（分析化学专业论文）基于sers方法检测的dna酶生物传感器的研究.pdf

l s t u d i e so nd n a z y m ea n do ns e r s b a s e dbi o s e n s o r b y s u ny u nh o n g b s ( l u d o n gu n i v e r s i t y ) 2 0 0 8 at h e s i ss u b m i t t e di np a r t i a ls a t i s f a c t i o no ft h e r e q u i r e m e n t sf o rt h ed e g r e eo f m a s t e ro fs c i e n c e a n a l y t i c a lc h e m i s t r y i nt h e g r a d u a t es c h o o l o f h u n a nu n i v e r s i t y s u p e r v i s o r p r o f e s s o rz h a n gx i a ob i n g m a y , 2 0 1 1 伽9 胛8乃 m 1脚y 湖南大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 作者签名：刹、匦钮 日期：加f 年6 月年日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇 编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密团。 ( 请在以上相应方框内打“”) 日期：加1 1 年6 月缸日 日期：为7 1 年6 月日 硕：t 学位论文 摘要 表面增强拉曼散射( s e r s ) 是基于拉曼散射的一种分析表征技术。由于其灵敏 度高、分辨率高、水干扰小、稳定性好等优点，在材料、表面科学、分析化学、 生物学、诊断学等方面都得到了广泛应用。压电传感器是高灵敏的一种生物传感 器，具有简便、快速、灵敏、成本低、响应谱广、可实时数据输出等优点，在生 物技术、临床诊断、环境监测、食品工业、医药和军事等领域具有广泛的应用前 景。本文重点关注如何提高传感器的检测灵敏度等问题，利用纳米材料优越的信 号放大性能发展了几种新型的生物传感器，通过s e r s 技术对p b 2 + ，腺苷进行了 定量检测，同时发展了基于压电技术的p d g f b b 生物传感器。具体包括： 在第二章中，发展了一种基于多层金属分子金属纳米结的超灵敏的p b 2 + s e r s 检测方法。本章选用巯基标记的g r 5d n a 酶组装在金电极表面，作为 p b 2 + 的特异性识别探针部分。p b ”存在时，能够催化嵌入在该d n a 酶底物链中 r n a 碱基的水解，使其被剪切为两部分。金电极表面剩余的核酸片段部分可以和 纳米金标记的报告探针链杂交，通过层层自组装，利用完全互补的两条d n a 链 间的杂交作用力，纳米金之间形成了纳米结，标记在报告探针上的拉曼标记分子 与a u n p s 间的距离缩短，拉曼信号得到显著增强。该传感器对p b 2 + 的检测限可 达到1 0 x 1 0 。1 0m 。 在第二章发展的方法的基础上，第三章进一步发展了基于目标导致链置换型 核酸适体s e r s 传感器。核酸适体首先与金电极表面的捕获探针互补杂交被固定 在电极表面，当腺苷存在时，与核酸适体发生特异性结合，导致其构型发生变化， 从电极表面脱落。然后，捕获探针可以和纳米金标记的报告探针链杂交，同样通 过层层自组装形成纳米结，从而导致拉曼信号的显著增强。该传感器具有较好的 选择性和较高的灵敏度，检测下限为5 o 1 0 一m 。 在最后一章中，我们提出了一种简便的基于抗体和核酸适体的夹心型压电免 疫传感器，用于p d g f b b 的检测。首先在石英晶振表面通过偶联组装上抗 p d g f b b 抗体，然后待测物p d g f b b 被晶振表面的抗体特异性结合，最后结 合纳米金标记的p d g f b b 核酸适体，从而引起晶振表面显著的质量变化，导致 明显的频率响应。该传感器对p d g f b b 的浓度检测范围为o 0 5 5p g m l ，检 测限为1 0 1 0 一g g m l 。 关键词：表面增强拉曼光谱；压电；生物传感器；分子结；核酸适配体；腺苷； p d g f b b i i 基于s e r s 方法检测的d n a 酶生物传感器的研究 a b s t r a c t s u r f a c e - e n h a n c e dr a m a ns c a t t e r i n g ( s e r s ) i sah i g h l ys e n s i t i v ea n ds e l e c t i v e t o o lf o rt h ei d e n t i f i c a t i o no f b i o l o g i c a lo rc h e m i c a la n a l y t e sb a s e do nr a m a ns c a t t e r i n g i t sn a r r o w ，w e l l - r e s o l v e db a n d s ，l o ws e r si n t e n s i t yo fw a t e ra n dh i g hs t a b i l i t ym a k e s e r sw i d e l yu s e di nm a t e r i a ls c i e n c e ，s u r f a c es c i e n c e ，a n a l y t i c a lc h e m i s t r y ，b i o l o g i c a l c h a r a c t e r i z a t i o na n dd i a g n o s t i c s p i e z o e l e c t r i cb i o l o g i c a ls e n s o rh a st h ec h a r a c t e r i s t i c s o fs i m p l e ，r a p i d ，s e n s i t i v e ，l o wc o s t ，t or e s p o n ei nab r o a ds p e c t r u m ，r e a l - t i m ed a t a o u t p u t ，e t c ，w i t hw i d ea p p l i c a t i o np r o s p e c t si nt h eb i o l o g i c a lt e c h n o l o g y , c l i n i c a l d i a g n o s t i c s ，e n v i r o n m e n t a lm o n i t o r i n g ，f o o di n d u s t r y , m e d i c i n ea n dm i l i t a r yf i e l d s t h i st h e s i sf o c u s e so nh o wt oi m p r o v et h ed e t e c t i o ns e n s i t i v i t yo fa b i o s e n s o r ，b yu s i n g o fn a n o m a t e r i a l s w eh a v ed e v e l o p e dt w on e ws e r sb i o l o g i c a ls e n s o r sf o rp b 2 + ，a n d a d e n o s i n e ，a n dap i e z o e l e c t r i cp d g f - b bb i o s e n s o r t h ed e t a i l sa r es u m m a r i z e da s f o l l o w s ： 1 i nc h a p t e rt w o ，w eh a v ed e v e l o p e dan o v e lm u l t i - l a y e rm e t a l - m o l e c u l e - m e t a l n a n o - j u n c t i o nf o rt h eu l t r a s e n s i t i v ep b 2 + s e r sd e t e c t i o n i nt h i sc h a p t e rg r 5d n a e n z y m ew a sa s s e m b l e do ng o l de l e c t r o d es u r f a c e ，a sas p e c i f i cr e c o g n i t i o np r o b ef o r p b 2 + t h ep r e s e n c eo fp b 2 + c a nb ee m b e d d e di nt h ed n a e n z y r m ec a t a l y z e ds u b s t r a t e h y d r o l y s i sc h a i no fr n ab a s e s ，a n di tw a sc u ti n t ot w op a r t s g o l de l e c t r o d es u r f a c e ， t h er e m a i n i n gp a r to ft h en u c l e i ca c i df r a g m e n t sc a nb et h er e p o r to fg o l dn a n o p a r t i c l e p r o b e sl a b e l e dh y b r i d i z a t i o nc h a i n t a k i n ga d v a n t a g eo ft h eh y b r i d i z a t i o nb e t w e e nt w o c o m p l e m e n t a r yd n as t r a n d s ，t h er a m a ns i g n a lo ft h e i rt e r m i n a lt a gm o l e c u l e sw a s s i g n i f i c a n t l ye n h a n c e dw i t ht h ef o r m a t i o no ft h em e t a l m o l e c u l e - m e t a ln j sb e t w e e n a un a n o p a r t i c l e s ( n p s ) c a p p e db yt h e m ad e t e c t i o nl i m i tt o w a r d sp b 计h a sb e e n o b t a i n e da sl o wa s1 0 x1 0 1 0m 2 i nc h a p t e rt h r e e ，a p t a m e ra n dt h eg o l de l e c t r o d es u r f a c eo ft h ef i r s tc a p t u r e p r o b ec o m p l e m e n t a r yh y b r i di sf i x e do nt h ee l e c t r o d es u r f a c e ，w h e nt h ep r e s e n c eo f a d e n o s i n e ，a n dt h eo c c u r r e n c eo fs p e c i f i cb i n d i n ga p t a m e r ，r e s u l t i n gi nc o n f i g u r a t i o n c h a n g e s ，o f ff r o mt h ee l e c t r o d es u r f a c e t h e nt h ec a p t u r ep r o b ec a nb el a b e l e dt h e r e p o r to f t h eg o l dn a n o p a r t i c l e sh y b r i d i z a t i o np r o b ec h a i n ，t h es a m et h r o u g ht h el a y e r s o fs e l f - a s s e m b l e d n a n o s t r u c t u r e s ，l e a d i n gt o as i g n i f i c a n te n h a n c e m e n to fr a m a n s i g n a l s t h es e n s o rh a sg o o ds e l e c t i v i t yd e t e c t i o nl i m i ti s5 0 10 一m 3 i n c h a p t e rf o u r ，w ep r o p o s e as i m p l e a n t i b o d y a n d a p t a m e r - b a s e d i i i 硕士学位论文 s a n d w i c h t y p ep i e z o e l e c t r i ci m m u n o s e n s o rf o r t h ed e t e c t i o no fp d g f - b b i nt h i s m e t h o d ，t h eq u a r t zc r y s t a ls u r f a c ew a sc o a t e dw i t has e l f - a s s e m b l e dm o n o l a y e ro f 3 - m e r c a p t o p r o p i o n i ca c i d ( m p a ) f o rc o v a l e n t l y i m m o b i l i z a t i o no ft h ep d g f - b b a n t i b o d y , t h e nt h eq u a r t zc r y s t a ls u r f a c ew a sa c t i v a t e db yi n c u b a t i n gw i t he d c n h s a n dt h e nt h r o u g ht h em p a 0 np d g f - b ba n t i b o d yc a r b o x y la n da m i n or e s p o n s eo n c o m b i n e da n a l y s i so fi t ss o l u t i o nc a ns p e c i f i c a l l yr e c o g n i z et h ep d g f - b b ，f o l l o w e d b va1 hi n c u b a t i o na tr o o mt e m p e r a t u r ew i t hb s as o l u t i o n t os a t u r a t eu n r e a c t e d b i n d i n gg r o u p so nt h eg o l ds u r f a c e s u b s e q u e n t l y ，b i n d i n gw i t ht h en a n o g o l dl a b e l i n g o fp d g f b ba p t a m e rs p e c i f i c a l l y t h es e n s o ro nt h ec o n c e n t r a t i o no fp d g f - b b d e t e c t i o nr a n g eo f0 0 5 5t a g m l ，t h ed e t e c t i o nl i m i ti s 1 0 1 0 一 t g m l k e y w o r d s ：s u r f a c e e n h a n c e dr a m a ns c a t t e r i n g ；p i e z o e l e c t r i c ；b i o s e n s o r ； m o l e c u l a rj u n c t i o n s ；a p t a m e r ；a d e n o s i n e ；p d g f b b ； i v 基于s e r s 方法检测的d n a 酶生物传感器的研究 目录 学位论文原创性声明与学位论文版权使用授权书i 摘要i i a b s t r a c t i i i 第1 章绪论1 1 1 拉曼散射的原理1 1 2 表面增强拉曼光谱( s e r s ) 2 1 2 1s e r s 的发现及其特点2 1 2 2s e r s 的机理3 1 2 3s e r s 活性基底和s e r s 标记物4 1 2 4s e r s 在生物分析中的应用4 1 3 功能d n a ( f u n c t i o n a ld n a ) 9 1 3 1 脱氧核酶( d n a z y m e s ) l o 1 3 2 核酸适配体( a p t a m e r ) 11 1 4 基于功能d n a ( f u n c t i o n a ld n a ) 的传感器1 2 1 5 本研究论文的构想1 3 第2 章表面增强拉曼光谱用于p b 2 + 检测1 5 2 1 前言1 5 2 2 实验部分1 6 2 2 1 试剂与仪器1 6 2 2 2 合成a u n p s 1 7 2 2 3 探针d n a 标记a u n p s 17 2 2 4 传感界面的制备1 7 2 2 5 目标物的检测17 2 3 结果与讨论18 2 3 1 检测原理1 8 2 3 2 性质表征2 0 2 3 3 检测条件的优化2 1 2 3 4 传感体系的选择性2 2 2 3 5p b 2 + 的定量检测2 2 2 4 小结2 3 第3 章表面增强拉曼光谱用于腺苷检测2 5 v 硕士学位论文 3 1 前言2 5 3 2 实验部分2 6 3 2 1 试剂与仪器2 6 3 2 2 合成a u n p s 2 6 3 2 3 探针d n a 标记a u n p s 2 6 3 2 4 传感界面的制备2 6 3 2 5 腺苷的检测2 7 3 3 结果与讨论2 7 3 3 1 检测原理2 7 3 3 2 检测条件的优化2 8 3 3 3 传感体系的选择性2 8 3 3 4 腺苷的定量检测2 9 3 4 ，j 、l ；3 0 第4 章基于纳米金增强检测p d g f 的压电免疫传感器3 1 4 1 前言31 4 2 实验部分3 2 4 2 1 试剂与仪器3 2 4 2 2 合成a u n p s 3 3 4 2 3a p t a m e r 标记a u n p s 3 3 4 2 4 压电传感探针的表面修饰3 3 4 2 5 压电检测方法3 4 4 3 结果与讨论3 4 4 3 1 检测原理3 4 4 3 2 检测条件的优化3 5 4 3 3 传感体系的选择性3 7 4 3 4p d g f b b 的定量检测3 8 4 4 ，j 、结3 8 结 论3 9 参考文献4 0 附录a 攻读学位期间发表的学术论文目录一4 9 致谢5 ( ) v i 硕士学位论文 1 1 拉曼散射的原理 第1 章绪论 首先，我们简单的介绍一下有关电子与核子相互作用的波恩一奥本海默的理 论。在分子中，当原子核运动的瞬间，电子的分布会随之变化，而且总能够跟得 上原子核在新的位置所形成的势场。反之，如果由于出现了某些变化( 例如吸收光 子) ，导致了电子的存在环境或者分布发生变化，则原子核将会无法快速地运动到 新的电子分布的位置，以及由新的电子分布而形成的新的势场中去。而电子的激 发态相对于分子的振动激发态来说是不稳定的，他将会快速地回到先前的状态一 即核子之前给电子规定的势场中去。上述有关于电子与核子运动的解释所阐述的 就是波恩一奥本海默近似的物理思想所在【l j 。 实际上，分子的散射过程是一个双光子的过程。若一个光子先被吸收，之后 该分子再发射出一个光子。而如果分子吸收的入射光是可见光，那么其能量足够 将电子激发到较高的能态。随后，如果电子又回到最初的激发态，此时原子核的 运动将不再受到任何的影响一一这就是瑞利散射过程。但是另外一个可能发生的 过程就是受到激发的电子与原子核之间的运动相互作用，这就使得最后散射出来 光的能量相较入射光有所变化，这种散射过程就是拉曼过程。 拉曼效应是分子的一种非弹性散射现象。自发拉曼散射是在频率为0 3 的入射 光的场作用下产生的发生频移的散射信号，这种频移反映了分子基态的振动频率， 因此可以在分子水平上描述所研究的体系。一些散射过程的示意图如下( 图1 1 ) 。 可以看出散射是一个双光子过程，如果在该过程发生前后光子频率没有发生改变， 则称之为瑞利散射；如果光子频率发生频移，则称之为拉曼散射。这些频移的能 量可以来自光子传递给分子的过程，称之为斯托克斯线( s t o k e s ) ；反之，则称之 为反斯托克斯线( a n t i s t o k e s ) 。通常都是利用强度比较高的斯托克斯线进行研究， 但是拉曼散射强度只有瑞利散射强度的l o 一一1 0 ，导致极低的灵敏度，正因为如 此其应用一直不如红外光谱。 如果入射光的能量与分子的第一激发态和基态的能级差接近或一致时( 如下 图1 1 所示) ，将会发生共振拉曼效应，其散射强度可以增强1 0 6 倍。由于能够在合 适的激发光下产生共振拉曼效应的分子并不多因而限制了共振拉曼效应的应用范 围。 基于s e r s 方法检测的d n a 酶生物传感器的研究 激发态 虚态 一一 基态 加 饥忽 h v v ，v v i 一 砒 h v 、 m p 斯托克斯拉曼散射瑞利散射反斯托克斯散射近共振拉曼散射 图i 1 不同散射过程示意图 1 2 表面增强拉曼光谱( s e r s ) 1 2 1s e r s 的发现及其特点 f l e i s c h m a n n 小组【2 】在1 9 7 4 年首次得到吡啶吸附在粗糙的银电极表面的高质 量拉曼图谱；直到1 9 7 7 年，由v a nd u - y n e 小组【3 】以及c r e i g h t o n 小组【4 】证实该信号 来自某种特殊的光学效应，吸附在粗糙电极表面的吡啶的拉曼散射信号比与溶液 中相同数量的吡啶的拉曼信号增强了约6 个数量级，这是一种与粗糙表面相关的 巨大的表面增强效应，称为表面增强拉曼散射( s u r f a c e e n h a n c e dr a m a ns c a t t e r i n g ， s e r s ) ，所得到的光谱称为表面增强拉曼光谱( s u r f a c e - e n h a n c e dr a m a ns p e c t r o s c o p y , s e r s ) 。 研究者们在理论和实验的基础上，将s e r s 效应所具有的一些普遍性的特点 归纳如下【5 7 】： ( 1 ) 可以产生s e r s 效应的前提是表面进行粗糙化的处理，不同的表面处理方 法获得的表面活性也就不同。 ( 2 ) 能够检测到许多分子的s e r s 信号，但是他们的增强因子往往是不同的； 能够在多种金属表面观察到s e r s 效应，而且可以在金、银、铜贵金属表面获得 1 0 6 的增强倍数。 ( 3 ) 具有极高的表面灵敏度，而且吸附在金属表面上的第一层分子可以获得最 大程度的增强。 硕士学位论文 ( 4 ) s e r s 谱峰的相对强度和频率与分子本体的常规的拉曼光谱相比存在较大 的差异。 ( 5 ) 在常规的粗糙化的金属表面s e r s 是完全退偏振的；在单个纳米粒子或者 纳米管、线的表面，则s e r s 谱峰可能是偏振的。 ( 6 ) 在具有s e r s 效应的粗糙表面上，电位法沉积少量非s e r s 活性金属例如 p b 、t l 等可以导致s e r s 效应的减弱和淬灭，而且s e r s 的活性也会随着外界条 件的改变而不可逆的消失。 1 2 2s e r s 的机理 现在虽然人们对于s e r s 现象有了比较清晰的认识，但是对于其增强的机理 仍未有统一的结论。科学家普遍认为存在的两种机理【6 。9 】是电磁场增强机理 ( e l e c t r o m a g n e t i ce n h a n c e m e n tm e c h a n i s m ) 和化学增强机理( c h e m i c a le n h a n c e m e n t m e c h a n i s m ) 。 首先，电磁场( e m ) 增强是一种物理模型，他来自于电磁场的增强因子约为10 5 【9 】。由于具有一定的表面粗糙度的自由电子金属基底的存在，使入射激光在表面产 生的电磁场有较大地增强，而由于拉曼散射强度和分子所处的光电场强度的平方 呈正比，因此极大地提高了吸附在金属基底表面的分子产生拉曼散射的几率，从 而提高了表面拉曼强度。但是这种模型无法解释一些问题，例如不同的吸附分子 在同一个s e r s 活性基底上出现了不同的增强效应；s e r s 谱峰的相对强度与常 规的拉曼光谱相比发生了变化；只有当吸附的分子是以化学成键或者形成表面络 合物的方式吸附于金属基底表面上才可能有非常高的增强因子；分子吸附在某些 特殊的活性位点上才能够产生s e r s 信号，而且一些实验表明在基底上只存在少 量的表面活性位点；在电化学体系中，吸附分子的s e r s 强度通常是所加电极电 位的函数。以上的种种现象说明除了电磁场增强作用外，极可能还存在着其他的 增强效应。 因此，科学家们又提出了许多种模型用来解释上面的现象，其中主要的是化 学增强机理，这种机理主要是研究吸附物种和金属表面的作用以及成键效应。化 学增强的贡献有两部分：增强因子分别为1 0 1 和1 0 3 的静态化学增强和共振增强【9 1 。 其中静态化学增强来自于在分子靠近金属表面后电子性质发生改变；而共振增强 则是来自于分子的激发或者分子和金属之间的电荷传递激发。而金属吸附原子和 吸附分子之间的电荷传递增强，即吸附原子电荷传递络合物模型是最受关注的。 迄今为止，人们认为，电荷的传递包括电荷从金属转移至吸附分子或者从吸 附分子转移至金属表面这两种方式。我们以前者为例，四个主要的过程如下： 1 ) 处于金属的费米能级附近的电子在吸收激发光子后被激发到比费米能级更 高的轨道，而在费米能级以下的轨道上产生了空穴，因此在金属的一侧形成了电 子空穴对： 基于s e r s 方法检测的d n a 酶生物传感器的研究 2 ) 电子在吸收了光子能量之后转移至吸附分子的l u m o 能级( 即分子离子态 的基态) ，这个过程需要吸附分子和金属的表面之间存在某种化学作用并与吸附原 子或者原子簇等活性中心形成化合物； 3 ) 当电子再次跃迁回到金属时，此过程中分子某些振动能级会发生变化，吸 附分子将处于某一振动激发态； 4 ) 返回的电子和金属的内部空穴复合并且辐射出一个拉曼光子【9 】。 第一和第二两个过程是在这四个过程中起决定作用的，这两个过程关系到激 发光的光子能量是否与电子跃迁所需的能量相匹配，只有两者接近或者相等时才 可能发生共振现象，因此可以通过改变激发光的波长或者电极的电位来实现电荷 的转移。 1 2 3s e r s 活性基底和s e r s 标记物 在关于s e r s 机理的讨论中，可以看出s e r s 的强度与增强基底的形貌和性 质有着极大的关系。到目前为止，可作为s e r s 活性基底的物质有a g ，a u ，c u ，p t ， l i ，n a ，k ，a 1 ，i n ，n i ，p d ，r u 及某些金属氧化物和半导体材料，其中以a g ，a u ，c u 三种金属最常见。由于具有纳米级尺度粗糙表面和大部分的水溶液的性质，金溶 胶、银溶胶常常作为s e r s 活性基底，在溶液的体系中，对于可溶性的吸附分子 展开生物化学、痕量分析等领域的研究具有重要的优势。一般来说，纳米粒子的 硕上学位论文 息。而选择某些对于表面结构比较敏感的分子作为探针，根据分子的特征谱峰频 率和峰形的变化能够推断出与它们相应的吸附位置；也可以利用这类对表面十分 敏感的探针分子来研究它们和不同表面的作用。 s e r s 能够提供的表面丰富的振动光谱信息使得表面增强拉曼光谱得以飞速 的发展，并在各个领域如材料、电化学、催化、腐蚀及防腐、分析化学、化学与 生物传感器、医学等方面得到了广泛的应用。不久前，在英国皇家化学会c h e m i c a l s o c i e t yr e v i e w s 杂志上发表了一期专刊，主要内容是由多位科学家从不同的角度 详细探讨了s e r s 在生物化学分析方面的理论基础及其相关的应用 1 5 1 。 在生物检测技术中，研究者们能够广泛注意表面增强拉曼光谱( s e r s ) 的原因 在于：s e r s 窄谱带的拉曼特征光谱能够在避免复杂体系中多物种问的相互干扰 的情况下为分析物种提供极其丰富的结构信息；而与荧光相比较，任何波长光源 的激发下，s e r s 都不会发生光漂白和自淬灭等现象 1 6 1 ；在检测的灵敏度方面 s e r s 能够达到几乎可以和荧光技术相媲美的单分子水平，能够得到高达1 0 t m _ 1 0 ” 的增强倍数【l7 。 近年来，由于表面增强拉曼光谱( s e r s ) 能够提供详细的结构信息以及高达几 乎可以和荧光技术相媲美的单分子水平的高灵敏度，被广泛应用于d n a 、生物活 性分子、蛋白质和细胞的生物分析。而研究者们研究发现怎样制备出具有高s e r s 活性同时稳定的拉曼标记基底是s e r s 能够应用于这些生物分析的关键。因此研 究人员利用具有极高s e r s 活性的a g 和a u 纳米颗粒用作基底和具有大拉曼 横截面的分子用作标记物，应用于d n a 检测和免疫分析。一般情况下，捕获探 针和拉曼标记物都可以吸附在纳米颗粒表面【l 弘2 们，或是先形成共轭再吸附到纳米 颗粒表面【2 卜2 引。然而，第一种方法需要小心谨慎和大量地试验来控制捕获探针和 拉曼标记物的比率；第二种方法要求高的有机合成技术。然而纳米粒子核壳结构 的引进，尤其是硅包裹的a g n p s 和a u n p s 【2 5 1 ，极大地增加了捕获探针和拉曼 标记物吸附在纳米颗粒表面上的数量。 1 2 4 1s e r s 应用生物小分子中的检测 s e r s 应用于生物小分子的检测上，一般方法是向生物小分子中加入拉曼的 活性基底溶液，利用的是其本身所具有的拉曼活性实现分析检测，如k n e i p p 等f 2 6 】 将多巴胺和去甲肾上腺素加入银溶胶中充分混合，利用待测物具有的拉曼活性和 银纳米颗粒的信号增强作用，达到区分这两种小分子的目的。 然而，不是所有的生物小分子都能直接吸附到基底表面，因此我们需要开发 出新的技术来检测。例如s h a r e r p e l t i e r 等【2 7 刁o 】借鉴h p l c 中有关固定相的方法， 而吸附相是在s e r s 活性基底上修饰了一层自组装膜( s a m ) ，从而加快了葡萄糖 分子在膜中的渗透速率，并且在银电极表面的电磁增强场中富集，然后利用s e r s 实现实时快速检测葡萄糖的目的。 基于s e r s 方法检测的d n a 酶生物传感器的研究 1 2 4 2s e r s 应用d n a 中的检测 近些年来，d n a 的特异性检测得到人们的关注，发展快速、可靠的检测方法 不仅仅停留在科研领域，在很多其他领域例如法律取证、食品安全控制以及农业 均有实际的应用。s e r s 在d n a 检测中的应用，通常分为标记型和非标记型两 种。 标记型d n a 的s e r s 检测一般通过分析修饰在d n a 上的拉曼染料或 s e r s 活性标记物来进行对目标d n a 的检测。s e r s 活性的d n a 探针设计如 图1 2 所示，要获得有效的s e r s 信号必须具备两个基本条件：1 ) 生色团能在该 激发频率下共振；2 ) 标记的d n a 片段能吸附于粗糙的金属表面。 tttt d n a连接部分染料表面捕获基团 图1 2s e r s 活性的d n a 探针成分示意图 1 9 9 4 年，v o d i n h 小组【3 l 】首次报道了基于s e r s 标记的基因探针。他们把具 有s e r s 活性的染料和d n a 链相结合形成拉曼检测探针，在该探针与目标d n a 链结合后，将其转移到镀银的氧化铝基底上，从而产生增强的拉曼信号。随后， 他们利用标记了拉曼活性物质的d n a 探针完成了一系列的工作，例如在聚合酶链 反应( p c r ) 中将其作为引物来测定目标d n a 的序列，以及在微阵列上检测乳腺癌 基因b r c a l 的片断等 3 2 - 3 4 j 。 在标记型d n a 的s e r s 检测上，c a o 等 2 0 , 3 5 - 3 7 】直接在金纳米颗粒上固定标记 有s e r s 活性物质的d n a 探针，通过与目标链杂交，将d n a 探针固定到基底表 面，并通过银染使s e r s 信号增强的方法来定量检测d n a 的浓度，值得一提的是 其检测限达到了2 0f m o l 。w a b u y e l e 小组【3 8 】通过a u s 键将标记了s e r s 活性分子 具有发夹结构的d n a 固定在纳米银基底表面，此时s e r s 活性分子与银纳米颗粒 距离较近而引起较强的拉曼信号。当引入目标d n a 时，由于目标d n a 与其中的 环状部分杂交而发生构象变化，使得s e r s 活性物质远离基底表面，引起s e r s 信号减弱( 如图1 3 ) ，从而达到检测d n a 的目的。 6 - 硕上学位论文 图1 3 基于构型的变化标记型d n a 检测方法 在非标记s e r s 活性分子检测d n a 方面，b r a u n 等【3 9 , 4 0 】将标记有银纳米颗 粒的目标d n a 通过与捕获探针杂交固定到银表面，利用银基底表面的s e r s 信 号分子检测目标d n a 分子。然后用中性的p n a 作为捕获探针和目标d n a 杂 交后，其表面带有负电荷，再通过静电作用吸附s e r s 活性分子和银纳米颗粒， 发展了一种检测d n a 的方法。另外一种非标记型的检测方法主要是基于s e r s 对d n a 片断的其自身的拉曼光谱进行分析检测。例如b a r h o u m i 等【4 l 】将退火的 单链d n a 或者双链d n a 吸附到s e r s 活性基底上，通过直接获得的d n a 的 s e r s 光谱，实现了对d n a 的直接检测，同时他们发现不同d n a 的拉曼光谱 类似，而且主要是腺嘌呤的拉曼光谱。 1 2 4 3s e r s 应用免疫中的检测 由于具有光谱选择性和较高的灵敏度，s e r s 应用在免疫检测中有许多独特 的优越性。而与荧光相比较，任何波长光源的激发下，s e r s 都不会发生光漂白 和自淬灭等现象，这样就能够通过提高光谱的累积时间和增加探针上染料分子的 标记个数来增强s e r s 信号，从而提高检测灵敏度。甚至是多种拉曼染料可以在 同一波长下激发，并且可以很大程度上避免不同峰的重叠，这就为多组分检测提 供了可能性【4 2 1 。这些事实均说明了在免疫检测中s e r s 的应用潜力。 s e r s 用于免疫检测，一般是通过构建各种不同的s e r s 标记物探针，利用 特异的免疫反应方法，形成夹心结构，以达到分析检测的目的。1 9 8 9 年，r o h r 小 组【4 3 j 首先将s e r s 用于甲状腺促进激素( t s h ) 抗体的检测，s e r s 活性基底为表 面覆有t s h 抗体的银膜，捕获溶液中待测的t s h 将其固定在基底表面，最后通 过加入甲基偶氮苯氨修饰的t s h 抗体来结合t s h ，形成了典型的“三明治”夹心 结构，这样，通过检测拉曼标记物的信号强度就可以确定t s h 的含量。免疫检 测的典型步骤如图1 4 所示。首先将抗原固定在基底表面，再将该基底浸入到抗 基于s e r s 方法检测的d n a 酶生物传感器的研究 体和不同种拉曼染料共同修饰的金纳米溶胶中形成夹心结构，随后通过表面 s e r s 信号检测待测物，通过标记不同的染料就可以检测不同的目标物。在免疫 检测探针的设计上，p o r t e r 等【1 9 , 2 1 , 2 2 , 4 4 开展了大量研究，开发出一系列s e r s 探 针，有效的提高了s e r s 检测的灵敏度。 c a p t u r es u b s t r a t ep r e p a r a t i o n a us u b