蛋白质测定-凯氏定氮法.ppt

奶粉中蛋白质的测定凯氏定氮法,实验,【基础知识】,蛋白质概述蛋白质是食品营养价值的重要指标，含N是蛋白质区别其他有机化合物的主要标志。大多数蛋白质含氮量接近，一般来说，pro的平均含氮量为16%，即一份氮相当于6.25份蛋白质，此数值称为蛋白质系数。注意：不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米、荞麦、青豆、鸡蛋等为6.25，花生为5.46，大米为5.95，大豆及其制品为5.71，小麦粉为5.70、全小麦、大麦、燕麦、裸麦和小米是5.83；硬果类为5.30；牛乳及其制品为6.38。,【一、实验目的】,1、掌握凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理和方法。2、学会使用凯氏定氮装置。3、了解蛋白质系数在蛋白质含量计算中的应用。,蛋白质是食品营养价值的重要指标。测量食品中蛋白质的含量对于评价食品的营养价值、合理开发利用食品资源、指导生产、优化食品配方、提高产品质量具有重要的意义。,注意：此法测定得到的蛋白质含量，实际上包括核酸、生物碱、含氮类脂、叶啉和含氮色素等非蛋白质氮化合物，故称为粗pro。,【二、原理】,1、消化,仪器及试剂的准备仪器：,【三、实验步骤】,样品预处理,固体试样0.22g半固体试样25g液体试样1025g,样品充分混匀,直接消化,样品称量、消化,1.000g奶粉0.2g硫酸铜6g硫酸钾20mL浓硫酸玻璃珠,小火加热炭化至泡沫完全停止,轻摇,大火加热保持瓶中液体微沸,至蓝绿色澄清透明继续加热0.51h,冷却加20mL水冷却,同时做试剂空白试验,2、蒸馏、吸收,仪器及试剂的准备仪器：,100mL3只,试剂（混合指示剂）：2份甲基红乙醇液（1g/L）与1份亚甲基蓝乙醇液（1g/L）临用时混合。指示剂在碱性溶液中呈绿色,在中性溶液中呈灰色,在酸性溶液中呈红色。,凯氏定氮蒸馏装置,传统装置,1：电炉2：水蒸气发生器3：螺旋夹4：小玻杯及棒状玻塞5：反应室6：反应室外层7：橡皮管及螺旋夹8：冷凝管9：蒸馏液接收瓶,水蒸气发生器：装水至2/3处，加入数粒玻璃珠，加甲基红乙醇指示剂数滴及硫酸数ml，使水呈微红色（保持酸性以防水中氨的逸出）按上图所示搭好装置,蒸馏及吸收,10.0mL硼酸溶液100mL三角瓶加12滴混合指示剂冷凝管下端插入三角瓶液面下准确吸取10mL试样由小玻杯流入反应室少量水洗涤小漏斗盖紧玻璃塞量筒取10.0mLNaOH溶液倒入小玻杯提起玻塞使其缓慢流入反应室立即塞紧玻璃塞加水于小玻杯防漏气通蒸汽颜色变化时开始计时蒸馏5min移动接受瓶使液面离开冷凝管下端再蒸馏1min用少量水冲洗冷凝管下端外部取下接收瓶,注意加NaOH一定要过量，此时溶液生成深蓝色或黑色沉淀为防止样液中氨气逸出。一是要水封，二要夹紧废液蝴蝶夹后再通蒸汽，三要注意接头处有无松漏现象,硼酸吸收液的颜色,反应室中溶液的颜色,冷凝管下端先插入硼酸吸收液液面以下才能蒸馏。吸收液温度不应超过40，避免氨气逸出，若超过时可置于冷水浴中使用。在蒸馏时，蒸汽发生要均匀充足，蒸馏过程中不得停火断汽,否则会发生倒吸。蒸馏完毕后，先将冷凝管下端离开液面，再蒸1分钟，将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移开，最后关闭电源，绝不能先关闭电源，否则吸收液将发生倒吸。所用的试剂溶液必须用无氨蒸馏水配制。,3、盐酸滴定,接收瓶以HCL标准滴定液滴定灰色终点记录VHcl,【四、数据记录与计算】,有效数字：蛋白质含量1g/100g时，结果保留三位有效数字蛋白质含量1g/100g时，结果保留两位有效数字。精密度：在重复性条件下的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%,（g/100g）,小结,凯氏定氮法用于所有动物、植物类食品的蛋白质含量的测定，但因样品中含有核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质含氮化合物，所以测定结果为粗蛋白质含量。若要测定样品的蛋白氮,则需要向样品中加入三氯乙酸溶液,使其最终浓度为5%,然后测定未加入三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸溶液后样品中的含氮量,进一步计算出蛋白质含量:蛋白氮=总氮-非蛋白氮,准确称取某乳粉样品0.800克，经凯氏法消化定容至100ml，移取5ml消化液进行蒸馏，用20ml硼酸吸收，再用0.05000mol/lHCl滴定，结果消耗5.00ml，试计算该乳粉的蛋白质含量？试述蛋白质测定中，样品消化过程所必须注意的事项，消化过程中内容物颜色发生什么变化？为什么？样品经消化进行蒸馏前，为什么要加入氢氧化钠？这时溶液发生什么变化？为什么？如果没有变化，说明什么问题？须采用什么措施？,知识拓展：三聚氰胺假蛋白“原理”,三聚氰胺的“优点”,1、普通蛋白质含氮量平均为16%，一般不超过30%，而三聚氰胺含氮量为66.7。,2、三聚氰胺为白色结晶粉末，没有什么气味和味道，掺杂后不易被发现，但是尿素等却有气味，掺入后容易被检测出来,若以合格奶粉蛋白质含量为18%计算，则含氮量为2.88%。,三聚氰胺含氮量是牛奶的151倍，是奶粉的23倍。每100g牛奶中添加0