（环境科学专业论文）两株海洋玫瑰杆菌与其噬菌体之间相互关系的研究.pdf

摘要 定，揭示r d j l 1 至少由1 2 种不同的蛋白质所组成，其中4 个蛋白为其宿主同 源蛋白，另外的8 个蛋白由于在现有的数据库中找不到其同源匹配物，被认为是 目前未知的新蛋白。以我们所知，本文中r d j l 1 代表了第一株分离到的好氧不 产氧光合异养菌( a e r o b i ca n o x y g e n i cp h o t o t r o p h i cb a c t e r i a ，a a p b ) 噬菌体， 为将来人们研究a a p b 与其噬菌体之间的相互关系拉开了序幕。 其次，结合使用原子力显微镜成像技术( a t o m i cf o r c em i c r o s c o p y ，a f m ) 与比较蛋白质组学的方法，我们对噬菌体r d j l 1 感染r d e n i t r i f i c a n so c h l l 4 的 整个过程中，宿主菌的动态响应过程及机制进行了研究与探讨。在原位状态下， 对受感染宿主菌的实时a f m 成像揭示了r d e n i t r i f i c a n so c h l1 4 在受噬菌体感染 的整个过程中其细胞表面形态的动态变化过程，尤为值得一提的是，噬菌体裂解 细菌这一极其短暂的动态过程被以a f m 图片的形式追踪记录了下来，这也是原 子力显微镜技术在原位实时地观察噬菌体裂解细菌这一短暂过程中得以成功应 用的首次报道，为人们直观的了解噬菌体感染细菌的动态过程提供了珍贵的图片 资料。另外，利用基于双向凝胶电泳( 2 d p a g e ) 与m a l d i t o fm s m s 质谱鉴 定技术的蛋白质组学方法，对r d e n i t r i f i c a n so c h l1 4 受r d j l l 感染后不同时间 点( 分别是受感染后的0 、o 5 、1 5 、3 和4 5h ) 的蛋白质组表达谱进行了比较与 分析，发现r d e n i t r i f i c a n so c h l l 4 受噬菌体感染后，在很短的时间( 约3 0 m i n ) 内即能够完成全部的蛋白质响应，所需时间大大短于噬菌体r d j l l 在其宿主细 胞内的潜伏时间( 约8 0m i n ) ，对宿主细菌蛋白质的双向电泳图谱进行比较分析 后，发现约有9 1 种蛋白质点的表达发生了显著变化。为了对这一响应机制进行初 步的了解，我们对部分重要的响应蛋白进行了质谱鉴定，并对其生理功能进行了 探讨。从一个新的视角出发，该研究将有助于我们对细菌与噬菌体( 尤其是海洋 细菌与其噬菌体) 之间的相互关系进行更加全面的了解。 在噬菌体感染原核生物细胞的过程中，一些原核生物细胞有时可以通过突变 获得对某些噬菌体的抗性，从而得以存活下来。m 1 是由海洋玫瑰杆菌s i l i c i b a c t e r p o m e r o y id s s 一3 在噬菌体o1 感染的强胁迫诱导作用下产生的一株突变体，它获 得了一种能抵抗噬菌体l 感染的能力。在本论文最后部分，我们对突变株m l 抵抗噬菌体l 感染的作用机制进行了研究，逐对以下几种机制发生的可能性 进行了排除，它们分别是流产感染、吸附抑制、以及基于c r j s p r s ( c l u s t e r e d 摘要 r e g u l a r l yi n t e r s p a c e ds h o r tp a l i n d r o m i cr e p e a t s ) 的抗感染机制。最后，利用比较蛋 白质组学的方法，对d s s 3 与其突变株m 1 的蛋白表达图谱进行比较分析后，发现 胞内4 种高丰度蛋白的某种翻译后修饰可能赋予了突变株m l 对噬菌体r d j l ol 感染的抗性作用，其中的一种蛋白质经m a l d i t o fm s 分析后，被成功鉴定为 一种基于& p o m e r o y id s s 3 基因组进行注释得到的假定蛋白( s p o a 0 3 4 3 ) 。该部分 的研究结果暗示了像s p o a 0 3 4 3 这类蛋白的某种翻译后修饰参与了细菌抵抗噬菌 体感染的过程。以我们所知，这是将蛋白质组学技术引入到细菌对噬菌体感染的 抗性机制研究中的首次报道，丰富了人们对细菌抵抗噬菌体感染的方式和机制的 了解。 关键词：r o s e o b a c t e rd e n i t r i f i c a n so c h l1 4 ；s i l i c i b a c t e r p o m e r o y id s s 3 ；玫瑰杆 菌噬菌体r d j l l ；噬菌体l ；分离与鉴定；宿主响应；抗噬菌体感染机制 a b s t r a c t a b s t r a c t p h a g e sa r et h em o s ta b u n d a n tm i c r o b i a lg r o u pi nt h eo c e a n t h e yp l a yi m p o r t a n t r o l e si nd o m i n a t i n gt h em o r t a l i t yo fp r o k a r y o t i cc e l l s ，s t r u c t u r i n gt h em i c r o b i a l c o m m u n i t y , i n f l u e n c i n gt h e m i c r o b i a lf o o dw e bp r o c e s sa n dp r o m o t i n gt h e b i o g e o c h e m i c a l ( s u c ha sca n dne t c ) c y c l e si nt h eo c e a n s i n c ep h a g ei n f e c t i o nh a s a ni m p o r t a n ti m p a c to nt h eb a c t e r i a lp h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lp r o c e s s ，f o ra c o m p r e h e n s i v e l yi n v e s t i g a t i o na n de v a l u a t i o no ft h ek i n e t i cp r o c e s sa n de c o l o g i c a l s i g n i f i c a n c eo fo n em i c r o b i a lg r o u p ，t h es u b s t a n t i a le x i s t e n c eo fp h a g e si nt h e s u r r o u n d i n ge n v i r o n m e n ta n dt h e i ri n t e r a c t i o n sw i t ht h e s eb a c t e r i aw o u l db ea n i n d i s p e n s a b l ef a c t o rt ob ec o n s i d e r e d s t u d i e so nt h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e nb a c t e r i aa n d p h a g e sa r eo fg r e a te c o l o g i c a lm e a n i n g s i nt h i ss t u d y , t h et w ob a c t e r i a ，r o s e o b a c t e r d e n i t r i f i c a n so c h l14a n ds i l i c i b a c t e rp o m e r o y id s s - 3 ，w h ob o t hh a v ea ni m p o r t a n t e c o l o g i c a l s t a t u si nt h eo c e a n ，w e r es e r v e da s t h eh o s tb a c t e r i at oi s o l a t et h e i r s u s c e p t i v ep h a g e sa n dt os e tu pt h e i rs p e c i f i ch o s t p h a g es y s t e m s ，t h e nu s i n gt h e s e h o s t p h a g es y s t e m s ，t h ei n t e r a c t i o n so fh o s tb a c t e r i aa n dt h e i rp h a g e sw e r e i n v e s t i g a t e d f i r s t l y , b yu s i n gr d e n i t r i f i c a n so c h l1 4a st h eh o s tt oc h a l l e n g ev i r a l c o n c e n t r a t ec o l l e c t e df r o mt h es o u t hc h i n as e a w ei s o l a t e dt h er o s e o p h a g er d j l 1 a n dt h e nc h a r a c t e r i z e dt h i sp h a g ef r o ms e v e r a la s p e c t s ，s u c ha sp h a g em o r p h o l o g y , g r o w t hc h a r a c t e r i s t i c s ，h o s tr a n g e ，n u c l e i ca c i d sa n dp r o t e o m i cc o m p o s t i o n ，e t c t r a n s m i s s i o ne l e c t r i cm i c r o s c o p yr e v e a l e dt h a tr d j l 1h a sa ni s o m e t r i ch e a d ( c a 6 9n mi nd i a m e t e r ) a n dal o n g ，f l e x i b l e ，n o n c o n t r a c t i l et a i l ( c a 17 0n ml o n ga n dc a 9 a mw i d e ) ，m o r p h o l o g i c a l l y b e l o n g i n gt ot h es i p h o v i r i d a ef a m i l y t h es t r o n g r e s i s t a n c et oc h l o r o f o r mi n d i c a t e dt h a tr d j l 唾 1i sa l i p i d f r e ep h a g e i ti sc a p a b l eo f r a p i dl y s i so fh o s tc e l l sw i t hab u n ts i z eo fc a 2 0 0p h a g e sp e rc e l la n dal a t e n tp e r i o d o fc a 8 0m i n h o s t r a n g et e s tr e v e a l e dah i g h l ys p e c i f i ci n f e c t i v i t yo fr d j lo 1w h i c h c a no n l yi n f e c t 足d e n i t r i f i c a n so c h l14a m o n g2 4t e s t e db a c t e r i a ls t r a i n s i t s i v d o u b l e s t r a n d e dg e n o m i cd n ai sr e f r a c t o r yt os e v e r a lc o m m o n l yu s e dr e s t r i c t i o n e n z y m e s ，s u g g e s t i n gt h a ti tc o n t a i n ss o m em o d i f i e dn u c l e i ca c i db a s e s s e q u e n c e a l i g n m e n ta n a l y s i so fa1 , 6 5l - b pp h a g ed n af r a g m e n t ，w h i c hw a sr e v e a l e db y r a n d o m l ya m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a p c r c o u p l e dw i t hc l o n i n ga n ds e q u e n c i n go f t h ea m p l i c o n s ，i n d i c a t e dac l o s er e l a t e d n e s so fr d j l 1w i t ha n o t h e rm a r i n e s i p h o p h a g e j l 0 01 s o d i u md o d e c y ls u l f a t e - p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i so f t h ev i r i o np r o t e i n sr e v e a l e dt h a tr d j l 中1i sc o m p o s e do fa tl e a s t12p r o t e i n s s u r p r i s i n g l y , 4o ft h e mw e r ei d e n t i f i e da st h eh o s tc e l l u l a rp r o t e i n sv i am a t r i xa s s i s t e d l a s e r d e s o r p t i o n i o n i z a t i o nt i m e o f - f l i g h tm a s ss p e c t r o m e t r y m a s ss p e c t r o m e t r y ( m a l d i t o fm s m s ) m e t h o d w h i l es i n c en oh o m o l o g u e so ft h eo t h e r8p r o t e i n s w e r ef o u n di nt h en c b id a t a b a s e ，t h e yw e r ec o n s i d e r e dt ob en o v e lp r o t e i n s 尼 d e n i t r i f i c a n so c h l14i st h ef i r s td i s c o v e r e da e r o b i ca n o x y g e n i c p h o t o t r o p h i c b a c t e r i u m ( a a p b ) ，a n dr d j lo 1i st h ef i r s t p h a g ei s o l a t e d f r o mt h ea a p b f u n c t i o n a l g r o u p t h e yr e p r e s e n tt h e f i r s t h o s t - p h a g em o d e lf o rs t u d y i n g t h e i n t e r a c t i o n sb e t w e e na a p ba n di t ss u s c e p t i v ep h a g e s s e c o n d l y ，w ee m p l o y e da t o m i cf o r c em i c r o s c o p ya n dp r o t e o m i ct e c h n i q u e st o i n v e s t i g a t et h eh o s tr e s p o n s e so f 足d e n i t r i f i c a n so c h l14d u r i n gt h ew h o l ec o u r s eo f i n f e c t i o nb yr d j l 1 i ns i t ur e a l t i m ea t o m i cf o r c em i c r o s c o p i ci m a g i n go ft h e i n f e c t e dr d e n i t r i f i c a n so c h l14c e l l sr e v e a l e dt h em o r p h o l o g i c a ld y n a m i cc h a n g e s i nt h eh o s ts u r f a c ef o l l o w i n gp h a g ei n f e c t i o n n o t a b l y , s e v e r a lv a l u a b l ea t o m i cf o r c e m i c r o s c o p i ci m a g e sr e v e a l i n gt h eh i g h l yd y n a m i cp h a g el y s i sp r o c e s sw e r eo b t a i n e d f o rt h ef i r s tt i m e i ts h o w e dt h a ts e v e r a ll a r g eh o l l o w sw i t hi n c r e a s i n gd i a m e t e ra n d d e p t hw e r ea b r u p t l ya n ds u c c e s s i v e l yf o r m e do nt h eh o s ts u r f a c e ，f i n a l l yl e a d i n gt o t h ec o l l a p s eo ft h eh o s tc e l l t h e n ，u s i n gt h et w o - d i m e n s i o n a lp o l y a c r y l a m i d eg e l e l e c t r o p h o r e s i sm e t h o d ，a tag l o b a ls c a l e ，w ei n v e s t i g a t e dt h ed y n a m i cp r o t e i n e x p r e s s i o np r o f i l e so ft h eh o s tc e l l sa td i f f e r e n tt i m e p o i n t s ( 0 ，0 5 ，1 5 ，3a n d4 5h p o s t i n f e c t i o n ) f o l l o w i n gp h a g ei n f e c t i o n i n t e r e s t i n g l y , t h eh o s tp r o t e i nr e s p o n s e s w e r ef o u n dt ob ea l m o s tc o m p l e t e di no n l y3 0m i n ，w h i c hi sm u c hs h o r t e rt h a nt h e l a t e n tp e r i o do fr d j l l ( c a 8 0m i n ) f o rap r e l i m i n a r yi n v e s t i g a t i o no ft h er e s p o n s e m e c h a n i s m ，s e v e r a lr e s p o n s ep r o t e i n sw i t hs i g n i f i c a n tc h a n g e si ne x p r e s s i o nw e r e v a b s t r a c t i d e n t i f i e du s i n gm a l d i - t o fm s m sm e t h o da n da r ed i s c u s s e ds e p a r a t e l yi nt h i s a r t i c l e f r o man e w p e r s p e c t i v e ，t h i ss t u d yc o n t r i b u t e st oo u rk n o w l e d g ea b o u tt h e i n t e r a c t i o n so fb a c t e r i aa n dt h e i rp h a g e s ，e s p e c i a l l yt h o s ew h i c he x i s ti nt h em a r i n e s y s t e m u n d e rp h a g ei n f e c t i o n ，s o m e t i m e ss o m ep r o k a r y o t i cc e l l s c a ns u r v i v eb y o b t a i n i n gam u t a t i o nc o n f e r r i n gu p o nt h e m s e l ft h ea n t i p h a g ea b i l i t y m1i sj u s ts u c ha p h a g er e s i s t a n tm u t a n to ft h em a r i n er o s e o b a c t e rs i l i c i b a c t e rp o m e r o y id s s 3 i nt h e l a s tp a r to ft h i sp a p e r , t h ep h a g er e s i s t a n c em e c h a n i s m so ft h em u t a n ts t r a i nm 1w e r e i n v e s t i g a t e d u p o ne s t a b l i s h m e n to fp h a g er e s i s t a n ts t r a i nm 1o fs p o m e r o y id s s 3 ， o u rr e s u l t se x c l u d e dt h e p o s s i b i l i t i e so fs e v e r a lp h a g er e s i s t a n c em e c h a n i s m s ， i n c l u d i n ga b o r t i v ei n f e c t i o n ，a d s o r p t i o ni n h i b i t i o n ，a n dt h ec l u s t e r e dr e g u l a r l y i n t e r s p a c e ds h o r tp a l i n d r o m i cr e p e a t s ( c r i s p r s ) t h ec o m p a r i s o no fp r o t e i n e x p r e s s i o np r o f i l e sb e t w e e nt h ew i l dt y p es t r a i n ( d s s - 3 ) a n dm u t a n ts t r a i n ( m 1 ) i d e n t i f i e da p o t e n t i a lp h a g er e s i s t a n c er e s p o n s ed u et ot h em o d i f i c a t i o no ff o u rh i g h l y e x p r e s s e dp r o t e i n s o n eo ft h e s ef o u rp r o t e i n sw a ss u c c e s s f u l l yi d e n t i f i e dv i am a s s s p e c t r o m e t r y , a n dm a t c h e dah y p o t h e t i c a lp r o t e i n ( s p o a 0 3 4 3 ) a n n o t a t e df r o mt h e p o m e r o y id s s - 3g e n o m e o u rr e s u l t ss u g g e s tt h a tt h em o d i f i c a t i o no ft h e s ep r o t e i n s l i k et h ep r o t e i ns p o a 0 3 4 3i n v o l v e si nt h e d e v e l o p m e n to fr e s i s t a n c et op h a g e i n f e c t i o n t ot h eb e s to fo u r k n o w l e d g e ，t h i sw o r kc o n s t i t u t e st h ef i r s ta p p l i c a t i o no f c o m p a r a t i v ep r o t e o m i c st ot h es t u d yo fp h a g er e s i s t a n c e a sar e s u l t ，i te x p a n d so u r u n d e r s t a n d i n go ft h ea n t i - p h a g em e c h a n i s m so fb a c t e r i a k e y w o r d s ：r o s e o b a c t e rd e n i t r i f i c a n so c h l1 4 ；s i l i c i b a c t e rp o m e r o y id s s 3 ； r o s e o p h a g er d j l l ；p h a g e l ；i s o l a t i o n a n dc h a r a c t e r i z a t i o n ；h o s tr e s p o n s e ；p h a g e r e s i s t a n c em e c h a n i s m v i 厦门大学学位论文原创性声明 本人呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立完成的研究成 果。本人在论文写作中参考其他个人或集体已经发表的研究成果，均 在文中以适当方式明确标明，并符合法律规范和厦门大学研究生学 术活动规范( 试行) 。 另外，该学位论文为() 课题( 组) 的研究成果，获得() 课题( 组) 经费或实验室的 资助，在() 实验室完成。( 请在以上括号内填写课 题或课题组负责人或实验室名称，未有此项声明内容的，可以不作特 别声明。) 声明人( 签名) ：永小雨 沙7 年月j g 日 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人同意厦门大学根据中华人民共和国学位条例暂行实施办 法等规定保留和使用此学位论文，并向主管部门或其指定机构送交 学位论文( 包括纸质版和电子版) ，允许学位论文进入厦门大学图书 馆及其数据库被查阅、借阅。本人同意厦门大学将学位论文加入全国 博士、硕士学位论文共建单位数据库进行检索，将学位论文的标题和 摘要汇编出版，采用影印、缩印或者其它方式合理复制学位论文。 本学位论文属于： () 1 经厦门大学保密委员会审查核定的保密学位论文， 于年月日解密，解密后适用上述授权。 () 2 不保密，适用上述授权。 ( 请在以上相应括号内打“或填上相应内容。保密学位论文 应是已经厦门大学保密委员会审定过的学位论文，未经厦门大学保密 委员会审定的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的，默认 为公开学位论文，均适用上述授权。) + 声明人( 签名) ：矗办i 雨 珈一7 年月1 8 日 第一章前言 第一章前言 1 1 海洋噬菌体的研究概况 1 1 1 噬菌体的研究历史 噬菌体是一种以原核生物( 包括细菌和古菌等) 为宿主的病毒类群，它最早 发现于1 9 1 5 年。之后，d h e r e l l e 在1 9 1 7 年又再次发现了这种能够裂解细菌的生 物类群，并将其命名为“b a c t e r i o p h a g e ”( d u c k w o r t h ，1 9 8 7 ) 。噬菌体的发现以及 人们后来围绕噬菌体所开展的大量研究，对生命科学的发展具有极其重要的意 义。尤为值得一提的是，人们通过噬菌体侵染细菌的实验，证明了d n a 是生命 的遗传物质，并进而推动了一门全新学科，即分子生物学( d u c k w o r t h ，1 9 8 7 ) 的 问世。继噬菌体被发现之后，人们曾试图利用裂解性噬菌体对细菌的强杀伤作用 来对一些由病原菌所引起的疾病进行治疗，即噬菌体治疗( l e v i n & b u l l ，1 9 9 6 ； s u l a k v e l i d z ee ta 1 ，2 0 0 1 ) 。之后，在一些中东国家及前苏联，这种关于噬菌体治 疗的研究一直开展了下来( m e r r i le ta 1 ，1 9 9 6 ；w r e i n b a u e r ，2 0 0 4 ) 。直到现在，一 些有关这方面的研究报道仍不断见诸科学期刊。 另外，上世纪7 0 年代曾有一些关于噬菌体在微生物网中作用的研究报道。 例如，w i e b e 和l i s t o n ( 1 9 6 8 ) 推测噬菌体可能通过限制细菌的数量、种类、以 及改变细菌的代谢能力和生活史等途径对微生物的生物化学循环起着一定的影 响。然而，这一推测在当时由于缺乏直接的证据，因而没能引起人们足够的重视。 直至十年后，t o r r e l l a 和m o r i t a ( 1 9 7 9 ) 电镜观察到噬菌体在自然环境中的丰富 数量( 1 0 4m l j ) ，并指出这一观察值可能还远远低于其实际丰度，人们才开始 关注起噬菌体在微生物网中可能会起到的重要作用。后来，人们了解到噬菌体在 水环境中的数量极其丰富，约为细菌的十倍之多，关于噬菌体在微生物网及生物 地球化学循环中的巨大潜在作用才真正开始引起了人们的广泛关注。 当前海洋病毒已经成为世界海洋学者及生物学者极大关注的一个研究热点， 研究发现海洋病毒中的绝大多数均为噬菌体( w e i n b a u e r ，2 0 0 4 ) ，它们在调节微 生物群落结构、促进微生物进化、以及在生物地球化学循环中扮演着十分重要的 角色，然而，目前有关海洋噬菌体方面的研究工作还远远不够，人们对其的了解 两株海洋玫瑰杆菌与其啦蕾体之问相互关系的研究 仍然还是处于起步阶段，因此围绕海洋噬菌体开展一系列相关的研究工作将具有 十分重要的生态学意义。 1 1 2 海洋毒( 绝大多数为t 曹体) 的发现、丰度殛其主要粪群 海洋病毒的研究始于2 0 世纪6 0 年代，一段时期内，人们主要是将其视为动 植物的病原体来进行关注和研究。直到2 0 世纪9 0 年代，人们才发现海水中含有 极其大量的浮游病毒，进而围绕浮游病毒在海洋生态系统中可能会行使的重要生 态作用开展了大量的研究工作。如今，有关海洋浮游病毒( v m o p l a n k t o n ) 的研 究己成为海洋生态学研究的前沿热点之一( 焦念志，2 0 0 6 ) 。 彩吲 图卜1 原核生物、原生动物以发病毒的生物量和丰度图( 引自s u t t l e ， 2 0 0 7 ) f i g1 lr e l a t i r eb i o m a s sa n da b u n d a n c e so fp r o k a r y o t e s 。p r o t i s t s a n dv i r u s e s ( s u t t l e ，2 0 0 7 ) 据报道，病毒在海洋中总数量约为1 0 ”个。在表层海水中浮游病毒的丰 度约为t o 7 p a r 6 c l e s m l ，是细菌丰度的5 2 5 倍之多( f u l m m 锄，1 9 9 9 ) 。虽然， 随着海水深度的增加，病毒的数量有逐渐减少的趋势。但在海底沉积物中， 由于营养物质丰富，使得细菌具有非常高的丰度，与其相对应，病毒的数量 也达到了一个极高的水平，约为1 1 矿p a r t i c l c s c 一( s u r e 2 0 0 5 ) 。为了对 海洋中病毒的总量有个形象的认识，s u t t l e ( 2 0 0 7 ) 曾打了一个恰当的比喻来形 第一章前言 容它，“如果将海洋中的病毒头尾相连排成一列，那么这个队伍的长度将比 距地球最近的6 0 个星系相连起来的距离还要长 。 病毒在海洋中的丰度占据了全部生物体的9 4 之多，然而由于其体积微小， 它们在生物量上仅占海洋中总生物量的5 左右。相比之下，原核生物的丰度虽 仅占全部生物体的1 0 ，但其生物量却占据9 0 以上。相对于病毒和原核生物 而言，原生动物是海洋中生物量最低的类群( s u t t l e ，2 0 0 7 ) ( 图1 - 1 ) 。 海洋中的浮游病毒主要包括噬菌体、噬藻体( 或称蓝细菌病毒) 和真核藻类 病毒等。其中噬藻体在分类学上也属于噬菌体。海水中绝大多数的病毒均为噬菌 体( f u h r m a n 1 9 9 9 ；s u t t l e ，2 0 0 7 ) 。 1 1 3 海洋噬菌体的结构特征及其分类 噬菌体个体小、结构简单，主要由蛋白质外壳和包裹在外壳内的核酸所组成， 少数噬菌体还含有少量的糖类或脂类物质。每种噬菌体往往仅含有一种类型的核 酸物质，有的是d n a ，有的是r n a ；有的是双链，有的是单链；有的是线状，有 的是环状。 在2 0 0 5 年国际病毒分类委员会发表的病毒分类一国际病毒分类委员会第 8 次报告中，对噬菌体根据核酸类型、形态结构、基本特征以及宿主菌类型等 特征，进行了系统的分类与命名。较具体的噬菌体分类信息可以参见冯书章等人 发表的文章细菌的病毒一噬菌体最新分类与命名( 2 0 0 7 ) 。由于篇幅限制，本 文在此就不一一展开说明了，而主要对海洋中的噬菌体进行简述。 大多数海洋噬菌体具有头和尾结构的复合形态，核酸为线型双链d n a ( d s d n a ) 。根据其尾部形态特征的不同，可以分为以下三科，分别是长尾病毒 科( s i p h o v i r i d a e ) 、短尾病毒科( p o d o v i r i d a e ) 和肌病毒科( m y o v i r i d a e ) ( s u t t l e ， 2 0 0 5 ) 。如图1 2 所示，肌病毒科噬菌体通常具有一个粗壮且可以伸缩的尾部。 这类病毒往往具有较强的裂解能力，即大多数为烈性病毒。另外，它们的宿主范 围较广，因而也是最容易从海水中分离出来的一类噬菌体。短尾病毒科噬菌体往 往具有一个短且不可伸缩的尾部，它们也具有较强的裂解能力，但宿主范围非常 小，另外，它们对宿主菌感染的专一性很强，因此这类噬菌体也是较少能从海水 中分离出来的一个类群。长尾病毒科的噬菌体，顾名思义，它们通常具有一个长 长的尾部，但与肌病毒科噬菌体不同的是，它们的尾部往往不能伸缩。另外，这 3 两株海洋玫瑰杆菌与其噬苗体之目相互关系的研究 类病毒对宿主菌的裂解能力较弱，常为温和性噬菌体，它们在感染宿主菌时，并 不马上9 1 起宿主菌的裂解，而是将其自身的基因组整合到宿主菌的基因组中，并 随着宿主菌的繁殖而完成它们自身的增殖。它们的宿主范围介于肌病毒科与短尾 病毒科噬菌体之间，是一类较常能从海水中分离出来的噬菌体( s u r 【l e ，2 0 0 5 ) 。 孽，澎 圈l 一2 海洋浮游噬菌体的三个科a ：肌病毒科；b ：短尾病毒科；c ： 长尾病毒科，标尺长度为5 0r t r n ( 引自s u t t l e ，2 0 0 5 ) f i g 1 - 2t h et h r e ef a m i l i e so ft a i l e dd s d n av i r u s e s ( p h a g e s ) t h a ti n f e c t b a c t e r i a ：am y o v i r o s e s ；b ：p o d o v i r u s e s ；c ：s i p b o v i r u s e ss c a l eb a r ：5 0 n m ( s u t t l e ，2 0 0 5 ) 114 海洋搞毒( 包括噬菌体) 的遗传多样性 在对海洋病毒的遗传多样性研究中，早期人们主要是运用限制性片段长度 多态陛( r f l p ) 和杂交分析等方法，后来，随着分子生物学技术的不断发展，一 些较先进的研究手段逐渐被引入到海洋病毒的遗传多样性研究中来，如变性梯度 凝胶电泳、脉冲场凝胶电泳等，近几年，宏基因组学技术开始在海洋病毒的遗传 多样性研究中得到应用，并获得了大量的病毒遗传信息，研究结果揭示了病毒在 第一章前言 海洋中的极大多样性，并提出病毒是地球上遗传多样性最为丰富的生物体。 最初对病毒群落的宏基因组学研究表明，在近海及沉积物中病毒群落的遗 传结构约由成千上万个不同的基因型所组成( b r e i t b a r tc ta 1 ，2 0 0 2 ，2 0 0 6 ) 。近来， 运用一种新的高通量测序技术( 即p y r o s e q u e n c i n g ) 对北冰洋、英国哥伦比亚近 岸海域、墨西哥海湾、及马尾藻海等地所采集的样品进行分析后，获得了约l ，8 0 0 万个不同的病毒基因片段序列，平均每个片段的长度约为1 0 0 b p ，对这些宏基因 组序列片段进行b l a s t 分析后，发现其中9 0 以上的片段序列在现有的数据库中找 不到其同源匹配( a n g l ye ta 1 ，2 0 0 6 ) 。当然，在某种意义上讲，这些基因在数据 库中找不到其同源基因可能是由于其片段序列太短所造成。然而，在其他研究中， 即使使用了一些片段较长的基因序列在数据库中进行b l a s t 分析时，能够找到的 同源匹配也仅仅占3 0 左右( e d w a r d s & r o h w e r , 2 0 0 5 ；a n g l ye ta 1 ，2 0 0 2 ) 。另外， 对不同海区采集的样品进行宏基因组分析，发现它们之间的同源序列也非常少 ( s u t t l e ，2 0 0 7 ) 。由此可见，我们目前对海洋病毒遗传多样性的研究和了解，还 仅仅处于起步阶段，大量的病毒遗传信息对我们而言，还是未知领域。 1 1 5 噬菌体的增殖周期及测定方法 根据噬菌体对宿主细胞裂解能力的大小，主要分为以下三种类型( f u h r m a l l ， 1 9 9 9 ；w e i n b a u e r , 2 0 0 4 ) ，即裂解性感染、溶源性感染和慢性感染。发生裂解性感 染的噬菌体也被称为裂性噬菌体，烈性噬菌体侵入细胞后：可迅速篡夺宿主细菌 的自主代谢系统，并利用其代谢系统进行噬菌体自身物质的合成和增殖，短时间 内即引起宿主细胞的裂解，释放出大量子代病毒，并开始另一个生命循环。发生 溶源性感染的噬菌体也被称为温和噬菌体，这类噬菌体感染宿主细胞时，并不马 上裂解宿主细胞，而是将其基因组整合到宿主染色体的一定位置上，随着宿主基 因组的复制而复制，从而完成自身的传代。但在一定条件下，如遇到环境诱变物 ( 如紫外线、丝裂霉素c 等) 的刺激，即可进入裂解途径，引起宿主细胞的裂解 和子代噬菌体的释放，不过有时候，温和性噬菌体也可自发的进入裂解途径。慢 性感染是一种较为特殊的感染方式，受感染后，宿主细胞可通过泌出或出芽释放 子代病毒，并不引起细胞结构的裂解。此外还有一种称为“伪溶源性 的噬菌体 侵染类型，即噬菌体在侵染并将核酸注入到宿主细胞后，在宿主细胞发生裂解或 5 两株海洋玫瑰杆菌与其噬菌体之间相互关系的研究 破碎之前，噬菌体核酸会在宿主细胞内存留一段时间( l e n s k i ，1 9 8 8 ；w e i n b a u e r , 2 0 0 4 ) 。推测“伪溶源性状态可能与宿主饥饿或免疫状态有关( m o e b u s ，1 9 9 6 ； c h i u r a , 1 9 9 7 ) 。 以烈性噬菌体为例，其感染宿主细菌时的增殖周期主要可分为五个阶段 ( w e i n b a u e r , 2 0 0 4 ) ( 图l - - 3 ) 。分别是吸附、侵入、复制、装配和裂解。 一商6 爱 吸附侵入 宿主细胞的裂解 臼 装配 合成病毒的外壳和尾部 图1 - 3