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四川大学硕士学位论文 糖胺聚糖产生菌的筛选及其 发酵条件的优化 微生物学专业 研究生孙勇指导教师王忠彦 摘要 本文利用糖胺聚糖可与氯化十六烷基吡啶( c e t y l p y r i d i n i u m c h l o r i d e ，c p c ) 反应生成白色混浊的性质，从不同来源的5 0 0 株 菌种中筛选的到4 株菌种，再通过琼脂糖凝胶电泳，筛选得到一 株糖胺聚糖产生菌，编号为g s 3 6 。其发酵产物纯化后测得的红外 光谱图与硫酸软骨素标准红外光谱图比较基本一致，可初步确定 产物为硫酸软骨素。经形态观察和生理生化实验，初步鉴定该菌 株为坚实芽孢杆菌( b f l - m u s ) 。 通过单因素窘验和正交实验，进了步对该菌株的发酵条件进 行了优化：以书葡萄糖为碳源，d 嘲牛肉膏为氮源，加入0 1 n a ：s o 。，0 1 k 2 h p 0 4 ，0 0 2 m g s 0 4 ，培养基起始p h = 7 ，3 0 c 下 摇瓶培养2 4 h ，发酵液中产物浓度最高为0 1 3 3 m g m l 。 经过质粒提取和琼脂糖凝胶电泳，检测到有质粒存在，经过 质粒消除，该菌发酵液中的产物浓度大幅度降低，推测该菌株调 节酶活的基因可能存在于质粒上。 菌株活化后接种至发酵培养基培养2 4 h 后，对胞内胞外产物 四川大学硕士学位论文 浓度的进行比较，可知该菌的合成产物主要存在于细胞外。 关键词：糖胺聚糖 硫酸软骨素 氯化十六烷基吡啶 发酵条件 琼脂糖凝胶电泳 质粒 型! ! 奎兰堡主兰垡丝苎 t h es c r e e n i n go f t h eg l y c o s a m i n o g l y c a np r o d u c t s t r a i na n dt h eo p t i m i z a t i o no fi t sf e r m e n tc o n d i t i o n m a j o r ：m i c r o b i o l o g y p o s t g r a d u a t e ：s u ny o n g t u t o r ：w a n gz h o n g - y a n a b s t r a c t u t i l i z e g l y c o s a m i n o g l y c a n s c h a r a c t e ro f p r o d u c i n g w h i t e t u r b i d i t yt h r o u g hr e a c t i n gw i t l lq u a t e r n a r ya m m o n i u ms a l t f o r e x a m p l e ，c e t y l p y r i d i n i u r nc h l o r i d e ( c p c ) ，t oo b t a i n4s c r e e n e ds 姐i 1 1 s f r o m5 0 0o n e so f v a r i o u ss o u r c e s ag l y c o s a m i n o g l y c a np r o d u c ts t r a i n g s 3 6i so b t a i n e db y a g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s t h ei n f m r e d s p e c t r u m t e s t e da f t e rt h ep u r i f i c a t i o no ft h ef e r m e n tp r o d u c ti s i d e n t i c a lw i t l lt h es t a n d a r di n f r a - r e ds p e c t r u mo ft h ec h o n d r o i t i n s u l f a t e t h e r e f o r e ，t h ep r o d u c ti sp r o v e dt ob ec h o n d r o r i ns u l f a t e t h r o u l 曲t h eo b s e r v a n c e o fi t ss h a p ea n dt h ep h y s i o l o g i c a la n d b i o c h e m i c a lt e s t i ti si d e n t i f i e d 船b f i r m u s t h r o u g h 恤8 i n 9 1 。梳o 。吼删恤o n b 8 2 埘n a l t e s t , m 。 f e r m e n tc o n d i t i o no f t h es t r a i ni sf u r t h e ro p t i m i z e d ：t a k e 愀出u c o s ea s 3 岩 t h ec a r b o ns o u r c e , 懈b e e fe x t r a c ta st h en i t r o g e ns o u r c e a d d0 1 n a 2 s 0 4 ，0 1 k 2 h p 0 4a n do 0 2 m g s 0 4 ，、v i t l lc u l t u r em e d i u m s t a r t i n gw i t hp h 7 c u l t i v a t e df o r2 4 hu n d e r3 0 t h r o r l g hs h a k i n gt h e b o t t l e ，t h ec o n c e n t r a t i o no f t h ef e r m e n t p r o d u c ti s0 1 3 3 m g m 1 t h r o u g ht h ee x t r a c t i o na n da g a r o s eg e le l e c t r o p h o r e s i s ，p l a s m i d i sf o u n d a r e re l i m i n a t i o no fi t ，t h ec o n c e n t r a t i o no ft h ef e r m e n t p r o d u c ti sl a r g e l yd e c r e a s e d t h u si ti sp r e s u m e dt h a tt h eg e n ew h i c h r e g u l a t e st h ev i t a l i t yo f e n z y m ee x i s t si nt h ep l a s m i d i n o c u l a t et h ea c t i v a t e ds t r a i nt ot h ef e r m e n tc u l t u r em e d i u m ， 3 四川大学磺士学位论文 c u l t i v a t i n g f o r 2 4 h c o m p a r e i n t r a c e l l u l a ra n de x t r ac e l l u l a r c o n c e n t r a t i o no ft h ep r o d u c t i ti sc o n c l u d e dt h a tt h es y n t h e t i cp r o d u c t o f t h es t r a i nm a i n l ye x i s t se x t r a c e l l u l a r l y k e yw o r d s ：g l y c o s a m i n o g l y c a n ：c e t y l p y r i d i n i u mc h l o r i d e ( c p c ) a g a r o s eg e le l e e t r o p h o r e s i s ，：c h o n d r o i t i n s u l f a t e ： f e r m e n tc o n d i t i o n ；p l a s m i d 4 四川大学硕士学位论文 糖胺聚糖产生菌的筛选及其 发酵条件的优化 引言 糖胺聚糖( g l y c o s a m i n o g l y c a n ，g a g ) 又名粘多糖，多为己糖醛 酸和己糖胺交替出现的长链多聚物。糖胺聚糖主要存在于动物体 中，在体内形成软骨，也是血管、基底膜的组成成分。它们在细 胞内合成后，分泌到细胞外形成蛋白聚糖，在细胞与细胞间、细 胞与其间质的粘附和识别中起重要作用。糖胺聚糖具有多种生物 活性，可用于抗凝血、抗肿瘤、抗病毒、降血脂、增强免疫等， 其产品用途广泛，涉及药品、食品、化妆品等。其中g a g 药物是 当今药物研发的热点。 根据糖胺聚糖中重复二糖骨架的化学结构，一般可分为：肝 素( h c p a r i n ) 、硫酸软骨素( c h o n d r o i t i ns u l f a t e ) 、透明质酸 ( h y a l u r o n i ca c i d ) 等几类。 肝素由己糖醛酸即l 一艾杜糖醛酸和d 一葡萄糖醛酸以及己 糖胺即。一d 一葡萄糖胺且主要是它们的衍生物( 硫酸化、乙酰化) 组成【j 1 ，其结构式见图l 。因肝素能使抗凝血酶与凝血酶的结合速 度增加几千倍，从而有效地抑止血凝过程，所以被广泛用作抗凝 血药物f 舶。 图l 肝素的结构 n 。，j。，l 四川大学硕士学位论文 硫酸软骨素由d 一葡萄糖醛酸和n 一乙酰一d 一氨基半乳 糖组成，只是硫酸基团位置不同而有c s a 、c 、d 和e 四种异构体。 c s a 的结构式见图2 。硫酸软骨素用于治疗冠心病、某些神经性头 痛、关节痛、偏头痛、动脉粥样硬化等症及链霉素引起的听觉障 碍和肝炎的辅助治疗，此外，还是化妆品的重要物料3 ”。 图2 c s a 的结构 n 透明质酸由b d n 乙酰胺基葡萄糖和p d 一葡萄糖醛酸 组成，其结构式见图3 。由于其独特的保水、润滑等高分予多糖的 性质，其天然性、无过敏性和与人体组织良好的生物相容性，在化妆 品、保健食品、美容手术和医药领域具有广泛的应用嘲。 co o hc h i o h 图3 透明质酸的结构 1n 目前，糖胺聚糖的生产方法主要有两种：一是直接从生物原 材料中直接提取，如哺乳动物的软骨和软体动物。二是微生物发 酵合成，不过主要集中在利用微生物发酵合成透明质酸。 斟蛐翰 四川大学硕士学位论文 在菌种的筛选上，大多集中在糖胺聚糖裂解酶产生菌的筛选， 而能够合成糖胺聚糖的微生物筛选( 除透明质酸) 很少有报道， 透明质酸产生菌的筛选大多采取观察菌落形态，然后扩大培养， 提纯产物测其含量的方法，工作量较大。本文根据糖胺聚糖可与 氯化十六烷基吡啶( c e t y l p y r i d i n i u mc h l o r i d e ，c p c ) 反应生成白色 混浊的性质嘲，与琼脂糖凝胶电泳配合，建立了糖胺聚糖类物质产 生菌新的筛选方法。利用此方法筛选得到了一株糖胺聚糖产生菌， 产物经鉴定为硫酸软骨素，并对菌种进行了鉴定，对发酵条件进 行了研究，为糖胺聚糖工业化生产提供了基础。 四川大学硕士学位论文 材料与方法 1 实验材料 1 1 样品来源 从空气、土壤、污水等不同来源的样品中，利用平板稀释法 进行分离培养获得5 0 0 个菌株。 1 2 培养基 种子培养基：肉汁蛋白胨培养基 牛肉膏3 9 蛋白胨1 0 9 n a c i5 9p h 7 0 蒸馏水定容至1 0 0 0 r a l 发酵培养基：葡萄糖1 0 9 n a 2 s 0 4l g p h = 7 0 蒸馏水定容至1 0 0 0 m l 斜面培养基：同种子固体培养基 生理生化培养基： 肉汁蛋白胨培养基 糖或醇类发酵培养基： ( n h a ) 2 h p 0 4l g m g s o 7 h 2 00 2 9 k c l0 2 9 蒸馏水1 0 0 0 m l 牛肉膏3 9 k 2 h p 0 4l g 酵母膏o 2 9 糖或醇类1 0 9 琼脂5 6 9 调节p h 为6 8 7 0 ，然后加入0 4 溴甲酚紫 乙醇溶液2 m l 。 四川大学硕士学位论文 甲基红试验培养基： 蛋白胨5 9 n a c l 5 9 蒸馏水1 0 0 0 m l 明胶水解试验培养基： 蛋白胨5 9 蒸馏水1 0 0 0 m l 石蕊牛奶培养基： 2 5 石蕊水溶液4 m l 脱脂牛奶1 0 0 m l 柠檬酸盐培养基： 柠檬酸钠2 9 m g s o 7 h 2 00 2 9 k 2 h p 0 3 h 2 0l g 葡萄糖5 9 p h = 7 o 7 2 明胶1 2 0 9 p h = 7 2 7 4 n a c i5 9 ( n 心) 2 h p 吼l g l 溴百里酚蓝水溶液1 0 m l 琼脂2 0 9 蒸馏水1 0 0 0 m l 1 3 主要试剂与设备 1 3 1 设备 7 5 2 分光光度仪 d y y i 】1 8 稳压电泳仪 红外光谱仪( b r u k e rv e c t o r 3 3 型) 超声波破碎仪 1 3 2 主要试剂 硫酸软骨素：西南合成制药有限公司 肝素钠：生化试剂，上海伯奥生物科技有限公司 透明质酸：生化试剂，中科院上海生物化学研究所 9 四川大学礤士学位论文 氯代十六烷基毗啶：化学纯，。蒸馏水配成l 叽的溶液 1 4 革兰氏染色指示菌 大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o i l ) 枯草芽孢杆蕴( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 均为本实验室保存。 2 实验方法 2 1 筛选与鉴定 2 1 1 初筛 从空气、土壤、污水中利用平板稀释法分离培养得到5 0 0 个 菌株，将其编号，保存。将保存的菌株按编号接种到对应编号的 斜面培养基中，3 0 培养2 4 h 后，每只试管加入生理盐水2 m l ，振 荡，收集液体，用微量离心管离心( 1 5 0 0 0 r m i n ) ，取其上清液。 将得到上清液分别用滴管滴入装有2 m l 氯代十六烷基吡啶溶 液的试管中，滴入量为l m l ，观察是否有白色混浊产生。产生混浊 的试管对应的菌株保存以进行下一步筛选。 2 1 2 复筛1 8 1 0 1 初筛所得到的菌株产物中可能因含有色素等而对结果产生影 响，因此可用琼脂糖电泳进行进一步筛选。 a 试剂 电泳缓冲液：取巴比妥钠1 2 4 9 溶于8 0 0 m l 水中，用2 m o l l h c i 调至8 2 ，加水至1 0 0 0 m l 备用( 0 0 6 m o l 1 ) 甲苯胺蓝：溶于乙酸一乙醇一水( 0 1 ：5 ：5 ) 试剂中，配成 0 1 ( w v ) 溶液 甲酚红：变色范围p h 7 2 8 8 脱色剂：乙酸：乙醇：水= o 一：5 ：5 四川犬学硕士学位论文 b 步骤 制各凝胶，将电泳缓冲液和电泳级琼脂糖( 1 o ) 在微波炉 或经高压熔化，混匀，冷却至5 5 c ，倒入已封好的凝胶灌制平台 上，插入样品梳。 待胶凝固后，从制胶平台上除去封带，拔出梳子，放入有足 够电泳缓冲液的电泳槽中，缓冲液高出凝胶表面l m m 。 将上一步所得的菌种接种到发酵培养基培养3 6 h ，离心，取上 清液，用移液器加入样品孔中，点样量为1 0 p 1 。同时再其它样品 孔中加入含有甲酚红的标准品作为对照。 电泳电压为8 0 v ，使标准品向阳极泳动，当甲酚红迁移至一定 距离时，关闭电源。 取出凝胶，在甲苯胺蓝染色液中浸泡1 0 m i n ，用脱色剂脱色。 脱色后观察并照相。 2 1 3 菌种的初步鉴定 根据文献【7 】，通过形态观察和生理生化实验相结合的方法进行 初步鉴定，以伯杰细菌鉴定手册( 第八版) 作为分类参考。 2 1 4 扫描电镜 1 1 ) 1 2 l 扫描电镜的制片方法： 1 ) 菌液用o i m 磷酸盐缓冲液( p b s ) ( p h 7 2 ) 洗三次。 2 ) 后一次悬于适量p b s 中，浓度以滴在3 4 m m 2 小玻片上密 度均匀菌落不互相重叠为宜。 3 ) 将菌悬液稀释到适当浓度后，滴在小玻片上，室温静置 1 0 m i n ，将多余细胞悬液吸去。 4 ) 面朝上，把小玻片放入小称量瓶底部，用吸管沿瓶壁缓慢 加入l 冷却的戊二醛溶液，淹过样本即可，4 固定2 h 以 上，可过夜或更长时间。 5 ) p b s 洗三次。 四川大学硕士学位论文 6 ) 随即加l 四氧化锇，固定3 0 m i n 。 7 ) 用p b s 洗三次。 8 ) 逐级脱水：5 0 ，7 0 ，9 0 丙酮各一次，1 0 0 两次，每 次5 1 0 r a i n 。 9 ) 用醋酸己戊酯取代丙酮，程序为：5 0 ，7 0 ，9 0 醋酸 已戊酯丙酮溶液各一次，1 0 0 两次，时间与丙酮相同( 各 级醋酸已戊酯用1 0 0 丙酮配制而成) 。 1 0 ) 放入临界点干燥仪干燥 1 1 ) 以碳、金分别喷镀。 1 2 ) 取出样本，扫描电镜观察。 2 2 产物的初提及鉴定 2 2 1 初提 将g s 3 6 活化后接种至发酵培养基中3 0 培养2 4 h 。4 0 0 0 r m i n 离心2 0 r a i n ，除去蕴体，保窖发酵液。在发酵液中加入2 倍体积5 ( w v ) 浓度的c p c 溶液，3 7 放霞一夜，使充分沉淀，4 0 0 0 r m i n 离心2 0 m i n 收集沉淀。将沉淀溶解于l m o l l 的醋酸钠溶液，于4 0 下加入3 倍体积的9 5 乙醇。产物沉淀析出为除去沉淀中残 留的c p c 离子，可进行重复沉淀，直到溶液中无泡沫产生。用少 量无水乙醇冲洗沉淀，再用丙酮洗涤去乙醇，减压抽滤，于6 0 烘干后的得到纯化的样品。 2 2 2 鉴定 产物的鉴定产用红外光谱法“。 称取约2 m g 的样品，在红外灯的照射下，置于玛瑙研钵中研 磨4 1 0 m i n ，再和1 5 0 m g 左右干燥的k b r 粉末充分混合，继续研 磨2 5 m i n 。将研磨好的混合物粉末压膜制片，放入样品架上，置 于红外光谱仪内全波段扫描，绘出红外光谱图。 四川大学硕士学位论文 2 3 标准曲线的绘制 采用天青a 法f 2 0 1 。 1 ) 配制0 0 2m g m l 、o 0 5m g m l 、o 1m g m l 、0 2m g m l 、 0 5m g m l 、1 0m g m l 的硫酸软骨素标准品溶液 2 ) 天青a 配置成2 0 m g l 的溶液 3 ) 取干净的试管7 只，分别按顺序加入蒸馏水和上述6 各浓 度的标准品各l m l ，再加入天青a 溶液，振荡，混匀。 4 ) 以蒸馏水为空白对照，在5 0 0 r i m 的波长下测其o d 值，重 复3 次，取平均值。 5 ) 以浓度为横坐标，o d 值为纵坐标绘制标准曲线。 2 4 产物含量的测定 将烘干的产物溶于5 0 m l 的蒸馏水，取l m l 加入5 m l 的天青a 溶液，于5 0 0 r i m 波长下测o d 值，对照标准曲线计算含量。 2 5 菌体量的测定 菌体经离心分离后，用少量生理盐水清洗，然后离心，重复 三次。将菌体收集置于6 0 。c 下烘干至恒重，称取起重量为菌体量。 3 发酵条件的研究 3 1 生长曲线及产率 为测定菌株生长曲线及生长过程中发酵液产物含量的变化， 将菌株接种至种子培养基中，3 0 c 培养1 6 h ，以1 的接种量转入 3 0 0 m l 的发酵培养基中，3 0 c 摇瓶培养，每隔8 小时取样测量菌体 量和产物含量。 3 2 单因素实验 四川大学硕士学位论文 测定不同碳源、氦源、起始p l 、培养温度、培养方式和金属 离子对产量的影响。 3 3 正交实验1 2 3 1 为了了解培养基主要成分对菌株发酵的影响，选取了培养基 中的两个主要成分：氮源和碳源进行两因子三水平的正交实验， 选取b ( 3 2 ) 正交表。 表1 培养基主要成分的正交实验表 实验编号葡萄糖含量( )牛肉膏含量( ) ab 10 5o 1 2o 50 3 3o 5o 5 41 00 1 5 1 o 0 3 61 00 5 n q 71 50 1 81 50 3 91 5o 5 4 质粒的提取及检测 4 1 溶液的配制 溶液l ：5 0 m m o l l 葡萄糖 2 5 m m o i lt r i s c 1 ( n h 8 0 ) 1 0 m m o l le d t a ( p h 8 0 ) 1 0 磅高压灭菌1 5 m i n ，4 保存 溶液2 ：0 2 m o i l n a o h ( 临用前用l o m o l l 贮存液稀释得到) 1 s d s 溶液3 ：5 m o l l 乙酸钾 6 0 m 冰乙酸 1 1 5 m l 水 2 8 5 m l 1 4 四川大学硕士学位论文 4 2 质粒的提取 采用碱裂解法1 2 4 】： a 将菌株的7 2 h 培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4 以1 2 ，0 0 0 r m i n 离心3 0 s 。吸去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。 b 将细菌沉淀重悬于1 0 0 m 用冰预冷的溶液1 中，剧烈振荡。 c 加2 0 0 u l 新配制的溶液2 。盖紧管口，快速颠倒离心管5 次， 以混合内容物。应确保离心管的整个内表面均与溶液2 接触。不 要振荡，将离心管放置于冰上。 d 加1 5 0 u l 用冰预冷的溶液3 。盖紧管口，将离心管倒置后温 和的振荡l o s 使溶液3 在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将 离心管置于冰上3 5 m i n 。 e 用微量离心机于常温以1 2 ，0 0 0 r m i n 离心5 m i n ，将上清液 转移到另一个离心管中。 f 加等量酚：氯仿( 2 5 ：2 4 ) ，震荡混匀，用微量离心机于常 温以1 2 ，0 0 0 r m i n 离心2 s ，将上清液转移至另一个离心管中。 g 用2 倍体积的乙醇于室温沉淀双链d n a ，震荡混合，于室温 放置2 m i n 。 h 用微量离心机于常温以1 2 ，0 0 0 r m i n 离心5 m i n 。 i 小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有 液体流出。在将附于管壁的液滴除尽。 j 用l m l 7 0 乙醇于4 洗涤双链d n a 沉淀，按步骤i 所述方 法去掉上清液，在空气中使核酸沉淀干燥l o m i n 。 k 用5 0 u l 的t e ( p h 8 0 ) 重新溶解核酸。贮存于一2 0 ，备用。 4 3 质粒d n a 的琼脂糖凝胶电泳汹1 4 3 1 试剂 a t b e 电泳缓冲液： 1 0 贮存液：1 0 8 9t r i s 碱 5 5 9 硼酸 4 0 m i 0 5 m o l ke d t a ，p h 8 0 加水至1 0 0 0 m l 1x 工作液：8 9 m m 0 1 lt r i s 碱 8 9 m m 0 1 l 硼酸 2 m m o l le d t a b 1 0 x 加样缓冲液：2 0 ( w v ) f i c o l l4 0 0 0 i m o l l n a 2 e d t a ，p h 8 0 1 0 ( w v ) s d s 0 2 5 ( w v ) 溴酚蓝 0 2 5 ( w v ) 二甲苯青 c ，溴化乙锭溶液：1 0 0 0 x 贮存液0 5 m g m l 5 0 m g 溴化乙锭 1 0 0 m 1h 2 0 工作液：0 5 u g m l ，按l ：1 0 0 0 稀释配置凝胶 和染色液 4 3 2 实验条件：电泳电压为5 v c m ，m a r k e r 为 d n ae c o ri h i n d i i i 。 4 3 3 实验方法和步骤 a 制各凝胶，将电泳缓冲液和电泳级琼脂糖( 1 0 ) 在微波 炉或经高压熔化，混匀，冷却至5 5 ，倒入已封好的凝胶灌制平 台上，插入样品梳。 b 待胶凝固后，从制胶平台上除去封带，拔出梳子，放入有 足够电泳缓冲液的电泳槽中，缓冲液高出凝胶表面i m m 。 c 用适量的1 0 x 加样缓冲液制各d n a 样品，然后用移液器将 样品加入样品孔中。 d 接通电极，使d n a 向阳极移动，在5 v c m 凝胶的电压压迫 1 6 四j i i 大学硕士学位论文 下进行电泳。 e 当加样缓冲液中溴酚蓝迁移至足够分离d n a 片断的距离时， 关闭电源。 f 已染色的凝胶在紫外投射仪上观察并照柜。 5 质粒的消除 质粒消除采用变温一s d s 法f 2 6 l ： a 将菌种接种于种子培养基中3 0 培养4 8 h ： b 接种l m l 该增菌液于5 0 m l o 。0 1 5 s d s 种子培养基中，3 0 培养4 8 h ； c 接种l m l 该培养物于5 0 r a l 种子培养基中4 3 c 培养4 8 h ： d 重复b 、c 步骤一次 e 将培养液用生理盐水适当稀释后，涂布在种子培养基平板 上，3 0 培养4 8 h ，待长出菌落后进行质粒提取和检测。 6 酶活调节基因位置的初步确定 将质粒消除子接种至发酵培养基进行培养，测其产物含量， 初步确定调节酶活基因的位置。 7 胞内胞外产物含量的比较 将菌体和发酵液离心分离后，分别测其产物含量，确定产物 合成后的最终存在位置。 四川大学硕士学位论文 结果和分析 1 菌种筛选和鉴定 1 1 初筛 从空气、土壤、污水中利用平板稀释法分离纯化得到5 0 0 个 菌株，将其编号为g s l 5 0 0 。将所得菌株分别接种到斜面培养基 中3 0 培养2 4 h ，加入生理盐水2 m 1 ，震荡，收集液体，离心取其 上清液，滴入装有2 m 1 的氯代十六烷基吡啶溶液的试管中，观察。 5 0 0 株中产生明显混浊的有4 株，分别是g s 2 3 、g s 3 6 、g s l 3 7 、 g s 4 8 9 。下图为不同样品滴入氯代十六烷基毗啶溶液后的反应。如 图所示，g s 3 6 产生明显白色混浊，g s 4 2 未产生混浊。将产生混 浊的4 株菌种保留，进行下一步筛选。 1 2 复筛 图4 不同样品滴入氯代十六烷基毗啶溶液 蒸馏水2 硫酸软骨素标准品3 g s 3 64 g s 4 2 四川大学硕士学位论文 选择产生白色混浊的g s 2 3 、g s 3 6 、g s l 3 7 、g s 4 8 9 ，进行进 一步筛选。分别接秭至发酵培养基中( 5 0 m l 培养基2 5 0 m l 三角 瓶) ，3 0 2 0 0 r r a i n 摇床上培养2 4 h ，离心提取上清液，与标准品 对照进行琼脂糖凝胶电泳。如图5 所示，g s 3 6 豹发酵产物与硫酸 软骨素、透明质酸、肝素纳等标准品均具有甲苯胺蓝染色反应， 且在电场作用下均翔鞭极泳动，表明g s 3 6 的产物中会有糖胺聚 糖。g s 2 3 经甲苯胺蓝染色后来见到明显的蓝色斑点，表明其产物 中不含糖胺聚糖类物质。 圈5 璩廉麓凝胶电溶 麓艘软骨簟2 遗明厦醇3 肝蠢蚺4 ，g s 3 6 5 g s 2 3 1 3 菌种鉴定结果 1 3 1 形态特征 菌体为杆状，长1 4 - - 2 u r n 。宽0 5 l u m ，能产生芽孢n 图6 为 扫描窀镜照片。 菌落呈白色形状不规则，潮湿，不透明，扁平，边缘不整 齐。 1 9 1 3 2 主要生化特征 生理生化性质见表2 。 圈6 g 8 3 6 电镜照片 表2 生理生化鉴定 生理生化试验结果 葡萄糖产酸、产气 v p 试验 m r 试验 明胶水解 淀粉利用 柠檬酸盐的利用 石蕊牛奶试验 过氧化氢酶试验 开管、闭管均产酸不产气 + + + 产酸凝固 ( + ：阳性、能利用或生长一：阴性或不能利用或不生) 根据以上形态及生理生化试验鉴定结果，初步判定g s 3 6 为坚 实芽孢杆菌( b f i r m u s ) 。 四大学硕士学位论文 2 产物的红外光谱鉴定 所测得的纯化样品红外光谱如图8 所示，整个红外光谱大致 分为两个区域：官能团区( 4 0 0 0 - - 1 3 0 0 c m l ) 和指纹区( 1 3 0 0 4 0 0 c m “) 。与硫酸软骨素标准品红外光谱图7 比较基本一致。 = a o 卜一 x ， 圈7 硫酸软骨素红外光谱 厂弋w 图8g s 3 6 发酵产物红外光谱 2 l 坚业查兰堡主兰垡堡苎 3 标准曲线的制作 采用天青a 法制作标准曲线，测定结果及标准曲线分别见表3 和图9 。 表3 标准曲线的测定结果 标准品浓度( m g m 1 ) o d 啪 00 0 0 5 0o 0 4 1 0 0 7 50 0 6 3 0 1 0 0 0 0 8 3 o 1 5 00 1 3 2 0 2 0 00 1 8 l o o 0 5 标准品浓照1 ( m g m 1 ) o 1 5 o2 图9 硫酸软骨素标准曲线 四川大学硕士学位论文 4 发酵条件的研究 4 1 生长曲线及发酵时间与产物产量的关系 g s 3 6 经活化后接种至5 0 m l 发酵培养基中培养，每隔8 小时 取样，测菌体量及产物含量。结果见表4 和图1 0 。 表4 发酵时间与菌体量及发酵产物产率的关系 时间( h ) 菌体于重( g ) 0 d 值 产量浓度 ( m g m 1 ) 0000 80 0 0 9 oo 1 6o 0 40 0 2 20 0 2 5 2 40 0 5 8 0 0 7 5 0 0 8 5 3 20 0 60 0 6 60 0 7 5 4 80 0 6 10 0 4 90 0 5 6 o 0 7 0 0 g 0 0 5 弓o 蚓 盔0 , 0 3 秘 o j 0 0 1 o 0 0 9 o o 0 7 o - 毛 o 0 5 詈e 习丽司 o 寰b ! 塑鲤j 0 0 3 嚣 屯 o 0 2 0 0 1 0 图l o 生长曲线及发酵时间与产物产量的关系 菌体生长呈对数生长趋势，产物含量随菌体量的增加而增 加。2 4 h 后发酵液中产物含量达到最大值，为0 0 8 5 m g m l ，然后逐 渐减少。 四川大学硕士学位论文 4 。2 单因素实验 4 2 1 碳源对产物产量的影响 以发酵培养基为基础，加入1 的不同碳源代替葡萄耱，3 0 下摇瓶培养2 4 h ，测产物含量，结果见图1 1 。从图中可以看出， 以葡萄糖为碳源的发酵产物浓度最高，所以采用葡萄糖作为碳源。 o 】2 o 1 o ，0 8 高铷0 6 趟驰0 4 羹蔑。 o 葡蕾糖蔗糖麦芽糖可涪性淀糟乳糖 碳源种类 图1 l 碳源对产物产量的影响 4 2 2 氮源对产物产量的影响 以发酵培养基为基础，1 的葡萄糖为碳源加入o 3 的各种 氮源，3 0 o t 摇瓶培养2 4 h ，测产物含量，结果见图1 2 。从图中 可以看出，以牛肉膏为氮源的发酵产物浓度最高，因此采用牛肉 膏为氮源。 四川大学硕士学位论文 o 1 2 ，、0 1 鼍o0 0 8 岩v 整妒0 6 妞0 0 4 l 0 0 2 o 大豆蛋白藤酵母膏牛内青硝酸饷 硫酸钠 氨源种类 图1 2 氮源对产物产量的影响 4 2 3 起始p l l 值对产物产量的影响 将发酵培养基用1 n 的n a o h 和l n 的h c l 分别调至p h 5 o 9 0 ，3 0 c 下摇瓶培养2 4 h ，测产物含量，结果见图1 3 。起始p h 值为7 时发酵产物浓度最高。 0 1 2 0 1 奢9 0 0 8 型塑0 0 6 誊藉o o a 址 0 0 2 0 56 789 起始p h 值 图1 3 起始p h 值对产物产量的影响 四川大学硕士学位论文 4 2 4 温度对产物产量的影响 以l 的葡萄糖为碳源，0 3 的牛肉膏为氮源，于不同温度 下摇瓶培养2 4 h ，测产物浓度，结果如图1 4 。如图1 4 所示，3 0 为最佳培养温度。 皇 营 嚣 | l 3 04 0 5 06 0 培养温度 图1 4 温度对产物产量的影响 4 2 5 培养方式对产物产量的影响 在2 5 0 m l 三角瓶中装入5 0 m l 发酵培养基，分别采用静置和摇 瓶培养，于3 0 c t 培养2 4 h ，测产物含量，见图1 5 。结果表明， 最佳培养方式为摇瓶培养。 屹 骢 j 0 o o o o o 四川大学硕士学位论文 摇瓶静置 培养方式 图1 5 培养方式对产物产量的影响 4 2 7 金属离子对产物产量的影响 以1 的葡萄糖为碳源，o 3 的牛肉膏为氮源，分别加入 o 呼2 的金属离子，于3 0 c - f 2 4 h ，测产物含量，结果 见图1 6 。加入适量的m 9 2 + 。能够增加产物产量。 m 9 2 + c a 2 +m n 2 +f e 3 + 金属离子 图1 6 金属离子对产物产量的影响 坨 。 姆 舛 姑 0 o o 0 o o v 嘲挚扭 一_【)越艇器k h地o毗会0 o 0 o o o o 嚣) 嘲堆襁 _【箸v越爱s址 4 3 正交实验 通过单因素实验发现氮源和碳源对产物产量的影响比较大， 因此选用正交表b ( 3 2 ) ，设计了一个两因素三水平的正交实验确 定最佳碳源和氮源含量。 表5 正交实验结果 实验号葡萄糖含牛肉膏含量 0 d 浓度( m g m 1 ) n q 10 5o 10 0 4 80 0 5 4 20 5o 30 0 7 8 0 0 8 8 30 5o 50 0 8 40 0 9 5 。41 o0 。l0 0 5 60 。0 6 4 5 1 00 30 0 8 9o 1 0 1 61 o0 5 、 0 1 0 90 1 2 4 71 5 o 1 0 1 0 10 1 1 5 81 50 30 1 1 20 1 2 7 91 50 50 0 8 30 0 9 4 k 1 0 2 3 7 0 2 3 3 k 20 2 8 90 3 1 6 k 30 3 3 60 。3 1 3 k l0 0 7 90 0 7 8 k 20 0 9 60 1 0 5 k 30 1 1 2 0 1 0 4 极差0 0 3 3 0 0 2 7 优化方案 a 1 正交实验如表5 所示。通过极差比较可知：培养基中葡萄糖 的含量对发酵产物的产率影响较大，牛肉膏含量其次。通过直接 分析，发酵培养基中碳源和氦源的优化配方为a ，b ：。 ，o 根据上述实验结果得到优化后的培养基为葡萄糖m m ，牛肉 膏飘n a 2 s 0 4 1 0 ，k 2 h p 0 4 1 0 ，m g s 0 4 0 ，2 ，起始p h 7 ，3 0 c 下 摇瓶培养2 4 h ，发酵产物浓度为0 1 3 3 m g m l 。 t j t l 川i 大学硕士学位论文 5 菌株的质粒提取及琼脂糖凝胶电泳 采用碱裂解法对g s 3 6 菌株细胞进行质粒提取，经过琼脂糖凝 胶电泳，检测到有质粒存在。如图1 7 所示。 2 图1 7g s 3 6 质粒琼脂糖凝胶电泳 1 g s 3 6 质粒d n a2 m a r k e r 12 图1 8g s 3 6 + 琼脂糖凝胶电泳 i g s 3 6 +2 m a r k e r 6 质粒消除的结果 采用变温- - s d s 法交替传代对菌体细胞进行质粒消除，将交替 传代后的适当稀释涂布再种子培养基平板上，待长出菌落后对其 进行质粒提取和检测，确定质粒消除突变子，命名为g s 3 6 + 。经 四川大学硕士学位论文 琼脂糖凝胶电泳发现，已经检测不到先前的质粒带，证明该菌质 粒已经被消除，结果如图1 8 所示。 7 酶活调节基因位置的初步确定 将g s 3 6 + 接种至发酵培养基中培养2 4 h ，测得产物浓度为 0 0 2 7 m g m l ，与未消除质粒前比较大幅度降低，延长培养时间至 4 8 h ，测得产物浓度为o 0 2 9 m g n - a 。初步推测调节酶活的基因位于 质粒上。图1 9 为质粒消除子发酵时间与产物浓度的关系。 0 培养时间( h ) 图1 9 质粒消除子发酵时间与产物浓度的关系 8 胞内胞外产物含量的比较 g s 3 6 菌株经活化接种至发酵培养基培养2 4 h ，将发酵液与菌 体分离，菌体经超声波破碎，离心取清液，纯化后测产物浓度为 0 0 1 2 m g m l ，发酵液中浓度为o 1 1 0 m g m l ，两者之比为l ：9 。胞 外产物含量明显大于胞内，推测细胞合成产物后将其分泌到细胞 外。 5 3 5 2 5 1 5 o 窨叭加 0 0 o o _嚣一趟爱s址 四川大学硕士学位论文 讨论 1 筛选方法的建立 在与糖胺聚糖类物质相关的微生物研究中，主要集中在糖胺 聚糖裂解酶产生菌的筛选上，而对于能够合成糖胺聚糖的微生物 的研究鲜有报道( 除透明质酸外) 。在透明质酸产生菌的筛选大多 采用观察菌落形态，测量其粘度，然后扩大培养，提纯产物的方 法。因微生物种类繁多，其代谢产物复杂，在前期筛选的准确度 不高，后期扩大培养的重复次数多，工作量较大。 糖胺聚糖为大分子聚阴离子，带有负电荷，可与季铵盐类，如氯 化十六烷基吡啶( c c t y l p y r i d i n i u mc h l o r i d e ，c p c ) 在一定p h 值 和浓度范围内反应生成白色混浊【4 “。利用这种性质，本文建立了 新的筛选方法。将分离到的单菌落接种至试管中培养后，加入蒸 馏水振荡，使菌体胞外代谢产物溶解在水中，再离心取上清液， 滴入装有c p c 溶液的试管，观察是否有白色混浊产生，进行初筛。 再将能产生白色混浊的菌种的上清液进行琼脂糖凝胶电泳，与标 准品对照，具有甲苯胺蓝染色反应，且在电场作用下向阳极泳动 的，即为目标菌种。 本文建立的这种筛选方法在前期筛选具有较高的准确度，且 操作简单，减少了后期扩大培养的工作量。加上对产物的鉴定后， 不仅可以作为透明质酸产生菌的筛选方法，也可作为除透明质酸 外硫酸软骨素、肝素等糖胺聚糖这一大类物质产生菌的筛选方法。 2 标准曲线的制作及产物含量的测定 硫酸软骨素的含量测定有多种方法，其中我国卫生部药品标 准【4 2 】所才用的使乙酰丙酮一对二甲氨基苯甲醛法。其原理是硫酸 软骨素先用酸水解成氨基己糖，然后在碱性条件下与乙酰丙酮反 应，生成色原物质，与对二甲氨基苯甲醛的乙醇溶液反应产生红 色，以盐酸氨基葡萄糖为标准对照品，于5 2 5 n m 处用分光光度法 测定。此种方法操作复杂，要求较高，酸水解不完全或样品中存 四j i i 大学醺士学位论空 在杂质都会对结果产生很大的影响。根据文献 4 3 ，4 4 ，本文采用天 青a 法，该法操作简单，相对误差较小，可快速测定样品浓度。 3 产物的提纯一乙醇沉淀法 乙醇沉淀法是制备糖胺聚糖中煨常用的一种操作，既可以从 溶液中定量回收糖胺聚糖，也可用于不同糖胺聚糖组分的分级分 离。为了使糖胺聚糖完全沉淀，需有足够浓度的盐，即应有足够 的离子浓度。若糖胺聚糖水溶液中无盐或少盐，虽加入乙醇，仍 可保持澄明而不发生沉淀，这种现象会发生在用乙醇反复进行沉 淀( 即将沉淀用水溶解再用乙醇沉淀) 致使盐浓度降低时。此时加入 醋酸钠、醋酸钾或醋酸铵，多糖立即沉淀。盐的最终浓度小于5 即足够。大量制备时，盐的浓度还可低一些。醋酸盐在乙醇中 有较高的溶解度，在使用过量乙醇时，也不至于杂有过量的沉淀( 氯 化钠则有沉淀的可能) 。 4 关于质粒消除 日前质粒消除法大体采用( 1 ) s d s 化学消除法：该法与s d s 浓度有密切关系。若s d s 浓度太高，会抑制细菌生长；浓度太低， 质粒消除不理想。最适的s d s 浓度为o 0 1 5 1 2 6 1 。( 2 ) 高温消除法： 4 3 ( 2 培养法，单用此法消除率极低。( 3 ) 溴化乙锭法“：溴化乙 锭有致癌作用，一般不采用。本文采取s d s 化学消除法与高温法 交替传代的方法，先加入s d s 于正常温度下培养，再转入不含s d s 的培养基于高温下培养，这样重复交替传代，同时达到细菌的较 好生长和较佳的质粒消除效果。 5 质粒消除子 经过质粒消除后得到的g s 3 6 + 接种至发酵培养基培养后，仍能 测的有产物存在，推测合成酶基因不在质粒上：但产物浓度大幅 度降低，延长培养时间后，产物浓度基本不变，推测调节合成酶 四川i 大学硕士学位论文 活的基因存在于质粒上。 6 糖胺聚糖合成酶 本文只探讨了糖胺聚糖产生菌的筛选和发酵条件优化，对菌体 中合成酶的基因位置及其酶学性质是下一步的研究方向。 l ! q 川大学硕l 学位论文 小结 1 本文利用糖胺聚耱可与氯化十六烷基毗啶反应生成白色混浊的 性质建立了新的筛选方法。将分离到的单菌落接种至试管中 培养后，加入蒸馏水振荡，离心取上清液，滴入装有c p c 溶液 的试管，观察是否有白色混浊产生，进行初筛。蒋将能产生白 色混浊的菌种的上清液进行琼脂糖凝胶电泳，与标准品对照进 行复筛。该筛选方法在前期筛选其有较高的准确度，且操作简