（食品科学专业论文）丙酮丁醇梭菌的选育及其发酵产丁醇研究.pdfVIP

合肥工业大学 1 1 1 111i i1 111 1ii1 11 1wll y 18 8 6 2 4 0 本论文经答辩委员会全体委员审查，确认符合合肥工业大 学硕士学位论文质量要求。 答辩委员会签名：( 工作单位、职称) 合肥工业大学副教授 安徽省农科院副研究员 翔参 合月巴工业大学 副教授 ， ? 一_ 。二l 二，二、一 ”一：j ：二- j 0 - ”。“：、 一 j- ：陟午 合肥工业大学教授 泌 il奴丫i 舻粉 或撰写过的研究成果，也不包含为获得合肥工业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示谢意。 丁醇作为一种重要的四碳平台化合物，已广泛应用于医药、化工等领域。 随着石油资源的枯竭和环境压力的加剧，丁醇作为一种极具开发潜力的可再生 能源倍受人们的高度关注。玉米秸秆是自然界中储量非常丰富的可再生资源， 采用廉价的秸秆代替传统的玉米及糖蜜发酵产丁醇可以很大程度上减少丁醇生 产成本。本文采用复合诱变的方法对丙酮丁醇梭菌进行选育；通过高产突变株 发酵工艺的优化，获得最适发酵条件；并对玉米秸秆水解液发酵产丁醇的效果 进行了初步研究，得到如下主要结果： 1 采用紫外线与甲基磺酸乙酯复合诱变丙酮丁醇梭菌c i c c 8 0 1 2 的较适条 件为紫外照射1 2 0s ，5 ( v v ) 甲基磺酸乙酯处理6 0r a i n ；经溴甲酚绿平板初筛 和发酵复筛，最终得到1 株高产丁醇突变株m 3 l ；突变株发酵葡萄糖产总溶剂 1 0 3 9 l ，其中丁醇产量为6 5 5g l ，较原始菌株分别提高了1 6 4 8 和2 0 6 2 ； 经6 次传代接种，突变株m 3 1 丁醇产量较稳定。 2 通过p l a e k e t t b u r m a n 及b o x b e h n k e n 响应面设计，得到突变株m 3 1 最 适的培养基组成为：初始糖4 9g l 、( n h 4 ) 2 s 0 43g l 、酵母浸粉1 5g l 、 m g s 0 4 7 h 2 0o 3 7g l 、k h 2 p 0 4lg l 、f e s 0 4 7 h 2 0l5m g l 、c a c 0 3 4 4 5g l 和l 半胱氨酸盐酸盐0 7 5g l ；正交试验获得突变株m 3 1 最适发酵条件为： 温度3 7 ，初始p h 5 5 、接种量5 、装液量8 0 、热激时间为6 0s 。此条件下， 总溶剂产量达到1 5 2 6g l ，其中丁醇产量为9 5 7g l 。 。， 3 考察玉米秸秆水解液中有毒成分对丁醇发酵的影响，结果表明糠醛含量 超过1g l 时，严重抑制菌体生长和产物合成；不同方法对玉米秸秆水解液脱 毒的效果显示，亚硫酸盐法虽然总糖损失率较高，但水解液中的糠醛含量最少， 。二二、? 仅为对照组的2 5 6 2 ，并且发酵终点时生物累积量和丁醇质量浓度最高，分剐? 一“：一， 较对照组提高4 2 3 4 和1 6 5 9 。 一 “。7 4 对突变株m 3 1 发酵脱毒玉米秸秆水解液的碳源、氮源及无机盐浓度进 行考察，得到的较优条件为：初始秸秆水解液8 0g l 、( n h 4 ) 2 s 0 43g l 、k h 2 p 0 4 0 3g l 、m g s 0 4 7 h 2 00 3g l 和f e s 0 4 7 h 2 01 5m g l ，此条件下发酵7 2h ，丁 醇产量为5 5 3 l ，较优化前提高了6 5 5 7 。 关键词：丙酮丁醇梭菌，丁醇，复合诱变，响应曲面法，玉米秸秆水解液，糠 醛 s c r e e n i n go fc l o s t r i d i u ma c e t o b u t y l i c u ma n df e r m e n t a t i o no f b u t a n o l a b s t r a c t b u t a n o l i sai m p o r t a n tn e u t r a lc 4p r i m a r ya l c o h 0 1 i ti sw i d e l yu s e di nt h ea r e a o fm e d i c i n e 、f o o da n dc h e m i c a l b e c a u s eo ft h e s e r i o u s n e s so fe n e r g ya n d e n v i r o n m e n t a lp r o b l e m s ，t h e r ei sa ni n c r e a s i n gf o c u so nb i o b u t a n o la sar e n e w a b l e e n e r g ys o u r c e c o r ns t r a wi sa b u n d a n ta san a t u r a lr e n e w a b l es o u r c e u s eo fs t r a w a sas u b s t i t u t eo fc o r na n dm o l a s s e sf o rb u t a n o lp r o d u c t i o ni sa n t i c i p a t e dt ob e m o r ee c o n o m i c a l t h i s p a p e rh a ss t u d i e do nt h es c r e e n i n go fc l o s t r i d i u m a c e t o b u t y l i c u m ；o p t i m i z a t i o no ff e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sa n df e r m e n t a t i o no fc o r n f i b e rh y d r o l y s a t e ；r e s e a r c hr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1c l o s t r i d i u m a c e t o b u t y l i c u mc i c c 8 0 1 2w a sm u t a t e db yu va n de m s c o m p l e xm u t a g e n e s i sw i t ht h ep u r p o s eo fi n c r e a s i n gt h ey i e l do fb u t a n 0 1 t h e r e s u l t ss h o w e dt h a tm u t a n tm 31w a so b t a i n e dw i t hh i g hy i e l da n dh e r e d i t a r y s t a b i l i t yi nt h ec o n d i t i o n so fu v12 0sa n de m s6 0r a i n t h ey i e l do ft o t a ls o l v e n t a n db u t a n o lp r o d u c e db ym u t a n tm - 31w e r e1 0 3 9g la n d6 5 5 g l ，w h i c hw e r e 16 4 8 a n d2 0 6 2 h i g h e rt h a nt h eo r i g i n a ls t r a i ni ng l u c o s em e d i a h e r e d i t a r y s t a b i l i t yt e s td e m o n s t r a t e dt h a tt h ep r o d u c t i v i t i e so fm u t a n tm 一31f r o m1 。t o6 m s e r i a lp a s s a g ew e r es t a b l e 2b yp l a c k e t t b u r m a n 、b o x b e h n k e na n do fe x p e r i m e n t t h ef e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n so fm u t a n tm 31w e r eo p t i m i z e d t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h eo p t i m u m f e r m e n t a t i o nm e d i u mw e r ea sf o l l o w e d ：g l u c o s e4 9g l ，( n h 4 ) 2 s 0 43 g l ，y e a s t e x t r a c t1 5 g l ，m g s 0 4 7 h 2 00 3 7g l ，k h 2 p 0 4 1 g l ，f e s 0 4 7 h 2 0 15m g l ， 劬34 4 5 kl c y 吼萌n e 0 7 5 0 p t i m u m c u l t u r ec o n d i t i o nw e r ef e r m k e n t 时a t i o o r n 也t e o g m p o n e r 矾a t “u r 器e 勰i n i 勰t i 豁o 3 7 g ：。a 蚕h5 - 5 一。 i n o c u l u m sv o l u m e5 ，l i q u i dv o l u m e8 0 ，h e a tt r e a t m e n tt i m e6 0s u n d e rt h o s e c o n d i t i o n s ，t h et o t a ls o l v e n ty i e l do fm - 31w a si5 2 6g l ，b u t a n o lp r o d u c t i o n r e a c h e d9 5 7g l 3t h er e s e a r c hw a sf o c u s e do nt h ee f f e c t so ft o x i cc o m p o u n d si nc o r nf i b e r h y d r o l y s a t ed u r i n g b u t a n o lf e r m e n t a t i o n 。t h e r e s u l ts h o w e dt h a tw h e nt h e c o n c e n t r a t i o no ff u r f u r a le x c e e d e d1 g l ，t h eg r o w t ho fm i c r o o r g a n i s m sa n dt h e p r o d u c t i o no fs o l v e n tw e r es e v e r e l yi n h i b i t e d t h e r e f o r es e v e r a lm e t h o d sw e r e e v a l u a t e df o rd e t o x i c a t i o no fh y d r o l y s a t e b ys e n s i t i v i t ya n l y s i s ，w ef o u n dt h a t c o m p a r e dt ot h eo t h e rp r o d u r e s ，d e t o x i f i e dm e t h o d sb yn a s 0 3h a sg a i n e dt h e l o w e s tc o n c e n t r a t i o no ff u r f u r a la c c o u n t e df o r2 5 6 2 o fc o n t r a s ta n dt h eh i g h e s t l o s so ft o t a ls u g a r t h eb i o m a s sa n db u t a n o lp r o d u c t i o na c h i e v e dg r e a t e s t ，w h i c h h w e r e4 2 3 4 a n d1 6 5 9 h i g h e rt h a nc o n t r a s t 4t h e o p t i m a lc o m p o s i t i o no fc o r nf i b e rh y d r o l y s a t ef e r m e n t a t i o nm e d i aw e r e d e t e r m i n e da sf o l l o w s ：i n i t i a ls u g a ri nc o r nf i b e rh y d r o l y s a t e8 0g l ，( n h 4 ) 2 s 0 43 g l ，k h 2 p 0 40 3g l ，m g s 0 4 7 h 2 0o 3g l ，f e s 0 4 7 h 2 015m g l u n d e rt h o s e c o n d i t i o n s ，t h ey i e l do fb u t a n o lw a s5 5 3g l ，w h i c hw e r e6 5 5 7 h i g h e rt h a n b e f o r eo p t i m i z a t i o n k e yw o r d s ：c l o s t r i d i u ma c e t o b u t y l i c u m ，b u t a n o l ，c o m p l e xm u t a g e n e s i s ，r e s p o n s e s u r f a c e ，c o r nf i b e rh y d r o l y s a t e ，f u r f u r a l i i i 致谢 本论文是在潘丽军教授的悉心指导和帮助下完成的。在三年的研究生期间， 潘老师在学习和生活上都给予了极大的关心与照顾。从论文的选题、实验设计 和实验实施到论文的定稿都凝聚着潘老师大量的心血。潘老师严谨的治学态度， 孜孜不倦的育人精神令我深深感动，终身难忘。在此向潘老师致以最衷心的感 谢和最诚挚的敬意，祝潘老师身体健康，万事如意。 感谢姜绍通教授、杨培周老师、李兴江老师、罗水忠老师、韩卓老师、陈 小燕老师等对我的试验大力支持和帮助。 感谢已毕业的易守连学姐在实验过程中给予的帮助和指导。感谢汪昊曙学 弟和高星星学妹在实验中的帮助。感谢储开庆、庞锐、吴锦长、孟玲玲、徐涟 漪、胡琳琳、黄增霞、鲍俊杰、周俊、刘涛涛这些我最亲爱的同学们，与你们 一起度过的三年是一辈子难以忘怀的，你们在学习上给了我极大地帮助和支持， 在生活上带给我开心和快乐，在我遇到困难的时候总有你们在背后支持我，鼓 励我，谢谢你们。 最后要感谢我的家人，是他们给了我最大的支持和关怀，让我能够顺利完 成学业，无论身在何方，都能感到你们浓烈的爱，让我勇敢面对一切，在此向 你们表示深深的感谢。 作者：袁忠娣 2 0 1 】3 】4 i v 第一章绪论。1 1 1 丁醇的性质及应用1 1 1 1丁醇的性质1 1 1 2 丁醇的应用1 1 1 3丁醇的主要生产方法2 1 3 生物丁醇研究进展。：3 1 2 1生物丁醇菌种及其代谢机理_ 3 1 2 2 菌种的改良5 1 2 3发酵底物与工艺的研究现状6 1 3 本课题研究的目的、意义及主要内容9 1 3 1研究的目的和意义一9 1 3 2 研究的主要内容9 第二章高产丙酮丁醇梭菌的选育1 0 2 1 材料与方法j 1 0 2 1 1菌种与试剂1 0 2 1 2 仪器与设备1 l 2 1 3培养基与培养方法j 1 1 2 1 4 分析方法1 2 2 2 实验方案1 4 2 2 1 紫外线诱变1 4 v2 2 。2 甲基磺酸乙酯诱变：1 4 2 2 3 复合诱变1 5 2 2 4 高产菌株的筛选 - _ ： 。：j j ：_ ：1 5 2 2 5 高产突变株与原始菌株发酵特性比较：o ：e 1 5 2 3 结果与分析l5 2 3 1 紫外线诱变效果1 5 2 3 2 甲基磺酸乙酯处理结果16 2 3 3复合诱变后高产突变株的筛选结果1 6 2 3 4高产突变株遗传稳定性考察结果1 8 2 3 5突变株m 3 1 与原始菌株发酵特性比较结果1 9 2 4 小结2 l 第三章高产丁醇突变株m 3 l 的发酵工艺优化2 2 3 1 材料与方法2 2 v 3 1 2 试剂与设备2 2 3 1 3培养基与培养方法2 2 3 1 4 分析方法2 2 3 2 实验方案2 2 3 2 1培养基单因素试验2 2 3 2 2 培养基p l a c k e t t b u r m a n 试验2 3 3 2 3培养基b o x b e h n k e n 试验2 4 3 2 4发酵条件单因素试验一2 4 3 2 5正交试验优化最适发酵条件2 4 3 3 结果与分析2 5 3 3 1培养基单因素试验结果2 5 3 3 2培养基p l a c k e t t b u r m a n 试验结果3 0 3 3 3培养基b o x b e h n k e n 试验结果3 2 3 3 4发酵条件单因素试验结果3 5 3 3 5发酵条件正交试验优化的结果3 9 3 4小结4 1 第四章突变株m 3 1 利用秸秆水解液产丁醇研究4 2 4 1 材料与方法4 2 4 1 1菌种与原料。4 2 4 1 2试剂与设备4 2 4 1 3 培养基与培养方法4 2 4 1 4 分析方法j 4 3 4 2 实验方案4 5 4 2 1糠醛质量浓度对发酵效果的影响：4 5 茏磊呈嘉粪纂篡塞篓鋈譬季喜鋈墓黧鬟黧瞧黧豢i ：主 4 2 3 脱毒秸秆水解液发酵产丁醇试验：j ：j ：。：o ：i 嚣：4 5 一，：0 + 。_ 一 4 2 4高产突变株m 3 1 利用脱毒秸秆水解液发酵特性试验4 6 4 3 结果与分析j - j 4 6 4 3 1 糠醛质量浓度对发酵效果的影响4 6 4 3 2 不同水解液脱毒方法研究试验结果：4 7 4 3 3脱毒秸秆水解液发酵产丁醇试验结果4 7 4 3 4突变株m 3 1 利用脱毒秸秆水解液发酵过程曲线5 2 4 4 d 、结5 2 第五章结论与展望5 3 v i i 5 3 5 3 5 5 6 4 。6 5 图1 1 图2 1 图2 2 图2 3 图2 - 4 图2 5 图2 - 6 图2 7 图2 8 图2 9 图3 1 图3 2 图3 3 图3 - 4 图3 5 图3 - 6 图3 7 图3 8 图3 - 9 图3 1 0 图3 1 1 图3 1 2 图3 1 3 图3 1 4 图3 1 5 图3 1 6 图4 1 图4 2 图4 3 图4 4 图4 5 图4 6 图4 7 图4 8 图4 9 插图清单 丙酮丁醇梭菌葡萄糖代谢途径4 葡萄糖标准曲线1 4 紫外诱变存活曲线1 6 e m s 诱变效应曲线1 6 紫外诱变突变株筛选结果1 7 e m s 诱变c m 2 3 突变株筛选结果1 7 突变株m 3 1 与原始菌株总溶剂产量变化1 9 突变株m 3 1 与原始菌株丁醇产量变化1 9 突变株m 3 l 与原始菌株还原糖含量变化2 0 突变株m 3 1 与原始菌株生物量变化o 2 0 葡萄糖质量浓度对溶剂产量的影响2 5 ( n h 4 h s 0 4 质量浓度对溶剂产量的影响2 6 酵母浸粉质量浓度对溶剂产量的影响2 6 m g s 0 4 7 h 2 0 质量浓度对溶剂产量的影响2 7 k h 2 p 0 4 质量浓度对溶剂产量的影响2 8 f e s 0 4 7 h 2 0 质量浓度对溶剂产量的影响2 8 c a c 0 3 添加量对溶剂产量的影响2 9 l 半胱氨酸盐酸盐添加量对溶剂产量的影响3 0 y f f i f ( x l ，x 2 ) 响应面图及等高线3 4 y = f ( x l ，x 3 ) 响应面图及等高线3 4 y = f ( x 2 ，x 3 ) 响应面图及等高线3 4 热激时间对溶剂产量的影响3 5 装液量对溶剂产量的影响3 6 接种量对溶剂产量的影响3 7 初始p h 对溶剂产量的影响3 8 温度对溶剂产量的影响：3 8 糠醛标准曲线4 3 葡萄糖标准曲线4 4 木糖标准曲线4 4 糠醛含量对发酵的影响4 7 突变株m 31 生长曲线4 8 秸秆水解液初始糖质量浓度对溶剂产量的影响4 8 氮源种类对溶剂产量的影响4 9 ( n h 4 ) 2 s 0 4 质量浓度对溶剂产量的影响5 0 k h 2 p 0 4 浓度对溶剂产量的影响5 0 v i i i i x 5 1 5 l 5 2 2 1 3 1 8 1 8 3 0 3 1 3 1 3 2 表3 5b o x b e h n k e n 试验设计与结果3 2 表3 - 6方差分析及显著性检验3 3 表3 7 正交试验因素水平表3 9 表3 8正交试验设计与结果4 0 表3 - 9正交试验方差分析表4 0 表3 1 0发酵条件优化验证试验结果4 l 表4 1不同脱毒方法的效果4 7 x 1 1 丁醇的性质及应用 1 1 1丁醇的性质 正丁醇( 1 b u t a n o ) 又称1 丁醇，习惯简称为丁醇，分子式为c 4 h 9 0 h ，结 构式为c h 3 c h 2 c h 2 c h 2 0 h ，相对分子质量7 4 1 2 ，是一种具有酒精气味的无色 透明液体。熔点为9 0 2 ，沸点为1 1 7 7 ，2 0 时密度为0 8 1 0 9 ，在水中的 溶解度为7 7 ( 质量比) ，能与乙醇和乙醚等多种有机溶剂混溶。丁醇易燃，其 蒸汽与空气形成爆炸性混合物，爆炸极限为1 4 5 1 1 2 5 ( 体积比) 】。 1 1 2 丁醇的应用 正丁醇是一种重要的四碳平台化合物，是合成邻苯二甲酸正丁酯、脂肪二 元酸和磷酸丁酯、丙烯酸丁酯及醋酸丁酯等物质的原料，现已广泛应用于医药、 化工、生物燃料等领域【2 巧】。 1 1 2 1正丁醇在医药行业中的应用 丁醇在病理组织切片制作过程中既可以与水和乙醇互溶又能与石蜡互溶，_ 因此起到了脱水及透明的双重作用。此外丁醇性质较柔和，可以使组织韧性增 加，脆性减少，适用于任何性质组织的脱水及透明。一般认为，组织的性质和 厚度不同，脱水时的要求也不同，丁醇则可满足此要求。既避免了二甲苯的较 强收缩作用导致的切片质量问题，同时也消除了二甲苯对人体健康的伤害1 6 竭】。 1 1 2 2正丁醇在化工行业中的应用 正丁醇是邻苯二甲酸二丁酯( d b p ) 、丙烯酸丁酯( b a ) 、乙二醇醚和醋酸丁 酯等重要化学品的合成原料。d b p 是应用广泛的增塑剂，用于聚氯乙烯( p v c ) p j 、 硝化纤维和赛璐珞等化工制品中，也可作为油漆润滑剂、乳化剂等。b a 是丙烯 酸酯类的重要聚合单体，丙烯酸酯类聚合物及其衍生物被广泛应用于涂料、塑 料、皮革、纺织、造纸和橡胶等领域中【1 0 ，1 1 】。 1 1 2 3正丁醇在生物燃料中的应用 、。，诲 生物燃料是指通过生物资源转化得到可替代汽油和柴油的燃料，是可再生 一， 能源开发利用的重要方向，主要指生物气体燃料( 如生物氢) 、生物液体燃料( 如 生物柴油【12 1 、生物乙醇【1 3 1 和丁醇等) 和生物固体燃料( 如薪柴) 等【1 4 】，目前市 场上最普遍的生物燃料为生物柴油和生物乙醇，生物丁醇也逐渐受到人们的重 视【1 5 , 1 6 】。丁醇、乙醇和汽油特性比较见表1 1 1 7 , 1 s 】。 表1 1乙醇、丁醇和汽油的特性比较【1 q t a b l el 1c o m p a r i s o no fp r o p e r t i e so fe t h a n o l ，b u t a n o l a n dg a s o l i n e 由表1 1 可知，丁醇性质更接近汽油，可添加到汽油中，代替部分汽油。与 乙醇相比，丁醇具有以下不可超越的优势：第一，丁醇的性质更接近烃类，具 有较好的汽油配伍性，能够达到更高的汽油混合比。在不对发动机进行改造的 情况下，乙醇与汽油混合比的极限为15 ，而汽油中允许调入的丁醇可以达到 2 0 e 1 9 】。第二，由表1 1 可知，丁醇的能量密度、辛烷值、低热值与十六烷值都 高于乙醇，说明丁醇含有更高能量，具有较好的燃料经济型。研究显示，与传 统燃料和乙醇相比，丁醇可支持汽车分别多走1 0 和3 0 的路程【2 0 1 。第三，丁 醇可与汽油任意比互溶，避免分销终端调和。第四，丁醇腐蚀性小，便于管道 输送，节省运输成本。第五，丁醇亲水性弱，即便发生泄漏，其在地下水中的 扩散有限，比乙醇和汽油更安全。同时，与乙醇相同，燃烧时不放出s o x 或n o x 有利于环保。因此，丁醇是一种极具发展潜力的新型生物燃料。 1 1 3丁醇的主要生产方法 1 1 3 1 化学合成法 化学合成法包括羰基合成法和醇醛缩合法。羰基合成法是指丙烯、氧化 i ：一、碳和氢气在钴或铑催化作用下羰基合成生成正丁醛和异丁醛，经过加氢后制得 ，7i 正丁醇赫丁醇。一霹醛缩合法是由两分子乙醛缩合并脱水得到丁烯醛，丁烯醛 ：在镍或铬催化作用下加氢生成正丁醇。其牢羰基合减法办工业生产正丁醇最主 r 一 要的方法。 ，一 1 1 3 2发酵法 发酵法生产丁醇是以糖蜜和淀粉质为原料【2 ，在严格厌氧条件下利用丙酮 丁醇梭菌发酵生产丁醇。1 9 1 3 年，英国斯特兰奇一格拉哈姆公司以玉米为原料 发酵生产丙酮，丁醇作为主要副产物。一战期间，丙酮丁醇发酵一度成为生产 规模仅次于乙醇发酵的第二大发酵工业。5 0 年代石油化工的飞速发展，使化学 合成法成为丁醇生产方法的主导，发酵工业逐渐衰退。随着石油资源枯竭和环 境压力加剧，以可再生资源为原料的丙酮丁醇发酵再次受到人们的重视【2 引。 2 0 0 6 年6 月，美国杜邦公司与英国b p 公司联合宣布共同开发生产新一代生物 燃料一生物丁醇，以满足全球日益增长的燃料需求。 2 酵乳酸及 ，1 9 1 4 年 在英国的金斯郎姆( k i n g sl g m n ) 建起了世界上第一座使用威兹曼法丙酮发酵工 厂。一战结束后，杜邦公司( d up o n t ) 首先发现由丁醇合成的乙酸丁酯是硝基纤 维喷漆的优良溶剂，因此丁醇的重要价值被人们认识。到上世纪6 0 年代，美国 和日本等工业发达国家都从石油中廉价合成丙酮丁醇等溶剂，发酵法逐渐被取 代【2 3 1 。我国是少数几个未中断丙酮丁醇发酵的国家之一。1 9 5 5 年我国第一个发 酵法生产丙酮丁醇的工厂在上海建成。2 0 0 8 年1 0 月2 0 日，总投资8 千万美元， 以木薯为原料生产生物丁醇的江苏联海生物科技有限公司在海门投产，是目前 全球最大的生物丁醇生产项引2 4 1 。 1 2 1生物丁醇菌种及其代谢机理 1 2 1 1生物丁醇生产菌种 工业生产丙酮丁醇的菌种主要是梭状芽胞杆菌属( c l o s t r i d i u m ) t 2 5 1 ，按照发 酵底物的嗜好性分为两大类，一类是以淀粉质为原料，如c l o s t r i d i u m a c e t o b u 钞l i c u ma t c c8 2 4 和c l o s t r i d i u ma c e t o b u 移，l i c u md s m1 3 8 6 4 2 6 i ，此类菌株 细胞内含有淀粉酶，不需要经过糖化可直接发酵；另一类是以糖蜜和纤维素水 解液为原料，如c l o s t r i d i u mb e u e r i n c k i f 、c l o s t r i d i u mb e i j e r i n c k i in c i m b 8 0 5 2 弘 和c l o s t r i d i u ms a c c h a r o p e r b u t y l a c e t o mn 1 4 【2 8 枷】。目前国内外报道的工业发酵丙 酮丁醇菌株多为以上菌株的突变株。丁醇是丙丁菌发酵产物含量最多的溶剂， 其对细胞的毒性也最大。目前报道中有涉及到高丁醇耐受性菌株c l o s t r i d i u m b e i j e r i n c k i ib a i o i 3 1 1 ，是cb e i j e r i n c k i in c i m b 8 0 5 2 的突变株【3 2 1 ，该菌株分批 发酵总溶剂浓度达到3 3 ，其中丁醇产量1 7 2 lg l ，是目前国内外报道的丁 醇分批发酵的最高产量，具有良好的遗传稳定性，是一种适合工业连续生产的 优良菌株。 本研究采用的原始菌株是丙酮丁醇梭菌( c l o s t r i d i u ma c e t o b u t y l i c u mc i c c 8 0 12 ) 。厌氧发酵生成的丁醇：丙酮：乙醇= 6 ：3 ：1 ( 质量比) 。该菌最初由上海溶 剂厂分离得到。 1 2 1 2丙酮丁醇梭菌代谢机理 丙酮丁醇梭菌发酵分为产酸阶段和产溶剂阶段两个阶段。其代谢途径如图 1 1 【33 1 。 图1 1丙酮丁醇梭菌葡萄糖代谢途径 f i g 1 1 m e t a b o l i cp a t h w a y si nc l o s t r i d i u ma c e t o b u t y l i c u mw i t hg l u c o s e 酶代号：a ：3 磷酸甘油醛脱氢酶； ， b ：丙酮酸铁氧还原蛋白氧化还原酶； c ：n a d 铁氧还原蛋白氧化还原酶； e ：n a d h 红素还原蛋白氧化还原酶； c 氢酶； g ：磷酸酰基转移酶，。 。 j h ：乙酸激酶作用； i ：硫激酶f - 卷”乞：。：。f 一 j ：3 羟基丁酰c o a 脱氢酶； k ：巴豆酸酶；l ：丁酰c o a 脱氢酶； m ：磷酸丁酰转移酶： i 1 丁酸激酶： o ：乙醛脱氢酶； p ：乙醇脱氢酶； q ：丁醛脱氢酶； r ：丁醇脱氢酶； s ：乙酰乙酰c o a ：乙酸丁酸：c o a 转移酶： t ：乙酰乙酸脱羧酶； u ：葡萄糖磷酸变位酶； 、v ：a d p 葡萄糖焦磷酸化酶； w ：淀粉糖合成酶：x ：淀粉糖磷酸化酶： 整个代谢过程中，2 4 种酶调控代谢【3 4 1 。发酵初期，菌种处于生长指数期， 菌种迅速繁殖，生成大量乙酸和丁酸，从而引起发酵液p h 的下降，p h 降到5 - 4 时会有c 0 2 和h 2 产生，此阶段称为产酸阶段。随着菌种进入生长稳定期，p h 下 4 降至u 4 - - - 3 时，进入产溶剂阶段，乙酸和丁酸被还原成丙酮、丁醇和乙醇，酸度 上升【3 5 39 1 。 1 2 2 菌种的改良 丙酮丁醇梭菌发酵中，丁醇对细胞的毒性较大，当丁醇浓度为4 5g l 时 菌体生长受到影响；当丁醇浓度达到1 1g l ，菌体生长受到严重抑制；一旦丁 醇浓度超过1 5 l 时，菌体停止生长【4 0 1 。除此之外，发酵产物中丁醇质量比例 约为6 0 ，而工业上需要更高的丁醇比例，两个因素影响了丙酮丁醇发酵的工 业生产。因此，通过菌种改良选育出高丁醇耐受性和高丁醇比例的高产突变株 可以大大降低生产成本。 在丙酮丁醇梭菌改良中，诱变育种是目前广泛使用的手段。1 9 9 1 年，a n n o u s 等【4 1 】利用n 一甲基一n 硝基亚硝基胍( m n n g ) 诱变得到突变菌株c l o s t r i d i u m b e i j i e r i n c k i ib a l 0 1 ，具有遗传稳定性好，高淀粉酶活的特性，丙酮、丁醇和乙 醇( a b e ) 最大产量达3 3g l ，其间歇发酵的丁醇含量可达到1 9g l ，较出发菌 株提高约1 0 0 。张益菜等 4 2 l 用亚硝基胍和甲基磺酸乙酯诱变处理，获得高丁 醇比的遗传稳定菌株，丁醇产量占总溶剂的7 0 ，在百吨生产罐连续应用一年 以上，丁醇占总溶剂的7 1 9 ，比原始菌株提高了1 0 。靳孝庆等【4 习首次将氮 离子注入技术应用于丙丁菌选育，得到1 4 2 8 和1 8 1 两株较好的传代稳定性的 突变菌株，总溶剂产量分别较出发菌株提高了2 7 9 6 和2 1 8 3 ，丁醇产量较 出发菌株分别提高了4 0 6 6 和3 0 7 3 ，丁醇比由6 3 3 9 分别提高到7 1 9 4 和 6 8 0 2 。j e o n g 等【4 4 】利用离子束技术辐照c l o s t r i d i u ma c e t o b u t y l i c u m 基因工程 菌得到ec o i la t c c8 7 3 9 ，辐照前菌体所能忍受的丁醇浓度不到o 8 ，得到的突变 株可以耐受超过1 3 的丁醇，大大提高了丁醇耐受性。 口 傺了诱变育种，构建基因工程菌已经受到很多国内外学者的青睐。1 9 9 3 年， m e r m e l s t e i n 等j 4 5 】构建了一个包含乙酰乙酸脱羧酶基因( a d c ) ，辅酶a 转移酶基 因( 么c t f e ) 的质粒p f n k 6 ，并转移到c l o s t r i d i u ma c e t o b u t y l i c u ma t c c 8 2 4 中， 一! 、 首次构建了丙酮丁醇基因工程菌，该尊具鸯疼蛭穆巷篾璺囊萼瓣订譬誓：二二鼍 乙醇的产量较原始菌株分别提高拍5 ，3 7 和9 0 。；r o m a s 等【4 6 4 7 j 将过量表达 ? 。 热激蛋白( g r o e s l ) 的质粒转入c a c e t o b u t y l i c u ma t c c 8 2 4 中，构建了高丁醇耐受 性基因工程菌。该基因工程菌产生的总溶剂浓度较原始菌株提高了4 0 ，且其 代谢活性周期较原始菌株延长了2 5 倍。h a r r i s 等【48 】构建了溶剂抑制酶( s o l g ) 缺陷 性菌株肋腿日，具有较高的葡萄糖利用率和溶剂产量( 丁醇：丙酮：乙醇 = 2 5 ：1 4 ：8 1 ) ，并在此菌基础上构建携带醇醛脱氢酶基因( a a d ) 工程菌 s o l r h ( p t a a d ) ，该菌发酵后其溶剂比例丁醇：丙酮：乙醇= 2 1 ：4 5 ：6 2 ，产量分别 为2 2g l ，8 2g l ，1 7 6g l ，a b e 产量达到2 8g l ，但a a d 在a t c c8 2 4 中的表 达并不能提高溶剂产量，这表明s o l r 失活对a a d 的过量表达造成溶剂产量大幅提 高的积极作用是必需的。b o r d e n 等【_ 9 】在2 0 0 7 年构建两株较好的分别携带 5 c a c 0 0 3 和c a c l 8 6 9 基因的工程菌，分别较原始的丁醇耐受性提高了13 和8 1 。 h a r r i s 等【5 0 】为了研究控制孢子形成基因s p 0 0 a 在控制溶剂产生和孢子形成的作 用构建了工程菌s k 0 1 和8 2 4 ( p m p s o a ) ，分别失活勋d 伽的表达和高效的表达 s ；0 0 a ，结果表明s p 0 0 a 失活表达使丙酮和丁醇的产量分别降低了9 8 和9 2 ， 并且未形成孢子，但8 2 4 ( p m p s o a ) 具有较高的溶剂产量，且孢子形成期提前， 这说明s p 0 0 a 的过量表达有利于孢子形成和溶剂产量的提高。后来学者 s c o t c h e r ”】研究印d e 在控制溶剂产生和孢子形成的作用构建了工程菌p ms ；o 和p a 勋d ，分别高效的表达勋d 口e 和降低勋口e 的表达，结果表明跏d e 过量 表达并不能提高溶剂产量，但勋d e 表达减低使丙酮、丁醇、乙醇的产量分别 提高了4 3 ，1 1 0 和2 2 5 ，并且使孢子延期形成，形态也发生了改变，这