（无机化学专业论文）含锰配合物的水解性质和sod活性测试.pdf

顽士学住论文 m a s t e r st h e s i s 摘要 采用跟踪反应体系的1 3 c - n m r 的变化，测定配合物【m n 2 ( n r b ) 2 以 0 ) 2 】( c 1 0 4 ) 4 2 h 2 00 3 1 ) 对精氨酸的作用。结果显示在一定条件下，b 1 具有选择性 催化精氨酸发生脱羧、脱氨和d - c 断裂反应，其反应机理可能是羟基离子进攻的 亲核反应历程。 通过x 射线衍射仪测得3 个化合物的晶体结构：【m n ( i d b ) ( c h 3 c h 2 0 h ) c 1 2 】， 【m n ( i m ) 6 c 1 2 。2 h 2 0 和类环二肽化合物( a 1 ) ：1 ，4 一b i s ( ( 1 h - b e n z i m i d a z o l 一2 一y 1 ) m e t h y l ) p i p e r a z i n e 一2 ，5 - d i o n e ( c 2 0 h 1 8 n 6 0 2 ) 。 类环二肽化合物a i ( c 2 0 h 1 8 n 6 0 2 ) 晶体的出现，引起了对金属锰和锌的配合物催 化i d b 水解开环和对水解产物之一( i 蟠：2 - ( ( 1 h b e n z i m i d a z o l 一2 y 1 ) m e t h y l a m i n o ) a c e t i ca c i d ) 分子间脱水关环现象的研究。 测定了7 种含n ，n 二苯并咪唑甲基亚胺n ，n d i ( b e n z i m i d a z 0 1 2 y l m e t h y l ) i m i n e ) ( i d b ) 配合物的s o d 活性，测试结果表明m n ( i i ) 和c u ( i i ) 的配合物包括铜离 子都具有很好的活性，催化反应速率达到了1 0 7 数量级，而f e ( i i i ) 和z n ( i i ) 的配合 物对超氧负离子表现了一定的惰性。 关键词：i d b ；s o d ；含锰配合物；类环二肽化合物；精氨酸催化裂解 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s a b s t r a c t t h er e a c t i o no fa r # n i n eh y d r o l y s i s c a t a l y z e db yt h ec o m p l e x 【m n 2 ( n t b ) k u - o ) 2 】+ ( c 1 0 4 ) 4 2 h 2 0 ( b 1 ) h a sb e e ns t u d i e db yt r a c i n gt h e ”c n m r a n de s i - m s ( e l e c t r o s p r a yi o n i z a t i o nm a s ss p e c t r u m ) t h er e s u l ts u g g e s t e dt h a tt h ea r g i n i n ew a s s e l e c t e d l yd e c a r b o x y l a t e d ，d e a m i n a t e da n dd - cc l e a v e db yc a t a l y s e db yt h ec o m p l e xb 1 ， a n di tm a yb ea n u c l e o p h i l i cr e a c t i o n 一 t h es t r u c t u r eo ft h r e ec o m p o u n d sh a v eb e e nd e t e c t e db yx r a y s i n g l e - c r y s t a l d i f f r a c t o m e t e r , t h e ya r e 【m n ( i d b ) ( c h 3 c h 2 0 h ) c 1 2 ，【m n ( h n ) 6 0 2 2 i - i ：0 ，a n dc y c l o d i p e p t i d ea n a l o g u e1 ，4 - b i s - ( ( 1 h - b e n z i m i d a z o l - 2 - y 1 ) m e t h y l ) p i p e r a z i n e - 2 , 5 - d i o n e ( c a ) t - h s n 6 0 ：, a 1 ) b e c a u s et h e c r y s t a l o fc o m p o u n da 1 ( 1 ，4 - b i s ( ( 1 h b e n z i m i d a z o l - 2 - y 1 ) m e t h y l ) p i p e r a z i n e 一2 ，5 一d i o n e ) a p p e a r e di nm a n yt i m e s ，s oi tc a n tb eaa c c i d e n t a l l yp h e n o m e n a t h ef u r t h e re x p e r i m e n tg a v es o m ei m p o r t a n ti n f o r m a t i o no nt h em n ( i ) o rz n ( i i ) 一 c o n t a i n i n gc o m p l e x e s ，t h e ym a yb eak i n do fh y d r o l a s em o d e lc o m p l e x e s ，w h i c hc a n c a t a l y s ei d bi n t o2 - ( ( 1 h - b e n z i m i d a z o l - 2 y 1 ) m e t h y l a m i n o a c e t i ca c i d ( i d a b ) b yr i n g - - o p e n i n gc l e a v a g er e a c t i o no nt h ei m i d a z o l e ，a n dt h e nt w oi d a bm o l e c u l e sd e h y d r a t e d f o r m e dan e wc o m p o u n da 1 t h es o da c t i v i t yo fs e v e nc o m p o u n d sc o n t a i n i n gd i ( 2 - b e n z i m i d a z o l y l m e t h y l ) - i m i n e ( i d b ) h a v e b e e nd e t e c t e d t h er e s u l ts h o w e dt h a t t h e c o m p l e x e s 【m n ( i d b ) c 1 2 ( c h 3 c h 2 0 h ) 】，【c u ( i d b ) c 1 2 m e o h ，【c u ( i d b ) 2 c 1 2 2 m e o h 2 h 2 0 a n d 【c u ( i d b ) ( n 0 3 ) 2 m e o h h a v e g o o d a c t i v i t y i n c a t a l y s es u p e r o x i d e r a d i c a l d i s p r o p r o t i o n a t i o n ，t h er e a c t i v er a t e i su pt o1 0 7o r d e ro fm a g n i t u d e ；t h ec o m p l e x e s 【f c ( i d b ) c 1 3 】a n d 【z n ( i d b ) ( h 2 0 ) c 1 。c 1 。( h 2 0 ) h a v ep o o ra c t i v i t yo fs o d k e yw o r d s ：i d b ；s o d ；m n c o n t a i n i n gc o m p l e x ；c y c l o - d i p e p t i d ea n a l o g u e ； a r g i n i n ec a t a l y t i cc l e a v a g e 。 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作 所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 作者签名：多嗲艰 日期：州年z 月二日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权华中师范大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进 行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 作者签名：专豫伎 日期：w 年月7 日 导师始j 7 5 ；胁 日期：叩- 群易月7 日 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程”，同意将本人的 学位论文提交“c a l l s 高校学位论文全文数据库 中全文发布，并可按“章程”中的 规定享受相关权益。回意论文提交卮溢卮：口坐生；旦生一宣竺生筮壶! 作者签名：身镡粒 日期：“年b 月日 撕签名：局胁 日期：砂彩年舌月7 日 项士学位论文 m a s t e r st h e s i s 1 1 1 简述 第一章文献综述 1 精氨酸 精氨酸沁西n i i l e ) 是动物细胞中一种多功能氨基酸，它不仅是合成蛋白质的前 体，也是生成一氧化氮、尿素、多胺、脯氨酸、谷氨酸、肌酐酸和丫胍基丁胺的 前体。在催化控制精氨酸生成和裂解的酶中，精氨酰琥珀酸合成酶，两种精氨酸 酶同功酶，三种一氧化氮合成酶以及精氨酸脱羧酶是精氨酸新陈代谢中的关键性 酶。 对精氨酸以及其新陈代谢的研究已经有1 0 0 多年的历史。早在1 8 8 6 年从扇豆 种子中提纯了这种氨基酸，1 8 9 5 年证明它也是动物蛋白的组成部分。尽管早在 1 9 0 4 年就已证实精氨酸酶有很好的水解精氨酸生成尿素和鸟氨酸的活性，但直到 1 9 3 2 年k r e b s 和h e n s e l e i t 才发现尿素循环，精氨酸在新陈代谢中的突出地位才得 到说明和重视【。 二十世纪3 0 年代后期到4 0 年代生理学和营养学的发展为精氨酸的研究带来了 一个新的发展阶段。据f o s t e r 等人【2 】的报道：精氨酸是肌酐酸生成的必需前体物 质，而作为肌酸酐前体的肌酐酸早在1 9 2 6 年就被认为是一种肾功能的临床指示剂 1 3 1 。同时，在对小鸡和老鼠的试验中，给它们喂养含有精氨酸的食物是很重要的， 同时也是必要的【4 1 。前面的研究成果加上后来5 0 年代到7 0 年代的研究，使得科学 家们有了对精氨酸的最初的认识：精氨酸对健康成人不是必需的氨基酸1 6 j ，而对成 长中的哺乳动物以及食肉动物则是必要的。 随着动物体内精氨酸的生成和分解的各种新的途径的发现，8 0 年代开创了精 氨酸研究领域的另一阶段。1 9 8 1 年w i n d m u e l l e r 和s p a e t h 报道：成熟老鼠小肠是 内源性精氨酸的合成、胍氨酸循环的主要场所。这个发现揭示了从谷氨酸谷酰胺 经过i 厂脯氨酸一羧酸合酶生成胍氨酸的过程【卯。人们渐渐认识到精氨酸应该是 人类或其他哺乳动物尤其在疾病或损伤状况下必须的氨基酸。1 9 8 7 年，k e y 发现并报 道了：精氨酸是哺乳动物亚硝酸和硝酸合成的前体【6 1 ，同时认为n o 是血管内皮松 弛因子吲。现在知道很多细胞都利用精氨酸生成n o ，n o 在许多不同的过程中都 起到重要作用：如血管松弛，免疫反应，神经传递以及血小板和黏性白血球等【8 】。 顾士学位论文 m a s t e r st h e s i s 所以，精氨酸不仅仅是以前所认识的那样只是是生成尿素、胍氨酸，合成蛋白质 的前体，还是形成各种细胞信号分子的前体【9 1 。( 精氨酸的各种代谢途径见f i g u r e 1 1 ) 和圆n 呦啪由删l 瓿甄酸l 。_ 一 _ - p 赫臼_ 0 0 i o 州一炉删烈困 c 0 0 1 4e 。0 0 1 4h c _ c h 一畸p 喇 网、圃 峨 困 、倒 1 。 粥一t 1 1 4 雌- - e u ：， 1 1 2 精氨酸酶( i ) 和胍丁胺酶( a m a t i n a s e ) 精氨酸酶 由于精氨酸可以调节n o ，多胺，胍基丁胺，脯氨酸，以及谷氨酸的合成，人 们对精氨酸的兴趣与日俱增。哺乳动物的精氨酸酶由于自身的基因编码不同有两 种同功酶：精氨酸酶( i ) 作为尿素循环的组成部分在肝脏中分布较多，而在其他地 方含量较少，它的主要的功能就是在肝脏中催化细胞溶质的尿素循环的最后一 步，在成年人的一年的生活里，精氨酸酶( i ) 平均能生产1 0 k g 的尿素。l 精氨酸在 精氨酸酶( i ) 作用下的产物鸟氨酸( o m i t h i n e ) 口- y 以在鸟氨酸脱羧酶( o d c ) 的催化下生 成腐胺( p u t r e s c i n e ，生物合成多胺的前体) ，这条路线被称作生物合成多胺的经典路 径( s c h e m e1 1 ) 。精氨酸酶( i i ) 是一种线粒体酶，在肾、脑、小肠、乳腺和巨噬细胞 中分布较多，在肝中基本没有，它的主要功能是调节细胞中l 精氨酸的浓度，以 2 顾士学位论文 m a s t e r st h e s i s 保持生物合成n o 的动态平衡。 胍丁胺酶( a g m a t i n a s e ) 精氨酸脱羧酶催化l 精氨酸发生脱羧反应得到胍丁胺( a g m a t i n e ) ，胍丁胺酶 a 血a s c ) 再催化胍丁胺生成腐胺f 1 0 1 ，这条路线被称为生物合成多胺的选择性路 径( s c h e m e1 1 ) 。胍丁胺酶广泛存在于哺乳动物的脑、肾、胃、肠和主动脉中，最 新的研究表明胍丁胺( a g m a t i n e ) 不仅是合成多胺的中间代谢产物，而且还具有治疗 慢性病痛、毒瘾和脑部伤害的功能，同时还被建议用作神经传递素或者神经调节 物质。 、h 2 h 2 岱c i n c 置，h 2 n g 弋最冬h 州麓久锚、如，一一州：。“。2 e x 黛恶：i n l c 3 0 1 2 歹夕e x a c t m a s s ：8 8 1 0 k ，i ，。f o d c 冒h h 1 n f i l 。：二；。 1 i h 。h：f h。大宁n，h2cvn产巴hov父ch11、+ 心人2hi 1 2 n h 2 h o c c h ，c c c n c n 卜i _ 三专h。h 。n h 2 + hn 人 l - 。 。1 2 几 删2 l - a r g i n i n e mn h h 2 e x a c t m a s s ：1 7 4 e x a mm m i a s t h i s ：1 舱3 2 0 9 取撩醛： l 0 m l t l l l n e p 一：i 二 1 1 一艺：x 一 精氨酸酶( i ) 活性中心的结构 1 9 9 6 年人们证实了精氨酸酶( i ) 的结构( s c h e m e1 2 ) t 1 1 】，来自老鼠肝脏的精氨酸 酶( d 含有三个亚基，分子量为1 0 5 k d a ，每个亚基包含一个双核锰簇活性中心，该 活性中心位于1 5a 深的裂缝底部，m n 2 + m i i b 2 + 间的距离为3 3a ，其中m 1 0 + 与 h i s l 0 1 ( nd ) ，a s p l 2 4 ( od 1 ) ，a s p l 2 8 ( od 1 ) 和a s p 2 3 2 ( od 1 ) 四个原子配位，m nb 2 + 与h i s l 2 6 ( nd ) ，a s p l 2 4 ( od 1 ) ，a s p 2 3 2 ( od 1 ) 和a s p 2 3 4 ( od l ，0d 2 ) ：一个溶剂分 子桥联两个锰离子，并且和a s p l 2 8 ( od 2 、) 形成氢键。如s c h e m e1 4 所示【1 2 1 。 3 项士学位论丈 m a s t e r st h e s i s 。2 + 一7 0 i i 、 、 a s p l 2 4 h i s l 2 6 s c h e m e1 2 精氨酸酶( i ) 活性中心双核锰的配位环境结构示意图 椭疋延。广一 一一、一“n 令川t, t 脯产露哺一p - l n ph 扩研瑚更沁 彤k 硝产 。套 心 脯已研 脯一7 y 一日7 冀 辅一 1 k l 蚝心冬叩 。乏峨 h 神妇 一二o 、驴= 譬，、舻 f i g u r e1 2 ：精氨酸酶( i ) 催化精氨酸水解机理推测示意图 精氨酸酶( i ) 催化精氨酸水解的推测机理 根据已知的精氨酸酶( i ) 的结构推测了其催化精氨酸水解的机理如f i g u r e1 2 所 示。其要点有：精氨酸水解中保持胍基与谷氨酸的羧基形成盐键，桥联金属离子 4 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 的水分子脱质子形成羟基离子亲核进攻胍基碳。h i s l 4 1 位于活性中心裂缝的中 部，距离桥联分子4 2a ，在催化过程中起着传递质子的作用。在整个催化过程 中，两个锰离子的化合价不变。今年来也有人认为起主要作用的是个m n ( i i ) ， 另一个m n ( i i ) 的作用是活化底物【1 0 1 。 胍丁胺酶( a 暑m a t i 瑚s e ) 活性中心的结构和催化机理推测【1 q ， 胍丁胺酶的活性中心结构和精氨酸酶( i ) 的极其相似，主要的差别在于联结两 个m n ( i i ) 离子的桥基基团中有一个是水分子。和精氨酸酶( i ) 催化精氨酸水解的机 理相同的是，胍丁胺酶催化胍丁胺反应的机理也是采用亲核反应，亲核进攻的基 团也是桥基羟基离子。羟基离子进攻胍基碳原子，形成一个四面体构型的中间 体，然后双键转移，尿素脱离，生成腐胺。在这过程中，金属离子与底物并没有 直接相连。 1 1 3 精氨酸酶( i ) 的模型化合物 精氨酸酶( i ) 的模型化合物目前报道的还不多，人们还在着重研究天然酶的反 应机理。1 9 9 7 年，b a oh u i _ y c 等人【1 4 】报道了【m n 2 弛- o a c ) 2 ( l ) 4 ( o a c ) 2 ( l = 咪唑，苯 并咪唑) ，从而在结构上模拟精氨酸酶( i ) 。1 9 9 8 年，s t e p h e nj l i p a r d 等人【l 习报道了 双核钴作为功能模型化合物，【c o 似o n ) 0 卫- x d k ) ( b p y ) 2 t o h ) 】( n 0 3 ) ，并运用定 的手段推测其反应机理。本论文中将报道由肖风萍合成的配合物 m n 2 ( m 飞) 2 ( u o ) 2 】( c 1 0 4 ) 4 2 h 2 0 ( a 1 ) 在精氨酸水解酶性质上的一些模拟。 2 类环二肽化合物 环肽化合物是一类很有研究价值的的化合物，因为它不含有线性肽链中的末 端残基，这样在x 一射线和其他结构研究中就具有简易性。环二肽( s c h e m e1 3 b ) 是 最简单的环肽化合物，有效的合成环二肽化合物可以解决一些有关蛋白质结构的 常见问题f 阍。另外，环二肽还可以用作催化剂催化s t r e c k e r 氨基酸的不对称合成 1 1 7 , 1 8 ，使用的环二肽是c y c l o 【( s ) 一f h c 。( s ) a r g 和c y c l o ( s ) h i s ( s ) p h e ：也曾有报道 使用环二肽催化由醛合成氰醇的对映异构体的专一反应f 1 9 , 2 0 , 2 1 , 2 2 。但是环二肽的合 成是一个比较困难的事情，比如合成c y c l o ( s ) p h e ( s ) 翘】这样的环二肽需要4 步 反应，需要的原料达到8 种以上，中间体有三个，总的产率在1 8 以下。 5 项士学位论文 m a s t e r st h e s i s n n 0 a ：1 , 4 b i s ( ( 1 日- b e n z i m i d a z o l - 2 - y 1 ) m e t h y l ) p i p e r a z i n e - 2 , 5 - d i o n e s c h e m e1 3 ：a ，类环二肽化合物；b ，环二肽 o b ：c y c l od i p e p t i d e 我们在合成m n 2 + 、z n 2 + 的i d b c o i s ( ( i h - b e n z o i m i d a z o l 一2 y 1 ) m e t h y l ) i m i n e ) ( s c h e m e 1 钔晶体的时候却偶然得到了类似于环二肽的多环化合物( a 1 ) 1 ，4 - b i s ( ( 1 h b e n z i m i d a z 0 1 2 y 1 ) m e t h y l ) p i p e r a z i n e 2 ，5 。d i o n e ( s c h e m e1 3 a ) 。对比这两者的结构， 有相似的骨架，都是以2 ，5 一二酮一对二氮己环为主环，不同的是取代基一个在 1 ，4 位，一个在3 ，6 位；另一个不同就是在环二肽中因为受到氨基酸的限制不存在 苯并咪唑这样的2 环取代基，所以我们暂且把它称作类环二肽化合物。 h i d b ：b i s ( ( 1h - b e n z o d i m i d a z o l 2 y 1 ) m e t h y l ) a m i n e s c h e m e1 4 ：配体i d b 1 3 1 引言 3 超氧化物歧化酶 超氧离子( 0 2 一) 是高等有机体在进行光合作用和呼吸作用的时候发生氧分子单 电子还原的一种副产物；巨噬细胞在应激的情况下，作为一种免疫的响应，也会 产生超氧负离子( 0 2 一) 。有机体必须降低超氧负离子( 0 2 一) 的浓度，因为过量的超氧 化物负离子( 0 2 一) 会使一些酶失去活性，包括铁一硫簇蛋白等，以及会产生具有更 高氧化性的基团( 比如羟基自由基) ，这会对细胞产生致命的损伤。 超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d cd i s m u t a s e ，s o d ) 是有机体防御系统里的一种重要 6 一 hzn 一 夕h y n 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 的生物酶，它能通过有效的催化超氧离子( 0 2 一) 发生歧化，从而保护细胞免受过量 活性氧的损伤f 2 3 1 ，在植物体内则可以增强植物抗寒、抗旱、抗渍和抗早衰等抗逆 性【2 4 1 。自然界的超氧化物歧化酶根据活性中心的金属离子的不同( c u z n 、m n 、 f e 、f e - z n 和n i ) ，分为五种类型：c u - z n s o d 、m n s o d 、f e s o d 、f e z n s o d 和 n i s o d 矧。比较常见研究得深入的是c u z n s o d 、m n s o d 、f e s o d 。 1 3 2c u z n s o d 从真核细胞的细胞质和细菌的细胞中提取的c u z n s o d 是一种同型二聚体的 蛋白，大小是3 2k d a 。每个单体都含有一个铜离子和锌离子，并呈现出g r e e kk e y b 桶状折叠。从人体和酵母中提取的c u z n s o dx 射线晶体衍射分析表明，c u z n s o d 的活性部位包含一个咪唑( h i s 6 3 ) 桥联的c u ( i i ) 、z n ( 1 1 ) 结构，作为一种桥联 的咪唑或者组氨酸，目前只在c u z n s o d 中发现过。处于正二价的c u ( n ) 离子与4 个来自氨基酸残基( h i s 4 6 、4 8 、6 3 和1 2 的咪唑氮配位，呈现畸变的平面四边形 构型；在离c u ( n ) 大约2 5 a 的地方，有一个水分子通过很弱的配位方式处于畸变 平面四边形的轴向位置；晶体学和光谱学资料研究表明，当c u ( n ) 被还原为一价亚 铜的时候，c u ( i ) 失去与桥基咪唑氮的结合，这个失去与h i s 6 3 配位的c u ( i i ) 的构型 发生了变化，形成一个几乎是平面三角形的构型。与锌离子配位的有h i s 6 3 、6 7 、 8 0 和天冬氨酸的羧氧( a s p 8 1 ) 配位，呈畸变四面体构型( s c h e m e1 5 ) 1 2 6 , 2 7 1 。c u ( n ) 是 氧化还原的活性中心，z n ( n ) 只起着稳定蛋白质结构的作用。 弋夕d l 专爹q 酒卜 降 | x | 丁一夺 7 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 0 2 + c u ( i i ) z n s o d 0 2 + c u ( i ) z n s o d 0 2 + c u ( i ) z n s o d + h + 一h 2 0 2 + c u ( i i ) z n s o d s c h e m e1 6c u z n s o d 催化0 2 - 反应 根据c u z n s o d 的结构，提出的有关其催化机理是( s c h e m e1 6 ) ：超氧负离子 ( 0 2 一) 还原c u ( n ) ，同时释放出一分子的氧；然后超氧负离子( 0 2 一) 又和还原态的 c u ( i ) 作用得到氧化态c u ( 1 1 ) ，并消耗2 个质子生成过氧化氢【2 8 1 。 1 3 3 含锰、铁超氧化物歧化酶 含锰和含铁的超氧化物歧化酶是同源酶，通常是二聚体或者四聚体，每一个 单体都含有一个活性中心，每个活性中心有一个m n 或f e 的离子。m n s o d 和 f e s o d 拥有相似的氨基酸序列、肽链折叠情况和立体结构，并且它们的活性中心 除了金属离子不同，结构几乎完全一样 2 9 , 3 0 ：在m n s o d 中，m n ( i i ) 的配位构型为 三角双锥，有2 个h i s 残基和一个a s p 一处于三角双锥的平面内，还有一个溶剂分 子和h i s 位于三角面轴向的位置，这个溶剂分子有很大的可能是水分子，并作为一 个质子给体参与氧化还原循环；f e s o d 活性中心除了在一些氨基酸侧链的旋转方 向和与中心离子的距离有轻微的差别外，中心离子f e ( 1 1 1 ) 和m n ( i i ) 有相同的配体 和几何构型( f i g u r e1 3 ) 【3 1 】。在酶的催化机理上，m n s o d 和f e s o d 类似( s c h e m e 1 刀，由两步反应完成对超氧负离子( 0 2 一) 的歧化，m o i i ) ( m = m n ，f e ) 先被0 2 一还原 为m ( i i ) ，释放出分子氧；m o o 再被另一分子0 2 一氧化为三价，同时生成h 2 0 2 。这 样中心离子就完成了氧化态一一还原态循环，使催化反应能不断地进行下去。 8 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s f i g u r e1 3 ：f e s o d 活性中心结构 0 2 + m ( m ) s o d 0 2 + m ( f f ) s o d 0 2 + m ( i i ) s o d + 甜_ h 2 0 24 - m ( i i i ) s o d s c h e m e1 7 ：m n ( f e ) s o d 催化0 2 一反应 1 3 4 含镍超氧化物歧化酶 含镍超氧化物歧化酶是一个只有1 1 7 个氨基酸的小分子蛋白，在氨基酸序列 上和其他s o d 不具有相似性。n i s o d 为一个六聚体的多聚蛋白，每个单体含有一 个金属n i ( i i ) 的活性中心，其6 个活性中心的6 个n i 离子构成一个八面体的构 型。通过x 射线光谱学和e p r 对s t r e p t o m y c e ss e o u l e n s i sn i s o d 的研究表明， n i s o d 处于氧化态的n i 3 + 时，c y s 6 和c y s 2 提供两个配位s 原子，组氨酸用氨基 氮和咪唑基上的n 原子与n i 离子配位，还有一个配位原子为h i s l c y s 2 肽键的氮 9 妒 h、i、 o工(!ux o 靠编哎 嗍瓢 钳删够 镰 ：气届 原子，其中咪唑氩处于轴向位置，另外四个配位原子构成一个平面四边形，总的 构型为四方锥另一个空的轴向位置是0 2 与n i “的结台位置，还原悉时的n i 2 + 具 有相似的配位结构，只是h i s l 的咪唑氮离去，形成心配位的平面四边形构型，0 ：一 的结合仍然在空的轴向方向( f 培u r c1 4a a n db ) 。n i s o d 催化反应的机理类似于 c u z n s o d 和m n ( f e ) s o i ) ( v i ”r e1 5c ) 3 2 1 。 “凄4 漂1 。孓。，之慈。b 必 一一一【二、：1 1 3 5 研究现状 作为一个已经研究了3 0 多年的课题，在理论工作上已经做得非常完善，在应 用领域也取得了一定的成就。模拟酶的啦训原理是从酶的活性部位出发，根据结 构相似性质相似的原则，合成模型化含物研究反应性及其结构和功能的关系，寻 求在温和条件下( 常温、常压、普通溶剂) ，实现对酶特异性的增强。科学家们在 血红蛋白、肌红蛋白及铁硫蛋白活性中心模拟物研究金属酶的生物活性所取得的 巨大成功，也为模拟台成s o d 模型化台物奠定了理论基础和信心。 须士学位论文 m a s t e r st h e s i s 酶的模拟合成工作可分为3 个层次：( 1 ) 合成与酶活性中心有相似性质的简单 配合物；( 2 ) 酶活性中心结构的模拟；( 3 ) 整体模拟，即包含酶的微环境在内的模 拟。其中，酶活性中心的模拟最为化学家所重视，也是酶模拟的关键步骤。8 0 年 代初，l i p p a r d 等人1 3 3 j 率先开展了有关s o d 酶模型物的研究工作，从那时起，国内 外许多化学界的科研人员均开展了此项工作【3 5 1 。模拟合成的第一步是寻找和合 成与天然s o d 有着相似配位环境的配体，这一步的工作已有很大进展，目前已设 计和合成了多种配体；第三步是测定这些配合物作为s o d 模拟配合物的晶体结 构、磁性及其催化活性，并与天然s o d 的结构和活性进行比较。 1 小分子量、脂溶性c u 配合物对s o d 活性的模拟，如3 ，5 二异丙基水杨酸铜 c u ( s ，5 - d 疋s ) 】及氯羟安定( 1 0 r a z e p a m ) 等1 4 引。 2 双s c h i 蹴配合物对s o d 活性中心的模拟。l i n s sm 等【4 7 l 合成了双s c h i 嘁 c i u 2 + 模型化合物，其活性达到了天然酶的3 ；罗勤慧等【铝】报道的双s 出蹴铜配合 物，其活性达到了天然酶的0 5 1 0 7 。以s c h i f f 碱为配体的模型化合物中， c u 2 + 处于平面正方形的配位环境，类似于c u z n s o d 中c u 2 + 的键合状态，这类化合 物可被看作初期经典的s o d 模型化合物。 3 大环类配体s o d 模型化合物。9 0 年代中期，对大环类s o d 模型化合物的合 成与活性研究成为一个热点。k i l g o r ek s 等 4 9 , 5 0 相继报道了m n s o d 的s c 系列模型 化合物，其催化速率常数达到了1 0 7 数量级。l a b u d a 等【5 1 ，5 2 1 对大环s c h i f f 碱配合物 c u ( t a a b ) 2 + 】的研究，发现它有很好的热稳定性，催化速率常数更是达到了1 0 8 数 量级，为天然s o d 活性的2 8 ，已经具有了医药应用价值。以卟啉环为配体的大 环类s o d 模型化合物是另一类重要的s o d 模型化合物。m o l d o v a nl 等【5 3 l 报道了 m n t m p y p ( m n ( 1 1 1 ) t e t r a k i s ( 1 - m e t h y l 一4 - p y r i d y l ) p o r p h y r i n ) 在离体状态下的s o d 活 性，为天然s o d 活性的0 2 左右。 4 以富含苯并咪唑的配体的s o d 模型化合物。本课题组已经做了大量的有关 方面的工作，主要的配体包括i d b 、n t b 、a r b 、e d t b 、e g t b 和d t p b 等，金属 离子包括c u ( i ，i i ) 、f e ( i i ，i i i ) 、m n ( i i ，i i i ，i v ) 、z n ( i i ) 、c 0 0 0 和n i ( i i ) ，在模型化合物 的合成，光谱性质和活性测试及农业、医药上的应用做过一些工作。 1 3 6 课题意义 s o d 作为抗氧化剂已经应用于医药保健、食品和植物保护等多种领域，并取 得了显著的成果。由于天然s o d 难以获得，且容易失活，所以在了解了s o d 结构 和机理的基础上，合成具有高活性的s o d 模型化合物就是一个具有挑战意义的课 顾士学位论文 m a s t e r st h e s i s 题阳。我们在本课题组2 0 多年来工作的基础上，合成并得到了6 个含有i d b 配合 物的晶体，使用的金属离子有：c u ( i x ) 、m n ( i i ) 、f e ( 1 l i ) i 乖 1z n ( i i ) ，用x - 射线单晶衍 射仪测试了它们的晶体结构，通过对这几个配合物s o d 活性的测试，对比了解在 主配体相同的情况下不同金属离子对活性的影响，进而比较不同天然s o d 之间因 为金属活性中心不同而固有的差异。 顽士学住论文 m a s t e r st h e s i s 第二章。实验部分 1 实验试剂与仪器 2 1 化学试剂 亚氨基- - 7 , 酸( i d a ) ，氨三乙酸( n t a ) ，邻苯二胺，碳酸锰( m n c 0 3 ) ，二氯化锰 ( m n c l 2 4 h 2 0 ) ，醋酸锰( m n ( o a c ) 2 4 h 2 0 ) ，氯化铜( c u c l 2 4 h 2 0 ) ，硝酸铜 ( c u n 0 3 4 h 2 0 ) ，氯化铁( f e c l 3 4 h 2 0 ) ，氯化亚铁( f e c l 2 6 h 2 0 ) ，氯化锌 ( z n c l 2 4 h 2 0 ) ，醋酸锌 z n ( o a c ) 2 4 h 2 0 】，盐酸，高氯酸，乙醚，7 , - - 醇，无水乙 醇，无水甲醇，乙腈，氢氧化钠，精氨酸，重水，氘代甲醇，氘代d m s o ，i d b 丝 寸。 邻苯二胺和乙二醇为化学纯( c r ) 外，其他均为分析纯( a r ) 。 2 2 分析仪器 b r u k e ra x ss m a r t4 0 0 0c c d 单晶衍射仪；a p i2 0 0 0 型电喷雾质谱分析仪； s h i m a d a z uu v - 2 6 5 型紫外可见分光光度计；p e r k i n e l m e r2 4 0 0 型c h n 元素分析 仪；p h s 3 c 型酸度计；w s 7 0 1 型红外快速干燥器：m e r c u r yp l u s 一4 0 0 核磁共振 仪。 2 配合物的合成 2 2 1 配体的合成 采用改进后的文献1 5 4 5 5 】报道的方法合成以下配体： 1 ) n ，n ，n - - - ( 2 。苯并咪唑甲基) 胺( t r i s ( 2 一b e n z i m i d a z o l y l m e t h y l ) a m i n e ，n t b ) 按 物质的量之比1 ：3 分别称取氨三乙酸( a m m o n i at r i a c e t i ca c i d ，w r g ) 1 9 1 4 9 ( o 1 0 m 0 1 ) 和邻苯二胺( 0 p h e n y l e n e - d i a m i n e ，o p d ) 3 3 2 6 9 ( o 3 0 m 0 1 ) 邻苯二胺 装入反应器中，再加入1 0 0 m l 乙二醇，用空气浴进行加热，控制温度在 1 8 0 。c 回流6 8 小时，无气泡冒出( 水蒸汽) 时停止加热，待温度降低到 1 0 0 以下时，趁热倒出，加入1 5 0 m l 无水乙醇，让其冷却后结晶，然后用 顽士学位论史 m a s t e r st h e s s 无水乙醇重结晶3 - - 5 次，至产品颜色为白色，且滤液颜色接近于无色为 止。红外灯下干燥o 5 1 小时，得到白色粉末n t b3 4 6 9 ，计算产率为 8 5 ，密封干燥保存。 2 ) n ，n - ( 2 一苯并眯唑甲基) - 亚胺( d i ( 2 b e n z i m i d a z o l y l m e t h y l ) a m i n e ，i d b ) ：按物质 得量之比l ：2 称取亚甲基- - 7 _ , 酸( i m i n o d i a c e t i ca c i d ，i d a ) 2 6 6 9 ( 0 2 t 0 0 1 ) 和 邻苯二胺4 3 2 4 9 ( 0 4 m 0 1 ) 装入反应器中，再加入8 0 m l 乙二醇，搅拌混合均 匀，空气浴维持温度在1 8 0 - - , 1 9 0 4 c 回流6 - 8 小时，无气泡冒出( 水蒸 汽) 时停止加热。反应液呈深红色。冷却形成土黄色块状体。将固体过滤 后用无水乙醇重结晶数次直到固体为白色，滤液基本无色为止。干燥称 量，得到白色粉末3 9 o g ，计算产率为7 0 ，干燥保存。 2 2 2 配合物的合成 1 ) 配合物 m n ( i m ) 6 c 1 2 2 h 2 0 ( x 1 ) ( i r a ：咪唑) 的合成：1 0m m o lm n c l 2 4 h 2 0 的 2 0 m l 乙醇溶液与6 0m m o li m 的2 0 m l 乙醇溶液混合，在5 0 反应4 个小 时，过滤后将滤液静置使其缓慢挥发，常温下自然长出晶体，2 天后得到 无色晶体，适合x 射线单晶衍射仪测试其晶体结构。 2 ) 配合物【m n ( i d b ) c 1 2 ( c h 3 c h 2 0 h ) ( x 2 ) 的合成：1 0m m o lm n c l 2 4 h 2 0 的 2 0 m l 乙醇溶液与1 0m m o li d b 的2 0 m l 乙醇溶液混合，用少量盐酸调节p h 值大约为4 ，在5 0 反应4 个小时，过滤后将滤液静置使其缓慢挥发，常 温下自然生长晶体，1 2 小时后得到无色晶体，适合x 射线单晶衍射仪测试 其晶体结构。 3 ) 配合物 z n ( i d b ) ( h 2 0 ) c 1 c i h 2 0 ( 】【7 ) 的合成：1 0m m o lz n c l 2 4 h 2 0 的2 0 m l 无水乙醇溶液与1 0m m o li d b 的2 0 m l 无水乙醇溶液混合，z n 2 + 易水解，所 以用少量盐酸调节p h 值大约为4 ，避免过早的出现沉淀，影响反应进度。 维持反应温度在5 0 反应4 个小时，过滤后将滤液静置使其缓慢挥发，常 温下自然生长晶体，2 天后得到无色晶体，适合x 一射线单晶衍射仪测试其 晶体结构。 4 ) 配合物 m n 2 ( n t b ) 2 以一o ) 2 】( c 1 0 4 ) 4 2 h 2 0 ( b 1 ) 的合成：将o s 1 5 9 ( 2 m m 0 1 ) n t b 溶解于2 0 m l 无水乙醇中，再加入m n ( c 1 0 4 ) 2 6 h 2 00 7 3 0 9 ( 2 m m 0 1 ) 的水溶液 5 m l 。水浴恒温5 0 8 c 反应1 小时，加入丙二酸0 1 0 4 9 ( 2 m m 0 1 ) ，半小时后有 1 4 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 白色沉淀生成，随