o e n d o p e p t i d a s e s t h r o m b i n l i k ee n z y m e i 华南理工大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 作者签名： 知咽 日期：弘砷年f 月巧日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权华南理工大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。 保密口，在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密呱 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者签名：幺秒。嗍 门 导师签名：d 弘i 救华 日期：妒n ，i 薛f 月瑶日 日期：如。牛年月，日 第一章绪论 第一章绪论 近年来，随着生命科学、生物技术、药学以及医疗技术的日益发展，对活性生物大 分子分离和纯化的要求越来越高。另外随着后基因组时代的到来，科学家更加迫切想知 道各基因表达产物的结构和功能关系，因而也需要获得高纯度的生物大分子。但是由于 生物大分子往往处在体液或发酵液等几十种甚至上百种大小分子的混合物中，而且大多 数的生物大分子的生理活性依赖于其习惯的生理条件，有严格的构象要求，脱离了适当 的条件，大都容易变性失活，这些复杂性和不稳定性，使得对它们的分离纯化显得特别 困难 t , 2 l 。 同时在生化工程技术中，下游技术是生物高技术发展的重要的组成部分，离开了有 效的分离技术，一项生物技术的商业化几乎是不可能的。在一个生化工程的工艺流程中， 下游工程的投入常常超过总投入的6 0 。世界上发达国家都十分重视生物技术的研究与 开发，因而对生物技术下游产品的分离与纯化给予高强度的投资。我国对生物技术也十 分重视，从“t 五”计划开始，生物技术被列为国家高技术项目重点支持。 1 仿生亲和分离技术概述 就某些生物医药而言，起初的价格并不是进入市场的障碍，尤其在尚无竞争对手或 者市场需求总量较少的情况下。然而，生物医药从微克剂量的品种( 如细胞因子) 向毫 克级，甚至克级剂量品种( 如单克隆抗体，血浆蛋白) 的发展和转换，表现在生产规模 是年产量数克，到数十，甚至数百公斤的差别。传统的分离技术主要是利用目标物质分 予与其他物质( 杂质) 的性质差异进行分离，比如沉淀、萃取、抽提等是利用溶解度的 差异，分子筛凝胶层析和超滤是利用分子大小的差异。这些传统方法的纯化倍数和生产 效率较低，需要比较严格的控制条件，不利于生产工艺的稳定。因此一般生产需要多种 技术组合( 如离子交换，凝胶过滤，疏水作用) 多个步骤。生产步骤增加使产品的回收 率降低，生产成本升高【3 】；在治疗性生物制品生产中，多达5 0 一8 0 的直接生产成本是 在产品的下游纯化和精制过程中产生的。利用市场上通用的分离技术不能经济高效的生 产需求量大，技术难度高的生物医药品种，如组织纤溶酶原激活剂( t p a ) 至今在我国 还不能大量生产。此外，可以预见在不远的将来，对专利保护到期的生物医药品种的竞 争会更加激烈。这些因素综合起来要求生产厂商提高生产的技术工艺水平，降低生产成 本，增强市场竞争力。现有的分离技术已经不能满足高纯度生物制品的生产规模的市场 规模和市场竞争的双重要求。降低生物医药的成本已经成为生物医药的成本已经成为生 兰垦翌三盔兰堡! ：兰垒丝奎 物技术领域的一项重大挑战。 亲和分离技术利用生物识别性质的差异，具有纯化效率( 纯化倍数) 高、纯化步骤 少，重复性好、操作简单的优点【4 】。此外产品的洗脱条件很温和，能够分开失活和复性 的生物产品，在分离的同时起到浓缩的作用。稳定的小分子仿生亲和配体，能够保持传 统亲和技术的优点，尤其有稳定性好，制备便宜的特点。不仅能够提供高效的纯化倍数、 重复性的结果，而且配体极少脱落。这种仿生亲和分离技术是至今为止最有效的生物活 性制品的大规模生产技术之一【5 】。 1 1 亲租层析的基本原理 首次利用亲和层析分析生物大分子是由e s t a r k e n s t e i n 【6 】在1 9 1 0 年付诸于实践的。 他利用不溶性淀粉与n 一淀粉酶进行专一性作用从而将其与b 一淀粉酶分开。e n g e l h a r d t 在1 9 2 4 年提出“固定配基原理”作为分离活性物质的普遍方法。但在当时由于缺乏和 数的固相载体，同时也缺少简单、方便的偶联技术，是的亲和层析的发展受到了局限。 直到1 9 5 9 年，p o r a t h 和h o d i n 将葡聚糖凝胶，h j e r t e n 等将球转琼脂糖凝胶引入亲和 层析介质中，才使得亲和层析得到飞速的发展【7 】。 早期般用于纯化蛋白质和核酸等大分子物质的方法的主要依据是各种大分子物 质之间理化特性的差异。由于这种差异性较小，因此要得到一种纯度稍高的物质，通常 需要繁琐的步骤，经历较长的时间，但最终收得率却很低。随着生化技术的发展，人们 找到了一个有效的分离方法，即亲和层析法，尤其是固定化方法在亲和层析中的应用， 解决了固相基质的制备问题，使得蛋白质等大分子物质的纯化过程变得较简单，迅速和 高效。各种分离方法的比较见表1 1 亲和层析( a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y ) 以分子识别原理为基础，主要利用的是配 体与生物大分子间相互识别辨认时所产生的独特生物学作用，主要是指受体活性部位附 近的氨基酸残基原子与在此活性部位中的配体原子之间的相互作用，这些相互作用在本 质上通常是非共价的和可逆的，这种作用包括配位体与蛋白特异结合过程中所涉及微观 作用力如：范德华力，疏水力，氢键，静电力，空间位阻效应等。它是唯一一种利用生 物大分子与其互补配基，如酶底物、酶抑制剂、激活剂、辅酶、荷尔蒙、抗原、核酸和 糟等分子1 可特异性识别能力来达到分离目的的“8 。”3 如图卜l 所示：当含有目标蛋白分子的混合物通过亲和吸附介质后，没有作用的生 物分子由于没有吸附而流出层析柱，与介质非特异性吸附的生物分子由于吸附不牢固在 随后的平衡中随着缓冲液流出层析柱，只有目标蛋白特异性吸附在介质上。待充分平衡 后改变流动相的条件( 如p h ，离子强度等) 将目标生物分子洗脱下来，达到分离纯化 的目的。此外，产品的洗脱条件很温和，能够分开失活和复性的生物产品，在分离的同 时起至浓缩的作用。 2 第一章绪论 沉淀法，萃取和抽提 分子筛凝胶层析和超滤 阳离子和阴离子交换凝胶层析 疏水凝胶层析 金属螫合亲和凝胶层析 硼基亲和凝胶层析 染料亲和凝胶层析 亲和凝胶层析 溶解度的差异 5 分子大小的差异 5 电荷性质的差异 1 0 疏水区域10 hist【dine20 顺式二羟基 2 0 核苷酸，辅酶结合位点 查出分子量为2 3 8 0 0 1 0 0 0 d a ，见图3 - 2 2 及附录l 第三章试验结果与讨论 图3 2 2 分子量的估算 f i g3 - 2 2a s s e s st h ep r o t e i nm o i c u l a rw e i g h t l i h e lp r o t e i nm a r k e rl i n e 2s a m p i ep r o t e i n 另外我们使用a p p l i e db i o s y s t e m sv o y a g e rs y s t e m6 1 9 2 进行了质谱m a l d tt o f 的 测定，结果如下： 精确分子量为：2 9 2 2 6 6 6 d a 使用g e l p r 0 3 0 分析软件和质谱测定出来的分子量有一定的差距，主要是s d s p a g e 电泳过程中，蛋白质空间结构对于迁移速率有影响，通常把电泳测出的分子量称之为表 观分子量，以质谱的结果作为准确分子量。 3 1 6 全肽谱分析 使用a p p l i e db i o s y s t e m sv o y a g e rs y s t e m6 1 9 2 进行全肽谱分析( 附录2 ，3 ) ，结果 如f d a t a 1 1 1 8 4 9 9 9 1 2 0 1 6 9 2 0 1 3 9 0 6 7 4 9 1 4 9 3 6 9 5 1 2 0 3 5 7 躺6 9 9 3 5 7 3 8 1 0 9 0 5 1 7 8 1 1 0 7 5 4 7 2 1 3 0 8 6 2 4 3 2 7 0 6 ”8 8 1 4 0 2 砷5 4 1 7 3 6 5 9 0 8 1 9 2 0 7 5 1 1 1 9 2 7 8 1 5 5 2 0 5 5 9 2 5 2 2 1 0 4 9 1 9 2 2 3 7 9 9 9 0 4 2 鸫6 9 7 8 华南理工大学硕上学位论文 根据n c b i 数据库搜索，未发现匹配的蛇毒蛋自，说明此蛋白的数据没有在数据库注册， 也有可能属于新发现的蛋白。这需要进一步的研究证明。 # ( ) m o w s ep r o t e i n r a n km a s s e s s p e c i e s s c o r e m w ( d a ) p l m a t e h e d d r o s o p h 皿a 3 4 0 5 1 8 ( 2 7 1 2 9 0 9 1 9 9 7 9 m e i a n 0 6 a s l e r n c b l n rp r o t e i n a o g e s s i o n 静n a m e h y p o t h e t i c a l c a e n o r h a b d i t i s 3 7 3 5 1 8 ( 2 7 )2 4 2 3 0 2 1 0 8 5 1 7 5 3 1 2 8 5 p r o t e i n e l e g a n s b 0 3 0 4 2 第三章试验结果与讨论 本文结论及创新点： 通过计算机模拟计算，设计出大约4 0 0 个针对有丝氨酸活性中心的蛋白酶类的仿生 亲和配基。根据合成的方法不同，分为直接合成和三氨嗪连接合成两种。合成工艺条件 已经确定，重复性好，条件相对温和，易于操作。4 0 0 个小分子亲和配基组成本试验所 用的筛选平台。此平台属于国内首创，是国家中药现代化及创新药物筛选平台的重要组 成部分 针对中国特有的江浙蝮蛇粗蛇毒进行仿生亲和库的筛选。江浙蝮蛇学名尖吻蝮蛇， 是国内外血液系统疾病治疗药物的首选研究对象，是我们宝贵的医药原材料，使用仿生 亲和库的目的是为了发现2 0 “3 0 k d a 附近处的凝血酶和类凝血酶，尝试开发新型的抗栓 类医用蛋白。 经过筛选，选择出有较好结合性和专一性的仿生亲和配基共1 3 种，选出a t l 4 进行 下一一步纯化条件摸索。经过吸附p h ，吸附离子强度，洗脱p h ，洗脱离子强度以及综合 优化的步骤，确定了上样吸附条件为p h 7 ，电导率k = i 1 1 0 3 u s c m ，洗脱条件为p h 8 电 导率k = 4 * 1 0 3u s c m 。s d s - p a g e 电泳检测，纯化效果良好。h p l c 检测纯度在9 5 以上。 对纯化得到的蛋白进行理化性质的研究。蛋白精确分子量为2 9 2 2 6 d a ，s d s p a g e 分 子量为2 2 2 k d a 。此蛋白能分解纤维蛋白原，但是却不能使加进凝血酶的纤维蛋白溶解， 另外此酶还具有精氨酸脂酶的活性，按照蛇毒蛋白分类归属予类凝血酶。蛋白内部含有 s s 双链结构和金属离子活性中心，0 一巯基乙醇和e d t a 可以抑制其活性，p m s f 能部 分抑制其活性，说明此蛋白也是含有丝氨酸活性中心。 通过比较与医用降纤酶的酶活评价方式，发现此蛋白的酶活曲线和降纤酶类似，粗 略的估算可以使用药典关于降纤酶的评价方法。通过温度一时间对酶活影响的试验，发 现在3 7 下，此酶酶活变化缓慢但在5 0 和8 0 。c 下迅速失活。 通过质谱和全肽谱分析，并在美国n c b i 数据库检索，未发现有匹配数据，说明我 们纯化的此类凝血酶金属蛋白有可能是新发现的。 进一步的研究还有待深入。 兰妻竺三奎兰丝主兰竺鎏兰 参考文献： 【l 】叶浩生物分离工程北京：化学化工出版社1 9 9 8 ：4 2 。5 0 【2 】陶慰孙等编著蛋白质分子基础，第二版一e 京：高等教育出版社，1 9 9 5 ：1 2 1 9 3 】3 范清林，桂向东，吴清发等基因工程蛋白下游纯化技术研究进展生物学杂志，1 9 9 8 3 ：2 3 2 7 4 】韩进玉，那平，元英进亲和色谱纯化蛋白质新进展色谱，1 9 9 6 ，v o l l 4 ( 0 6 ) ： 4 4 7 4 5 l 【5 】c h r i s t o p h e rr ，l o w e ，a l a nr l o w n ，g e e t ag u p t a n e wd e v e l o p m e n t s i na f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y w i t h p o t e n t i a la p p l i c a t i o ni nt h ep r o d u c t i o no fb i o p h a r m a c e u t i c a l s j b i o c h e m b i o p h y s m e t h o d s ，4 9 ，2 0 0 1 ：5 6 1 - 5 7 4 6 】周先婉，胡晓倩编著，生物化学仪器分析与试验技术北京：化学工业出版社，2 0 0 3 ： 1 2 6 1 2 7 【7 】李容秀，杨金菊分子仿生学及其应用北京：化学工业出版社，2 0 0 3 【8 】c r l o w e ，s j b u r t o n ，j c p e a r s o n ，s b m c l o u g h l i n ，n p b u r t o n ，s d i l m a g h a n i a n ， y d c l o n i s ，c v s t e a d ，b i 0 1 c h e m h o p p e s e y l e r3 6 8 ( 1 9 8 7 ) 7 5 9 - 7 6 0 9 lg u p t a g l o w ec r r a t i o n a ld e s i g n ，s y n t h e s i sa n d e v a l u a t i o n ；a f f i n i t yl i g a n d s i n ：w i l s o ni d ，e d i t o r e n c y c l o p a e d i ao fs e p a r a t i o ns c i e n c e l o n d o n ，u k ：a c a d e m i c p r e s s 2 0 0 0 ，2 9 7 - 3 0 6 【1 0 】l ir - x ，d o w dv ，s t e w a r td j ，b u r t o ns j ，l o w ec r ，；d e s i g n ，s y n t h e s i sa n da p p l i c a t i o no f ap r o t e i nam i m e t i c n a t b i o t e c h n o l1 9 9 8 ，1 6 ：1 9 0 - 1 9 5 【1l 】e n z e l b e r g e r ，m a r k u sm ；e t a 1 ；d e s i g n i n gn e w m e t a l a f f i n i t yp e p t i d e sb yr a n d o m m u t a g e n e s i so fa n a t u r a lm e t a l - b i n d i n gs i t e ，j o u r n a lo f c h r o m a t o g r a p h ya ，8 9 8 ( 2 0 0 0 ) 8 3 - 9 4 【1 2 1s z u r d o k if ，r e nd ，w a l td r ；ac o m b i n a t o r i a la p p r o a c h t od i s c o v e rn e wc h e l a t o r sf o r o p t i c a lm e t a l i o ns e n s i n g a n a lc h e m 2 0 0 0 ，7 2 ：5 2 5 0 5 2 5 7 【1 3 c l o n i sy d ，l a b r o un e ，k o t s i r av p ，m a z i t s o sc ，m e l i s s i ss ，g o g o l a sg ；b i o m i m e t i cd y e s a sa f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h yi ne n z y m e p u r i f i c a t i o n jc h r o m a t o g r a2 0 0 0 。8 9 1 ：3 3 4 4 1 4 la n s e l lr j ，l o w ec r ；a r t i f i c i a lr e d o xc o e n z y m e s b i o m i m e t i ca n a l o g u e so fn a d + a p p l m i c r o b i o lb i o t e c h n o l1 9 9 9 ，5 2 ：7 0 3 - 71 0 【15 1t e n gs - f ，s p r o u l ek ，h u s s a i na ，l o w ec r ；as t r a t e g yf o r t h eg e n e r a t i o no fb i o m i m e t i cl i g a n d sf o r a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y ，c o m b i n a t o r i a ls y n t h e s i sa n db i o l o g i c a le v a l u a t i o no f a l li g g b i n d i n gl i g a n d jm o l r e c o g n i t1 9 9 9 1 2 ：6 7 7 5 参考文献 1 6 t e n gs - f ，s p r o u l ek ，h u s s a i na ，l o w ec r ；a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h yo ni m m o b i l i s e d b i o m i m e t i c l i g a n d s s y n t h e s i s ，i m m o b i l i z a t i o na n dc h r o m a t o g r a p h i ca s s e s s m e n to fa n i m m u n o g l o b u l i ng b i n d i n gl i g a n d jc h r o m a t o g r b2 0 0 0 ，7 4 0 ：1 1 5 【1 7 】s p r o u l ek ，m o r r i l lp ，p e a r s o nj c ，b u r t o ns j ，h e j n a e sk r ，v a l o r eh ，l u d v i g s e ns ，l o w e c r ：n e w s t r a t e g y f o r t h e d e s i g n o f l i g a n d s f o r t h 。p u r i f i c a t i o n o f p h a r m a c e u t i c a l p r o t e i n s b ya f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y j c h r o m a t o g r b 2 0 0 0 ，7 4 0 ：1 7 3 3 【1 8 】f i l i p p u s s o nh ，e r l e n d s s o nl s ，l o w ec r ：s y n t h e s i so f b i o m i m e t i ca f f i n i t y f i g a n d s f o r e l a s t a s e sa n dt h e i ru s ef o r t h e p u r i f i c a t i o no fp o r c i n ea n d c o d e l a s t a s e s jm o l r e c o g2 0 0 0 1 3 ：3 7 0 - 3 8 1 【1 9 】p a l a n i s a m yu d ，h u s s a i na ；d e s i g n ，s y n t h e s i sa n dc h a r a c t e r i z a t i o no fa f f i n i t yl i g a n d s f o rg l y c o p r o t e i n s jm o l r e c o g1 9 9 91 2 ：5 7 6 6 【2 0 】p a l a n i s a m yu d ，w i n z o rd j ，l o w ec r ，s y n t h e s i sa n d e v a l u a t i o no f a f f i n i t ya d s o r b e n t s f o rg l y c o p r o t e i n s jc h r o m a t o g rb2 0 0 0 ，7 4 6 ：2 6 5 2 8 1 【21 s u g i m o t on ，m i y o s h id ，z o uj ，d e v e l o p m e n to fs m a l lp e p t i d e sr e c o g n i s i n ga m o n o s a c c h a r i d eb yc o m b i n a t o r i a lc h e m i s t r y c h e mc o m m u n2 0 0 0 ，2 3 ：2 2 9 5 2 2 9 6 【2 2 1r o y om ，d e lf r e s n om ，f d e d e na ，v a nd e nn e s tw ，s a n s e v e r i n om ，a l s i n aj ，k a t e ss a ， b a r a n yg ，a l b e r i c i of ，u s e f u ls c a f f o l d sa n dh a n d l e s f o r c r e a t i n gd i v e r s i t yi nt h e p r e p a r a t i o n o fc h e m i c a ll i b r a r i e s r e a c tf u n c t p o l y m1 9 9 9 4 1 ：1 0 3 一1 1 0 2 3 l a b r o un e ，e l i o p o u l o se ，c l o n i sy d ；m o l e c u l a rm o d e l l i n gf o rt h ed e s i g no fa b i o m i m e t i cc h i m a e r i cl i g a n d a p p l i c a t i o nt ot h ep u r i f i c a t i o no fb o v i n eh e a r tl - l a c t a t e d e h y d r o g e n a s e b i o t e c h n o lb i o e n g1 9 9 9 ，6 3 ：3 2 2 - 3 3 2 ， 【2 4 b a t r as ，r a s t o g is k ，k u n d ub ，p a t r aa ，b h a d u r ia p ，an o v e li s o x a z o l e b a s e ds c a f f o l d f o rc o m b i n a t o r i a lc h e m i s t r y t e t r a h e d r o nl e t t2 0 0 0 ，4 1 ：5 9 7 1 5 9 7 4 2 5 】x u el ，b a j o r a t hj ；m o l e c u l a rd e s c r i p t o r si nc h e m o i n f o r m a t i c s ，c o m p u t a t i o n a l c o m b i n a t o r i a lc h e m i s t r y ，a n dv i r t u a ls c r e e n i n g c o m bc h e m h i g h t s c r 2 0 0 0 ，3 ：3 6 3 - 3 7 2 2 6 】g a s t e i g e rj ，p f o r t n e rm ，s i t z m a n nm ，h o l l e r i n gr ，s a c h e ro ，k o s t k at ，k a r g n ： c o m p u t e r a s s i s t e ds y n t h e s i sa n d r e a c t i o np l a n n i n gi nc o m b i n a t o r i a lc h e m i s t r y p e r s p e c t d r u g d e s d i s c o v e r y2 0 0 0 ，2 0 ：2 4 5 2 6 4 【2 7 】b o h mh j ，s t a h lm ；s t r u c t u r e b a s e dl i b r a r yd e s i g n ：m o l e c u l a rm o d e l l i n gm e r g e s w i t h c o m b i n a t o r i a lc h e m i s t r y c u r ro p i nc h e mb i o l2 0 0 0 ，4 ：2 8 3 2 8 6 ， 2 8 印国银蛇伤急救与防治湖南科学技术出版社，1 9 9 9 ：8 2 6 【2 9 】梁宁生蛇毒基因工程进展蛇志1 9 9 4 0 1 ：2 5 2 9 3 0 陈建智我国蛇毒酶类抗凝剂的研究与应用近况( 清栓酶的历史和现状) 。蛇 志，1 9 9 4 ，s 1 ：4 7 5 0 【3 1 刘敏涓，管锦霞，周立红，刘泽霖尖吻蝮蛇毒促凝组分的血栓形成研究中华 华南理工大学硕士学位论文 血液学杂志，1 9 9 4 。0 9 ：3 4 - - 3 9 3 2 李民，杨青，包永明，许小明，安利佳蛇毒类凝血酶的研究进展生命科学研 究，2 0 0 2 ，s 1 ：1 5 2 1 3 3 张梅朱柞铭丝氨酸蛋白酶抑制剂的研究及应用生物化学与生物物理进 展。1 9 9 6 ，v o l 2 3 ( 0 3 ) ：2 4 0 2 4 7 【3 4 1 ：李文辉高荣张云