（生物化学与分子生物学专业论文）新基因th1的功能研究.pdf

复且大学2 0 0 6 届博上学位论文 新基因t h l 的功能研究 摘要 人t r i h y d r o p b o b i n1 ( 册，) 基因是果蝇d r o s o p h i l at i l l 基因的周源物，是 d t b o n t h r o n 等人在2 0 0 0 年通过定位克隆方法得到的一个新基因。序列分析 表明，该基因序列从d r o s o p h i l a 果蝇到人之间高度保守，其位于染色体2 0 q 1 3 上，转录产物为2 4 k b ，蛋白产物分子量约为6 5 8 k d 。n o t h e r n 检测表明其在组 织分布广泛，在心肌和骨骼肌，肾脏，肾上腺，甲状腺里高表达。尽管其进化上 高度保守，目前对于其功能研究还是片空白。 我们实验室首先报导了新基因t h l 编码产物，t r i h y d r o p h o b i n l 蛋白，无论在 体外和体内都能够特异的与r a f 激酶家族中的a - r a f 激酶结合，而非b r a f 或 c - r a f 为进一步研究其可能具有的生物学功能，我们构建了一系列t h i 的缺失突 变体，通过酵母系统和g s t p u l l d o w n 实验证实了t h l 蛋白n 端卜3 7 2 氨基酸组成的 区域对于这种结合是至关重要的。在h e k 2 9 3 和s m m c - 7 7 2 1 肝癌细胞中，无论在静 息状态还是当a r a f 受到血清刺激或癌基因r a s 和s r c 激活后都表现为与t h i 蛋白 的结合并且这种结合随着a - r a f 激酶活性的增强而增强。这些现象促使我们进一 步研究t i l l 与a - r a f 的结合究竟会对a r a f 的激酶活性产生什么影响。我们发现在 上述细胞系中过表达t h i 后，a - r a f 的激酶活性明显下降，并有明显的剂量依赖关 系：而b r a t 和c r a f 激酶活性并不受影响。通过构建稳定表达t h i 的细胞株，经 过流式细胞仪检测后，我们发现过表达t h i 蛋白能够使细胞在g 0 6 1 期增多而s 期 细胞数明显减少，这与我们绘制细胞生长曲线的过程中观察到的细胞生长速度减 缓现象是一致的。有趣的是我们还发现t h i 蛋白也同样受到h - r a f 激酶地调控，表 现为其可以被具有激酶活性的a r a f 磷酸化，这提示t h i 可能是一种新的a r a f 激 酶底物分子，但是a - r a f 作用于t h l 分子中的具体位点还有待于进一步的确定。 在接下来的研究中，我们发现t h i 还可以与h - r a f m e k l e r k l 通路中的其他的 组分比如m e k i 和e r k l 分别能够结合，这提示t h i 可能作为构架蛋白的可能性。我 们发现，t h i 能够和a - r a f ，m e k i ，e r k l 形成多元复合物，并能够分别与这些蛋白 直接结合。在体外重组蛋白结合实验中，可以发现t i l l 能够干扰a - r a f m e k i 以及 m e k l e r k l 间的相互作用，起到了分离阻隔上游激酶和下游底物之h j 的作用。同 样的结果在体内结合实验中也得到了证实。有趣的是，t h i 对于此通路激酶级联 反应的调控主要作用于a - r a f m e k l 这个层次，它能够显著的抑制a r a f 激酶的活 性，而对于下游的m e k l 和e r k i 的激酶活性并无明显影响。这表明在调控e r km a p k 复q 大学2 0 0 6 届博士学位论文 这条通路的过程中，它是高度特异性的一个调节分子。对于e l k - 1 报告基因的荧 光素酶测活实验中，我们发现t h l 的过表达确实能够显著的抑制e r km a p k 通路的 激活，这与我们以前的发现细胞周期的阻滞，生长曲线实验中观察出来的结果是 一致的，表明t h l 是e r km a p k 信号通路的一个新的特异的抑制调节蛋白。 为了进一步丰富对于新基因t h l 的认识，在运用酵母双杂交系统筛选人胎脑 e d n a 文库寻找t h i 新的结合蛋白的过程中，我们发现了e 6 a p ( u b e 3 a ) 和n p 2 2 0 这两 种新的作用蛋白，并在体内免疫共沉淀实验中证实了与e 6 a p 的相互作用。e 6 a p 在 依赖泛素的蛋白酶体降解通路中作为一种泛素一蛋白连接酶( e 3 ) 而发挥作用。 我们发现t h l 蛋白能够受到e 6 a p 参与的泛素化降解调控。 本课题研究t h l 蛋白与a - r a f 间的相互调控关系；研究t h l 与m e k l 及e r k l 等多 者间的作用模式，阐明了t h l 作用于该信号通路的机制；研究e 6 a p 与t h l 间的关系， 以探索t h l 与依赖泛素的蛋白酶体降解通路的问的关系。 关键词：t r i h y d r o p h o b i n1 ( t h l ) ，a - r a f ，构架蛋白，m a p k ，酵母双杂交 系统，e 6 a p ( u b e 3 a ) 2 复旦大学2 0 0 6 届博 学位论文 s t u d i e so nt h ef u n c t i o n so f 缀， a b s t r a c t t h eh u m a nt r i h y d r o p h o b i n1 ( t i l l ) g e n ei st h eh o m o l o go fd r o s o p h i l a t h i ，w h i c hw a so r i g i n a l l yi d e n t i f i e dd u r i n gt h ep o s i t i o n a lc l o n i n go f m e i 一4 i t h e 硼lg e n e1i e sa d j a c e n tt om e i - 4 1a n dw a sc h a r a c t e r i z e df u r t h e r b yt h ed t b o n t h r o ng r o u pi n2 0 0 0 ，a c c o r d i n gt ot h e i rs t u d i e s ，t h e 确1 g e n ew a sh i g h l yc o n s e r v e df r o md r o s o p h i l at oh u m a nb ys e q u e n c ec o m p a r i s o n t h eh u m a nt h lg e n ew a sl o c a t e di nc h r o m o s o m e2 0 q 1 3 w h i c hh a dat r a n s c r i p t p r o d u c to f2 4k b m u l t i p l et i s s u e sd e t e c t e db yn o r t h e r nb l o t ss h o w e dt h a t 删w a sw i d e l ye x p r e s s e d t h eh u m a nt h lp r o t e i nh a sb e e np r e d i c t e dh a v i n g am o l e c u l a rm a s so f6 5 8k d aa n dd i s p l a y sh i g hl e v e l so fe x p r e s s i o ni n c a r d i a ca n ds k e l e t a lm u s c l e ，k i d n e y ，a d r e n a l ，a n dt h y r o i d a l t h o u g h u b i q u i t o u s l ye x p r e s s e d ，i t sf u n c t i o ni sn o tc l e a ra tp r e s e n t o u rp r e v i o u sw o r ki n d i c a t e dt h a ti n s t e a do fb i n d i n gt ob - r a fo rc - r a f ， t h l ( t r i h y d r o p h o b i n1 ) s p e c i f i c a l l yb i n d st oa - r a fk i n a s eb o t hi nv i t r o a n di nv i v o i nt h i sw o r k ，w ei n v e s t i g a t e di t sf u n c t i o nf u r t h e r u s i n g c o n f o c a lm i c r o s c o p y ，w ef o u n dt h a tt h ic o l o c a l i z e sw i t ha r a f ，w h i c h c o n f i r m so u rf o r m e rr e s u l t s t h er e g i o no ft h ir e s p o n s i b l ef o r t h e i n t e r a c t i o nw i t h a - r a fi s m a p p e d t oa m i n oa c i d s l 一3 7 2 c o i m m u n o p r e c i p i t a t i o ne x p e r i m e n t sd e m o n s t r a t et h a tt h i i sa s s o c i a t e d w i t ha - r a fi nb o t hq u i e s c e n ta n ds e r u m - s t i m u l a t e dc e l l s w i l dt y p ea - r a f b i n d si n c r e a s i n g l yt ot h lw h e ni ti sa c t i v a t e db ys e r u ma n d o ru p s t r e a m o n c o g e n i cr a s s r cc o m p a r e dw i t ht h a to f “k i n a s e d e a d ”a r a f t h el a t t e r c a ns t i l lb i n dt ot h lu n d e rt h es a m ee x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n t h eb i n d i n g p a t t e r no fa r a fi m p l i e st h a tt h i si n t e r a c t i o ni sm e d i a t e di np a r tb yt h e a - r a fk i n a s ea c t i v i t y a si n d i c a t e db yr a fp r o t e i nk i n a s ea s s a y s ，t h i i n h i b i t sa r a fk i n a s e w h e r e a sn e i t h e rb - r a fn o rc r a fk i n a s ea c t i v i t y i si n f l u e n c e d f u r t h e r m o r e ，w eo b s e r v e dt h a tt h li n h i b i t e dc e l lc y c l e p r o g r e s s i o ni nt h is t a b l yt r a n s f e c t e d7 7 2 1c e l l sc o m p a r e dw i t h m o c kc e l l s ， a n df l o wc e l lc y t o m e t r ya n a l y s i ss u g g e s t e dt h a tt h e t n is t a b l yt r a n s f e c t e d 7 7 2 1c e l i sw e r eg o g 1p h a s e a r r e s t e d t a k e nt o g e t h e r ，o u rd a t ap r e y i d e 3 复黾人学2 0 0 6 届博七学位论文 ac l u et ou n d e r s t a n d i n gt h ec e l l u l a rf u n c t i o n o ft i l lo nr a fi s o f o r m - s p e c i f i cr e g u l a t i o n i nf o l l o w i n gs t u d i e so nt h i ，w ef i n dt h a tt h lc o u l di n t e r a c tw i t ho t h e r c o m p o n e n t s ( m e k l ，e r k l ) i n v o l v e di ne r km a p kp a t h w a ya n dw ef u r t h e r i n v e s t i g a t e dt h em e c h a n i s mt h a tt h li n t e r f e r e dw i t ht h ea c t i v a t i o no fe r k p a t h w a y t h ic a nf o r mt e r n a r yc o m p l e x e sw i t ha r a f ，m e k ia n de r k t h i i n t e r f e r e sw i t ha r a f m e k li n t e r a c t i o n ，b e h a v i n ga sac o m p e t i t i v e i n h i b i t o ro fm e k lp h o s p h o r y l a t i o n f r o mo u ro b s e r v a t i o n ，t h ii t s e l fc a n b ep h o s p h o r y l a t e db ya r a fk i n a s e ，t h u si ts e e m st ob ean e ws u b s t r a t e o fa r a fk i n a s e i n t e r e s t i n g l y ，t h ic a ni n t e r f e r ew i t ht h ei n t e r a c t i o n b e t w e e nm e k la n de r k l ，e i t h e r ，i th a sn o te f f e c to np h o s p h o r y l a t i o no f e r k ib ym e k i k i n a s ea n do ne r k l sk i n a s ea b i l i t y t h lo v e r e x p r e s s i o n c o u l di n h i b i tt h ed o w n s t r e a mt r a n s c r i p t i o n a lf a c t o re l k 一1a c t i v t i y ，w h i c h i n d i c a t e db yr e p o r t e r g e n el u c i f e r a s ea s s a y i nt h i s s t u d y ，w e i d e n t i f i e dt h ia san e ws c a f f o l d i n gp r o t e i ni nt h ee r km a p kp a t h w a y i no r d e rt os e a r c h i n gf o rp o t e n t i a li n t e r a c t i o np a r t n e ro ft h l ，w eu s e d t h ey e a s tt w o h y b r i ds y s t e mt os c r e e nh u m a nf e t a lb r a i nc d n a1 i b r a r y ，a n d f o u n dt w oc a n d i d a t e sp r o t e i n s ：e 6 一a s s o c i a t e d p r o t e i n ( e 6 a p u b e 3 a ) ， n u c l e a rp r o t e i n2 2 0 ( n p 2 2 0 ) i n t e r a c t i o nb e t w e e nt h la n de 6 h pw e r ep r o v e d b yc o i n m u n o p r e c i p i t a t i o na s s a y s e 6 a pf u n c t i o n sa sau b i q u i t i n p r o t e i n 1 i g a s e ( e 3 ) i nu b i q u i t i n - d e p e n d e n dp r o t e o l y t i cp a t h w a ya n dw ef o u n dt h a t t h ii sf ln e wt a r g e tp r o t e i nf o rd e g r a d a t i o nb ye 6 a p t h i sp r o b a b l yp r o v i d e s u san e wc l u ei nu n d e r s t a n d i n gt h l sf u n c t i o na n ds t u d yo nt h em e c h a n i s m t h a tt h i p a t i c i p a t e si nr a f , m e k e r ks i g n a l i n gp a t h w a yn e e d t ob e f u r t h e r e d k e yw o r d s ：t r i h y d r o p h o b i n1 ( t h l ) ， a r a f ，s c a f f o l d ， y e a s tt w o h y b r i ds y s t e m ，e 6 - a s s o c i a t e dp r o t e i n ( e 6 a p u b e 3 a ) a b b r e v i a t i o n s ： m a pk i n a s e ：t h i ：t r i h y d r o p h o b i n1 ：m i t o g e na c t i r a t e dp r o t e i nk i n a s e ：m k k k ： m i t o g e na c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s ek i n a s ek i n a s e ：m k k ：m i t o g e na c t i v a t e d p r o t e i nk i n a s ek i n a s e ：e r k ：e x t r a c e l l u a l rs i g n a l r e l a t e dk i n a s e ：m e k ： 4 复旦大学2 0 0 6 届博士学位论文 e r k ( e x t r a c e l l u l a rr e g u l a t e dk i n a s e )a c t i v a t o rk i n a s e ： j n k ：j u n a m i n o t e r m i a n lk i n a s e ；b d ：d n ab i n d i n gd o m a i n ：a d ：a c t i v a t i o nd o m a i n ：u a s ： u p s t r e a m a c t i v a t i o ns e q u e n c e ：j a s p l ，州k s t r e s s e da c t i v a t e d p r o t e i n k i n a s e ：m p i ：m e k p a r t n e r 1 ： r k i p ：r a fk i n a s e i n h i b i t o r p r o t e i n ：e g f ：e p i t h e l i a lg r o w t hf a c t o r ：s d s p a g e ，s d s ( s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e p o l y a c r y l a m i d ee l e c t r o p h o r e s i s ：i p t g ：i s o p r o p y l b d t h i o g a l a c t o s i d e ：p b s ：p h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n e ： 5 复目大学2 0 0 6 届博士学位论文 第一章t h l 与 - r a f 相互调控关系的研究 前言 人t r i h y d r o p h o b i n1 ( 删基因是果蝇d r o s o p h i l at h l 基因的同源物，是 d t b o n t h r o n 小组在2 0 0 0 年通过定位克隆方法得到的一个新基因。序列分析 表明，该基因序列从d r o s o p h i l a 果蝇到人之间高度保守，其位于染色体2 0 q 1 3 上，转录产物为2 4 k b ，蛋白产物分子量约为6 5 8 k d 。n o t h e r n 检测表明其在组 织分布广泛，在心肌和骨骼肌，肾脏，肾上腺，甲状腺里高表达“1 。目前对于其 功能知之甚少。我们实验室首先报道了在哺乳动物中，t i l l 是 r a s r a f m e k m a p k ( e r k s ) 信号传导通路r a f 激酶家族中a - r a f 激酶的新的作用蛋 白“，但其具体功能仍不明了。 哺乳动物m a p k ( m i t o g e na c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e ) 信号传导通路在细胞 对各种各样的刺激应答后一系列生化事件中发挥了重要作用，包括调节细胞的增 殖，分化，凋亡和存活。1 。它存在于所有真核生物，基本组成是一个三级激酶级 联反应，包括m k k k s ( m i t o g e na c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s ek i n a s ek i n a s e s ) ， m k k s ( m i t o g e na c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s ek i n a s e s ) ，和m a p k s 。这一信号传 导系统的组成不仅具有信号放大的作用，更重要的是为精确调节信号传递的强度 和持续时间提供了平台。哺乳动物中m a p k s 可分为四类：e x t r a c e l l u a l r s i g n a l - r e l a t e dk i n a s e ( e r k l 2 ) ，j u na m i n o - t e r m i a n lk i n a s e ( j n k i 2 3 ) ， p 3 8p r o t e i n s ( p 3 8 a 6 y 6 ) 及e r k 5 岬1 。r a s r a f m e k e r k 通路是其中最基 本、研究最多的信号通路 已经知道，r a f 激酶家族位于这条通路的中间，是一类重要的胞质内丝苏 氨酸激酶，它们能被上游信号分子活化，继而激活下游效应蛋白，在信号转导过 程中发挥了重要作用。1 。r a f 激酶家族有三个成员：a - r a f 、b - r a f 、c - r a f 从酵 母到人类都很保守“1 ，目前关于它们的各自独特的功能还不十分了解。三者中相 对于b - r a f 和c r a f 来说，对a - r a f 的研究和了解是最少的。在对细胞外信号 应答的过程中，它们活性受到不同的调节，除了共同的上游激活蛋白激酶( 小g 蛋白r a s ，r h o 家族) o ”1 和共同的作用底物( m e k l 2 ) “。”1 外，都可以和1 4 - 3 3 蛋白“4 “”1 作用保持各自构象稳定和激活状态。生物和生化学上的研究表明各个 成员的功能有所重叠，但并不是冗余的。有报道证明，r a f 激酶家族各成员在体 内各种组织的分布也有其特异性n o r t h e r n 表明c r a f 转录体几乎在体内各组 织中都有较高水平的表达，而b - r a f 在神经系统及睾丸中表达最高；a - r a f 主要 6 复q 大学2 0 0 6 届博- l 学位论文 特异分布在泌尿生殖系统和肾脏组织，w e s t e r n 检测显示a - r a f 蛋白的分子量为 6 8 k d a ，是三个家族成员中最小的“”。c r a f 蛋白的分子量为7 4k d a ，而b r a f 转录体可以通过不同的剪切形式可形成分子量从6 7k d a 到9 9k d a 的至少l o 种 异构蛋白“”。在不同的组织中，这些异构体的表达各不相同，可能分别参与了某 些特定的信号传导过程。另外，对c - r a f 的大量研究表明，单单只有r a s 与c r a f 的结合不足以最大程度的激活c r a f “”要达到最大程度的激活，还必须要有第 二信号的刺激一往往需要酪氨酸激酶实现对c - r a f 上酪氨酸位点的磷酸化“。 a - r a f 同c - r a f 一样，相对与r a s 微弱的激活a - r a f ，癌基因s r c 能够强烈的激活 a r a f , 并且r a s 和s r c 协同刺激后，a - r a f 活性达到了最大。“1 而b - r a f 则不需 要s r c 的帮助恤1 ，除了需要r a s 外，在p c i 2 细胞中需要其他的小g 蛋白如r a p l 的协同刺激o ”：在n i h 3 t 3 细胞中则需要t c 2 1 的帮助来使之达到最大程度的激活 2 4 o 近来，研究表明只有温和的r a f 活性对于细胞越过g 1 期和细胞增殖是必须 的，强烈的激活r a f 激酶则导致凋亡嘲。总之，这些从侧面反应了它们之间功能 相对具有特异性的方面。 我们以前的工作证实了t h i 是a - r a f 的新的作用蛋白。令我们吃惊的是，通 过同源性分析，t h l 蛋白似乎不具有激酶结构域，我们推断其有可能类似m p i 蛋 白嘲发挥了构架蛋白的作用。由于细胞生命过程中的调节的特异性部分可以通过 一些无激酶活性的蛋白如构架蛋白，连接蛋白或锚定蛋白连接不同的特异性信号 分子来达到选择性的激活，分离或者引导信号复合物定位的目的删。基于这种 认识，结合现在已知t h i 能够和a r a f 结合，我们试图深入研究t h l 对于a r a f 究竟有何影响? 其如何对a r a f 进行调控以及其可能具有的蛋白特性这部分主 要分析了t h l 结合a - r a f 的区域，研究了这种作用对于a - r a f 激酶活性的影响以 及对于下游e r k 激酶通路的影响，这些有助于对r a f 激酶家族的认识及调控细胞 增殖方面的理解。 材料与方法 ( 一) 材料和试剂： 1 质粒、菌种和细胞株质粒p c d n a 3 和p c d n a 3 卜m y c h i s ( 一) 为i n v i t r o g e n 产品。质粒p e g f p _ nv e c t o r 系列及p d s r e d l - c 1 购自于b db i o s c i e n c e sc l o n t e c h 公司。p c d n a 3 o - g s t 、p c d n a 3 o - g s t c y c l i nd 1 、p c d n a 3 o - g s t c y c l i nd 2 、 p c d n a 3 o - g s t c y c l i nd 3 、p d s r e d c y c l i nd 3 和p c m v e r k l 为本实验室原有质粒。 p a t h o e t e c t 固e l k lt r a n s r e p o r t i n gs y s t e m 相关质粒p f r - l u c ，p f h 2 一e l k l 等购 自s t r a t a g e n e 公司。ec o l i d h 5a 、t o p l o 为本中心保存。s 删c 7 7 2 l 细胞株，c o s l 细胞株购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所。 7 复旦大学2 0 0 6 届博上学位论文 2 其它试剂耗材网织红细胞体外翻译试剂盒( t n rc o u p l e d r e t i c u l o c y t e l y s a t es y s t e m ) ，w i z a r dp l u sm i n i p r e p sd n ap u r i f i c a t i o ns y s t e m 购自于 p r o m e g a 公司。g l u t a t h i o n es e p h a r o s eb e a d s ，e n h a n c e dc h e m i l u m i n e s c e n c e ( e c l ) a s s a yk i t ，笃- m e t h i o n i n e 。a n t i - m o u s e h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( h r p ) s e c o n d a n t i b o d y 及a n t i r a b b i t h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ( h r p ) s e c o n da n t i b o d y 购自 于a m e r s h a m 。p r o t e i n ga g a r o s e 购自于r o c h ec o m p a n y 。a n t i c m y cm o n o c l o n a l a n t i b o d y 及觚k l 蛋白购自于i n v i t r o g e n ，n o r m a lm o u s ei g g 、a n t i a - r a f a n t i b o d y 购自于s a n t ac r u zb i o t e c h n o l o g y ，y 一3 2 p - a t p 购自北京亚辉生物技术公 司。0 n p g ( o n i t r o p h e n y lb d - g a l a c t o p y r a n o s i d e ) 购自于s i g m a 公司。p e g f p n v e c t o rs e t 及p d s r e d l - - c 1 购自于c l o n t e c h 公司。p b l u e s c r i p ti is r 购自于 s t r a t a g e n e 公司。p c d n a 3 1 m y c h i s ( 一) 购自于i n v i t r o g e n 。t a k a r am u t a n b e s t k i t 购自于宝生物工程有限公司。 限制性内切酶、r p m i 一1 6 4 0 培养基、小牛血清、g 4 1 8 、l i p o f e c t a m i n e ”r e a g e n t 、 t r i z o l 为g i b c o 产品。t 4d n a 连接酶购自b o e h r i n g e r 公司。质粒抽提试剂盒、 胶回收试剂盒购自q u i a g e n 公司。p m s f 购自s i g m a 公司。n y l o n 膜( n + ) ，a - 3 2 p - a t p 购自a m e r s h a m 公司。随机引物探针标记试剂盒购自p r o m e g a 公司。焦磷酸二乙 酯( d e p c ) 、b 一巯基乙醇为f l u k a 产品。十二烷基肌氨酸钠( s l s ) ，十二烷基 磺酸钠( s o s ) 为a m e s c o 产品。x 光胶片为柯达公司生产。其余试剂均为进口分 装或国产分析纯。s b c 一7 7 2 1 细胞购自于中科院上海细胞所。 3 s s - m e t h i o n i n e 购自a m e r s h a m 公司。d u a l l u c i f e r a s e 西r e p o r t e ra s s a y s y s t e m 购自p r o m e g a 公司。r p m i 一1 6 4 0 培养基，小牛血清，l i p o f e c t a m i n e “ r e a g e n t 为i n v i t r o g e n 产品。梭华s o f a s t 转染试剂购自厦门太阳马公司。e c l 增强 发光试剂盒为上海普飞公司产品；x 光胶片为柯达公司生产。十二烷基磺酸钠 ( s d s ) 等其它试剂均为进口分装或国产分析纯。 ( 二) 仪器 1 p c r 仪：购自p e r k i ne l m e r 公司和f e r o t e c 公司。 2 荧光显微镜：n i k o n 公司；z e i s sl s m5 1 0 倒置单光子激光共聚焦显微镜( 中 科院神经所) 。 3 d n a 电泳槽购自于华美公司。离心机购自e p p e n d o r f 公司、b e c k m a n 公司。 4 细胞培养箱为f o r m as c i e n t i f i c 公司产品。 5 蛋白电泳和转印装置分别为b i o r a d 公司的m i n i p r o t e a n 电泳槽、小型 t r a n s b l o t 转印槽。 复旦人学2 0 0 6 届博l 学位论文 6 凝胶成像装置：上海复日公司。 7 l u c i f e r a s e 活性测定仪：b e r t h o l d 公司。 8 f l a 一5 1 0 0 磷屏检测系统：购自f u j i f i l m 公司。 ( 三) 引物 模板t h lf u ll e n g t h ( f l ) 由实验室已有质粒得到。 t h if 1 ( 1 - 4 5 2 a a ) ( e c o r i + n o t i ) s e n s e ：5 一g t c g 从t t c a t g g a c g a g g a c t a c t a c g - 3 a n t i s e n s e ：5 一t t t g c g g c c g c t t a g c a g g t g c t g a t c t c a t 一3 t h lf 2 ( 1 - 3 7 2 a a ) ( e c o r i + n o t i ) s e n s e ：5 - g t c g a a t t c a t g g a c g a g g a c t a c t a c l 卜3 a n t i s e n s e ：5 一a t t g c g g c c g c t t a a t c t t t a t t g a t g c t c 一3 t h lf 3 ( 1 - 1 9 2 a a ) ( e c o r i + n o t i ) s e n s e ：5 - g t c g a a t t c a t g g a c g a g g a c t a c t a c g 一3 a n t i s e n s e ：5 - t t t g c g g c c g c t t a g a a c a c t t c t a g c t g c t g - 3 t h lf 4 ( 1 - 1 7 0 a a ) ( e c o r i + x h o i ) s e n s e ：5 一g t c g a a t t c a t g g a c g a g g a c t a c t a c g - 3 a n t i s e n s e ：5 - t g c c t c g a g a a t a a g c c t 从c g g t g 从一3 t h if 5 ( 1 6 4 4 5 2 a a ) ( e c o r l + n o t l ) s e n s e ：5 一t g g 从t t c a t g t t c a c c g t t a t g c t t a t t t 一3 a n t i s e n s e ：5 一t t t g c g g c c g c t t a g c a g g t g c t g a t c t c a t 一3 t h lf 6 ( 1 7 1 5 8 2 a a ) ( e c o r i + n o t i ) s e n s e ：5 - t 从g g a a t t c t c t g a c g c a g g g t a c c a g g g - 3 a n t i s e n s e ：5 一g a t g c g g c c g c t t a g t t c a c c a t g a t g - 3 t h if 7 ( 4 5 2 5 8 2 a a ) ( e c o r i + n o t i ) s e n s e ：5 - a g a g a a t t c c a c c a g c t c c t g c a c c 一3 a n t i s e n s e ：5 一g a t g c g g c c g c t t a g t t c a c c a t g a t g - 3 引物由上海生工生物技术有限公司合成。 ( 四) 实验方法 9 复旦人学2 0 0 6 届博七学位论文 一、多聚酶链反应( p c r ) 扩增目的e d n a 片断： t h l 的缺失突变体由p c r 反应获得。模板如下：p c d n a 3 卜m y c - t h l ( 如以前论文 所述) p c r 反应体系： 模板 l o x b u f f e r 上游引物( 0 3 3 9 9 p 1 ) 下游引物( 0 3 3 p g p 1 ) d n t p ( 1 0 x ) h 2 0 t a q 酶 5 0 d 用于构建t h l 系列突变体的p c r 循环条件为9 4 0 c3 0 s e c ，6 0 。cl m i n ，7 2 。c1 5 m i n ，共3 0 个循环，最后7 2 。c 延伸1 0m i n 。 二、载体质粒的构建 将p c r 产物t h l 分别通过e c o ri + x h oi 或者e c o ri + n o t i 酶切位点插入到 l e x a 蛋白d n a 结合结构域d n a 的3 端e c o ri 和x h oi 或n o t i 酶切位点，构成 l e x a - t h l 融合蛋白表达载体。 1 、分别将t h lp c r 产物和p l e x a 空载体用限制性内切酶酶切。2 0 微升酶反应体 积，3 7 c 消化2 h ，并进行d n a 琼脂糖电泳。 2 0 “l 反应体系如下： d n a ( 0 2 - 2 p g 1 1 )7 o p l l o x 酶切缓冲液2 0 1 限制性内切酶( 1 0 2 0 u p 1 )1 o l d d h 2 0 1 0 0 l l l 2 、用q i a q u i c k g e le x t r a c tk i t ( q i a g e n 公司生产) 回收d n a 片段t h l 和p l e x a 。 割下含目的片段的琼脂糖凝胶块，放入1 5 m le p p e n d o r f 管中。按照每l o o m g 琼脂糖加入3 0 0 p 1 s 1 液的比例加入s 1 液，5 5 。c 水浴1 0 分钟，使琼脂糖完全溶 解，每隔2 分钟颠倒混匀一次。再加入1 3 体积的异丙醇，混匀，5 5 。c 水浴1 分钟。将溶化的琼脂糖液移入吸附柱中，静置1 分钟，1 0 0 0 0 1 2 0 0 0 9 离心1 5 秒， 倒掉收集管中液体，将吸附柱放入同一收集管中。在吸附柱柱中加入4 5 0 p lw l 1 0 止 m 叫。叫叫此 3 l 复互人学2 0 0 6 届