（林产化学加工工程专业论文）Nimbin的提取、分离、纯化及生物活性研究.pdf

摘要 本论文主要目标是鉴定印楝种仁内n i m b i n 成分的化学结构；建立n i m b i n 的h p l c 定 量分析方法：系统考察常规溶剂法对n i m b i n 的提取效果；比较超声波、微波辅助溶剂法 对n i m b i n 提取率的影响；探索制备n i m b i n 纯化合物经济、快速、有效的分离精制流程体； 研究n i m b i n 粗提物的室内生物活性，分析n i m b i n 的主要作用方式。 1 通过熔点测定、紫外( u v ) 光谱、红外( i r ) 光谱、液相一质谱( h p l c m s ) 联 用和核磁共振( n m r ) 的分析，验证了制备得到的n i m b i n 纯化合物的化学结构。 2 建立了n i m b i n 的h p l c 定量分析方法。色谱条件为，o d s 色谱柱，1 5 0 x 4 6 m m i d ， 1 0 9 m ；流动相为甲醇：水( v v ) = 7 0 ：3 0 ；紫外检测器，检测波长2 1 7 n m ；流速1 m l m i n ； 柱温为室温。得到( 1 ) n i m b i n 的保留时间为1 1 3 m i n 左右；( 2 ) n i m b i n 质量计算公式为 x = ( y 一4 0 3 9 8 ) 1 8 1 1 0 5 0 ，y - 峰面积，x n i m b i n 质量( r t g ) 。 3 首次系统考察了常规溶剂法提取n i m b i n 过程中各因素对n i m b i n 提取率的影响，通 过正交实验得到优化条件。各因素的影响大小依次为料液比 提取时间 提取温度；优 化条件为：料液比1 ：5 ，提取温度4 0 c ，提取时间3 h r x 3 ；在n i m b i n 无水乙醇提取液的 后处理过程中，乙酸乙酯是较理想的萃取溶剂，经适宜条件下提取后，其萃取物中n i m b i n 的含量及n i m b i n 的提取率均最大，分别为3 4 0 6 ，7 2 1 9 7 。 4 首次进行了超声波、微波辅助溶剂法提取n i m b i n 的研究。考察了超声波、微波作 用时间，超声波、微波功率以及料液比对n i m b i n 提取率的影响，发现此两种提取方式下 n i m b i n 的提取率均低于常规溶剂法，但是可以明显缩短提取时间，减少溶剂用量。 5 首次成功探索了一次硅胶柱层析斗二次f l o r i s i l 柱层析- 甲醇结晶的分 离精制流程，制备得到纯度为9 6 0 7 2 的n i m b i n 纯化合物。 6 研究了常规溶剂法提取得到的n i m b i n 粗提物对棉铃虫幼虫的室内抑制生长发育 和毒杀生物活性。实验结果表明( 1 ) n i m b i n 粗提物对棉铃虫幼虫的生长发育具有明显的 抑制作用，且强于毒杀活性，当稀释8 0 0 倍时接虫5 天后检查结果，棉铃虫幼虫指数减 退率达7 4 5 9 。( 2 ) n i m b i n 粗提物对棉铃虫幼虫具有较强的毒杀活性，且好于印楝素原 药，当稀释至1 6 0 0 倍时5 天后检查结果，校正死亡率达到5 5 3 2 ；而印楝索原药即使 稀释至1 0 0 倍时同样作用于棉铃虫幼虫5 天后检查结果，校正死亡率也只有2 4 4 4 。( 3 ) 随着n i m b i n 粗提物浓度的降低，棉铃虫幼虫指数减退率和校正死亡率都随之降低，且其 速效性较弱。( 4 ) n i m b i n 粗提物5 天对棉铃虫幼虫毒力反应的致死中量( l c 5 0 ) 值为 1 6 1 6 5 p p m 。 关键词：n i m b i n ，h p l c ，提取，分离，生物活性 a b s t r a c t t h ea i mo ft h ed i s s e r t a t i o ni st oi d e n t i f yt h ec h e m i c a ls 仃u c n l r eo fn i m b i n ；f o u n dq u a n t i t y a n a l y s i sm e t h o do fn i m b i nb yh p l c ；d or e s e a r c h e sc o n c r e t e l yo nt h ee 虢c to ft r a d i t i o n a l s o l v e n te x t r a c t i o nw h i c hw a sc o m p a r e d 、撕mu l t r a s o n i c - a s s i s t e da n dm i c r o w a v e a s s i s t e d e x t r a c t i o no nn i m b i ny i e l df r o mn e e mk e r n e l s ；t r yt of i n daq u i c k ，e c o n o m i c a la n de f f e c t i v e p r o c e s st og e tn i m b i nm o n o m e r ；d e t e r m i n et h e i n d o o rg r o 州hi n h i b i t i n ga n dp o i s o ne f f e c to f n i m b i nc r u d ee x t r a c tf r o mt r a d i t i o n a ls o l v e n tm e t h o dt oh e l i c o v e r p aa r m i g e r a ( h t i b n e r ) a n d c o m p a r et h ep o i s o ne 虢c tw i t ha z a d i r a c h t i ne x t r a c ta tt h es a l n et i m e 1 t h er e s u l t so fm e l t i n gp o i n t ，u v i r , h p l c m s ，a n dn m rh a v es h o w nu st h e c o r r e c t n e s so f t h ec h e m i c a ls t r u c t u r eo f n i m b i nw h i c hh a sb e e np r e p a r e di nt h el a b o r a t o r y 2 t h er e v e r s e d - p h a s eh p l cm e t h o dw a su s e di nq u a n t i t a t ym e a s u r e m e n to fn i m b i n w i t hao d sc o l u m n ( 1 5 0 x 4 6 m mi d ，1 0 9 i n ) a ni s o c r a t i cs o l v e n ts y s t e mc o n s i s t i n go f m e t h a n o la n dw a t e r ( 7 0 ：3 0 ，v ) w a sp r e p a r e da n du s e da st h em o b i l ep h a s ea taf l o wr a t eo f 1 0 m lm i n 1 t h ed e t e c t i o nw a v e l e n t hw a sc h o s e da t2 t 7 n mw i t hau vd e t e c t o r t h er e t a i n t i m eo fn i m b i nw a sa ta b o u t11 3 m i n ；t h ee x p r e s s i o nt oc a l c u l a t et h em a s so fn i m b i nw a s d e s c r i b e da sf o l l o w s ：x 2 ( y - - 4 0 3 9 8 ) 18 11 0 5 0 ，y 二p e a ka r e a ，x n i m b i nm a s s ( g g ) 3 t r a d i t i o n a ls o l v e n te x t r a c t i o nt e c h n o l o g yo fn i m b i nf r o mn e e mk e r n e l sh a sb e u n s t u d i e di nd e t a i lf o rt h ef i r s tt i m ea n dt h em o s ti n f l u e n c i n gf a c t o rw a sr a t i oo f m a t e r i a lt ol i q u i d f o l l o w e dw i t he x t r a c t i o nt i m ea n dt e m p e r a t u r e t h eo p t i m a lc o n d i t i o n so b t a i n e db yo r t h o g o n a l t e s t sw e r er a t i oo fm a t e r i a lt ol i q u i d1 ：5 ( w v ) ，e x t r a c t i o nt e m p e r a t u r e4 0 ca n de x t r a c t i o n t i m e3 h x 3 u n d e rt h eo p t i m a lc o n d i t i o n s ，t h ec o n t e n ta n dy i e l do fn i m b i nw a s3 4 0 6 ， 7 2 1 9 7 r e s p e c t i v e l yw i t ha c e t i ce s t e ra st h em o s tf e a s i b l ee x t r a c t i o ns o l v e n t 4 t h ee f f e c to fu l t r a s o n i c a s s i s t e da n dm i c r o w a v e a s s i s t e dp r o c e s so nt h ey i e l do fn i m b i n h a sb e e nr e s e a r c h e df o rt h ef i r s tt i m e a f t e ra n a l y z i n gt h ee 虢c to f u l t r a s o n i c ，m i c r o w a v et i m e ， u l t r a s o n i cm i c r o w a v ep o w e r , r a t i oo fm a t e r i a lt ol i q u i dd e t a i l e d l y , u n l u c k i l y ，w ef o u n dt h e y i e l d so f n i m b i nw e r ea l ll o w e rt h a nt r a d i t i o n a ls o l v e n te x t r a c t i o np r o c e s s ，b u ts o l v e n t q u a n t i t ya n de x t r a c t i o nt i m ew a sa l ll e s st h a nt r a d i t i o n a ls o l v e n te x t r a c t i o np r o c e s s e i t h e r 5 an e w q u i c k ，e c o n o m i c a la n de f f e c t i v ep r o c e s st oa c q u i r ep u r en i m b i nh a sb e e ng o t t e n l a sf o l l o w s ，t h ef i r s tt i m es i l i c ag e lc o u m nc h r o m a t o g r a p h y _ t h es e c o n dt i m ef l o r i s i l c o l u m nc h r o m a t o g r a p h y + m e t h a n o lc r y s t a l l i z a t i o n t h e n9 6 0 7 2 p u r en i m b i nw a s r e a c h e dn a t u r a l l y ， 6 t h ei n d o o rp o i s o na n dg r o w t hi n h i b i t i n ge f f e c to fn i m b i nc r u d ee x t r a c tb yt r a d i t i o n a l s o l v e n te x t r a c t i o np r o c e s sa g a i n s tt w oi n s t a r sh e l i c o v e r p aa r m i g e r aw a sd e t e r m i n e d a f t e rf i v e d a y st r e a t m e n t ，w eh a v eg o t t e nt h r e ec o n c l u s i o n sa sf o l l o w s ：( 1 ) t h eg r o w t hi n h i b i t i n ge f f e c t w a sm o r en o t a b l et h a np o i s o ne f f e c t ，f o re x a m p l e ，w h e nn i m b i nc r u d ee x t r a c tw a sd i l u t e dt o 8 0 0t i m e s ，t h er a t eo f i n d e xs l i pw a s7 4 5 9 a f t e rf i v ed a y st r e a t m e n t ( 2 ) t h ep o i s o ne f f e c tw a s a l s on o t a b l e ，e g w h e ne v e nd i l u t e dt o1 6 0 0t i m e s ，t h ee m e n d a t a b l em o n a l i 妙r a t er e a c h e d 5 5 3 2 ，w h i l ei tw a sm o l es m a l l e ro n l y2 4 4 4 e v e nw h e na z a d i r a c h t i o ne x t r a c tw a sd i l u t e d t o10 0t i m e sa f t e rf i v ec l a y st r e a t m e n ( 3 ) a st h en i m b i nc r u d ee x t r a c tc o n c e n 仃a t i o nd e s c e n d e d ， t h er a t eo fi n d e xs l i pa n dm o l t a l i t ya l la l s of e l l ，m e a n w h i l e ，t h ee f f e c tw a sm o r es l o w l y ( 4 ) l c s o ( n i m b i nc r u d ee x t r a c t ) o f h e b c o v e r p aa r m i g e r aa f t e rf i v ed a y sl r e a t m e n tw a s1 6 1 6 5 p p m k e y w o r d s ：n i m b i n ，h p l c ，e x t m c t i o n ，s e p a r a t i o n ，p u r i f i c a t i o n ，b i o a c t i v i t y 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得本研究生培养单位或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确 的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：辛彳予亏弓 日期：劢刀年7 月g 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解中国林业科学研究院有关保留、使用学位论文的规定，中 国林业科学研究院有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论 文被查阅和借阅。本人授权中国林业科学研究院可以将学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：争衍方 z o o t ：年7 e j8 日 导师签名： 叼年7 月 学位论文作者毕业联系方式 工作单位：中国林业科学研究院南京林产化学工业研究所 联系电话：0 2 5 - 8 5 4 8 2 4 5 2 电子邮件：n j l i y a n f a n g y a h o o c o r n c n 通讯地址、邮编：南京市锁金五村1 6 号2 1 0 0 4 2 第一章绪论 1 1 生物农药的出现及研究应用 2 0 世纪6 0 年代随着化学农药的大量使用，“农药公害”问题日益严重引起国际震动， 此时具有选择性强，对入畜安全，对生态环境影响小等优点的生物农药应运而生【”。生 物农药是指具有农药特性的用来防治病、虫、草等有害生物的生物活体及其产生的生理 活性物质和转基因产物口】。1 8 5 3 年a g o s t i n ob a s s i 首次报道了由白僵菌引起的家蚕传染性 病害“白僵病”；1 8 7 9 年俄国梅契尼可夫应用绿僵菌防治小麦金龟子幼虫；1 9 0 1 年日本 石渡从家蚕中分离出苏云金芽孢杆菌：1 9 2 6 年g b f a n f o r d 使用拮抗体防治马铃薯疮痂 病，但是当时著未形成产品【3 j 。随着全球生物技术的兴起，生物农药产业逐渐发展起来， 2 0 世纪9 0 年代以来全球生物农药的产量每年以1 0 - - 2 0 的速度递增，而化学农药却以每 年2 左右的比例下降【4 1 。目前全世界生物农药产品已经超过1 0 0 多种，已实现商品化的 生物农药约3 0 种，全世界每年涉及有关天然产物新农药的技术专利约有1 0 0 个，且数量 相对稳定p l 。 世界上生物农药使用量最多的国家有墨西哥、美国和加拿大，三国的生物农药使用 量占世界总量的4 4 ，欧洲的生物农药使用量占全世界的2 0 ，另外亚洲占1 3 ，大洋 洲占l l ，拉美和加勒比占9 ，非洲占3 i “，如2 0 0 0 年日本生物农药销售额达1 1 2 0 0 亿日元，2 0 0 1 年上升到1 2 4 0 0 亿日元，2 0 0 3 年以后市场对生物农药的需求呈逐年增长趋 势，近十年问生物农药的登记品种增加到5 4 种【7 】o 在生物农药迅速发展的过程中，国际 上一些新型生物技术公司如m y e o g e n 公司、e c o g e n 公司等应运而生。另外一些全球性大 型化学农药公司和生物技术公司，如美国的杜邦公司、德国的拜耳公司、瑞士的汽巴嘉 基公司、丹麦的n o v o 公司、日本的住友观念公司等也纷纷投巨资发展生物农药降j 。 我国生物农药按来源可分为微生物农药、植物农药、转基因生物农药、生物化学农 药、农用抗生素和天敌生物农药【9 】。我国生物农药的研究始于2 0 世纪5 0 年代初，经历 熏三个发展阶段，分别是5 0 年代初到7 0 年代末的探索发展阶段，8 0 年代初到9 0 年代 初的相对平稳发展阶段和9 0 年代中期至今的快速发展阶段1 9 l 。目前我国能大规模生产的 生物农药品种主要有4 个，即苏云金芽孢杆菌、井岗霉素、阿维菌素和赤霉素【l 们。资料 第一章绪论 显示截止2 0 0 4 年我国生物农药已达1 4 0 种，占登记品种的1 5 ，产品为4 1 1 个，占总数 的8 ；制剂年产量1 2 1 3 万吨，占制剂总量的1 2 ；年产值约2 0 亿元，占农药产值的 1 0 【1 1 】。 同时我国生物农药的发展前景十分诱人，我国生物资源极为丰富，拥有全球1 0 的 生物遗传资源；生物农药适宜环境保护和市场需求，据农业部统计我国每年需要生产和 使用8 0 多万吨的化学农药制剂，导致2 0 以上果蔬和1 0 以上粮食农药残留超标；为鼓 励生物农药在我国的发展，农业部和国家石化局对生物农业的发展出台了相应的支持政 策，并计划到2 0 1 5 年使生物农药使用量占到农药总量的5 0 t 1 2 1 。但是我们也应该看到生 物农药在开发与应用过程中存在的诸多问题，如研究与生产脱节、规模化生产技术落后、 药效发挥缓慢、产品稳定性差、产品安全问题重视不够、田间使用技术不成熟以及售价 偏高等问题【l ”。近年来欧美等许多国家生物农药的替代率在3 0 以上，但是我国生物农 药的市场占有率仅为3 0 o - - 4 ，农药的使用量中仍有8 0 为高毒农药f 1 4 1 ，因此发展生物农 药产业是保证我国农业可持续发展、保障人们身体健康和保护生态环境的必由之路。 1 2 植物杀虫剂的主要植物种类和主要活性物质 植物农药是人类历史上最古老的生物农药之一，随着生物技术、组合化学技术的快 速发展及其在农药研究开发中的渗透和应用，植物农药越来越成为生物农药研发领域中 的热点之一。1 9 8 5 年全世界已报道过1 6 0 0 多种具有控制有害生物功效的高等植物，其 中具有杀虫活性的有1 0 0 5 种，能引起昆虫拒食、忌避、麻醉、引诱、生长阻断及抑制种 群繁殖的特异性杀虫植物达7 0 0 多种f ”】。植物农药主要包括植物杀虫剂、植物杀菌剂和 植物除草剂，其中植物杀虫剂的研究最为深入、应用最为广泛【1 6 】。 各国对植物杀虫剂的研究重点和方向不同，发达国家把大量精力投入到新植物杀虫 成分的发现、活性物质的鉴定、结构改造和模拟合成等方面，而发展中国家则将研究重 点放在使用产品的开发和应用方面。 i 2 1 主要杀虫植物种类 植物杀虫剂往往是多种组分协同作用，作用点多样，且一般化学结构较复杂，因此 不易诱发害虫抗药性，理论上讲害虫对其产生抗药性的机率远低于常规的化学杀虫剂； 植物杀虫剂的杀虫成分是植物在进化过程中为了抵御昆虫侵袭逐渐形成的，针对性较强， 2 第一章绪论 因此对非耙标生物相对安全；植物杀虫剂的主要成分是天然化合物，主要由c 、h 、o 元 素组成，在长期的进化过程中已经形成了其固定的参与能量与物质循环代谢途径，源于 自然用之于自然，因此容易自然分解，不产生残留，不会引起生物富集现象，对环境影 响小。 目前研究最多的杀虫植物主要是楝科、菊科、豆科、卫矛科和大戟科的植物，其中 楝科、豆科、卫矛科的植物被认为最具有开发利用价值。我国对植物杀虫剂的研究一般 集中在楝科，豆科，卫矛科，菊科，茄科，以及多种植物精油【1 7 】。 ( 1 ) 楝科，楝科植物约有5 2 属1 4 0 0 种，中国约有1 5 属6 4 种，主要有印楝、苦楝 和川楝，其中苦楝和川楝广泛分布于我国黄河以南地区，有效成分川楝素存在于二者的 树皮、种仁中，对害虫有拒食和胃毒毒杀作用埔j ，但研究最成熟的当数印楝，自1 9 8 5 年美国v i k w o o d g o n g s i 最早开发出印楝杀虫剂m a r g o s a n 一0 ( 马格乐) 以来，全世界已有 2 0 多个国家建立了印楝农药生产厂，并已有十几个产品投放市场，用于防治8 目4 0 0 余 种害虫”l 。我国生产0 3 印楝素乳油的公司主要有潞西市光明印楝产业开发有限责任公 司、云南中科生物产业有限公司、海南利蒙特生物农药有限公司和武汉市特利隆生物科 技有限公司。 ( 2 ) 豆科，鱼藤原产于热带、亚热带，我国广东、福建、台湾等省区都有野生品种， 是世界公认的理想杀虫植物，杀虫成分鱼藤酮存在于根皮中，对害虫具有触杀、胃毒作 用。 ( 3 ) 卫矛科，苦皮藤属于南蛇藤属，多年生藤本灌木，又称苦树皮、落霜红，广泛 分布于我国长江流域和黄河流域的山林荒坡，主要杀虫成分主要存在于根皮、叶子、茎 皮中，对害虫具有麻醉、拒食、毒杀以及杀卵等多种生物活性。雷公藤属于雷公藤属， 又称黄藤根，广泛分布于我国广西、广东、台湾、江西等雀，对害虫有忌避、拒食、毒 杀、抑制生长发育以及产卵忌避作用。 ( 4 ) 菊科，主要有除虫菊、艾蒿，白花除虫菊杀虫成分除虫菊素存在于花中，以触 杀作用为主，对害虫的接触击倒强是其一大特点。除虫菊素包括除虫菊素i 、i i ，瓜叶 菊素i 、i i 和茉酮菊素i 、六种成分。艾蒿广泛分布于我国东北、西北，全草都含有 挥发油。 ( 5 ) 茄科，烟草的杀虫成分烟碱在叶中的含量最多、茎中最少，越老熟烟草的烟叶 中所含的烟碱越多，对昆虫有胃毒、触杀和熏蒸作用，并有杀卵作用。另外还有其它科 的植物，如杜鹃花科中的闹羊花，百合科中的藜芦等。 第一章绪论 1 2 2 植物杀虫剂的主要活性物质 植物源杀虫剂中的活性成分主要有以下几种： ( 1 ) 生物碱，如烟碱、百部碱、藜芦碱、苦参碱、雷公碱，另外还有苦豆碱、乌头 碱、喜树中的喜树碱、三尖杉中的三尖杉碱。 ( 2 ) 萜类，印楝素、闹羊花素属于四环三萜类物质，苦皮藤及同属几种植物，近年 来我国研究较多，其杀虫成分主要为倍半萜酯类化合物，另外还有杜鹃素、木藜芦素、 石南素。 ( 3 ) 糖苷类( 配糖体) ，如山茶科山茶属植物中的茶皂素、巴豆中的巴豆糖苷和苦 木中的苦木素。 ( 4 ) 有机酸、酯、酮类，如除虫菊酯、鱼藤酮、丁布( 1 ，4 一二羟基一7 一甲氧基 1 ，4 苯嗪一3 一酮) 、地衣中的松果酸、狐衣酸及斑点酸，还有海藻中的类似谷氨酸 结构的化合物软骨藻酸和红藻氨酸，还有鱼藤素、毛鱼藤酮、马来鱼藤酚。 ( 5 ) 噻吩及炔类化合物，许多植物中存在光化学物质，光照条件下对昆虫有很强的 杀虫活性，如万寿菊中的三噻吩和呋喃乙炔。 ( 6 ) 有毒的蛋白质、挥发性香精油、单宁、树脂等，如蓖麻毒素、相思子毒素、巴 豆香素、草八角油、冬青油、沉水樟油、桉树油。我国植物源杀虫剂登记产品中的有效 成分有苦参碱、鱼藤酮、烟碱、苦皮藤素、川楝素、印楝素、藜芦碱、百部碱、茴蒿素、 苦豆子碱、莨菪碱、茶皂素1 2 种【2 0 】。 我国植物杀虫剂的研究和开发已取得了很大成就，但与国际同类研究相比，还有较 大差距并且存在一些问题，如对各种主要有效成分和辅助成分的分子结构，活性机理以 及相互协同作用及构效关系还不是十分清楚；在制剂加工和工艺水平上还较落后；提取 难、成本高；防治效果偏低，药效发挥速度较馒，持效期短。 1 3 印楝的自然分布及n i m b i n 的发现 印楝，英文名n e e m ，世界通用名a z a d i r a c h t ai n d i c a a j u s s ，楝科( m e l i a c e a e ) 楝属 ( m e l i al ) ，热带乔木，速生树种，高1 5 - - 4 0 m ，具喜温耐旱习性，原产于印度、缅甸等 地，中国无自然分布雎”。1 9 8 6 年，华南农业大学赵善欢教授首次引种印楝到海南省万宁 县试种 2 2 】。1 9 9 5 年，1 9 9 7 年以后中国林业科学研究院资源昆虫研究所赖永祺研究员【2 3 】 4 第章绪论 又两次从印度等地引入不同的印楝种源。目前已鉴定出以印楝素a ( a z a d i r a c h t i na a z a ) 为主的4 0 0 余种印楝素类似物的结构【2 4 1 。印楝种仁中除印楝素外还存在其它主要 活性成分1 2 “，如n i m b i n ，s a l a n n i n ，6 - d e s a e e t y l n i m b i n ，3 - d e s a c e t y l s a l a n n i n ，n i m b i n o l i d e ， i s o n i m b i n o l i d e ，s a l a n n i n o l i d e ，i s o s a l a n n i n o l i d e ( 结构式见图1 - 1 ) 等均具有一定的生物 活性，特别是对害虫的生长调节作用【2 6 】。王秋芬口7 1 、赵淑英在研究印楝素的提取分 析提纯及其应用研究过程中，在利用液一质联用技术( h p l c m s ) 分析时，除得到印楝素 a 外，另外还分析到n i m b i n 的存在，其对应的e s i m s ( + ) 的m z = 5 4 1 1 为n i m b i n 的分 子离子峰( m + h ) ，进而得到n i m b i n 的分子量为5 4 0 。 n i m b i n 属于四环三萜类化台物，分子式为c 3 0 h 3 6 0 9 ，分子量为5 4 0 ，白色晶体，熔 点为2 0 4 2 0 5 。c ，易溶于甲醇、丙酮、乙醇等极性有机溶剂。1 9 4 2 年s i d d i q u is 等 2 9 , 3 0 首次从印楝种油中发现n i m b i n 这种物质，1 9 5 7 年n a r a s i m h a nns 等 2 9 , 3 0 】通过化学反应推 测n i m b i n 的分子式为c 3 0 h 3 6 0 9 ，分子量为5 4 0 ，1 9 6 2 年a r y a vp 1 2 9 , 3 0 等通过质谱( m s ) 分析证实了这种推测，1 9 6 7 年h a r r i s m 等【3 1 】确定了n i m b i n 的立体化学结构。随着对a z a 研究的日益成熟，人们开始热衷于对n i m b i n 、s a l a n n i n 等萜类化合物的研究。 印楝种仁中n i m b i n 的含量远低于a z a ，且影响n i m b i n 含量的因素各不一样。s i d h u op 等3 2 1 对印度6 个主要印楝种植区，3 3 个不同气候地区，2 0 0 0 2 0 0 1 年问成熟的印楝 种子进行有效成分含量分析。发现( 1 ) 以去壳后种仁计，n i m b i n 含量变化范围为 1 8 2 6 3 6 8 m g k g ，平均为2 0 5 8m g 瓜g ，s a l a n n i n 含量变化范围为4 5 4 - 1 8 3 0 3 m g k g ，平 均为7 3 4 5m g & g ，印楝油的含量变化范围为3 2 9 - - 4 5 3 ，平均为3 9 7 ；( 2 ) n i m b i n ， s a l a n n i n 二者的含量比例大约是1 ：3 ，但是与a z a 的含量不存在任何线性关系；( 3 ) 不 同气候地区、不同品种之间，n i m b i n ，s a l a n n i n 的含量存在差异，同一气候地区、同一品 种、不同印楝树个体之间，r f i m b i n ，s a l a n n i n 的含量也存在差异，于是作者认为影响n i m b i n ， s a l a n n i n 自身生物合成最主要的因素不是温度、降雨量、湿度，而是印楝本身的基因所致。 j o h n s o ns 3 3 1 对斯里兰卡北方印楝种植区的印楝树种仁中主要萜类化合物和种油进行 了含量分析，分析对象分别为采集于生长期、成熟期和成熟期采集后1 - - 6 个月储存期中 的种子。结果显示( 1 ) a z a ，s a l a n n i n ，n i m b i n ，6 - d e s a c e t y i n i m b i n ，3 - d e s a c e t y i s a l a n n i n 和印 楝种油在种子的生长、成熟和储存期含量相对稳定；( 2 ) n i m b i n ，6 - d e s a c e t y l n i m b i n 含量 最低，以印楝种仁计，前者最高为1 5 m g g ，后者低于o 6 m g g ，s a l a n n i n ，a 乙a 含量最高， 分别为4 5 m g g ，3 5 m g g ，3 - d e s a c e t y l s a l a n n i n 的含量约为s a l a n n i n 含量的1 5 + 5 ，而印楝种 油的含量在种子成熟期达到最高，为4 5 0 m g g ，且在其后的种子储存期含量变化不大。 6 h 3 c o o co c o c h n i m b i n o h d e s a l a n n i n d e s a c e t y l s a l a n n i n o h j c o o c o c o c h 3 j s o n i m b i n o b d e o h 第一章绪论 s a l 9 , n n i n o f i d e o i s o s a l a n n i n o f i d e 图1 1 主要三萜类化合物的结构 f i g 1 1t h es t r u c t u r eo f m a i nt e t r a n o r t r i t e r p e n o i d s 1 3 1n i m b i n 的提取方法 天然活性成分的研究一般经历提取、分离、提纯、结构鉴定及应用研究这一过程。 提取过程中最常采用的一般是溶剂法，近年来新兴起的提取技术还有超临界流体萃取法、 微波、超声波辅助溶剂技术以及液膜萃取技术等。本论文在对n i m b i n 的提取研究中，除 、， 采用了常规溶剂法外还尝试了超声波、微波辅助溶剂法提取n i m b i n 的研究。 “ 文献资料显示，n i m b i n 的提取多采用常规溶剂法提取和超临界( s f e ) 法提取。在 常规溶剂法提取方面常采用以下两种提取工艺：( 1 ) 弱极性溶剂如石油醚、正己烷直接 提取。k u m a rj 等【3 4 】将印楝种仁粉置于索式提取器中，用正己烷做溶剂进行提取，提取 液减压浓缩得印楝油，然后分别用4 5 的甲醇水溶液和正己烷萃取三次，每次取醇水层， 分别减压浓缩，经h p l c 分析得知，三次醇水层萃取液中a z a 的回收率分别为7 5 - 8 0 ， 1 0 1 5 ，o ，n i m b i n ，s a l a n n i n 的回收率均分别为6 0 - - , 6 5 ，1 0 1 5 ，o 。( 2 ) 极性溶 剂如甲醇、乙醇直接提取。 常规溶剂法提取n i m b i n 的报道较多，但未见系统考察各因素对n i m b i n 提取效果的影 响以及优化条件的研究报道，同时溶剂法的缺点是对溶剂需求量大、回收溶剂量多、毒 性大、花费高。 t o n t h u b t h i m t h o n gp 等【3 卅考察了s f e 方法提取n i m b i n 过程中流速、压力、温度、物 料粒径大小、夹带剂对n i m b i n 提取率的影响。发现n i m b i n 的提取率随温度的升高而减小， 随物料粒径的增大而减小，随压力的增大而增大，夹带剂对n i m b i n 的提取率几乎无影响。 第一章绪论 适宜条件为：c 0 2 流速0 6 2 c m 3 m i n ，压力2 0 m p a ，温度3 5 c 。同时发现当使用甲醇作夹 带剂时，n i m b i n 的提取率随温度的升高而增大，可能是因为甲醇对萜类化合物的溶解性 随温度的升高而升高所致。 j o h n s o ns 等研究了s f e 方法对印楝种仁中印楝油和三萜类化合物的提取效果。考 察的影响因子有：压力、温度、夹带剂的种类和用量、溶剂流速、提取时间。实验结论 如下，当压力从6 9 m p a 升至2 0 6 m p a 过程中，三萜类化合物的提取率随压力的增大 而增大，但增幅不明显，且提取率均小于1 0 ，当压力从2 0 6 m p a 升至3 4 4 m p a 过程中， 三萜类化合物的提取率增幅明显；c 0 2 做溶剂时n i m b i n 、s a l a n n i n 绝大部分被提取出来， a z a 只有少量被提取出来，说明c 0 2 更适宜提取极性偏小的萜类化合物如n i m b i n ， s a l a n a i n ，不适宜提取极性偏大的a z _ a 等物质；当加入甲醇做夹带剂时，n i m b i n 、s a l a n n i n 的提取率在甲醇加入量为6 ，压力为2 0 6m p a 时最大，而a z a 的提取率随甲醇加入 量和压力的增大而增大。同时发现溶剂的流速、提取温度对n i m b i n 的提取率均有一定的 影响。 s f e 提取是利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响而进行的，c 0 2 是最常用 的萃取溶剂，优点是临界温度( t c = 3 1 3 ) 接近室温，临界压力( p c = 7 3 7 m p a ) 不高，且无 色、无毒、无味，不易燃，化学惰性，价格便宜，易制成高纯度气体。c 0 2 对不同溶质 的溶解能力差别很大，这与溶质的极性、沸点和分子量密切相关，一般说来化合物的极 性基团越多，分子量越高，越难萃取，需要加入适宜的夹带剂，夹带剂的辅助效果取决 于其本身的性质、欲提取化合物的性质和原料本身的特性。 n i m b i n 提取浓缩液或浓缩物的初步后处理多采用溶剂萃取法，萃取工艺有以下三种： ( 1 ) 先加入一定体积的水或饱和食盐水或醇水混合溶剂，然后用中等极性溶剂如二氯甲 烷或乙酸乙酯萃取，取有机层减压浓缩至干得n i m b i n 粗提物。( 2 ) 先加入一定体积的水 或醇水混合溶剂，然后用弱极性溶剂如石油醚或正己烷萃取，除去亲脂性杂质，剩余的 醇水层减压浓缩至干得n i m b i n 粗提物。( 3 ) 紧接( 2 ) 的醇水层，再用中等极性溶剂萃 取，取有机层减压浓缩至干得n i m b i n 粗提物。 1 3 2n i m b i n 的分离精制方法 1 3 2 1柱层析 用于分离n i m b i n 常用的填料有：硅胶、氧化铝，分离物质范围广，价格便宜，缺 第一章绪论 点是目标化合物与填料的吸附部分是不可逆的，且在二者的接触过程中遇酸、碱易造成 目标化合物的分解，接触时间越长分解越严重。( 墓) f l o r e xr v m ，一种硅镁土，主要成分 为水合硅酸铝镁，极性小于硅胶、氧化铝，对印楝中三萜类物质的保留时间较短，萜类 化合物分解较少，分离效果好，且回收率高，主要缺点是溶剂使用量大。 j a r v i sa 掣”1 将n i m b i n 粗提物先经过一个b i o t a g e4 0 m 柱( 1 5 0 4 0 m mi d ) ，9 0 9 硅 胶装柱，分别用体积比为1 0 ：0 ，7 ：3 ，6 ：4 ，5 ：5 ，3 ：7 ，2 ：8 的石油醚乙酸乙酯混 合溶剂洗脱，分别洗脱1 5 ，2 ，3 ，2 5 ，2 5 ，1 5 倍柱体积，每5 0m l 记作一馏分，t l c 跟踪分析，相同馏分合并，然后经超临界流体色谱( s f c ) 分析n i m b i n 的含量。发现石 油醚：乙酸乙酯= 7 ：3 ( v v ) 洗脱液中主要含有n i m b i n ，d e s a c e t y l n i m b i n 两种物质，将 此馏分再次经过一个b i o t a g e4 0 m 柱( 7 0 x 4 0 m mi d ) ，4 0 9 硅胶装柱，石油醚：乙酸乙酯 = 8 ：2 ( v v ) 洗脱，分段收集分别得到n i m b i n ，d e s a c e t y l n i m b i n 单组分馏分。 j o h n s o ns 等【3 即使用f l o r e xr v m 柱精制n i m b i n 等三萜类化合物。1g 粗提物3 0 9 填料 加样，先用2 5 倍柱体积的石油醚洗脱，然后用5 倍柱体积的石油醚：乙酸乙酯= l ：l ( v v ) 洗脱，收集此馏分，减压浓缩，将此馏分再次经f l o r e xr v m 柱分离，用石油醚；丕 酸乙酯= 7 ：3 ( v v ) 洗脱，前段馏分中含有n i m b i n ，将此馏分减压浓缩至于。 1 3 2 2 固相萃取( s p e ) 固相萃取与液液萃取、柱层析相比，萃取过程简单快速，溶剂消耗少，能有效去除 杂质的干扰，降低有机溶剂对人体和环境的危害。 r a m e s ha 等1 3 9 1 在使用s p e 法分离精制a z a ，印楝素b ( a z a d i r a c h t i n b ，a z b ) ， n i m b i n ，s a l a n n i n 过程中，采用石墨化炭黑( g c b ) 做填料，取lm l 印楝油，加入o 2 0 5 m l 浓度分别为1 0 0 ，2 0 0 ，3 0 0 ，5 0 0 ，1 0 0 o 蛳的a z - a ，a z b ，n i m b i n ，s a l a n n i n 标 准溶液，混合均匀静置5m i n ，然后加入l o m l 正己烷，震荡3m i n ，加样至s p e 柱，5m