（农业昆虫与害虫防治专业论文）滞育中红侧沟茧蜂hsp70和hsp90的克隆与表达.pdf

中文摘要 中红侧沟茧蜂m i c r o p l i t i sm e d i a t o r 属于茧蜂科b r a c o n i d a e ，小腹茧蜂亚科 m i c r o g a s t e r i n a e ，侧沟茧蜂属m i c r o p l i t i s 。其寄主范围非常广泛，该蜂对棉铃虫各 世代的平均寄生率可达2 2 9 ，是棉铃虫田问生物控制的重要因子。中红侧沟茧 蜂有滞育的特性，利用这一特性，可以人工大量饲养并储藏滞育个体，在适当的 时机释放于田间，用于棉铃虫的生物防治。研究中红侧沟茧蜂滞育机理及其分子 调控机制，不仅具理论意义，而且对棉铃虫的生防实践有很强的指导意义。本实 验设置了三种光周期和温度的组合处理饲养被寄生的粘虫，分别是l ：d 为1 0 1 1 ： 1 4 h ，温度为1 7 ( 简称滞育处理) ；l ：d 为o h ：2 4 h ，温度为1 t c ( 简称低温非 滞育) ：l ：d 为1 6 h ：8 h ，温度2 6 ( 简称常温非滞育) 。在分子水平上比较和分 析了不同三种处理中红侧沟茧蜂热激蛋白基因序列和表达特性，克隆了中红侧沟 茧蜂热激蛋白7 0 ( h e a ts h o c kp r o t e i n , h s p 7 0 ) 和热激蛋白9 0 ( h e a ts h o c kp r o t e i n , h s p 9 0 ) 的基因片段。研究结果如下： 1 克隆了中红侧沟茧蜂h s p 7 0 和h s p 9 0 的部分基因并进行了测序，其中h s p 7 0 的核苷酸序列长1 0 2 2b p ，与其它昆虫的序列的同源性达到7 0 以上，h s p 9 0 的核 序列长1 0 7 9b p ，与其它昆虫的序列同源性也达到7 0 以上。 通过实时定量p c r 技术，比较了滞育与非滞育幼蜂( 滞育处理为1 2 日龄和1 6 日龄，低温非滞育为1 6 日龄，常温非滞育为6 日龄) h s p 7 0 、h s p 9 0 的表达量，发 现h s p t o 、h s p g o 在滞育与非滞育中红侧沟茧蜂幼虫中都表达，且表达量都很低。 数据分析表明，h s p 7 0 、h s p g o 在滞育与非滞育的虫体内表达量差异不显著。 2 s d s p a g e 电泳分析表明，滞育和非滞育幼蜂总蛋白的种类和含量上有很 大差异。滞育处理( l ：d 为1 0 h ：1 4 ，1 7 ) 幼蜂处于滞育进入前期( 1 2 日龄) ， 滞育进入中期( 1 4 日龄) 和滞育进入后期( 1 6 日龄) 的蛋白谱带也有显著差异。 3 用等电点聚焦电泳技术分析了三种温光组合处理下饲养的幼蜂和寄主粘虫 血淋巴，结果发现不同处理间的蛋白谱带也存在一定的差异。 关键词：中红侧沟茧蜂；滞育；热激蛋白7 0 ：热激蛋白9 0 a b s t r a c t m i c r o p l i t i sm e d i a t o r ( h y m e n o p t e r a ：b r a c o n i d a e ) i sa nc n d o p a m s i t o i dw a s p p a r a s i t i z i n gn o c t u i dl a r v a i ti sa l li m p o r t a n tb i o l o g i c a la g e n t t oc o n t r o lc o t t o nb o l l w o r m ( h e l i c o v e r p aa r m i g e r a ) i nt h ec o t t o nf i e l db yp a r a s i t i z i n gr a t ea t2 2 9 t h ed i a p a a s e h a b i to ft h ew a s pa ti t sl a s ti n s l a r i nt h ec o c o o nm a k e si t b e i n gc o n v e n i e n tf o r c o m m e r c i a l i z i n gt h ew a s pt oc o n t r o lt h ec o t t o nb o i l w o r m i l l u s t r a t i n gm o l e c u l a r r e g u l a t o r ym e c h a n i s mo f d i a p a u s eo f t h ew a s pw i l ln o to n l ye n r i c hk n o w l e d g eo f i n s e c t d i a p a u s e b u td i r e c tu t i l i z a t i o no ft h ew a s pt oc o n t r o lt h ec o t t o nb o l l w o r m i nt h e d i s s e r t a t i o nw es e tt h r e ek i n d so ft e m p e r a t u r ea n d p h o t o p e r i o dr e g i m e nt o r e a r a r m y w o n n ( p s e u d e l a t i as e p a r a t a ) l a r v a e ，a n o t h e rh o s t p a r a s i t i z e db yt h ew a s p ，w h i c h w i l lp r o v i d es u i t a b l em a t e r i a l st oa n a l y z er e g u l a t o r ym e c h a n i s mo ft h ew a s pd i a p a n s e u n d e rd i f f e r e n tt e m p e r a t u r ea n dp h o t o p e r i o d u n d e rt h er e g i m e n1 0 hl i g h ta n d1 4 hd a r k p h o t o p e r i o da t1 7 d i a p a n s ew a s pl a r v a ek i n k i n gb r o w nc o c o o n sw e r er e a r e d u n d e r t h er e g i m e n s2 4 hd a r kp h o t o p e r i o da t1 7 a n d1 6 hl i g h ta n d1 4 hd a r kp h o t o p e r i o da t 2 6 n o n d i a p a u s ew a s pl a r v a ek i n k i n gg r e e nc o e o c n sw e 他r e a r e d e x p r e s s i o no ft h e h e a ts h o c kp r o t e i ng e n e sh s t , 7 0a n dh s p 9 0w e r ea n a l y z e di nt h et h r e et r e a t m e n t s p a r t so f h s p 7 0a n dh s p g og e n e sw e r es e q u e n c e d n 峙s e q u e n c e dl e n g t ho f h s p 7 0i s 1 0 2 2 b pw h o s eh o m o l o g yi so v g l 7 0 c o m p a r e dw i t ho t h e ro r g a n i s m s 1 1 圮1 0 7 9 b p s e q u e n c e dl e n g t ho fh s 痂) oi sa l s oo v e r7 0 c o m p a r e dw i t ht h es a m eo r g a n i s m s r e a l - t i m ep c rs h o w e dt h a tt h et w og e n e se x p r e s s e di nar e l a t i v el o wl e v e lw h e n e v e r t h e ye x p r e s s e di nd i a p a u s eo rn o n d i a p a u s ew a s p s t h e r ea r ei l os i g n i f i c a n td i f f e r e n c e s o f h s p 7 0a n dh s # 0e x p r e s s i o nb e t w e e nd i a p a u s ea n dn o n d i a p a n s ei n s e c t s s d s - p a g ea n a l y s i ss h o w e dp r o t e i np r o f i l e sw e r ed i f f e r e n tb e t w e e nd i a p a n s ea n d n o n d i a p a n s el a r v a ei nl e v e lo fc o n t e n ta n dk i n d h e m o l y m p h so fp s e u d a l e t i as e p a r a t a l a r v a ep a r a s i t i z e db y 膨m e d i a t o ru n d e rt h et h r e er e g i m e n sw e r ea n a l y z e dw i t hi e f ( i s o e l e c t r if o e u s ) t e c h n i q u e t h er e s u l t ss h o w e dt h a tp h o t o p e d o da n dt e m p e r a t u r e a f f e c t e dp r o t e i np r o f i l e so f t h eh o s th e m o l y m p h s i g n i f i c a n t l y k e yw o r d s ：m i c r o p l i t i sm e d i a t o r ；d i a p a u s e ；h s p 7 0 ；h s p 9 0 殷珍仙：滞育中红侧沟茧蜂h s p t o 和h s p g o 克隆与表达 l a m p b p c t a b m m d d h 2 0 d e p c d ! 灯甲 d t t e d t a i p t g l b m m l v r t o d p a g e p c r r - 2 5 0 r p m s d s t e m e d x g a l a m p i c i l l i n b a s ep a i r c e t y l t r i m e t h y la m m o n i m b r o m i d e c e n t i m o r g a n d o u b l ed i s t i l l e dh 2 0 d i e t h y lp y r o e a r b o n a t e d e o x yn u c l e o t i d et r i p h o s p h a t e s 1 , 4 d i t h i o t h r e i t o l e t h y l e n e d i a n m i n e t e r t r a a c e t i ca c i d i s o p r o p y l - d d t h i o g a l a e t o p y r a n o s i d e l u r i a - b e r t a n i m m l vr e v e r s et r a n s c r i p t a s e o p t i c a ld e n s i t y p o l y a e r y l a m i dg a le l e e t r o p h o r e s i s p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n c o o m a s s i eb r i l l i a n n tb l u er - 2 5 0 r a t i o n a ls p e e di nr e v o l u t i o i l sp e rm i n u t e s o d i u md o d c c y ls u l f a t e n ，n ，n n - t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e 5 - b r o m o 一4 - e h l o r o 3 i n d o l y l i i - d - g a l a e t o s i d e 氨苄青霉素 碱基对 十六烷基三乙基 澳化铵 毫摩 双蒸水 焦碳酸二乙酯 脱氧核糖核苷酸 1 ，4 一二硫苏糖醇 乙二胺四乙酸 异丙基1 3 - 1 3 硫代 半乳耱苷 l b 培养基 反转录酶 光密度值 聚丙烯酰胺凝胶 电泳 聚合酶链式反应 考马氏亮蓝r - 2 5 0 每分钟转数 十二烷基磺酸钠 四甲基乙三胺 5 溴4 氯3 一吲哚 1 3d 半乳糖苷 扬州大学硕士学位论文 2 第一章热激蛋白及其在昆虫滞育中的作用研究进展 1 1 引言 热激蛋白( h e a ts h o c kp r o t e i n , h s p ) 是一切生物细胞，包括原核细胞和真核 细胞在胁迫下( 热激、冷激、病原入侵、理化损伤等) 发生应激反应，表达由热 激蛋白基因( h s p ) 编码的一类蛋白。在系统发育上，热激蛋白具有高度的保守性 ( j a a t t e l a , 1 9 9 9 ) 。 1 2 热激蛋白的发现及其特性 i 2 1 热激蛋白的发现 热激蛋白是在观察果蝇幼虫热休克反应的过程中发现的。1 9 6 2 年，r i t o s s a 在 研究果蝇唾腺染色体时发现，果蝇正常生长的温度是2 5 ，当外界温度升至3 0 - - 4 0 ，经3 0 分钟后，果蝇唾液腺多丝染色体的某一区域出现了“膨突”，显示该区 域的基因转录增强。1 9 7 4 年，t i s s i e r e s 等研究证实，高温引起果蝇染色体出现“膨 突”是由于热休克激发了染色体内基因转录合成特异蛋白，即热激蛋白。n o v e r ( 1 9 8 4 ) 与s o g e r ( 1 9 8 7 ) 先后阐明编码h s p 的序列、基因结构及位点，并确定是 由于高温启动了h s p 中上游保守的调节序列热休克元素( h e a ts h o c ke l e m e n t , h s e ) ，由此引起热休克应答，从而激活该基因转录合成h s p ( s o r g e re ta 1 ，1 9 8 7 ) 。 1 2 2 热激蛋白的特性 随者对h s p 研究的深入，从原核生物到真核生物，从植物、动物到人类整个 生物界，无论培养细胞还是整个机体，热休克处理后都有h s p 的表达，并逐渐阐 明了h s p 的特点：( 1 ) 非特异性。( 2 ) 交叉耐受性。( 3 ) 时间性。又称“机会窗”。 ( 4 ) 结构上的高度保守性。( 5 ) 广泛性。l i s p 普遍存在于所有的细胞内，参与细 胞正常的生长、发育和分化。在各种有害胁迫下，细胞通过改变基因表达的方式， 诱导h s p 的表达，从而启动内源性保护机制( 杨德洪，陈佩杰，2 0 0 2 ) 。 殷珍仙：滞育中红侧沟茧蜂h s p t o 和b s p 9 0 克隆与表达 3 热激蛋白的结构比较保守，这主要表现在不同的生物中，无论其进化的程度 如何，分子结构都有很高的同源性。如人类和其它生物的h s p 都具有很高的同源 性，这一特性尤其表现在h s p t 0 上，其n - 末端有约4 5 0 个氨基酸残基的高度保守 区，该区具有a t p 酶的活性，c 末端有约2 0 0 个氨基酸残基的保守性较低的区域， 是肽链的结合区( h i g h t o w e r e t a l ，1 9 9 4 ) 。然而，这种进化上的高度保守性在分子 量较小的h s p 中表现得不太显著。热激蛋白的另一特征是大都存在异构体，这是 因为磷酸化、甲基化、糖基化、a d p 核进化等作用都可能导致h s p 异构体的形成。 交构作用能影响h s p 的功能与代谢的稳定性。另外，真核生物的热激蛋白表现为 酸性，等电点在5 0 6 5 之问( 靳远祥，陈玉银，2 0 0 2 ) 。 1 2 2 1 分子伴侣特性 e i l e t s 等将能够促进蛋白折叠和组装的一类蛋白质分子称为分子伴侣。“分子 伴侣”能促进细胞多肽正确折叠、蛋白质正确组装和纠正蛋白质的错误结构( e i l e r a n ds c h a t z , 1 9 8 6 ) ，而本身并不参与蛋白质的组成。细胞内的蛋自质为完成其生物 学功能，肽链需经正确的折叠、加工，并且定位于细胞内的合适位置，有时还需 与其它多肽链形成复合体。具有分子伴侣功能的热激蛋白主要有三类：h s p 9 0 、 h s p 7 0 d n a k 和h s p 6 0 ，o r o e l 系统。此外小分子的热激蛋白，如h s p 2 7 及其相关 蛋白等也具有分子伴侣的功能( 常蕴华，2 0 0 1 ) 。研究发现，正常情况下h s p 从3 个方面来维持和保护新合成蛋白质的折叠状态：( 1 ) 防止新合成蛋白质的错误折 叠或聚集：( 2 ) 允许其穿过生物膜；( 3 ) 使蛋白质正确折叠并形成寡聚体。在应 激状态下，h s p 可防止其它蛋白质发生变性或解聚，使其保持或恢复活性 ( w e l c h ，1 9 9 2 ；b u r d o n ，1 9 9 3 ) 。 h s p 7 0 是主要的分子伴侣，在细胞内的分布最广、含量最丰富( r o t h m a n ， 1 9 8 9 ) 。h s p t 0 家族成员在正常未受胁迫的细胞中，参与两种伴侣功能。首先，h s p 7 0 与核糖体上新生多肽结合，以控制新合成蛋白的折叠( b e c k m a r me ta 1 。1 9 9 0 ) ：其 次，这些h s p 7 0 分子伴侣携带蛋白，将其运到不同的细胞区室，包括陪伴蛋白跨 膜转运，或通过核膜孔，与小泡循环中的网格蛋白相互作用等( g e t h i n ga n d 扬州大学硕士学位论文 4 s a m b r o o k , 1 9 9 2 ) 。内质网上h s p 7 0 家族的代表性成员b i p ( c , r p 7 8 ) 的分子伴侣功 能是将蛋白转运过网膜，在网腔内再折叠并组装成有活性的蛋白( r a s s o wc ta 1 ， 1 9 9 5 ) 。 l i s p 作为分子伴侣，能与失活蛋白结合，阻止其凝集，这种结合一方面可以增 加敏感底物的浓度，直接促进蛋白水解。另一方面能使底物保持适宜被蛋白水解 酶降解的构象。同时它们能与蛋白水解酶直接作用，使蛋白水解酶自身保持一种 有很高活性的构象，从而加速蛋白水解( s i m e o ne ta 1 ，1 9 9 2 ) 。 1 2 2 2 抗氧化特性 h s p 具有抗氧化的能力，比如h s p 可抑制产生氧自由基的关键酶n a o p h 氧 化酶的活性，通过反馈作用减少氧自由基的产生。氧自由基( o x y g e nf r e er a d i c a l ) 是指含氧的自由基。受到胁迫时，增多的氧自由基会通过对脂质的氧化，对生物 膜的液态性、流动性、通透性等产生巨大的影响，从而对细胞及细胞器如线粒体、 溶酶体等造成破坏。 此外，h s p 对过氧化损伤还有修复作用。有研究表明，l i s p 参与了多脏器细胞 修复，并使细胞免受过氧化作用的损伤。在肠上皮过氧化损伤的研究中，谷氨酰胺 具有保护上皮的作用，同时还能诱导产生h s p 7 0 。如果用谷氨酰胺类似物6 一重氮基 一5 一氧左旋正亮氨酸( d o n ) 处理小肠上皮，同样可诱导h s p 升高，并可以耐受过氧 化造成的损伤。如果同时用h s p 升高的物质槲皮素处理，则可抑制h s p 升高，并 抑制谷胺酰胺和d o n 的保护作用( 刘杰，2 0 0 0 ) 。 1 2 2 3 协同免疫特性 h s p 可提供结合蛋白，协同参与抗原加工、提里、免疫球蛋白装配及细胞导航 等。热应激可干扰宿主的炎症反应，导致吞噬能力的增加。单核巨噬细胞的吞噬 能力在整体高温处理后，较正常的对照增强。吞噬能力也与一定的温度范围相关， 温度升高1 0 c ，吞噬功能约增加3 倍。巨噬细胞是宿主的第一道防线，其杀伤入 侵微生物的能力较大程度地依赖于呼吸爆发( r e s p i r a t o r yb u r s t ) ，这些细胞产 生高浓度的活性氧族( r e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s 。r o s ) 以及细胞因子 殷珍仙：滞育中红侧沟茧蜂h s p t o 和h s p 9 0 克隆与表达 5 ( c y t o k i n e s ) 。r o s 和细胞因子均可诱导h s p 的表达，反过来h s p 也可以通过抑制 r o s 和细胞因子起到保护细胞和组织免受炎症损伤的作用( 张旭辉，2 0 0 0 ) 。 刺激因素引起机体细胞免疫应答时，会产生各种细胞因子，如i l 广l ，i l - 2 ， t n f a 等，同时也伴有h s p 的产生，以对抗细胞因子对细胞的损害作用。h s p 7 0 可抑制人的单核细胞产生【l l 和t n f d ( h a l l ，1 9 9 4 ) 。s c a r i m 等人研究发现，h s p 7 0 是通过抑制i l l 及干扰素，对n o 合成酶诱导，而起到保护胰腺生理功能的作用的。 1 2 ，2 4 抗细胞凋亡特性 多种胁迫能引起机体细胞的自毁性死亡，即细胞凋亡。细胞对胁迫的一个适 应性变化就是在正常情况下，对具有细胞致死性作用的胁迫产生耐受能力( 张晓 鹏，2 0 0 2 ) 。热激蛋白与细胞凋亡的关系错综复杂，总的来说，应激诱导的热激 蛋白既可出现在细胞表面，也可出现在细胞内部。存在于细胞膜上的h s p 具有抗 原特性，增加了对自身淋巴细胞杀伤活性的敏感性，作为免疫攻击目标促进凋亡； 而存在于细胞内的热激蛋自主要是起保护细胞的作用，可以抵抗不同信号通路引 起的细胞凋亡( i s h i y a m a , 1 9 9 6 ；m a t h i a s1 9 9 8 ) 。如果先进行热胁迫，诱导h s p 高 表达，再用各种试剂诱导细胞凋亡，h s p 表现出抑制细胞凋亡的作用( p o c c i aa n d p i l l i ，1 9 9 6 ) ：如果细胞凋亡已经启动，再用应激因子诱导细胞表达h s p ，h s p 不 仅不能抵抗细胞凋亡，某些情况下这种损伤似乎还会加速细胞的凋亡( i s h i y a m a , 1 9 9 6 ；u r s i c s c d b r o o k , 1 9 9 4 ) 。 1 2 2 5 调节激素受体和某些蛋白激酶的特性 当类固醇受体家族中的许多成员，比如孕酮、睾酮和糖皮质激素受体等，与 h s p 9 0 结合形成复合物后，以一种无活性状态存在于细胞内，不能与d n a 结合启 动激素特异性的基因表达。当类固醇激素进入细胞与其特异受体结合后，h s p 9 0 与类固醇受体分离，受体以激活形式启动靶基因表达( c a t e l l ia n ds a n c h e z , 1 9 8 5 ) 。 扬州大学硕士学位论文 6 1 3 熟激蛋白的表达及其调节过程 1 3 1 热激蛋白的表达 通过热处理果蝇成虫，检查不同时段h s p 7 0 的表达水平，发现果蝇耐热性与 h s p 7 0 的表达呈正相关。随后人们发现，热激蛋白除了能被热损伤所诱导外，还 能被许多其它类型的胁迫所诱导，这些胁迫包括低氧( g u t t m a ne tl 乱，1 9 8 0 ，h a h n a n dl i ，1 9 8 2 ) 、局部缺血( m a r b e re ta 1 ，1 9 9 5 ) 、能量缺乏( s c i a n d r aa n ds u b j e c k , 1 9 8 3 ) 、酸中毒( w e i t z e l e t a l 。1 9 8 5 ) 和紫外辐射( b a r b ee ta 1 ，1 9 8 8 ) 等。 热激蛋白不仅在应激条件下高效表达，而且在正常生理状况下，细胞中也有 热激蛋白存在。这类h s p 是组成型表达的，被称为热休克相关蛋白( h e a ts h o c k c o g n a t ep r o t e i n ，h s c ) 。h s c 在正常条件下即有高表达，而应激后的表达量会进一 步提高，与细胞的分化、发育密切相关；h s p 在正常生理条件下不存在或表达量 低，但能被热强烈诱导，具有保护细胞的功能。h s c 和h s p 在核苷酸序列上有高 度同源性，蛋白结构和功能很相近，统称为h s p ( 王海鸿，雷仲仁，2 0 0 5 ) 。 1 3 2 热激蛋白的调节过程 ， 真核细胞凇瑾因的转录调节过程包括热休克因子( h e a ts h o c kf a c t o r s ，h s f ) 的激活、h s f 与热休克元件( h e a ts h o c ke l e m e n t ，h s e ) 的结合，以及h s p 基因的转 录这三个过程( b u r d o n 。1 9 9 3 ) 。h s f 是位于凰p 基因5 端上游的一段特殊d n a 序列， 它以5 个碱基( n g a a n ) 为基本单位重复排列而成，其中n 代表在进化上保守性较 差但很重要的碱基。在非应激细胞中h s f 与h s e 低水平结合，受到热激时，这种结 合迅速增加，5 分钟即达高峰状态，并且至少可以维持1 个小时。当热激去除后， 结合活性恢复至原来的低水平状态( z i m a r i n oe ta 1 ，1 9 8 7 ) 。 在非应激的细胞内，热休克因子以单体的形式存在，受到应激时，组装成h s f 三聚体( 金惠铭，1 9 9 6 ) 。这一过程现被认为是结构型h s p ( h s p 7 0 i ) 参与调控的 ( 赵克森，金丽娟，1 9 9 9 ；刘杰，2 0 0 0 ) ，随后h s f 三聚体与热休克反应元件结合， 从而调节熟休克基因的转录( 金惠铭，1 9 9 6 ；赵克森，金丽娟，1 9 9 9 ) 。 殷珍仙：滞育中红侧沟茧蜂h s p t o 和h s p g o 克隆与表达 7 t 4 热激蛋白的分类及其功能 在生物体内主要有两种h s p ：诱导型的和组成型的。诱导型h s p 主要在受到外 界环境的刺激下被诱导表达，具有保护细胞的功能：组成型h s p 在正常生理状态下 表达，与细胞的分化、发育密切相关。目前对于h s p 尚无明确的分类标准，不同的 学者具有不同的划分方法，但是大多数人是用分子量来划分的。c a r p e r 等( 1 9 8 7 ) 将生物体已经发现的几十余种h s p 分为h s p l l 0 、h s p 9 0 、h s p 7 0 、h s p 6 0 、小分子 h s p 和泛素等6 个家族。l i n d q u i s t 等将h s p 分为8 0k d ( 包括h s p l l 0 、h s p 9 0 ) ，3 0 - - 7 0 k d ( 包括h s p 7 0 、h s p 6 0 、h s p 4 7 、h s p 3 2 ) 和小于3 0k d ( 包括h s p 2 8 、h s p l 0 及泛素) 3 大类( l i n d q u i s t a n d c r a i g ，1 9 8 8 ) 。获得普遍认同的是m o r i m o t o ( 1 9 9 0 ) 的划分方法，他将主要的h s p 分为4 个家族：h s p 9 0 ( 8 3 - - 9 0 k d ) 家族，h s p 7 0 ( 6 6 7 8 k d ) 家族，h s p 6 0 家族，小分子h s p ( 1 5 - - , 3 0k d ) 家族。根据诱导方式不同，分子 量分别为3 4 、7 5 、7 8 、9 4 及1 7 9k d 的h s p 又称被为葡萄糖调节蛋白( g l u c o s e - r e g u l a t e d p r o t e i n , g r p ) ，认为同葡萄糖缺失诱导有关。事实上，钙浓度、缺氧等因素均可引 起g r p 表达量增加，然而g r p 这一名称却一直沿用下来( 王海鸿，雷仲仁，2 0 0 5 ) 。 另外有学者根据热激蛋白的同源性和分子量的大小，将其分成3 类( 朱大栩， 马更生，1 9 9 3 ) ：( 1 ) 分子量大于或等于9 0k d 的，如h s p 9 0 、h s p l l 0 ：( 2 ) 分子 量小于等于6 0 k d 的，如h s p 6 0 ；( 3 ) 分子量介于6 0 k d 与9 0 k d 之间的，如h s p 7 0 、 h s p 6 5 等。实际上每组包括多种不同的h s p ，如h s p 7 0 家族中包括h s p 7 0 ( 被热诱 导) ，h s p 7 0 ( 存在于正常细胞中，不被热诱导) ，o r p 7 s ( 被饥饿诱导) ，o r p 7 5 ( 存 在于线粒体内) ( 周永刚，祝其锋，1 9 9 6 ) 。在所有的热激蛋白中，7 0k d ( h s p 7 0 ) 及8 4k d ( h s p 8 4 ) 的蛋白被认为是最重要的两类热激蛋白，特别是h s p 7 0 ，在几 乎所有生物的应激细胞中都经常被高水平地诱导，而且哺乳动物的熟激蛋白也以 h s p 7 0 家族为主( 靳远祥，陈玉银，2 0 0 2 ) 。 1 4 1h s p 9 0 家族的特征及其功能 1 4 1 1h s p 9 0 家族的特征 h s p 9 0 家族的第一个成员是在果蝇中发现的，分子量为8 3k d ，所以又称为 扬州大学硕士学位论文 8 h s p 8 3 家族。h s p 9 0 的分子特征是2 5k d 的n 端具有抗肿瘤抑制剂格尔德霉素和 根赤霉素结合位点和一个靶蛋白的结合部位( p r o d r m o u e ta 1 ，1 9 9 7 ；p r o d r r n o u c t a l ， 1 9 9 7 ；s t e b b i n sc ta 1 ，1 9 9 7 ) ，c 末端具有钙调蛋白结合位点和多种蛋白的结合位点， 如：类固醇受体、肌动蛋白细丝等( p e t e r e ta 1 ，1 9 9 8 ) 。c 端最末端4 个氨基酸是e e v d ( g l l r _ 电i l r v a l a s p ) ，是所有真核细胞h s p 9 0 的共同特征。 通常h s p 9 0 在c 末端区域发生二聚化，以二聚体的形式存在。h s p 9 0 在正常或 受胁迫的各种类型细胞的胞质中都有存在，作为分子伴侣与变性蛋白结合，维持 它们的折叠状态( y o n e h a r ac ta 1 1 9 9 6 ) 。 在真核细胞内质网上大量存在的h s p 9 0 家族蛋白是g r p 9 4 ，也称为糖蛋8 9 4 ( g p 9 4 ) ，它与胞质内h s p 9 0 的序列有5 0 的同源。内质网上的c , r p 9 4 分子量较胞 质中的h s p 9 0 大，在s d s p a g e 上的分子量分别为9 4 1 0 8k d 和8 7 - 9 2k d 。g r p 9 4 的n - 端有一段信号肽，c 端为k d e l ( l y r a s r g i u l e u ) ，是内质网蛋白滞留 信号( 王海鸿，雷仲仁，2 0 0 5 ) 。 t a 1 2h s p 9 0 家族的功能 h s p 9 0 家族在正常生长条件下大量存在于所有细胞器的基质中，与其它大分子 量的分子伴侣不同，h s p 9 0 特异性地与一些特殊的靶蛋白结合，即与底物蛋白的结 合具有高度特异性；h s p 9 0 与某些靶蛋白的相互作用是长期的，并且具有重要的调 节作用，如它是甾类激素受体、某些转录调节因子、一些蛋白激酶、肌动蛋白、 微管蛋白等功能所必需的( n a d e a ua n dd a s ，1 9 9 3 ) 。h s p 9 0 的分子伴侣协同物，分 别与h s p 9 0 结合，可以形成不连续的亚复合体，使其具有生物活性( r u t h e r f o r da n d z u k e r , 1 9 9 4 ) 。例如与类固醇激素受体成熟有关的亚复合体，这些分子伴侣协同物 在帮助类固酵激素受体折叠上发挥着重要的作用。 此外，h s p 9 0 在依赖于g 蛋白的信号转录途径中起着重要的作用( p r a t t , 1 9 9 3 ) 。 h s p 9 0 还可以与一种调节真核生物转录起始因子e l f 2 亚基磷酸化的蛋白激酶相 互作用，并有可能通过这种方式调节蛋白转录( m a r t s 。1 9 8 9 ) 。当细胞受到应激而 产生h s p 9 0 时，h s p 9 0 随机与细胞内甾体激素受体结合，以防止激素受体同可能出 殷珍仙：滞育中红侧沟茧蜂h s p t o 和h s p 9 0 克隆与表达 9 现的甾体激素结合形成复合物，或者阻止受体单独向细胞核转移而作用于核d n a ， 从而避免引起细胞的早熟和一些无意义的反应( p o l l a , 1 9 8 8 ) 。即使是在无胁迫情 况下，h s p 9 0 也是真核生物生理活动必不可少的( b o r k o v i c he ta 1 ，1 9 8 9 ) 。果蝇体 内只有一种h s p 9 0 蛋白，在无胁迫情况下也有一定量的表达( b l a c k m a na n d m e s e l s o n , 1 9 8 6 ) 。果蝇的h s p 9 0 是细胞正常生长、存活、形成正常精子细胞以及 中心体正常发挥功能所必需的。 1 4 2h s p 7 0 家族的特征及其功能 对h s p 7 0 家族的结构、功能以及表达调控机理的研究较为深入。正常情况下 h s p t 0 位子细胞浆内，当细胞受到热胁迫裁激时，细胞核内h s p 7 0 迅速增加，细胞 浆内却只有少量存在；当细胞处于恢复阶段时，细胞核内的h s p 7 0 消失，细胞浆内 仍有低水平h s p 7 0 表达( v e l a z q u i s ta n dl i n d q u i s t ，1 9 8 4 ) 。 1 4 2 1h s p 7 0 家族的特征 h s p 7 0 家族的生化特点为：( 1 ) 具有弱的a t p 酶活性，与肌肉的肌动蛋白结构 很相似；( 2 ) 当a t p 酶活性被激活时，可与伸展的多肽结合；( 3 ) 可以保护各种酶 免受热损伤，使聚合的蛋白质解聚( b u r d o n ，1 9 9 3 ) 。 h s p 7 0 在原核生物和真核生物体内都存在，并且存在于所有细胞的区室和细 胞器中( m c k a yc ta 1 ，1 9 9 4 ) 。h s p 7 0 在所有生物细胞中都有表达。在大多数生物 中，h s p 7 0 含量丰富，具有高度保守性( 张晓鹏，2 0 0 2 ) 。不同来源的h s p 7 0 有相 似的生化特性，都具有高亲和力的a t p 结合位点和肽结合点。h s p 7 0 可识别非天然 和未折叠的蛋白，但它们对处于折叠状态的蛋白却几乎无识别能力。所以说h s p 7 0 与蛋白的结合是依赖于对未折叠状态的识别，而不是对特定序列的识别( 胡晓燕， 1 9 9 9 ) 。h s p 7 0 家族成员在细胞内的分布定位不同，具有与核苷酸结合的特性，特 别是能够与a d p 或a t p 结合( w e l c h ，1 9 8 5 ) 。 h s p 7 0 是一族最保守和最重要的热激蛋白家族，具有相同的等电点和相似的胰 蛋白酶肽谱。i l l 印7 0 基因在进化上具有高度保守性，人类h s p 7 0 氨基酸序列与果蝇 h s p 7 0 的同源性为7 3 ，与大肠杆菌诱导型h s p 7 0 同源性为4 7 。人类h s p 7 0 基因 扬州大学硕士学位论文 1 0 核苷酸序列与果蝇的同源性为7 2 ，与大肠杆菌的同源性为5 0 ( h u n ta n d m o r i m o t o ，1 9 8 5 ) 。 1 4 1 2 2h s p 7 0 家族的功能 果蝇的却7 d 基因家族有2 个诱导型成员( h s p 6 8 和h s p 7 0 ) ( v e l a z q u e ze ta t ， 1 9 8 3 ) 和5 个组成型表达的成员( h s c 7 0 - 1 、- 2 、3 、- 4 、5 ) ，其中h s c 7 0 - 3 和h s c 7 0 5 分别定位于内质网和线粒体，其余3 个定位于胞质内。h s p 7 0 家族成员均含有两个 主要的结构域，分别是n 端高度保守的4 4 k d a t p a s e 功能域( a t p - b i n d i n g d o m a i n ) 和一个2 5k d 的c 端区域。由于n 端有a t p a s e 功能域，因此可以结会a t p 。c 端又 可以分成保守的1 5k d 的多肽结合功能域( p o l y p e p t i d e - b i n d i n gd o m a i n ) 和不保守的 靠近c 端最末端的1 0k d 可变区和c 端最末端的基序( m o t i f ) 。不同类型的h s p 7 0 成员的基序是有特异性的，定位于胞质中的h s p 7 0 的基序序列为e e v d ，内质网中 的为h d e l ，线粒体中的为p e a e y e e a k k ( g u ya n dl i ，1 9 9 8 ) 。 大肠杆菌h s p 7 0 家族的成员d n a k 彳i 两种辅助蛋白，分别是d n a j 和g r p e 。d n a i 可以促进d n a k 与底物和a t p 结合，加速d n a k - 底物复合体的形成( c a p l a ne ta 1 ，1 9 9 3 ； s i l v e ra n dw a y , 1 9 9 3 ) 。d n a 2 自身也可以通过j 结构内的锌指结构结合硫氰酸一类 的未折叠蛋白，防止这些蛋白发生聚集( s z a b oc t a l ，1 9 9 6 ) 。此外，d n a j 还能决定 d n a k 对底物的选择性。d n a k 本身不具备底物选择性，它能帮助胞内不同蛋白的折 叠与组装，需折叠或转运的蛋自首先与d n a j 结合，再通过d n a l 与d n a k 发生作用 ( l u k ee t a l ，1 9 9 1 ) 。当c a p e 结合到d n 擞后，可以打开d n a k 的核苷酸结合位点， 从而加速a d p 的解离，促进a t p 的结合与底物的释放( l i b e r e ke ta t ，1 9 9 1 ) 。真核 细胞h s p 7 0 的辅助蛋白受热激后，从胞质转移到核内，并在核仁内累积，与h s p 7 0 结合在一起，辅助h s p 7 0 恢复核功能( o h t s u k ac ta t 。，1 9 9 3 ) 。 1 8 热激蛋自在昆虫滞育中的研究 1 5 1 热激蛋白在昆虫中的研究概况 虽然热激蛋白最早是在昆虫体内发现的，但在昆虫学领域并未得到广泛的研 究。目前在昆虫中已开展过熟激蛋白研究的类群主要涉及双翅目的昆虫，如黄猩 殷珍仙：滞育中红侧沟茧蜂h s p 7 0 和h s p g o 克隆与表达 i i 猩果蝇( d r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r ) ( r r o s s a , 1 9 6 2 ) 、果蝇( d t r i a u r a r i a ) 、黑尾果 蝇( d - l a n o g a s t e r ) ( l i n d q u i s t s , 1 9 8 0 1 、地中海实蝇( c e r a t i t i se a p i t a t a ) ( s t e p h a n o u e ta 1 ，1 9 8 3 ) 、拟麻蝇( s a r c o p h a g ac r a s s i p a l p i s ) ( j o p l i na n dd e n l i n g e r , 1 9 9 0 ；j o p l i ne t a 1 ，1 9 9 0 ) 、瘿实蝇( e u r o s t as o l i d a g i n i s ) ( l e ee ta 1 ，1 9 9 5 ) 、自纹伊蚊( a e d e s a l b o p i c t u s ) ( b e r g e re ta 1 ，1 9 8 5 ) 、摇蚊( c h i r o n o m u st h u m m i ) ( c a r r e t e r o e ta 1 ，1 9 9 1 ) 等；其它昆虫类群也有一些研究，如鳞翅目的大芭蕉卷叶蛾( c a l p o d e s e t h