（生物医学工程专业论文）生物组织折射率的概念界定与测试方法研究.pdf

堡主兰垡笙壅= = 圭望望塑塑墅皇塑垒墼墨塞量型蔓查鲨塑壅 a b s t r a c t w i t hi n d e p t hr e s e a r c ho ft i s s u e o p t i c s ，b a s i co p t i c a lp a r a m e t e r si n r a d i a t i v e t r a n s f e r t h e o r y c a n tf u l f i l lt h ed e m a n d so f d e p i c t i n go p t i c a l c h a r a c t e r i s t i c so f b i o l o g i c a lt i s s u e s ，w h i c hi m p e l u st os e a r c hf o raf u n d a m e n t a lp a r a m e t e rc o m b i n et h e e l e c t r o m a g n e t i s mt h e o r y o f o p t i c s w i t ho p t i c a lc h a r a c t e r i s t i c so f b i o l o g i c a lt i s s u e s ，w e d e f i n et h a tr e f r a c t i v ei n d e xo ft i s s u e si sac o m p l e xn u m b e rw h i c hc a r ls e r v ea sa f u n d a m e n t a lp a r a m e t e ra n du n i f yt h eo p t i c a lp a r a m e t e r so ft i s s u e s w eo b s e r v es o m e k i n d so ft y p i c a lt i s s u es l i c e su n d e rt h ep h a s ec o n t r a s tm i c r o s c o p ea n da n a l y z et h e i n f l u e n c eo fr e f r a c t i v ei n d e xa n dt h i c k n e s so fs l i c e so nt h ec o n t r a s to f p h a s ec o n t r a s t m i c r o g r a p h s ，a d d i t i o n a l l yd i s t r i b u t i o no f r e f r a c t i v ei n d e xi sd e d u c e df r o mt h ep h a s e c o n t r a s tm i c r o g r a p h s w ei l l u m i n a t et h es p e c i f i cm e a n i n go fr e f r a c t i v ei n d e xw h i c h s e l v e sa se q u i v a l e n tr e f r a c t i v ei n d e xw h e nd e a l tw i t hb o u n d a r yp r o b l e ma n da v e r a g e r e f r a c t i v ei n d e xu s e di nt i m e r e s o l v e dm o d e lt od e s c r i b et h ev e l o c i t yo fl i g h tan e w a l g o r i t h mi sp u tf o r w a r d t oc a l c u l a t et h ee q u i v a l e n tr e f r a c t i v ei n d e xa n ds o m ek i n d so f b i o l o g i c a l t i s s u e sa r e q u a n t m c a t i o n a l 】y m e a s u r e di n e x p e r i m e n t f e a s i b i l i t y o f m e a s u r i n gc o m p l e xr e f r a c t i v e i n d e xw i t h e l l i p s o m e t r y i sd i s c u s s e da n das e to f e x p e r i m e n te q u i p m e n t i ss e tu pt om a k e e l e m e n t a r ye x p e r i m e n t i nt h el a s tc h a p t e ro f t h i sp a p e r , t h ei n f l u e n c eo f c o n v e r g e n c ea n g l eo n t h el i g h tf i e l di nb i o l o g i c a lt i s s u e s a n d l i g h tf i e l dr e f l e c t e df r o mb i o l o g i c a lt i s s u e sa r ea l s od i s c u s s e d k e yw o r d s ：b i o l o g i c a lt i s s u e s ，o p t i c a lp a r a m e t e r s ，p h a s ec o n t r a s t m i c r o g r a p h s ， c o m p l e x r e f r a c t i v ei n d e x ，e l l i p s o m e t r y , c o n v e r g e n tl i g h ts o u r c e 声明 本学位论文是我在导师的指导下取得的研究成果，尽我所知，在 本学位论文中，除了加以标注和致谢的部分外，不包含其他人已经发 表或公布过的研究成果，也不包含我为获得任何教育机构的学位或学 历而使用过的材料。与我一同工作的同事对本学位论文做出的贡献均 已在论文中作了明确的说明。 研究生签名：选亟塑易硝年彳月万日 学位论文使用授权声明 南京理工大学有权保存本学位论文的电子和纸质文档，可以借阅 或上网公布本学位论文的全部或部分内容，可以向有关部门或机构送 交并授权其保存、借阅或上网公布本学位论文的全部或部分内容。对 于保密论文，按保密的有关规定和程序处理。 研究生签名：隆亟塑 弛乒年6 月芍日 硕士学位论文生物组织折射率概念的界定与测试方法研究 1 绪论 1 1 硒究背景 激光技术的发展以及光学在医学领域应用的深入，促使人们去了解和认识光 与生物组织相互作用的规律，包括生物组织的光学特性、光在生物组织内的传播 规律等等。随着这些研究的深入开展，逐步形成了一门光学与医学相结合的交叉 学科组织光学，其中心任务就是解答医学光子学发展过程中提出的关于光 与生物组织相互作用的基本问题，为其发展提供理论基础。生物组织内的光传输 问题是组织光学中的一个无法回避的基础性问题，因为无论是疾病的光学诊断还 是光学治疗，光或激光只有透过皮肤及肌肉，才能传到所要诊断和治疗的皮下组 织和器官。由此可见，确切地认识光在生物组织内的传输过程，以及建立相应的 数学分析工具对组织光学地进步发展有着非常重要的意义。组织光学经过十几 年的发展，初步建立了以难像模型辐射传输理论【2 】为基础的光传输模型，并 派生了一系列的近似方法，在组织光学中得到了一定的应用。然而，唯像模型仅 考虑了光能量在生物组织中的输运过程，而忽略了光的波动特性，因而该类无法 适用于与波动特性相联系的光学现象的理论分析。同时就组织本身光学特性的认 识而言，现有组织光学的发展仍然是相当不完善的。唯像模型的四个基本光学参 数f 3 1 ( 散射系数，、吸收系数敝、各向异性因子占和等效折射率行) 难以完整地 描述生物组织的光学特性，而对组织自身光学特性的深入认识与恰当描述恰恰是 建立具有普适性的生物组织光传输模型的基础。 目前，组织光学中对生物组织光学特性的描述仍局限于唯像模型的四个基本 光学参数，这极大地限制了生物组织光传输规律的研究，因此迫切需要解决生物 组织的光学特性的描述问题。生物组织光学特性问题研究进展缓慢的主要原因在 于生物组织自身结构和形态的复杂性，生物组织不同于一般的光学介质，其结构 非常复杂，内部包含了大量不同大小、不同种类的细胞和细胞间质，在光学上呈 现浑浊现象，因此也称其为混浊介质。光在此类物质中传播，将经历吸收和散射 两种物理过程。在唯像模型中，将这种传播过程抽象成大量彼此独立韵散射事件 和吸收事件，并用辐射传输理论进行分析，而这种理论是存在着很大的局限性的。 因此，我们力图从另外一种角度来考虑光在生物组织中的传播过程，即光是一种 电磁波，光波在组织内的传输是生物组织对其相位和振幅进行调制的过程。在这 里，我们认为对光波起调制作用的应该是生物组织内的折射率部分或介电常数分 布。从光学的角度，它应该可以成为描述生物组织光学特性的独立光学参量，而 组织光学中涉及生物组织折射率问题的研究甚少，即便是唯像模型中的等效折射 率也通常取在l3 3 1 6 0 t 4 4 】之间的经验值。另外，从生物组织光学特性的角度看， 硕士学位论文生物组织折射率概念的界定与测试方法研究 生物组织的折射率应该是一个复数的概念，丽现有所有研究仅只涉及了折射率的 实部，因此生物组织折射率本身也还是一个模糊的概念，尚需要明确的界定。 综上可见，生物组织折射率问题是组织光学中一个非常关键的基础性问题， 同时也是一个刚刚起步的新问题，这里存在许多理论和实验问题需要我们去解 决，如生物组织折射率概念的界定、生物组织等效折射率的测试、生物组织折射 率空间分布的测试等等。这些问题的解决对于组织光学的发展，乃至医学光子学 的发展都有着非常重要的理论价值和应用价值。 1 2 生物组织光学特性的研究现状及其评述 组织光学的重要工作之一就是生物组织光学特性的研究，这其中包括两个方 面的内容：光学特性参数内涵的明确界定以及相应测试方法的建立。生物组织光 学特性的研究不仅具有理论意义同时更具有实际的应用价值。首先，辐射传输理 论认为光在组织内的传输行为是由单个光子的吸收或弹性散射的综合造成的，这 时光子的传播幸亍为、生物组织特定层面上的光场分布就由组织的光学特性参数来 决定。其次，在医学的治疗诊断中，生物组织的一些生理特性，如血糖、血氧和 肌氧的含量、动脉硬化、癌变均与组织的光学参数密切相关的【9 】，因此光学特性 参数可以间接地反映生物组织的生理状况，通过测量组织光学特性参数的变化可 以揭示生物组织结构与功能的变化【”。”，从而为医学治疗和诊断提供参考。再次， 生物组织光学特性参数及其分布决定了生物组织不同层面上光通量的大小，因此 激光治疗要决定所使用的光剂量，也必须首先了解组织的光学特性参数。 生物组织光学特性的研究方法可以分为直接的方法和间接的方法。直接方法 是根据基本定义，将组织切片置于光学系统中进行切片钡4 试的方法，c h e o n g l l j j 以及w i l s o n h l 已发表了关于在离体切片状态下生物组织光学特性参数检测方法 与研究成果的综述文献。间接的方法是由测试得到的表面反射光信号或者透射光 信号推算组织光学参数的无损检测法，这种方法主要是根据在激光照射条件下生 物组织表面或者某一特定层面上的光场的分布来反演生物组织的光学参数，实现 这一目的主要理论基础是基于b o l t z m a n 传输方程【l 卸的辐射传输理论，但由于辐 射传输理论本身的复杂性，由此得出精确的解析解几乎是不可能的。因此，一般 是通过漫射近似方法【l “，再辅以适当的边界条件进行求解。 在生物组织光学特性的研究中，对于折射率的讨论是相对较少的，因为在辐 射传输理论中，折射率的主要作用体现在解决边界问题时改变光线行进的方向， 而且绝大多数生物组织折射率均采用l3 16 2 _ 问的经验值，这时的折射率实际 上是一种“等效折射率”。从折射率的根本意义上来说，它反映了物质对于入射 光场的响应特性，将其完全认为是反映物质自身特性的参数是不完整的。同时， 2 硕士学位论文生物组织折射率概念的界定与测试方法研究 折射率独立与其它参数作为描述组织光学特性的参数也是不全面的，因为光在生 物组织中发生的事件可以简化为散射和吸收，而散射是因为生物组织在波长量级 上折射率的不均匀性造成的【1 ”，这就说明散射系数与折射率的分布是有内在的 联系的；同时，不少的文献【l ”o 】已经报道了生物组织的电学特性，即生物组织是 具有一定的电导率的，因此光通过生物组织时一部分能量将转换为生物组织的内 能被消耗掉，这实际上是与组织的吸收特性相一致的，这说明生物组织的折射率 并不是像玻璃这类透明物体样的简单，而应当是个复数，其实部反映了生物 组织对入射光相位的延迟，而虚部表征了组织对入射光的吸收特性。 综上所述，尽管辐射传输理论在组织光学中己经得到了广泛地应用，但折射 率概念的重新界定并不是画蛇添足，而是真正意义上全面地考虑了光的粒子性和 波动性的特征；这对于完整地描述光在生物组织中的传输行为甚至于整个组织光 学来说都是一个有益的补充；同时充分地认识折射率的内涵，可以全面地涵盖生 物组织的其它光学参数，使得光在生物组织的研究统- - n 折射率及其分布的研究 上来，这一点也是非常有意义的。 1 3 本文的主要工作 在完成这篇论文的过程中，我们从组织光学中对于生物组织光学特性研究现 状出发，分析了耳前其中所存在的主要问题，著试图弥补组织光学的研究方法中 对光的波动特性视而不见的缺陷。因此，基于以上考虑本文的主要工作包括： ( 1 ) 对生物组织光学特性的研究现状进行了评述； ( 2 ) 从电磁学的角度出发，对生物组织复折射率概念进行了界定； ( 3 ) 运用相衬显微镜对生物组织切片进行观察，并分析了复折射率条件下组织 切片厚度对相衬显微图片衬比的影响，通过相衬图片半定量地反演出组织切片的 折射率分布； ( 4 ) 从概念上区分生物组织的等效折射率与平均折射率：建立可以测试典型生 物组织等效折射率的实验装置并提出了一种新的实验数据处理的算法；在此基础 上探讨了椭圆偏振测量术应用生物组织复折射率钡9 量的可行性，建立了相应的实 验装置并进行了初步的实验测量。 ( 5 ) 基于漫射近似理论，建立了可处理任意光源照射下生物组织内光传输问题 的计算模型，分析了光源会聚角对生物组织内光场分布与组织漫射场分布的影 响。 硕士学位论文生物组织折射率概念的界定与测试方法研究 2 生物组织折射率概念的界定 组织光学的研究包括两个方面的内容：第一是探索光或激光在生物组织中的 传输行为，并建立合适的数学模型，即所谓的正问题；第二是在一定理论模型的 基础上，通过实验测量反演组织的光学特性参数，即所谓逆问题。逆问题的研究 与正问题的研究是相互依赖的，逆问题以正问题的研究结果为基础，而逆问题的 研究结果将推动正问题的研究。在唯像模型中，以散射系数、吸收系数和各向异 性因子为基本光学参量，它们的实验测量以辐射传输模型为基础，在这方面组织 光学内已经开展了大量的研究。根据上一章的讨论，上述三个光学参数在描述生 物组织光学特性时具有很大的局限性，因而提出将折射率作为独立描述生物组织 光学特性的物理参量的观点。由于生物组织自身结构和形态上的特殊性，使得其 光学特性不同于一般的光学介质，因而其折射率也应不同于一般光学介质的折射 率。而在组织光学内一直延用传统光学介质的等效折射率概念，我们认为这是不 贴切的，只有在对折射率概念进行的新的界定的基础上，才能独立地描述生物组 织的光学特性。在下面的章节中，我们将对生物组织折射率概念进行简单的界定。 2 1 传统折射率的定义 确切地说，折射率并不是反映物质本身根本性质的物理量，但它描述了物质 对于光场的响应特性。因此，讨论折射率的定义应该从光的电磁理论出发。公式 ( 2 1 ) 给出了麦克斯韦方程组： v x e ：一罂 0 t v 。h ：j + 孚 战 v - d = p v b = 0 对于各向同性的线性介质，有物质方程 f d = e e b = h lj = 仃e ( 2 1 一a ) ( 2 1 - b ) ( 2 1 一c ) ( 2 1 一d ) 考察无限大的各向同性均匀介质，这时g = 常数，2 = 常数，并且在远离辐射源 的区域，不存在自由电荷和传导电流( p = o ，j = 0 ) ，这时麦克斯韦方程组简化 为 4 d d d j 里主兰垡兰! ! = 兰塑望塑塑堑皇塑查塑墨塞兰型蔓查鲨婴塞 v 。e ：一塑 a v b ：剐堡 a v ，e = 0 口b = 0 ( 2 3 一a ) ( 2 3 - b ) ( 2 3 一c ) ( 2 3 一d ) 对力栏【2 3 - a ) 的曲边求旋厦，并将方程( 2 3 _ b ) 代入，得到 v ( v e ) 一v b = - 印窘 协4 ， 而根据场论公式可知 v ( v x e ) = v ( v - e ) v 2 e ( 2 5 ) 由于v e = 0 ，所以可以得到 v x ( v x e ) = 一v 2 e ( 2 6 ) 因此得到 v 2 e 一掣宴：o ( 2 - 7 ) 。2 一 相类似地，将麦克斯韦方程组中的电场矢量e 消去，也可以得到磁场b 的方程 v 2 b 一掣窘= 。 ( 2 - 8 ) 方程( 2 7 ) 和( 2 8 ) 即为标准的波动方程。若令 i v = ；一 、掣 根据波动方程，v 是电磁波在介质中的传播速度 度c 之间存在下列关系【2 1 1 ( 2 9 ) 它和电磁波在真空中的传播速 v ：、! ，! 一三( 2 - 1 0 ) 忙而丽2 i 其中c = 1 毛风，n = 以是介质的折射率，其中昌，是介质的相对介电常数， “是介质的相对磁导率。对于非铁磁质的介质，4 a l ，”= 、i 。由此可见， 传统的折射率从速度的角度描述了介质对光波的调制作用，这里指的光传播速度 是指光波的相速度。因此，常规光学介质内的折射率分布对光波的调制作用表现 为沿不同传播路径的光波具有不同的相位延迟，如平面波经过个相位物体之 后，将成为一个褶皱的波面，这个波面会产生衍射现象。 硕士学 立论文生杨组织折射率概念的界定与测试方法研究 2 ，2 光与物质相互作用的谐振子理论 麦克斯韦的重要成就之一就是将光的现象和电磁现象联系起来，般称之为 光的电磁理论。光的电磁理论证明，在真空中光波是以恒定速度c 传播的高频电 磁场，这个恒定速度c 与光波的频率无关；而在介质中，光波的折射率等于、函：， 这样麦克斯韦就将电磁波( 包括光波) 在介质中的传播速度和介质的介电常数联 系起来并成功地解释了光在介质中传搔的很多物理现象，姐干涉、蕊射等，但是 光的电磁理论无法解释光的色散现象，即光在介质内传播时，其速度随光波频率 变化的现象。 当考虑单一频率光波在介质肉传播时，其只受介质折射率起伏的调制，从而 产生散射、衍射、干涉等光学现象。当在介质内传播的光波为非单一频率的光波 时，还将出现光坡的色散现象。光波在介质内传播时的色散现象的严格解释涉及 了原子物理和量子力学的知识，在这里不作详细的解释。为了直观地理解，我们 可以采用唯象的洛伦兹模型进行分析讨论。在洛伦兹模型中，入射光场作用下的 物质可以看成是有规则摊烈的电偶极子的集合，电偶极子作为辐射的次级子波奁 j 源发射电磁辐射，这些次级子波与入射波相互叠加，形成介质内的光场或电磁辐 射场。此光场的位相较入射波发生了变化，这反映了光在介质内传播时的相速发 生了变化：同时电偶极子在外场作用下作受迫振动导致吸收和色散。下面我们将 对洛伦兹模型作简单的介绍。 可以证明，在一级近似条 牛下( 即s 扫l 的条件下，& 是中性电萄系的最大 线度) ，中性电荷系( 介质中的每个分子就可以看作这样的电荷系 在距离本身 很远处的感应电场和一个偶极子的感应电场相同，这个偶极子的偶极矩与该电荷 系的偶极矩相等。在原子中，带正电的原子核的质量比电子大许多，因此在谐振 的过程中，正电荷的中心可近似看成不动，而负电荷相对于正电荷作振动，每个 这样的原子可以看成是一个偶极子，因此介质可以看成是大量这种偶极子的集 合。而光的色散问题的解决归结于求解在光波电场作用下，电子的位移s 。在光 场中电子的受迫振动的微分方程可表述为【”1 ； 掰。s = e f ，+ r ( 2 - 1 1 ) 式中 e = e e = e e 。e x p ( 一渤f ) ，是介质原子中的电子所受到光波场电场的作用力； f ，：m ，ys ，是考虑电子振动的衰减所出现的阻力； e = 一印：s ，是束缚电子作固有振动得恢复力，其中吼是电子固有振动的角频率； y 阻尼系数： 八射光波的圆频率； e 入射光波的振幅。 亟士i ! 垡论文生物组织折射率概念的界定与测试方法研究 设万栏( 2 - 1 1 ) 的解为 s = s oe x p ( i r o t ) 代入式( 2 - 1 1 ) 得 - - 0 9 + 0 ) 0 2 一国，) s 。2 老e 0 ( 2 - 1 2 ) 因此 s 。2 可孑e 碉e o ( 2 - 1 3 ) 上式所描述的电子的受迫振动与力学中质点的受迫振动的形式是一样的。当 0 9 = 。时振动最大，即为共振现象，这时简谐振子吸收光波能量最大。 电子的振动将使原子变成一个振荡偶极子，其电偶极矩为p s 。设介质单位体 积内有个原子，这样介质的极化强度为 k 2 等南 池 m p 一曲+ 脚j j 卯y 由于 因此有 因此 d = s e = 矗e + p ( 2 1 5 ) 聍2 2 言2 ，+ ；= ；= _ i = 南 c z 一，s ， 式中，单位体积物质的原子数目； 0 3 原子中电子的固有频率。 对于固体、液体以及压缩气体中的情况，物质原子中的电子在有效场的影响 下振动，除了电磁场外，作用在它上面的还有这个物质的其他粒子的力场。这时 候，作用在电子上的电场e 不再简单地等于入射光场e ，它还与介质的极化强度 p 有关，即 e ：e + 生( 2 1 7 ) 3 氏 如果在前面的计算中把e 换为e + ，作类似的推导，将可以得到适用于固体、液体 和压缩气体的色散公式 7 燕 + = p e = g 硕士学位论文生物组织折射率概念的界定与测试方法研究 n e z 疗2 ：1 + ! 监 = 卯：一2 一= 竖 3 9 0 r e 。 上式又可以化为 篙2 瓣n e 2 协 + 2 3 豫s 。( ：一曲2 ) 此式即为洛伦兹一洛伦茨( l o r e n z l o r e n t z ) 公式。 实际上，当入射光照射到物质上时，原本处于平衡状态的振子在入射波电磁 场的作用下开始作受迫振动，其结果是向四周辐射次级电磁波。由上述结果可知， 谐振子向外发射的是频率为国。的单色球面波，因此振子在运动过程中要受到 个衰减的力的作用，即y 0 ，这时洛伦兹一洛伦茨公式修正为 粤：上了i ( 2 1 9 ) 盯2 + 2 3 e o ，甜：一出2 + i f o 洛伦兹一洛伦茨公式是连接麦克斯韦唯象理论同微观物质理论的一个桥梁，它说 明了介质的折射率是随着入射光波的频率而改变的，即色散现象。 2 3 生物组织的光吸收特性 物质对光的吸收是指光波通过物质后光强减弱的现象。吸收是由于入射光的 部分光能转换成热运动或者是吸收材料中分子的某种振动造成的。一个完全透明 的介质允许光在其内部进行无吸收的传播即经过介质后不产生同频率光波能量 的衰减，对于生物组织，在可见光波段，角膜和晶状体被认为是高度透明的；相 反，如果光辐射很难透过一种介质，那么便称这种介质是不透明的。实际上，所 谓的“透明”和“不透明”的性质是相对的，因为对于同一种介质来说，它们对 于不同波段范围的光波其透明程度是不一样的。另外，我们还必要注意一点；一 种介质的透明程度不仅与其吸收有关，而且还与其散射特性相关，散射和吸收的 存在都将引起光在沿其入射方向上传播能量的衰减，亦即都将影响介质的透明程 度。就吸收而言，它对波长具有很强的依赖性，例如，角膜和晶状体主要是由水 组成的，在红外光谱波段内表现出强烈的吸收，因此从这个角度上看，生物组织 对于光辐射的吸收可以分为两种：一种是一般吸收，即物质对于定光谱范围的 所有波长光辐射的强度呈现相似的衰减，这种物质在可见光的情况下观察呈现灰 色；另一种是选择性吸收，即物质对光辐射的吸收与光波长相关的吸收，这就是 为什么在可见光下很多物质呈现五颜六色的原因。 介质吸收光波( 电磁波) 的能力取决于很多的因素，主要有原子和分子的电 硕士学位论文生物组织折射率概念的界定与测试方法研究 子结构、辐射的波长、吸收层的厚度以及内部参数例如温度或吸收剂的浓度。大 量的实验证明，介质对光的吸收作用造成的光强的相对减小量与吸收层的厚度成 正比，即 塑：一口d ( 2 ，2 0 ) i 式中，口称之为吸收系数，由介质的自身特性决定。对上式积分可得 1 = i o e “。 ( 2 2 1 ) 公式( 2 - 2 1 ) 通常被称为b e e r - l a m b e r t 定律。吸收系数口的倒数也被称为吸收长 度，即从光波入射位置到其强度衰减为初始强度的1 ，口时所经历的路径长度。在 组织光学中，通常采用t 。来表示生物组织的吸收系数，并从概率的角度给出了 其定义，即。等于光子在生物组织传播时单位路径长度上被吸收的概率。 从另一个角度来考虑物质吸收光波的过程，次级波是入射光辐射经过生物组 织后能量消耗的原因之一。由于辐射是振子所存储能量向外散射的原因，因此振 动的振幅不会趋于无穷大，这种衰减被称为“辐射的衰减”，它不会使入射波的 辐射能变成其它形式的能量，而只是向其它方向散射而已。同时，其它过程也会 引起光的“真”吸收，即辐射能转变为其它形式的能量，例如热能。洛伦兹 ( l o r e n t z ) 曾指出这种过程是由一个内部有振子振动的原子与其它原子碰撞所 构成的。这时振动能就可以转变为碰撞原子的平动能，即热能。当振子被迫而发 生很强烈地振动( 国= 印。) 时。这种过程所吸收的能量便特别的多。 图21 和2 2 是几种生物组织吸收光谱的曲线。从中可以看出对于不同波长 的光波，生物组织具有不同的吸收特性。在生物组织中，主要的吸收是由于水分 子以及蛋白质和色素等大分子等引起的。 图21 皮肤、主动脉壁和角膜的吸收光谱。在可见光 范围内皮肤的吸收比角膜组织的吸收高出2 0 3 0 倍。 硕士学位论文生物组织折射率概念的界定与测试方法研究 图2 2 皮肤中的黑色素和血液中的血红蛋白 “； ；：罢：三 ( 2 2 8 ) u卯 可以看出折射率变成了一个复数，因而表现出与金属相类似的性质。当光波通过 生物组织时光辐射能量的部分被生物组织吸收，这里的吸收主要表现为生物组 织中的原子发生受迫振动，光辐射能转化为热能而被消耗。 根据( 2 2 8 ) 式可以将生物组织的折射率重新写为 二= ( 1 + 瞳) ( 2 2 9 ) 式中1 2 , 均是实数，其中茁称为消拳幂攀。 对公式( 2 。2 9 ) 两边平方并结合式( 2 2 5 ) 和( 2 2 8 ) 得出 一2 一厂疗、 ”2 “8 2 岸s + i 丢- i ( 2 3 0 ) 考虑在生物组织内沿z 轴方向传播的平面波方程日 写为 e = e 。e x p l 心2 一c o t ) l 邓o e x - 忙一洲j | 心- 3 1 ) 地唧( 一半z ) 唧 侣r c 、gi 上式中，后面一个指数项反映了平面波在经过距离z 的传播后相位的变化，第 一个指数项反映了由于折射率虚部的存在引起的振幅的衰减。由于光强与振幅 堡主堂垡堡奎二= 竺塑望堡塑墅奎塑垒塑墨塞量型堡查鲨堑壅 的平方成正比，因此经过距离z 后其强度变为 ，= e e = 1 e 0 1 2 e x r ( 一等刁 = oe x p ( - c f z ) ( 2 3 2 ) 式中，。= 1 e 。卜表示在：= 0 处的光强；对比( 2 2 1 ) 可以看出，d 即为生物组织 的吸收系数，与消光系数的关系为 口：三坚：孥n 符 ( 2 3 3 ) c以 式子( 2 3 2 ) 表明光波的强度( 能量) 随着光波进入生物组织的深度的增加而 呈指数规律减小，衰减的快慢取决于生物组织的衰减系数。 2 5 本章小节 我们从光波在生物组织内部传输时光强不断衰减的事实出发，考虑了组织造 成入射光波能量减少的因素，结合经典的谐振子理论分析了光能被生物组织吸收 的原因。与其它普通透明物质不同的是，绝大多数生物组织对于可见光波段呈现 出混浊、高散射的特征并具有一定的电导率，因此生物组织的介电常数呈现出复 数性，进而其折射率也应该是复数的；其实部反映了组织对于入射光波的相位的 调制，而虚部则反映了组织对于入射光波强度的消耗，这种消耗主要体现于在生 物组织中原子的受迫振动。这样，对生物组织复折射率概念的界定使得组织光学 可以将散射及吸收事件归结于折射率及其分布上来，此时组织光学特性的四个参 数便可以统一到组织折射率一个参量上来。 硕士学位论文生物组织折射率概念的界定与测试方法研究 3 生物组织折射率测试研究的进展 正如第一章中所论述的那样，生物组织折射率的研究相对与生物组织其它光 学特性参数的研究显得滞后许多。由于认识的局限性，关于生物组织折射率问题 的研究主要集中于测量生物组织的“等效折射率”。李晖【28 】认为之所以现有研究 中涉及生物组织折射率问题的文献极少，原因在于如果将折射率的本意运用于生 物组织将使理论研究与实验测量陷入不可自拔的泥潭中，同时在组织光学中，折 射率又有其存在的价值，因此他建议引入“等效折射率”的概念。等效折射率更 多地与菲涅尔公式相结合处理不同组织或者组织与其它介质之间的边界问题。这 时候生物组织折射率在概念上与常规光学介质的折射率是一致的，它是一个大于 1 的实数，其在光波的传输过程中起相位调制作用。 3 1 生物组织折射率测试的代表性研究成果 生物组织折射率的研究最早可以追溯到1 9 8 9 年美国h e n r yf o r d 医院肿瘤放 射科的f r a n kb o l i n l 4 】所作的工作。他将裸光纤插入到组织内部，把组织作为光纤 的包层，按照光纤的全反射的条件，用实验的方法测定了组织的折射率。b o l i n 等人在实验中选用了一段长度为1 0 e r a 、折射率为1 4 5 7 ( 6 3 0 n t o 处) 的石英裸光 纤，将石英纤芯和待测组织共轴地放入个涂黑的、不透光的圆柱管内，制成一 根特殊的“光纤”。这样如果测得“光纤”7 l 径角臼，即可求得“光纤”包层即 待测组织的折射率。在实验中，b o l i n 等人测试了四种哺乳动物的组织：牛、猪、 狗以及入。b o l i n 的结果指出，在入射光波长为6 3 28 n m ，除了猪脂肪的折射率 为14 5 5 外，各种哺乳动物组织( 牛的肌肉、肾组织、肝、肺组织；人的血液、 肺、肝和脾组织；猪的肌肉、肾、肝、脾组织等等) 的折射率在13 8 14 1 之间。 b o l i n 同时认为造成折射率差别的原因有四个：样品之问的差异、不同组织类型 之问的差异、种群的差异以及测试波长的不同。 1 9 9 5 年，美国麻省理工大学( m i t ) 的g j t e a m e y t 5 l 等人运用o c t 通过两 种方法钡n 式了人体组织的折射率：第一种方法利用了o c t 能测试光程差的特性； 第二种方法采用o c t 的相干门特性来跟踪样品沿光轴移动时聚焦位置的变化， 并用这种方法测试了离体以及肌体内人体组织的折射率。在第一种方法中，研究 者先以固定的标准反射面为基础，调整o c t 装置是干涉达到最强记录参考臂的 位置；然后将己知厚度为z 的待测样品放置在标准反射面上，再调整o c t 装置 使干涉达到最大并记录参考臂的位置，算出由厚度为z 的待测样品引起的位相延 迟= 。，根据光程匹配条件即可计算待测样品的折射率： 硕士学位论文生物组织折射率概念的界定与测试方法研究 z ( n n ：z 。n ：2 坚 ( 3 一t ) z 其中2 为组织的厚度，z 为额外的光程延迟。在第二种方法中，研究者首先调整 参考臂的光程使得聚焦物镜的焦点刚好落在样品的表面上，然后将样品台向聚焦 ! 一蔓 、一 7 7 7 【 叨n 图31 利用o c t 测试生物组织折射率方案二 物镜方向移动距离z ，这时物镜的焦点落在了待测组织内部( 如图31 所示) 。为 了再次获得最强的干涉信号，参考臂移动了距离位。如果给定z 和缸，根据s n e l l 定理可以求得组织的折射率。对于单层介质可以得到以下方程： rr ，一、 门s i n i t a n 一i 丝! 丛生 ：n a ( 3 2 ) llz + 出j j 其中，聍为待测组织得折射率，n a 为聚焦物镜的数值孔径且s i n 0 = n a 。对于 多层的介质，可以从介质的表面开始重复上述过程计算每一层的折射率，这种方 法非常适合于人体组织。实验中，研究者运用o c t 焦点跟踪法测试了离体的真 皮和在体的食指表皮的折射率，并比较了光程差法和焦点跟踪法测得的离体的人 体真皮组织的折射率，两者的结果较为吻合。 1 9 9 6 年，福建师范大学李晖和谢树森等人运用内全反射的方法测试了几种生 物组织的折射率【6 l 。实验中，研究者使用了一个折射率已知、曲率半径为3 0 m m 的半圆柱形透镜，并将待测的组织置于半圆柱透镜的平端面上。由15 m w 的 h e n e 激光器发出的t e m 0 0 模式的光束从半圆柱透镜的一侧入射到其中，光束 在组织与半圆柱透镜的接触面发生反射并从半圆柱透镜另一侧出射，出射光由光 电探测器接收。其中半圆柱透镜置于分光计的工作台上，因而可以改变入射角来 改变出射光强。根据光电探测器所获得的出射光强与入射角的关系曲线可以得到 组织的临界角，从而计算出折射率。研究者给出了水、人的血液( 取至于研究者) 、 猪的肌肉及表皮、液体及凝结的蛋清的折射率，测量误差小于1 。 1 9 9 8 年，美国德壳萨斯大学地球与自然科学系的d k s a r d a r 和l bl e v y 用 最小偏折角的方法测试了人体全血的折射率【】。研究者设计了一个由三片石英薄 片制成的中空三棱镜，并在其中装满人体的全血。在实验过程中。三棱镜固定在 分光仪的实验平台上，旋转分光仪改变激光的入射角，记录入射光线发生最小偏 折的位置，获得光线的最小偏折角瓦。代入下述公式计算人体血液的折射率： 1 4 硕士学位论文生物组织折射率概念的界定与测试方法研究 s i n f 丝五、 行= 寺 3 - 3 ) s i n ( = ) 其中4 为三棱镜的顶角。实验发现光线很难全部通过稠密的人体血液，因此研究 者用浓度分别为2 0 ，4 0 $ h6 0 的血液水溶液来代替纯的血液，测试了纯水和 上述三种浓度的血液水溶液的折射率分别为1 3 4 ，13 5 ，1 f 3 5 ，1 3 7 ，并以此推 断人体全血的折射率为l - 3 8 。 2 0 0 3 年澳大利亚西澳大利亚大学光学与生物医学工程实验室的 s a a l e x a n d r o v 等人提出并制作了一套用于测试混浊介质折射率的系统，作者称 之为双焦点光学干涉折射率计【8 o 这套装置( 图32 所示) 的基本原理是同时在 待测混浊内产生两个焦点，并通过低相干干涉仪来确定两个焦点之间的光程差， 图3 2 职焦点光学干涉折射率计的结构示意图 从而确定介质的折射率。研究者测试了浓度为5 到7 5 、含脂量2 的牛奶溶 液的折射率，结果为l3 4 + o 0 1 ，并且给出了人体拇指背面角质层的折射率为 15 0 土0 0 2 。 3 ，2 对现行生物组织折射率测试方法的评述 在已有的研究中，研究者主要是从等光程原理和菲涅耳定律两个理论基础出 发探讨生物组织折射率的测量问题。以等效光程原理为基础的测试技术主要为基 于共焦测量o c t 技术的折射率测试方案，该方法能有效地克服组织散射的影响， 同时可对生物组织折射率进行三维活体层析测量，这是其最大的优点；但是系统 较为复杂。在该项研究中。最具代表性的工作为美国g j ，t e a r n e y 等和澳大利亚 的s a a l e x a n d r o v 的研究工作。以菲涅耳定律为基础的测试技术以全反射法为 主，因为光束在组织与载物台界面发生全反射时，由于组织内仅存在倏逝波可忽 略组织后向散射的影响。其它方法有e e b o l i n 等提出的裸光纤探针测量方案、 李晖和谢树森等发展的全反射测试方案等等。这类方法的主要优点在于原理简 硕士学位论文生物组织折射率概念的界定与测试方法研究 单、可避免测量组织与棱镜界面的反射率绝对值等突出优点，但是在现有的研究 中还存在一些不足： ( 1 ) 平均折射率的概念，有文献报道“生物组织平均折射率就是生物组织 光学液体模型中液体的折射率”，我们认为这种认识是存在问题的，正确的定义 应该为“生物组织的平均折射率应该是生物组织内折射率空间分布的统计平均 值”； ( 2 ) 由于生物组织折射率不均性的存在，使得在对组织与棱镜交界面的反 射特性进行测量时，不存在传统意义上的全反射临界角，而现有文献根本没有谈 及此事； ( 3 ) 在现有研究报道中，没有文献给出“全反射临界角”的确定方法，甚 至未曾给出过组织与棱镜界面反射特性的实验测量曲线，而事实上这对于生物组 织折射率的精确测定是至关重要的。 纵观生物组织折射率问题的研究过程可见，生物组织折射率问题在组织光学 的研究进程中是一项长期被忽视或者说是项长期被回避的重要内容。随着医学 光子学的进一步发展，对认识生物组织光学特性涵义和组织光传输规律以及建立 合适的组织光学模型的提出更高的要求，这使得研究者们重新认识到研究生物组 织折射率问题的重要性。医学光子学发展到今天，生物组织折射率问题已不再是 一项可以回避或者是可以抛开不谈的研究内容，而是整个组织光学研究进一步发 展的基石。就组织光学对生物组织折射率的研究现状看，无论是从概念的界定、 还是相关折射率测试技术的发展都存在着大量的工作有待进行，而这一点也是本 论文的重要内容。 硕士学位论文生物组织折射率概念的界定与测试方法研究 4 相衬显微术在生物组织折射率分布观测中的应用 相衬显微术( p h a s e c o n t r a s t m i c r o s c o p y ) 2 4 1 ，最早由荷兰科学家泽尼克( f r i t s z e r n i k e ) 于1 9 3 4 年提出，是种衬度加强的光学方法，可以用其对透明物体进 行观察并获得具有较高对比度的光学图像。相衬术采用了一种能够将微小的相位 变化转换成振幅变化的光学机制，从而可以用于透明相位物体的观测。相衬显微 术是最早利用阿贝( a b b e ) 成像原理以改变物体的频谱信息来改造光场信息的 应用，成功地解决了长期以来对于透明相位物体没有较为有效的观察方法的难 题。泽尼克也因其在相衬显微术上的突出贡献获得了的1 9 5 3 年的诺贝尔物理学 奖。 4 1 相衬显微术的提出 在化学、生物学、冶金学以及矿物学等许多科学领域中，常常会遇到一类特 殊的透明物体，它们与普通物体不同，光线通过这些透明物体后强度不发生变化。 用显微镜观察这一类物体时，视场非常均匀，因此它们的细微结构无法辨别清楚， 这类物体通常被称为相位物体，普通的显微镜下之所以观察不到相位物体的内部 结构，其原因不在于物体的细微结构过于微小，而是它们的衬度太低。例如，某 些细菌就是这样的，细菌没有颜色的痕迹，并且与其所浸入的液体一样的透明。 在相衬显微镜发明之前，对于这类相位物体的观察一般采用染色的方法，但这样 做法带来的后果是容易导致活细胞的死亡，因而无法进行活体动态的监测。 泽尼克刈在研究光栅的过程中，发现光栅主诺线两边会对称地出现“罗兰鬼 线( r o w l a n dg h o s t ) ”，当时有人提出这是由于主谱线和鬼线相干涉的结果，但 泽尼克经过一系列地实验和计算，成功地解释正常谱线和罗兰鬼线之间的区别是 因为相位相差9 0 。的缘故。为了改变这一点，泽尼克制出所谓的“位相板” 在玻璃板上刻划出宽度为小于l m m 、深度为半个波长的浅槽。将“位相板”放 置在光谱中，使光亮的谱线落在浅槽上，而鬼线从玻璃的两边通过，便可以清楚 地看到条纹。在发明了相衬板之后，泽尼克很自然地想到了把相板运用到显微镜 上，他认为物镜后焦面上的中央衍射斑和两侧携带物体信息的较高级次的衍射斑 相比尽管尺寸很小，但与主谱线和其鬼线很相似；两者在空间上可以分开，因而 可以分别处理改变它们的位相差。 泽尼克对相衬法进行了不断的改进。一是采用吸收型的位相板，即在位相板 上对应部分淀积金属层，对直射光进行部分吸收，从而改善其衬比。另一点是将 直条位相板改为圈环形状的位相板，直条形位相板只作用在直射光上，然而充满 1 7 耍士学位论文生物组织折射率概念的界定与测试方法研究 整个物镜孔径的衍射光将有一小部分受到位相板的拦截使这部分光减弱，因 而与直射光干涉形成晕斑。为了矫正这点，泽尼克引人了圆环状位相板，使晕 斑沿各个方向扩展开来，变得模糊，减小了其影响。 4 2 相衬显微术 1 ( x ，y ) - j f - 二lij 叫 厂 d u 口1 1 普通光学显微镜