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苯硼酸衍生物的合成及对 酪氨酸酶抑制作用的研究 专业：有机化学 硕士生：吕开智 指导教师：马林 摘要 酪氨酸酶( e c1 1 4 1 8 1 ) 是一种含铜的多酚氧化酶( p p o ) 。广泛存在于微生 物和动植物体内。在黑色素形成的过程中催化两类反应：羟基化单酚化合物和氧 化邻二酚类化合物成醌。( r o b b ，1 9 8 4 ) 。酪氨酸酶不仅参与动物体内形成黑色 素，还与植物褐变有关。在大多数食物的榻变过程中，起作用的是酶类氧化剂或 非酶氧化剂，。酶类氧化剂可以用酪氨酸酶抑制剂来抑制，非酶类氧化剂的氧化 可以用抗氧剂防止。酶类氧化齐h 被认为为害于植物来源的食品和蔬菜，这与它们 在黑化过程中的作用有很大关系。因此研究酪氨酸酶的抑制剂有很大的应用前 景。 本论文主要分为三章： 第一章介绍了酪氨酸酶的生物活性和应用，及其抑制剂目前的研究状况和发 展前景； 第二章介绍了苯硼酸衍生物的合成及其对酪氨酸酶抑制作用的研究，并总结 苯硼酸衍生物的结构与抑制能力之间的规律。作为今后合成苯硼酸类酪氨酸酶抑 制的基础。 第三章中测定了苯硼酸衍生物对糜蛋白酶的活性的影响。糜蛋白酶也是一种 重要的酶，在人体中起着重要的作用。 关键词：苯硼酸衍生物酪氨酸酶酪氨酸酶抑制剂糜蛋白酶活性 s y n t h e s i so fd e r i v a t i v eo fb e n z o b o r i ca c i da n d s t u d yo nt h ei n h i b i t i o no ft y r o s i n a s e m a j o r ：o r g a n i cc h e m i s t r y n a m e ：l vk a i z h i s u p e r v i s o r ：m al i n a b s t r a c t t y r o s i n a s e ( e c1 1 4 1 8 1 ) ，a l s ok n o w na sp o l y p h e n o lo x i d a s e ( p p o ) ，i sa c o p p e r - c o n t a i n i n ge n z y m ew i d e l yd i s t r i b u t e di nm i c r o o r g a n i s m s ，a n i m a l sa n dp l a n t s t h i sm i x e d f u n c t i o no x i d a s ec a t a l y z e st w od i s t i n c tr e a c t i o n so fm e l a n i ns y n t h e s i s ，t h e h y d r o x y l a t i o no fam o n o p h e n o la n dt h e c o n v e r s i o no fa n o - d i p h e n o l t ot h e c o r r e s p o n d i n go - q u i n o n e ( r o b b , 19 8 4 ) i ti sr e s p o n s i b l e ，n o to n l yf o rm e l a n i z a t i o ni n a n i m a l s ，b u ta l s ob r o w n i n gi np l a n t s i nm o s tf o o d s ，t h eb r o w n i n gp r o c e s sh a st w o c o m p o n e n t s ：e n z y m a t i ca n dn o n - e n z y m a t i co x i d a t i o n t h ee n z y m a t i co x i d a t i o nc a nb e p r e v e n t e db yt y r o s i n a s ei n h i b i t o r sa n dt h en o n - e n z y m a t i co x i d a t i o nc a nb ep r o t e c t e d b ya n t i o x i d a n t s t h ee n z y m a t i co x i d a t i o ni sc o n s i d e r e dt ob ed e l e t e r i o u st ot h ec o l o u r q u a l i t yo fp l a n td e r i v e df o o d sa n db e v e r a g e s t h i su n f a v o u r a b l ed a r k e n i n gf r o m e n z y m a t i co x i d a t i o nh a sb e e no fg r e a tc o n c e r n t h e r e f o r e ，t h es t u d yo nt y r o s i n a s e i n h i b i t o r sc a l lb ew i d e l yu s e do ns e v e r a lf i e l d s t h i st h e s i sw a sd i v i d e di n t ot h r e ep a r t s ： i n c h a p t e ro n e ，t h ef u n c t i o n sa n ds t r u c t u r eo ft y r o s i n a s ew e r ei n t r o d u c e d m o r e o v e rt h el a t e s tr e s e a r c h e so nt y r o s i n a s ei n h i b i t o r sw e r er e v i e w e d i nc h a r t e rt w o ，ii n t r o d u c e dt h es y n t h e s i so fd e r i v a t i v e so fb e n z o b o r i ca c i d ，a n d r e s e a r c h e dt h ei n h i b i t o r ya c t i o no nt y r o s i n a s e ia l s os u m m a r i z e dt h er e g u l a t i o no f d e r i v a t i v e so f b e n z o b o r i ca c i d ss t r u c t u r ew i t hi n h i b i t o r ya b i l i t y i nc h a r t e rt h r e e ，t h e r e l a t i o n s h i p o fd e r i v a t e so fh e n z o b o r i ca c i da n d c h y m o t r y s i n sa c t i v i t yw a sd e t e r m i n e d c h y m o t r y s i ni sa ni m p o r t a n te n z y m et o o ， k e y w o r d s ：d e r i v a t i v eo fb e n z o b o r i ca c i d ，t y r o s i n a s e ，t y r o s i n a s ei n h i b i t o r s ， c h y m o t r y s i n ，a c t i v i t y i i i 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独 立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论 文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文 的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：趴啥 e ii 非i ：m 8 年毛, e lae l 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学 校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电 子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论 文进入学校图书馆、院系资料室被查阅，有权将学位论文的内容编入 有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其他方法保存学位论文。 学位论文作者签名：趴莨 日期：睥6 月4 日 导师签名：马炸 日期：喙年易月垆日 知识产权保护声明 知识产权保护声明 本人郑重声明：我所提交答辩的学位论文，是本人在导师指导下 完成的成果，该成果属于中山大学化学与化学工程学院，受国家知识 产权法保护。在学期间与毕业后以任何形式公开发表论文或申请专 利，均需由导师作为通讯联系人，未经导师的书面许可，本人不得以 任何方式，以任何其它单位作全部和局部署名公布学位论文成果。本 人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名：暑鸭 日期：瑚g 年 8 5 的变位态酪氨酸酶， 1 5 的氧化态形式的酶。 脱氧态( d e o x y t y r a s e o s i a n e ，e d e o x y ) 酪氨酸酶( 又称亚铜离子态) ， 它与脱氧的血蓝蛋白相似，具有一个一价铜离子的双铜结构( c u c u ) 。1 9 3 8 年k u b o w i t z 通过在酶催化二茶酚还原后，每个铜原子可以结合一分子的一氧 化碳证实了这种形式酪氨酸酶的存在。 2 第l 章酪氨酸酶抑制剂的研究进展 1 1 1 2酪氨酸酶催化反应机制 酪氨酸酶的活性中心是由两个含铜离子位点构成。在催化过程中，双核 铜离子位点以3 种形态存在。研究表明与酪氨酸酶结合的双核铜离子活性 中心与在血蓝蛋白中发现的活性中心非常相似 9 , 1 0 】由x 射线吸收光谱 ( x a n e s ，x 2 r a ya b s o r p t i o nn e a re d g e s tr u c t u r e ) 分析，酪氨酸酶和血蓝蛋 白含铜活性中心主要的构象变化基本相同，铜离子位点的几何构型是可变 的。 血蓝蛋白氧化态结晶学和延伸x 射线吸收结构光谱( e x a f s ，e d g e x 2 r a ya b s o r p t i o nf i n es tr u c 2 tu r e ) 的研究结果表吲1 1 】，c u c u 键长约为 0 3 5a m 。每个二价铜离子构型为正四棱锥状，受到两个强的赤道面配位原子 的调控和一个相对较弱的轴向n h i s 配基的调控。形成5 个配位键( 结构可见 图1 2 ) 。 h l 嗨8 l 爹脚 l ， ， c u a o o 鬏i g 弱q 图1 - 2 酪氨酸酶活性中心的双核铜结构2 l 其电子构象为3 d 9 ，即与蛋白上的组氨酸残基上的氮原子形成3 个配位 键。外源氧分子作为过氧化物与铜离子形成两个配位键，占据了铜离子的两 个赤道面位置，并可作为两个铜离子之间的桥联配体。所以，e o x y 活性中 心可以写成c u ( i ) 一0 2 一c u ( i ) ，但通常更适合用过氧化态c u ( i i ) 一0 2 一c u ( i i ) 表示【9 1 。过氧化物的电子结构对于e o x y 的生物功能很重要，由于受强 3 中山大学硕士学位论文苯硼酸衍生物的合成及对酪氨酸酶抑制作用的研究 的o 受体作用，过氧化物带有较少的负电荷，而电子受体与过氧化物的o 轨道上的电子作用，大大的削弱了。一o 键。使之容易断裂。酪氨酸酶被认 为是血蓝蛋白的祖先蛋白，因为酪氨酸酶在非常原始的生物体中也有发现。 e o x y 的结构比血蓝蛋白的结构更紊乱，因此酪氨酸酶相对于血蓝蛋白存在更 多构象不同的底物与其活性中心结合。 人们最早研究酪氨酸酶的基本功能有两个：作为单酚酶羟基化单酚生成 邻二酚；作为双酚酶氧化邻二酚生成醌。其催化机理如图1 3 所示。反应中 首先e o x y 态的酪氨酸酶与一分子酚结合，形成的中间休称为e o x yt 态酶， 接着两个c u 2 + 间的过氧键断裂，将单酚的邻位氢氧化，此时的中间休称为 e o x yd 态酶。在h + 作用下，e o x yd 态酶c u o 键断裂，生成邻二醌和e d e o x y 态的酪氨酸酶或变位态的酶( e m e t ) 。脱氧态的酪氨酸酶可以和0 2 结合再次 形成e o x y 态，循环反应。e m e t 态酶也可以直接与邻二酚结合形成e o x yd 态酶。在单酚酶的催化过程中，单酚与变位态酶分子( e m e t ) 结合形成酶一 单酚复合物，该复合物不能进一步发生反应，是一种终端复合物，它从催化 循环中带走了一部分酪氨酸酶。但当二酚进入循环时，可使变位态酶一单酚 复合物带走的酪氨酸酶慢慢重新回到催化循环中 4 第l 章酪氨酸酶抑制剂的研究进展 h e m 小d e 姗 图1 3 酪氨酸酶催化酚类化合物氧化的机理【1 2 l 1 1 1 3酪氨酸酶在黑色素形成中的作用 酪氨酸酶是黑色素合成的关键酶，而黑色素异常生成造成的色素沉着是动物 衰老及果蔬腐败的重要表象哺乳动物体内黑色素分优黑素( e u m e l a n i n s ) 和 褐黑素( p h a e o m e l a n i n s ) 两种，前一种为棕黑色，后一种为红棕色，两种色素的 比例不同造成毛发皮肤颜色的不同黑素的生物合成是一个由酪氨酸酶( t y r o s i 2 n a s e ) 催化体内酪氨酸( t y r ) 羟化而启动一系列生化反应生成两种黑色素 的过程n 引这一过程最早为r a p e r 所描述，并由m a s o n 验证并补充，s e osy 等n 4 1 曾总结酪氨酸酶在催化黑色素形成的作用。 黑色素生物合成过程可大体分为两个阶段( 图1 4 ) ，第一阶段是由酪氨 酸酶催化酪氨酸被羟化反应形成l 3 ，4 二羟基丙氨酸( l 多巴) ( 单酚酶活 5 中山大学硕士学位论文苯硼酸衍生物的合成及对酪氨酸酶抑制作用的研究 h 。俐n h 2 警驯一警列 l 一酪氨酸l 一多巴多巴醛 驯_ c 多巴醛 ( a ) 酪氨酸酶催化l 一酪氨酸生成多巴胺 - - - - - - - - - - - 谷胱甘肽或 o o h 半胱氨酸 一c 0 0 h h h 2 - - - - - - - - - - - - - - - h n c o o h 羚h c o o 。 二脚c o o h ：勰h 真黑素 m c o o h 褐黑素 混合黑素 ( b ) 多巴胺经过一系列反应生成黑色素 图1 - 4 酪氨酸酶参与黑色素的形成过程 性) ，并进一步将l 一多巴氧化生成多巴醌( - - 酚酶活性) 。这两步反应都是 由酪氨酸酶催化的，酪氨酸酶在这里显示了独特的双重催化功能。第二阶段 从多巴醌( d o p aq u i n o n ) 为原料从两个不同途径分别生成真黑素和褪黑素的 过程。真黑素生成，多巴醌经多聚化反应等一系列反应生成无色多巴色素， 极不稳定的无色多巴色素被另一分子多巴醌氧化为多巴色素，多巴色素经异 构、脱羧生成5 , 6 二羟基吲哚( d h i ) ，5 , 6 二羟基吲哚( d h i ) 由酪氨酸酶催化 6 第1 章酪氨酸酶抑制剂的研究进展 氧化为真黑色素的前体吲哚一5 ，6 一醌( i n d q u ) ；褪黑素生成，多巴醌( d o p a q u i n o n ) 与半胱氨酸( c y s ) 反应生成产生5 - c y s 多巴及5 - c y s 一多巴醌，然后成环、脱 羧变成苯肼噻嗪的衍生物，最后形成褪黑素。在第二阶段，只有少数几步反 应由酪氨酸酶、异构酶或金属离子催化，大部分反应都是自发的，因此酪氨 酸酶是整个黑色素生成反应的限速酶，第一阶段的两步反应是限速步骤。 1 1 2 酪氨酸酶的应用 1 1 2 1在有机合成方面 由于酪氨酸酶作用的底物范围很广，并且对底物羟基位置高度特异性，因而 在有机合成上具有重要应用价值，不但可以利用酪氨酸酶选择性的羟基化能力， 对含有苯酚结构的化合物进行定向修饰；也可以利用酪氨酸酶催化反应生成的邻 醌结构作为活泼中问体合成新的化合物。如m u l l e r 利用酪氨酸酶催化不同取代 酚氧化生成的邻醌作为二烯中间体，与单烯类化合物通过d i e l s a l d e r 反应合成 了一系y u - - 环【2 2 ，2 】辛烯类化合物。郭刚军等人研究了利用酶促反应生成的 邻醌中间体与亲核试剂通过m i c h a e l 加成反应合成具有重要生理活性的胺醌类化 合物f 1 5 】。 酪氨酸酶在用于合成或修饰一些有重要价值的有机化合物方面也引起很多 科学家的注意。p a n d e y l l 6 】等利用该酶合成了具有雌性激素活性的化合物 c o u m e s t r o l ；舳m e d f 【1 7 】等合成出能治疗帕金森病的药物卜d o p a 。 1 1 2 2在环境保护方面 芳香簇化合物( 包括酚类) 广泛存在于工业废水中，它们都是有毒物质，有些 还是致癌物质，对人、畜和农作物都有危害。因此从工业废水中除去酚类等物质 越来越受到人们的关注。酪氨酸酶可以催化氧化单酚化合物一邻苯二酚类化合物 一醌类化合物，后者在水溶液中不稳定，经过一系列酶催化和化学催化反应，自 身聚合或与其它物质( 有机胺类化合物等) 聚合反应形成不溶于水的大分子物质 而沉淀1 1 8 1 。因此酪氨酸酶不仅除去酚类物质，还能去除其它多种有机物，如有机 胺、有机氯化合物等。利用酪氨酸酶处理工业废水的技术已经成熟。 利用酪氨酸酶处理去除酚类污染物时，去除效率受到污染物种类和浓度、酶 7 中山大学硕士学位论文苯硼酸衍生物的合成及对酪氨酸酶抑制作用的研究 的种类和浓度、p h 、絮凝剂和吸附剂以及污染物之间的协同效应等因素的影响。 酶的固定化可以提高酶处理效率和延长酶的使用寿命，降低处理成本。如何 获得廉价的酶源以及制备廉价易得固定化载体自然成为研究利用酪氨酸酶处理 废水领域的新方向【1 9 1 。 1 1 2 3在医药和美容方面 人体皮肤的黑素程度是由黑素细胞决定的，肤色的深浅主要决定于黑色素细 胞的量及细胞合成黑色素的能力皮肤和毛囊的黑素细胞内酪氨酸酶系统的功能 减退、丧失会引起皮肤色素的减少或丧失，从而导致相应的疾病白癜风就是局 限性或泛发性的皮肤色素的脱失引起的疾病。 现在已在白癜风病人血液中发现有抗黑素细胞抗体或抗白癜风抗体。这种抗 体与表皮底部的基底细胞之间的黑素细胞结合后影响了形成黑素细胞的酪氨酸 酶的作用，而使黑素细胞减少，皮肤变白色。y t a k i z a w a 通过研究发现，有的 白癜风患者是由于基因突变引起酪氨酸酶合成不足或酪氨酸酶活性下降或丧失， 这是白癜风最为严重的一种。m t a n i t a 采用等位基因分析方法对病人进行基因 诊断，认为如果不是由于基因缺陷引起的，就可以采用对酶进行激活的方式进行 治疗。常用于治疗白癜风的激活药物是光敏素8 一m o p ，它可在体外诱导黑色 素生物合成。某些中药在体外可直接激活酪氨酸酶活性，对白癜风有很好的治疗 效果，徐建国等研究发现驱虫斑鸠菊可在体外激活酪氨酸酶活性；龙子江等发现 消白灵片可使白癜风动物模型血液中酪氨酸酶含量增加。 虽然黑色素可由酪氨酸转化产生，但在美容保健方面，为了达到美白皮肤的 目的，一方面可以尽量吃少含酪氨酸的食物；另一方面可以在美白化妆品中添加 能抑制酪氨酸酶活性的美自剂，通过抑制酪氨酸酶活性直接抑制黑色素的形成。 陆哗等研究了三种常用美白剂( 对苯二酚、曲酸、熊果苷) 对酪氨酸酶活性的抑制 作用，探讨了其美白作用的机制。国内目前已筛选了具有增白作用的天然产物， 特别是许多中草药对皮肤有明显的增白效果，为美白化妆品的开发提供了依据。 1 1 2 4在食品方面 在食品加工与储藏过程中，经常会发生褐变等变色现象，这些现象许多都是 8 第l 章酪氨酸酶抑制剂的研究进展 由酶促产生的，引起酶促褐变的酶主要就是酪氨酸酶。酶促褐变具有正反两方面 的作用：一方面，为了增加色调，有意加入酪氨酸酶，促进酶促褐变。如在红茶 的制作、葡萄干、枣的晒制、啤酒生产等，为了增加酒的色泽，常需加入适量的 酪氨酸酶。另一方面，绝大多数时候的酶促褐变对食品储藏加工是不利的，褐变 影响食品储藏加工中的效果和质量的稳定。为了保证产品质量，必须抑制酶促褐 变，即尽可能降低酪氨酸酶的活性或使酶永久性失活。防止酶促褐变，常采用的 方法有：加螯合剂，如e d t a ：加抗氧化剂，如抗坏血酸、二氧化硫和硫化物； 加底物抑制剂，如柠檬酸、苹果酸和磷酸；减少氧化，排除空气或限制氧气；让 酶变性失活，热处理或烫漂处理。 1 2 酪氨酸酶抑制剂的研究现状 黑色素广泛存在于哺乳动物的皮肤及视网膜的黑素细胞内。酪氨酸酶催化 作用黑色素生成的前两步反应：酪氨酸经羟基化生成多巴，以及多巴氧化成多巴 醌。多巴醌异构化形成多巴色素后，再由多巴色素通过聚合作用形成黑色素。酪 氨酸酶是一个含铜的多功能糖蛋白，其活性中心有两个铜离子特异性结合位点， 两个铜离子之间有一个内源桥基，并且研究发现铜离子与一个位点的结合可以促 进其与另一个位点的结合。近些年来又发现，酪氨酸酶相关蛋白一1 和酪氨酸酶 相关蛋白一2 等黑色素生成蛋白，也参与黑色素生成过程的调控。随着分子生物 学的发展，酪氨酸酶及其相关蛋白的5 端调控区相继成功克隆，三者的基因结构 也逐渐明确。酪氨酸酶由5 2 9 个氨基酸组成( 蘑菇) ，分子量为5 5 k u ：，比较酪氨 酸酶及相关蛋白，发现其蛋白结构相似程度达到5 0 ，它们都包括一个氨基末端， 一个碳末端的跨膜区域，一个表皮生长因子的拷贝和两个金属结合位点。它们具 有共同的三级结构和结合形成黑色素体蛋白复合物的能力，并且对维持复合物的 稳定性有一定功能。酪氨酸酶及相关蛋白的基因结构在人和鼠已经得到明确。它 们的长度在2 0 6 0 k b 之间，酪氨酸酶基因1 6 k b 长的编码区分散在5 个外显子中， 酪氨酸酶相关蛋白l 和2 基因分别由7 个和8 个外显子组成。有研究发现酪氨酸 酶基因可以通过复制分化形成酪氨酸酶相关蛋白一1 基因，然后后者再通过自身 复制形成酪氨酸酶相关蛋白一2 基因。它们在黑色素合成过程中所起作用不同， 但在序列上有一些同源性，因此又被称之为“酪氨酸酶蛋白家族”。 9 中山大学硕士学位论文苯硼酸衍生物的合成及对酪氨酸酶抑制作用的研究 由于黑色素合成量与酪氨酸酶的活性呈正相关，所以抑制其活性从而减少 黑色素的生成，将有助于治疗色素沉着性皮肤病。早期使用的脱色物质曲 酸的发现，就是人们发现在酿造酱油、豆瓣酱的工厂中，操作工人的双手总是特 别白，从而受到启发。在1 9 0 7 年s a c 0 首先从溜曲霉中分离出曲酸，在上世纪9 0 年代日本开发出曲酸类美白产品。但是随着研究的进一步深入，发现曲酸在空气 中极易被氧化，性质很不稳定。近年来，由于生物技术在化妆品研发领域的广泛 应用，研究可以对皮肤没有毒副作用、更有效抑制酪氨酸酶活性的药物，越来越 引起科研工作者的兴趣。 1 2 1 酪氨酸酶抑制剂的作用机制 自从认识到酪氨酸酶的重要生理活性，国内外很多学者致力于寻找具有特异 的、高效的酪氨酸酶抑制剂，研究抑制作用机理、抑制动力学、以及抑制剂的应 用。研究人员致力于筛选酪氨酸酶抑制剂，主要有以下3 个渠道：( 1 ) 从天然植 物组织分离提取：( 2 ) 从商品化合物筛选；( 3 ) 有机合成出新的化合物。 对找到的众多酪氨酸酶抑制剂，现在的学者主要根据其抑制黑色素形成过程 中所起的作用不同，对酪氨酸酶抑制剂进行分类。见表1 1 。 表1 - 1 酪氨酸酶抑制剂的4 种抑制机制 类型 主要机理 底物类似物结合酶的活性中心抑制酶活性。如五羟基色胺，间苯酚类、 竞争型 熊果苷等。 抑制剂与酶活性中心以外的氨基酸残基结合及抑制剂对过氧自由基的清 非竞争型 除作用。 混合型 抑制剂对酶活性中心的内源桥基的影响。如：芦荟素，氢醌等。 缓慢结合型 抑制剂与酶快速形成复合物，此后经历一个缓慢的可逆异构化过程。 1 2 2 酪氨酸酶抑制剂的研究现状 现在合成或分离出的酪氨酸酶抑制剂种类繁多，按上面介绍的作用机制分类 稍显粗糙，因此这里按化合物含有的官能团进行分类介绍。 1 0 第l 章酪氨酸酶抑制剂的研究进展 1 2 2 1 含酚基的化合物对酪氨酸酶的抑制作用 因酚羟基可与e o x y 态的酶作用，因此含有酚羟基的很多化合物都有一定的 竞争性抑制作用。羟基苯甲酸和羟基苯甲醛对酪氨酸酶均有明显得抑制作用，单 酚基化合物对蘑菇酪氨酸酶均表现为竞争性抑制类型，并且，对位的抑制强度明 显高于邻位或间位，提高幅度达2 - - 一3 倍。熊果甙也是一种含酚基的化合物，对酪 氨酸酶也有抑制作用，虽然其抑制效应明显比羟基苯甲醛和羟基苯甲酸差【2 0 2 1 1 ， 但由于其副作用较小，已作为增白剂添加入美白化妆品中【4 j 。 含间苯二酚结构的化合物大多是酪氨酸酶的抑制剂，当对位存在取代基时， 这类化合物具有很强的酪氨酸酶抑制活性。研究表明，它们可以与酪氨酸酶的双 铜离子活性中心结合，大多数是酪氨酸酶的竞争性抑制剂。目前，4 己基问苯二 酚已作为商品用于虾的保鲜【2 2 1 。 表1 2 酚基化合物对蘑菇酪氨酸酶抑制效应 2 0 , 2 4 l 1 2 2 2 芪类及其类似物对酪氨酸酶的抑制作用 1 ，2 二苯乙烯( s t i l b e n e ，芪，图1 5 ) 化合物广泛的存在于植物体内，具有 重要的生物活性，因此这类结构的抑制剂的研究引起了广泛的关注。从太绿柄桑 木c h l o r o p h o r ae x c e l s a 的心材中分离得到带氯菌素【2 卯、从葡萄等植物中提取出的 白藜芦醇( r e s v e r a tr 0 1 ) 2 6 1 ，以及从桑m o r u sa l b a 中提取出的氧化白藜芦醇 ( o x y r e s v e r a tr o d1 2 7 1 ，均是很强的酪氨酸酶抑制剂，它们的i c 5 0 值分别为1 3 、5 4 6 和1 5l am o l l 。o h g u c h i 等从买麻藤属g e n u sg n e t u m 提取的买麻藤醇( g n e t 0 1 ) 可以 抑$ 1 j b l 6 黑色素的合成【2 8 1 。 中山大学硕士学位论文苯硼酸衍生物的合成及对酪氨酸酶抑制作用的研究 类似于芪类化合物的结构，查耳酮类化合物【2 9 】也具有抑制酪氨酸酶的活性。 ( a ) o ( b ) 图l 一5 芪( a ) 和查耳酮( b ) 化合物的化学结构式 1 2 2 3 黄酮类物质对酪氨酸酶的抑制作用 黄酮类化合物( 图1 们广泛存在于植物中，尤其是许多中药材中含量丰富， 属于酚类化合物，植物中的黄酮大体上可分为“黄酮类 与“黄烷酮类”两大类 物质。已知化学结构的黄酮类物质至少有4 0 0 0 余种，其中包括人们熟知的茶多酚 ( 儿茶素) 、大豆异黄酮( 染料木素与黄豆甙) 和来自柑橘的橙皮甙与柚甙等【3 0 1 。 黄酮具有多种药理作用，其中包括：抗氧化作用、消炎作用、抗癌和抗基因诱变 作用【3 l 】。近年来，许多富含黄酮类物质的植物天然提取物( 如银杏、甘草提取物) 应用于化妆品中【3 2 3 3 1 。 r r 4 。 r eo a ：r 3 = r s = r 7 = r 3 = r 4 = o h ，r 6 = hb ：r a = r s = r t = o h ，r 3 = r 4 = r 毛= h c ：r 3 = r 7 = r 3 = r 4 = o h ，r s = r 6 = hd ：r 3 = r 7 = r 4 = o h ，r s = r 3 = r 6 _ l e ：r 3 = r s = r 7 = r 4 = 心= o h ，r 3 = h r s = r t = r 3 = 心= o h ，r 3 = r 6 = h g ：r s = r 7 = r 3 = r 4 = o h ，r 3 = 心一h hr s = r - r = o h ，r 3 = r 3 = 凡= 心_ h i ：r s = r 7 = r 3 = r 4 = o h ，r 毛= h ，r 3 = o x 图1 - 6 类黄酮：( a ) 栎精；( b ) 高良姜精；( c ) 非瑟酮；( d ) 3 ，7 ，4 三羟基黄酮；( e ) 桑色素； ( f ) 毛地黄黄酮；( 曲芹菜素；( h ) 5 ，7 2 - - - 一羟基黄酮；( i ) 栎精2 3 2 - 芸香糖甙 1 2 第l 章酪氨酸酶抑制剂的研究进展 同芪类化合物一样，黄酮类化合物也是酪氨酸酶的有效抑制剂。x i e 等聊】研 究了一系列黄酮类化合物对酪氨酸酶活力的影响，实验结果表明：栎精( a ) ，高良 姜精( b ) ，非瑟酮( c ) ，3 , 7 ，4 一三羟基黄酮( d ) 和桑色素( e ) 这些黄酮醇是酪氨酸酶的竞 争性抑制剂。根据它们的结构可以推测它们是以螯合酶活性中心的铜来抑制酶活 力。而相应的黄酮：毛地黄黄酮( d ，芹菜素( 曲和5 ，7 二羟基黄酮( h ) 就无法螯合 酶活性中心的铜。另外，如果3 羟基被一个大的基团如芸香糖苷保护起来，栎精 - 3 芸香糖甙也无法抑制酶活性。有一个游离的3 羟基对黄酮醇的螯合能力似乎是 必须的。这些黄酮醇螯合活性中心的铜从而抑制二酚酶活力。这一螯合反应是可 逆的，而底物对酶有很强的保护作用。底物的存在可以阻止黄酮醇对酶的抑制。 桑色素( e ) 对栎精( a ) 的i c 5 0 值比例是1 4 4 ，而它们抑制常数的比率是1 4 3 ，表明 栎精( a ) 对蘑菇酪氨酸酶的抑制力比桑色素( e ) 强1 4 倍。栎精( a ) 和桑色素( e ) 的抑制 力区别来源于他们b 环取代基的不同。桑色素( e ) 的3 和67 羟基之间形成分子内 氢键干扰了3 氢键和4 一羰基与酶活性中心的铜形成螯合构象，因此对酶的抑制力 较低。 随着黄酮类新化合物的发现，如从福树g a r c i n i as u b e l l i p t i c a 叶子部分的甲醇 提取物中分离纯化出两种二黄酮化合物1 3 5 1 ，从苦参s o p h o r af l a v e s c e n s 的根部甲 醇提取物中提取出三个黄酮类化合物【3 6 1 。这些黄酮类化合物中3 一位均不存在羟 基，但抑制活性均很强，后三种化合物甚至强于曲酸的抑制强度。但这几种化合 物中均具有间苯二酚的结构，说明3 一位不是黄酮类具有抑制活性所必须的，而间 苯二酚的结构对于该类化合物的抑制活性具有重要的影响。 1 2 2 4 醛类和羧基化合物对酪氨酸酶的抑制作用 醛类化合物可以从植物中提取，如茴香醛 3 7 1 、枯茗醛【3 引、对甲氧基水杨醛 【3 9 】。该类化合物主要是通过羰基与酪氨酸酶活性中心周围的亲核基团如：- - s h 、 一n h 2 、- - o h 结合1 4 0 1 ，形成稳定的螯合配体结构( 席夫碱结构) ，生成的产物在 酪氨酸酶的疏水性环境中能稳定存在，并在活性中心周围形成空间位阻，阻止底 物与活性中心作用，从而抑制酪氨酸酶的催化活性，抑制黑色素的合成。 带有羧基的化合物如苯甲酸一0 1 、枯茗酸( c u m i c a c i d ) 【4 、肉桂酸类衍生物【4 2 】 等对酪氨酸酶都有显著的抑制作用。苯甲酸族化合物，在苯环的取代基团的类型 1 3 中山大学硕士学位论文苯硼酸衍生物的合成及对酪氨酸酶抑制作用的研究 与位置对于该类化合物的抑制活性也有重要的影响，也就是说研究抑制剂与酪氨 酸酶的构效关系在抑制剂的研究中是非常重要的。从酶学的角度来看，带羧基类 化合物对氧化态的酶( e o x y ) 的作用机理与酪氨酸酶与底物的作用机理不同因 为羧基是强吸电子基，它抑制了e o x y 中的氧原子与芳环的取代反应，于是e o x y 与之形成的化合物成了终端化合物，从而降低了黑色素合成过程中的酪氨酸酶浓 度，抑制黑色素的合成。羧酸型抑制剂也能通过与酪氨酸竞争e m e t 来抑制黑色 素的合成，这有待于用实验进一步证实。 1 2 2 5 苯硼酸类化合物对酪氨酸酶的抑制作用 苯硼酸类衍生物都含有图1 7 所示的结构单元。其中硼原子上的2 个羟基与 邻二酚中的羟基类似，可与酪氨酸酶中的2 个c u 2 + 络合，使其活性中心失活，达 到抑制酪氨酸酶的作用。近年虽然有大量关于苯硼酸衍生物合成的文献报道，但 国内研究其在酪氨酸酶抑制方面的文献却还没有，不过从本研究小组的实验数据 上看，可以预见苯硼酸衍生物会成为新一代的酪氨酸酶抑制剂。 p h ? b 、 i o h 图1 7 苯硼酸 1 2 3 酪氨酸酶抑制剂的研究前景 在过去几十年里的研究，已对酪氨酸酶抑制物的作用机制、酶反应动力学及 其影响因素有了进一步的认识，并合成了大量有价值的抑制剂。现在，虽然酪 氨酸酶基因3 端的空问结构还不清楚，但对酪氨酸酶基因的研究正在不断深入。 人酪氨酸酶合成水平，因皮肤类型不同而发生变化。肤色较深的皮肤酪氨酸酶活 性大约是肤色较浅皮肤的3 倍。而酪氨酸酶活性差异除了与酪氨酸酶合成水平有 关外，还应考虑以下因素：酶蛋白翻译后加工存在差异，酪氨酸酶基因转录 后m r n a ：，经选择性拼接生成不同类型酶蛋白。随着基因工程研究的深入，国 内外已有相关研究的报道，即通过对酪氨酸酶的抑制基因的研究，用特殊的病毒 做载体，将其转染到皮肤黑色素沉淀部位和黑斑生成部位，用来下调酪氨酸酶的 1 4 第l 章酪氨酸酶抑制剂的研究进展 表达，减少多巴胺的合成，从而使黑色素的生成下降。还有报道黑色素反转化因 子，能分别与酪氨酸酶、多巴色素互变酶、5 , 6 二羟基吲哚羧酸氧化酶基因转录 的m r n a 结合，通过阻止这些酶的合成，减少黑色素的合成量，从而防止色素 增多。由于酪氨酸酶抑制物广泛的应用前景，研究可以长期使用的、安全、有效 的药物是国内外许多研究机构及药物公司开发的热点和方向。 1 3 实验研究内容 酪氨酸酶是一种金属铜蛋白，广泛存在于自然界中，在生物体合成黑色素过 程中起着关键作用。寻找好的酪氨酸酶抑制剂，对于治疗色素障碍性疾病、恶性 黑色素瘤、白化病和老年性痴呆等疾病有着积极重要的意义。 本论文的工作主要分为两个部分： 第一部分( 第二章) ：合成一系列苯硼酸衍生物。利用紫外光谱分析其对酪 氨酸酶的抑制能力，总结活性与化合物的结构之间的规律。测定抑制活性较好的 化合物的i c s o 值。有激活能力的衍生物的激活率的测定。 第二部分( 第三章) ：糜蛋白酶在人身体里也是一种重要的酶。因此也测定 了苯硼酸衍生物对糜蛋白酶的活性。 1 5 生坐盔兰堡圭堂垡笙奎 一 苯硼酸衍生物的合成及对酪氨酸酶抑制作用的研究 参考文献 【1 】s h n c h e z - f e r r e r , ，r o d r i g u e z - l 6 p e zjn ，g a r c i a - c f i n o v a s ee ta 1 t y r o s i n a s e ：ac o m p r e h e n s i v e r e v i e wo f i t sm e c h a n i s m j b i o c h i m i c se tb i o p h y s i c aa c t a , 1 9 9 5 ，1 2 4 7 ：l 一1 1 2 【2 】陈清西，宋康康酪氨酸酶的研究进展【j 】厦门大学学报( 自然科学版) ，2 0 0 6 ，4 5 ( 5 ) ： 7 31 - 7 3 7 【3 】李韶勇，孙命，曲娜等黑色素的合成及其常见抑制剂的作用机理【j 】天津师范大学 学报( 自然科学版) ，2 0 0 2 ，2 2 ( 1 ) ：1 7 2 2 【4 】宋康康，邱凌，黄璜等熊果甙作为化妆品添加剂对酪氨酸酶抑制作用叨厦门大学学 报( 自然科学版) ，2 0 0 3 ，4 2 ( 6 ) ：7 9 1 7 9 4 【5 】王白强，曾晓军酪氨酸酶活性的抑制研究及皮肤美白化妆品的研制阴福建轻纺， 2 0 0 5 ( 7 ) = 1 - 6 【6 】韩强，林惠芬，朱玲莉几种中药提取物对酪氨酸酶活性的抑制【j 】香料香精化妆品， 1 9 9 8 ，1 2 ( 4 ) ：2 2 2 4 【7 】m c e v i l yaj ，i y e n g a rr ，o t w e l lws s u l f i t ea l t e r n a t i v e p r e v e n t ss h r i m pm e l a n o s i s j f o o d t e c h n o l o g y , 19 9 1 ，4 5 ：8 0 - 8 6 【8 】张宗炳，冷欣夫杀虫药剂毒理及应用【m 】北京化学工业出版社，1 9 9 3 【9 】g a s t e lmv ，b u b a c c ol ，g r o e n e nej j ，e ta 1 e p rs t u d yo ft h ed i n u c l e a ra c t i v ec o p p e rs i t e o f t y r o s i n a s ef r o mstr e t o m y c e sa n t i b i o t i c u s 【j 】f e b sl e t t ，2 0 0 0 ，4 7 4 ：2 2 8 2 3 2 1o h i m m e l w r i g h trs ，e i c k m a nnc ，l ub i e ncd ，e ta 1 c h e m i c a la n ds p e c tr o s c o p i cs t u d i e s 0 ft h eb i n u c l e a rc o p 2 p e ra c t i v es i t eo fn e u r o s p o r a t y r o s i n a s e ：c o m p a r i s o nt o h e m o c y a n i n s j 】j a m c h e m s o c ，1 9 8 0 ，1 0 2 ：7 3 3 9 7 3 4 4 11 l o n g asd ，a s c o n el ，b i a n o c o n ia ，e l ：a 1 t h ed i n u c l e a rc o p p e rs i t es tr u c t u r eo f a g a r i e u sb i s p o r u st y r o s i n a s ei ns o l u t i o np r o b e db yx 2 r a ya b s o r p t i o ns p e c tr o s c o p y j 】j b i 0 1 c h e m ， 1 9 9 6 ，2 7 1 ( 3 5 ) ：2 1 0 2 5 - 2 1 0 3 0 1 2 】殴志敏，王普，王鸿，柳彩波酪氨酸酶的应用研究进展中国生物工程杂志，2 0 0 5 ： 1 6 3 - 1 6 9 b 3 s d n c h e z f e t t e r ，ar o d r lg u e z l 6 p e zjn ，g a r c i a - c d n o v a sf ，e ta 1 t y r o s i n a s e ：a c o m p r e h e n s i v er e v i e wo fi tsm e c h a - n i s m j b i o c h i m b i o p h y s a c t a ，1 9 9 5 ， 1 2 4 7 ：1 一1 1 1 6 第l 章酪氨酸酶抑制剂的研究进展 1 4 s e osy ，s h a r m avk ，s h a r m an m m l l r o o mt y r o s i n a s e ：r e c e n tp r o s p e c ts 【j 】j a 酽c f o o dc h e m ，2 0 0 3 ，5 1 ：2 8 3 7 - 2 8 5 3 【1 5 g u 0g a n g - j u n ，e ta 1 a c t ac h i m i c as i n i c a ，2 0 0 2 ，6 0 ( 3 ) ：9 9 5 0 4 【1 6 p a n d e y ，g m u r a l i k r i s h n a ，c t e t r a h e d r o n l e t t 1 9 9 0 ，3 1 ：3 7 7 1 3 7 7 4 【1 7 a h m e d ，g v u l p h s o n b i o c h n o ll e t t 1 9 9 4 ，16 ：3 6 7 - 一3 7 2 【1 8 w a l s hc e n z y m a t i cr e a c t i o nm e c h a n i s m s m 1 9 7 9 ：4 6 1 4 6 3 【19 n e l s o nd u r a n ，e ta 1 e n z y m ea n dm i c r o b i a l t e c h n o l o - - - g y 2 0