（植物学专业论文）兰坪铅锌尾矿区共生固氮菌研究.pdf

y 18 0 7 6 1 8 u i i ii l l li ii i i l i l li i f i i i 声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含他人己经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得西南林学院或其它教育机构的学位或证书而使 用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的 说明并表示了谢意。 签名：盘日期：舭 关于论文使用授权的说明 本人同意：西南林学院有权保留论文的复印件，可以采用影印、缩印或其他复制 手段保存论文；提交论文一年后，允许论文被查阅和借阅，学校可以公布论文的全部 或部分内容。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 日期： 摘要：铅锌尾矿区属于土壤恶化、重金属严重污染的环境。尾矿区土壤的治理和生态 恢复一直是关注的热点和重点。本文调查研究了兰坪铅锌矿地区土壤重金属含量和自 然发生的植物类群；调查采集了尾矿区的自然发生的豆科植物：对根瘤菌进行了分离 培养，建立了兰坪铅锌矿地区的根瘤菌的菌库：从根瘤菌生理生化测定和遗传多样性 的分析，初步研究了铅锌矿地区根瘤菌的适应性。本文为研究兰坪铅锌矿地区根瘤菌 及其共生关系提供了基础数据，为兰坪铅锌矿地区土壤改良和生态恢复提供科学依 据。 对兰坪铅锌尾矿土的重金属含量的测定结果表明，土壤不但含有较高的铅锌，还 含有其他重金属，尾矿区土壤重金属污染较严重。 对兰坪铅锌尾矿区自然发生的植物的种类调查结果表明，兰坪铅锌尾矿区自然发 生的植物的种类有豆科( l e g u m i n o s a e ) 、莎草科( c y p e r a c e a e ) 、忍冬科( c a p d f o l i c a e a e ) 、 马桑科( c o r i a r e a c e a e ) 、木贼科( e q u i s e t a c e a e ) 等4 6 个科。以豆科植物为优势植物类群， 其次为菊科植物类群和禾本科植物类群。在豆科植物中主要种类为野豇豆( 1 , q g n a v e x i l l a t a ( l i n n ) r i c h ) ，长波叶山蚂蝗( d e s m o d i u ms e q u a xw a l l ) 、三叶草( 矾加厅删 r e p e n sl ) ；菊科的主要种类为蒲公英( t a r a x a c u mm o n g o h u mh a n dm a z z ) 、飞机草 ( e u p a t o r i u mo d o r a t u ml ) 、千里光( s c e n e c i os c a n d e n sb u e l l h a m ) ，禾本科种类为大芦 苇( p h r a g m i t e sk a r k a ( r e t z ) t r i n e x s t e u d ) 对尾矿地的4 种植物( 豪猪束l j ( b e r b e r i sj u l i a n a es c h n e i d ) 、大芦苇( p h r a g m i t e s k a r k a ( r e t z ) t r m e x s t e u d ) 、木贼( h i p p o c h a e t ed e b i l i s ( r o x b e xv a u c h ) h o l u b ) 、莎草 ( c y p e r u sm i c r o i r i a ) 、) 重金属累积测定结果表明：采自尾矿区的这4 种植物的全铅和 全锌含量都远高于样地土壤中的铅锌含量。根据m c g r a h 等对超积累植物的定义做了 修订，其中大芦苇( p h r a g m i t e sk a r k a ( r e t z ) t r i n e x s t e u d ) 和莎草( c y p e r u sm i c r o i f i a 以被 称为超积累植物。 对2 5 株采自兰坪铅锌尾矿区的豆科植物的根瘤菌进行了分离，根据在y e m 培 养基的菌落特征和对菌株革兰氏染色初步判断所分离的2 5 株豆科植物的根瘤菌菌株 为1 6 2 株。 对初步判定为根瘤菌中的3 1 株进行糖类发酵、油脂水解、淀粉水解、明胶液化、 吲哚试验、甲基红实验、乙酰甲基甲醇实验等1 2 项生理生化指标的测定，用u p g m a 法以百分相似度为比例尺进行表型特征聚类分析，结果表明所有3 1 株细菌在2 0 的 相似水平上归属于1 个群，在8 4 的相似性水平上可将所有菌株归属到2 1 个群中， 可以看出3 1 株菌的相似度较小，根瘤菌的生理生化多样性较为丰富。根瘤菌在兰坪 铅锌尾矿区存在多种的生理类型。 对初步判定为根瘤菌的5 5 株进行r e p p c r 实验，根据r e p p c r 的结果，对其用 m v s p 软件处理，得到聚类图，表明这5 5 株菌株2 0 的相似水平上属于一个群；在 4 0 的相似水平上有7 大类群，在9 5 的相似水平上归属为5 5 个群，说明这5 5 株的 相似度很小，根瘤菌的多样性较为丰富。 根据形态观察建立了1 6 2 株原始的兰坪铅锌尾矿区自然生长豆科植物根瘤菌菌 库，根据生理生化指标建立了3 1 株根瘤菌的生理类型菌库，根据r e p p c r 遗传多样 性分析的结果建立5 5 株根瘤菌的菌库。 关键词：兰坪铅锌尾矿区，豆科植物，根瘤菌 a b s t r a c t ：s o i lw a sd e t e r i o r a t e da n dp o l l u t e db yh e a v ym e t a l si nl e a d z i n cm i n i n gt a i l i n g s t h es c i e n t i s t sa n de x p e r t sa l w a y sf o c u s e do ns o i lr e m e d i a t i o na n de c o l o g i c a lr e s t o r a t i o ni n l e a d z i n cm i n i n gt a i l i n g s i nt h i sp a p e r , t h ec o n t e n t so fh e a v ym e t a lw a sd e t e r m i n e da n d t h ep o p u l a t i o no fp l a n t sn a t u r a l l yo c c u r r i n gi nl a n p i n gl e a d - z i n cm i n i n gt a i l i n g sw a s i n v e s t i g a t e d ，a n dl e g u m i n o u sp l a n t sn a t u r a l l yo c c u r r i n gw a sp a y e dm o r ea t t e n t i o nt o t h e r h i z o b i aw e r ei s o l a t e df r o ml e g u m i n o u sp l a n t sn o d u l e sa n dc u l t u r e d ，t h er h i z o b i al i b r a r y w a se s t a b l i s h e d b a s e do nt h ep h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a la n dg e n e t i cp o l y m o r p h i s m ， t h er h i z o b i a a d a p t a b i l i t y i nl e a d z i n c m i n i n gt a i l i n g s e n v i r o n m e n tw a s s t u d y e d p r e l i m i n a r i l y t h i sp a p e rp r o v i d e dt h ef u n d a m e n t a ld a t a f o rs t u d yo nr h i z o b i aa n d s y m b i o t i cr e l a t i o n s h i p ，a n ds c i e n t i f i cb a s i sf o rs o i lr e m e d i a t i o na n de c o l o g i c a lr e s t o r a t i o ni n l e a d - z i n cm i n i n gt a i l i n g s t h es o i lo fm i n i n gt a i l i n g sw a sp o l l u t e db yl e a da n dz i n c ，嬲w e l la sb yo t h e rh e a v y m e t a l s b u ts o m ep l a n t sw e r ea b l et oo c c u rn a t u r a l l yi nl e a d - z i n cm i n i n gt a i l i n g st h a tt h e r e w e r e4 6f a m i l i e sp l a n t ss u c ha sc y p e r a c e a e ，c a p r i f o l i a c e a e ，c o r i a r e a c e a e ，e q u i s e t a c e a e t h ed o m i n a n tv e g e t a t i o np o p u l a t i o n sw e r el e g u m e s ，c o m p o s i t aa n dg r a s sf a m i l yp l a n t s t h e r ew e r e4s p e c i e sw i d e l yg r e wi nl e a d - z i n cm i n i n gr a i l i n g sw h i c hw e r eb e r b e r 括 j u l i a n a es c h n e i d ，p h r a g m i t e sk a r k a ( r e t z ) t i 证e xs t e u d ，h i p p o c h a e t ed e b i l i s ( r o x b e x v a u c h ) h o l u b a n dc y p e r u sm i e r o i r i a t h e i rc u m u l a t i v ec o n t e n to fl e a da n dz i n cw a s d e t e i m i n e d t h er e s u l ts h o w e dt h e yw e r ea b l et oc u m u l a t et h el e a da n dz i n c ，a n da c o o d i n g t om c g r a h st h e o r yo fh y p e r a c c u m u l a t o r , p h r a g m i t e sk a r k a ( r e t z ) t f i n e xs t e u d a n d c y p e r u sm i c r o i r i aw e r eh y p e r a c c u m u l a t o r r h i z o b i aw e r ei s o l a t e df r o mn o d u l e so f2 5l e g u m i n o u sp l a n t s ，a n dt h e yw e r ec o n f i r m e d a sr h i z o b i ab yc o l o n yc h a r a c t e r i s t i c si ny e mm e d i u ma n dg r a ms t a i n ，n l er h i z o b i al i b r a r y w a se s t a b l i s h e d a m o n g16 2r h i z o b i 砧31r h i z o b i aw e r ec a r d e do np h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a la s s a y i n c l u d e dc a r b o h y d r a t ef e r m e n t a t i o n ，o i la n ds t a r c hh y d r o l y s i s ，g e l a t i n el i q u e f a c t i o n ，i n d o l e t e s t ，m e t h y lr e dt e s t ，a c e t y l m e t h y l c a r b i n o le x p e r i m e n t t h ep h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a l i n d e x e sw e r ea n a l y s e db yu p g m am e t h o d t h er e s u l t ss h o w e dt h a ta l l31o fr h i z o b i aw e r e a s c r i b e dt ol g r o u pi nt h el e v e lo f2 0 s i m i l a r i t y , a l ls t r a i n sm a yb ev e s t e di nt h e2 1 g r o u p st h el e v e lo f8 4 s i m i l a r i t y 31r h i z o b i as t r a i n sm a n i f e s t e da b u n d a n tp h y s i o l o g i c a l a n db i o c h e m i c a ld i v e r s i t y r h i z o b i aa d a p t e dt ot h el e a d z i n cm i n et a i l i n gp o s s i b l yb y m u l t i p l ep h y s i o l o g i c a lt y p e s 5 5r h i z o b i as t r a i n sw e r ec a r d e do nr e p p c r a c c o r d i n gt ot h er e s u l t so fr e p p c r ， t h e r ew e r e5 5s t r a i n sb e l o n gt oo n eg r o u pi nt h el e v e lo f2 0 s i m i l a r i t ya n di nt h el e v e lo f 4 0 s i m i l a r i t yt h e yw e r ed i v i d e di n t o7g r o u p s t h er e p - p c rr e v e a l e dt h a tt h e r ew e r e a b u n d a n tg e n e t i cd i v e r s i t ye x i s ta m o n gr h i z o b i as t r a i n s ，r h i z o b i aa d a p t e dt ot h el e a d z i n c m i n et a i l i n gp o s s i b l yb yg e n e t i cd i v e r s i t y k e yw o r d s ：l a n p i n gl e a d - z i n ct m l i n g s ，l e g u m ef a m i l y , r h i z o b i u m 目录 11 者论1 1 1 兰坪铅锌矿概况1 1 2 铅锌尾矿概况1 1 3 兰坪铅锌尾矿概况3 1 4 国内外对尾矿的治理概况3 1 5 国内外固氮植物和非豆科植物在尾矿区生态恢复的研究6 1 5 1 豆科植物根瘤菌共生6 1 5 2 根瘤菌研究7 1 5 3 豆科植物根瘤菌的共生关系7 1 5 4 非豆科植物- f r a n k i a e 菌共生。8 1 5 5 固氮植物和非豆科植物在尾矿区生态恢复的研究9 1 5 6 r e p p c r 对原核生物遗传多样性的研究l o 1 6 研究的目的意义1 l 2 材料与方法1 2 2 1 实验仪器、试剂与材料1 2 2 1 1 主要实验仪器。1 2 2 1 2 主要实验试剂1 2 2 1 3 供试材料1 3 2 2 根瘤菌的分离纯化、保存，建立菌库1 5 2 2 1 根瘤菌的分离1 5 2 2 2 根瘤菌的纯化1 5 2 2 3 根瘤菌的保存。1 6 2 2 4 建立兰坪地区根瘤菌菌库1 6 2 3 根瘤菌的形态观察和生理生化指标的测定。1 6 2 3 1 革兰色染色。1 6 2 3 2 菌落形态观察和根瘤菌形态观察1 6 2 3 3 生理生化指标的测定1 7 2 4r c p p c r 鉴定根瘤菌1 7 2 4 1d n a 提取。l7 2 4 2d n a 浓度及纯度检测1 7 2 5r e p p c r 18 2 5 1 反应缓冲液配制18 2 5 2 反应体系18 2 5 3 预变性一l8 2 5 4p c r 反j 立1 8 2 5 5 电泳18 2 6 数据处理一1 9 3 结果与分析2 l 3 1 兰坪尾矿土壤的理化性质2l 3 2 自然发生的植物的种类。2 l 3 3 自然发生的豆科植物及结瘤情况2 6 3 4 植物对铅锌等的吸收2 8 3 5 根瘤菌菌库的建立2 9 3 5 1 根瘤菌的形态2 9 3 5 2 根瘤菌的生理生化指标测定3 l 3 6 用r e p p c r 分析根瘤菌菌库3 5 3 7 兰坪铅锌尾矿区自然生长的豆科植物根瘤菌的菌库建立3 9 4 分析与讨论4 0 4 1 兰坪锚锌尾矿区土壤铅、锌含量较高4 0 4 2 在自然发生在铅锌尾矿土壤中，苔藓、木贼和豆科植物为先锋植物4 0 4 3 根瘤菌以不同的生理类型适应铅锌尾矿土壤，与豆科植物建立共生固氮关系。4 l 4 4 根瘤菌丰富的遗传多样性适应铅锌等重金属的胁迫下的尾矿区土壤4 l 4 5 根瘤菌的菌库为铅锌尾矿土壤改良和生态恢复提供了科学的依据和根瘤菌资源4 l 参考文献4 3 致谢4 8 1 绪论 1 绪论 1 1 兰坪铅锌矿概况 兰坪，因其蕴藏极其丰富的矿产资源而闻名于世。全县共有1 8 0 多个矿床( 点) ， 除占优势的铅、锌、铜、银、盐、等矿产外，还有铁、汞、锡、云母、叶腊石、冰 洲石、水晶石等十多种矿产，并伴生或共生大量贵金属及稀有分散元素。目前，已 探明金属储量铅锌1 4 8 3 3 万吨，仅金顶风凰山铅锌矿储量就达1 4 3 9 万金属吨，其 中铅的储量约占世界已知储量的六分之一，锌约占三分之一，是全国最大的铅锌矿 床。除此以外，还有大量的矿藏资源密布于境内八个乡镇，不仅储量大，品位高， 而且埋藏浅，极易开采【1 1 。 矿区共生、伴生有镉、铊、天青石( 规模均为大型，储量位居中国前列) 及银、 硫、石膏等多种有用矿产。矿区有架崖山( 首采区) 、蜂子山、北厂、跑马坪等7 个 矿段。矿体分布集中在1 1 平方千米范围内，共含矿体1 2 9 个，多呈层状、似层状产 出，其中i 、1 1 2 、l 三个矿体，铅锌储量均在2 0 0 万吨以上，矿体长6 0 0 一1 4 5 0 米，延伸3 7 0 - - 8 0 0 米，平均厚2 7 3 1 - - 4 2 2 米，富矿比例大，铅锌合计品位达9 4 4 。矿石质量好，易采可选，邻区水电资源丰富，已列为西南铅锌工业基地【2 】。 1 2 铅锌尾矿概况 尾矿是矿石经粉碎和浮选精矿、中矿后余下的微粒状固体废弃物。目前我国矿山 排放的尾矿堆存量已达5 0 余亿吨，并且每年以2 _ 3 亿吨的速度增长，这些矿山固体 废物处置不当会给社会、经济、环境造成严重的危害【3 】。 尾矿的大量排放，占据大量的土地而且尾矿中含有大量可能污染环境的有害物 质。尾矿的堆置就使得大量良田不能利用，多金属硫化物矿山尾矿在氧化过程中将产 生大量的酸，并且可能释放出大量重金属元素，从而给周围环境带来严重污染【伯】，尾矿 堆存引发的突发性灾害。尾矿沉淀后，一般结构松散，含有大量的水，很不稳定，一 旦超库容，超龄服役，或难以预料的地震和山洪暴雨等，引起塌陷、滑坡，造成尾矿 库溃泄。溃泄的尾矿可冲毁农田庄稼、公用和民用设施，造成人员伤亡，大面积破坏 l 兰坪铅锌尾矿区共生同氮菌研究 植被，淤塞溪流河道，并因此引发一系列影响范围更大、时间更长其他环境问题。干 燥地区堆放的尾矿随风飞扬污染大气环境。尾矿砂粉尘飞扬，污染空气，降低能见度， 乃至危害人体健康。尾矿砂粉尘中含有金属元素，随着粉尘被吸入呼吸器官，可造成 公害病。此外，还造成水源、食品、土壤等一系列环境污染。会造成大面积的污染。 含污染物的矿水会向下渗透，引起水质污染，后患无穷。 由于金属矿山尾矿颗粒极细，排出的尾矿干涸后极易扬尘。若遇到刮大风天气， 将有可能扬起尾矿黑砂尘暴。尾矿中的有害成分如混杂悬浮物、氰化物、酸碱度、重 金属离子、浮选药剂及含硫化合物等选矿尾矿在排放过程中将流失。金属硫化物尾矿 的氧化将产生大量酸性水污染水源和土壤。在高降雨量季节，尾矿坝向周围环境排放 的过剩尾矿水会严重危害农田、淤塞河流、毒害牲畜和鱼类将会产生严重的危害。 尾矿对地下水源的污染，尾矿水除在地面造成环境污染外，尾矿中的多种重金属 元素和有害物质还将进入水体，污染地下水源。据一些统计资料表明矿区周围饮水井 的水质普遍达不到饮用水标准【9 】。 现在我国每年产生二十多亿吨的矿业废料，主要是废石、尾矿、冶金渣、煤研石 和粉煤灰等，我们将矿石经选别之后所产生的大量残渣称为尾矿。我国选矿尾矿每年 大约会产生三至四亿吨【l o 】，这些尾矿中的有害成分如混杂悬浮物、氰化物、酸碱度、 重金属离子、浮选药剂及含硫化合物等选矿尾矿在排放过程中将流失，对周围环境将 会产生严重的危害。 首先是金属矿山尾矿地面堆放所引起的一系列问题和危害。金属矿山选矿厂排弃 的尾矿是矿山主要固体废弃物之一，其所引起的问题和危害日趋严重。金属矿山尾矿 的特点主要为毒性很强，金属矿选矿大多为浮选，浮选药剂含大量有机、无机有毒化 合物及油脂等。这些有毒物质大部分都存留在尾矿中。 其次是尾矿导致沙埋。如甘肃省金昌市是我国最大的镍铜生产基地【1 1 1 ，金川有 色金属公司的老尾矿库位于金昌市北部。由于临近金昌市，且座落在上风侧，在风力 作用下，向南和向东南运动的黑色尾矿砂，埋压道路、水源、城市建筑等设施以及造 成高崖子村农田的严重污染。干涸疏松的尾矿沙向库外蔓延，形成了黑色的沙漠化土 地。 再次是我国发生的典型尾矿坝工程灾害。云南锡业公司新冠选厂火谷都尾矿坝失 2 1 绪论 稳决口，奔涌出尾矿浆、库水造成下游村民伤亡和数千公顷农田被淹没。这是我国尾 矿史上最大事故，世界尾矿史上第三大事故。湖南东坡铅锌矿尾矿坝因洪水漫顶而决 口，4 7 人死亡，2 0 0 多户居民受灾【1 2 】； 2 0 0 8 年9 月8 日早上当山西襄汾县塔山铁矿的尾矿坝决堤时，2 6 8 万立方米的 泥沙碎石从5 0 多米的高度倾泻而下，泥沙湮没了2 5 9 条生命【1 3 1 。 1 3 兰坪铅锌尾矿概况 兰坪铅锌矿山经过数十年大规模的开采和人们不断进行各种活动，矿区的植被被 严重破坏，植被覆盖率大大降低，岩石裸露面积大大增加，采矿场及各种堆场裸露于 地表，随着开发的不断进行，裸露地表的面积变得更多，数l o 年的开采使得兰坪铅 锌尾矿区山体中空，树木稀少，环境恶化，水土流失。 铅锌矿在浮选过程中产生的废弃物，湿时粘重板结，干时极为松散，覆盖在尾矿 区，这些地区的土壤被严重酸化，土壤极端贫瘠，有机质、氮、有效磷含量低，重金 属含量高，极端p h ，尾矿直接堆放在尾矿区内，表面裸露，在尾矿区内只有极少量 、 的植物可以生长，在尾矿四周的边缘地区和尾矿周围的矿山上则有植物生长，从而形 “ 成环状的植物群落带。 1 4 国内外对尾矿的治理概况 目前世界上所采用的尾矿固结方法有： 覆剂法。用大块或粗粒物料覆盖于细尾矿表面是稳定尾矿砂较为有效的方法，用 土石覆盖效果较好，而且为复田造地提供有利条件。用树皮，麦秸作覆盖物，在尾砂 上喷水和排放稀矿浆也有_ 定效果，可以防止尾砂飞扬。 化学法。将化学药物喷洒于尾砂表面，形成一层抗风、抗水薄膜，避免尾砂飞扬。 这类化学药物有水泥、黄银矿、石灰、木质素、硅酸盐、磺酸盐、硅酸二钙、胺类、 弹性聚合物、树脂添加剂、水膨胀性聚合物及橡胶聚合物等。这种方法一般用于尾矿 的危害大，需要投资来处理的尾矿排放企业。 植被法。在尾矿砂上栽种植物，不但可以固结尾砂，而且可以恢复生态，改良土 壤。如南非有些尾矿场采用种植芦苇和防风林相结合的方法来固结尾砂。加拿大的穆 3 兰坪铅锌尾矿区共生固氮菌研究 斯山选矿厂，在尾矿坝的泥砂上种植各种豆科植物、禾本科植物及树木，使土壤得到 了很好的改良。我国广东板潭锡矿用重选尾矿回填造田，不仅解除了尾矿的污染，而 且恢复了土地。当然要在尾矿坝上植被，就必须适当改良表土条件，以满足植物生长 的条件，那就是表土中应含有一定的无机矿物质、有机物、水分、空气、活有机体及 营养物质。因此首先必须选择性地种植一些能耐低劣表土条件的植物，再加上自然条 件的作用，随着这些植物的生长，将会逐渐改变环境，派生出新的植物种属，也会产 生一个繁茂的植物群落的。 在植被法中超积累植物值得关注。超积累植物主要是指那些对某些重金属具有特 别的吸收能力( 超过一般植物1 0 0 倍以上的植物) ，而本身不受毒害的植物种和基因型， 即重金属超富集体( h y p e r a c c u m u l a t o r ) 1 4 】。 植物叶片或地上部( 干重) 中w ( c d ) 达到0 1x l o 一，w ( c o ) ，w ( c u ) ，w ( n i ) ， w ( p b ) 分别达到l x l o 一，w ( m n ) ，w ( z n ) 达到l o x l 0 3 以上，且叶片中重金属元素 含量与根中含量比值大于1 的植物称为超富集植物f ”】。 一般认为超富集植物应同时满足以下3 个标准：1 ) 植物地上部富集的某种 元素含量达到生长在同一介质非超富集植物地上部含量的1 0 0 倍以上，其临界含 量标准( 以干重计) p b ，c u ，n i ，m n 和c o 等多数金属的质量分数为1 0 0 x 1 0 ， w ( z n ) 为1 1 0 一，w ( a u ) 为1x 1 0 6 , w ( c d ) 为l o o x l o 一；2 ) 地上部重金属含量大于根 部含量；3 ) 植物的生长没有出现明显的毒害症状。当然，理想的超富集植物还 应具有生长周期短、抗病虫能力强、地上部生物量大、能同时富集2 种或2 种 以上重金属的特点【1 6 1 。 目前全世界发现的重金属超积累植物4 0 0 多种，但绝大部分超积累植物仅可积累 一种重金属元素，少数可以同时积累2 种以上重金属。m c g r a h 等对超积累植物的定 义做了修订【1 7 】： ( 1 ) 植株地上部重金属含量满足下列条件：z n 、m n 含量超过1 00 0 0m g k g ，c o 、 c u 、n i 、a s 和s e 含量超过10 0 0m 眺g ，c d 含量超过1 0 0m g k g ；( 2 ) 地上部生物富 集系数( b i o c o n c e n t r a t i o n ，地上部重金属含量与土壤重金属含量比值) l ，这样的植物对 重金属有很高的吸收效率；( 3 ) 地上部与根系中重金属含量比 l ，意味着植物对重金 属的转运效率很高。超积累植物积累的c r 、c o 、n i 、c u 、p b 含量一般在10 0 0m g k g ( d w ) 4 1 绪论 以上，积累的m n 、z n 含量一般在1 00 0 0m g k g ( d w ) 以上。重金属超积累植物以富 集n i 的最多。但超积累镉的植物只有一种，即十字花科的t h l a s p ic a e r u l e s c e n s ，地上 部积累的镉可达1 8 0 0 m g k g 。但这种植物生长缓慢、植株矮小、地上部生物量小，成 了实际应用中最大的限制。山览科的渐尖塞贝山榄( s e b e t i aa c c m m i n a t a ) 可在含p b 量 高的土壤中生长，树液内含2 5 0 9 k g 的n i ( 以干物质量计) 。十字花科天蓝遏蓝菜 ( t h l a s p i c a e r u l e s c e n s ) 植株组织内可积累高4 0 卧的z n 而未表现明显伤害。熊建平等研 究表明水稻田改种竺麻后极大地缩短了受污染土壤恢复至背景值水平时间。所有污染 环境的重金属中p b 的植物修复研究最多。植物可大量吸收并在体内积累p b ，圆叶遏 蓝菜( t h l a s p i r o - t u n d i f o l i u m ) 吸收p b 可达8 5 0 m g & g ( 以茎干物质量计) 。在含高浓度可 溶性p b 的营养液中培养芥菜( b r a s s i c a j u n e e a ) ，可使其茎中p b 的含量达到1 5 9 k g 。芥 菜可吸收p b 并吸收与积累c r ，c d ，n i ，z n 和c u 等重金属【1 8 - 1 9 1 。 理想的超积累植物应具有生长期短、抗病虫能力强、地上部生物量大、能同时富 集两种或两种以上重金属的特点。解决这个问题的方法有两种，一是寻找生物量大的 超积累植物；二是采用生物量大的中等富集植物，如十字花科的b r a s s i c aj u n c e a ，并 通过一些调控措施来增加富集浓度1 2 0 1 。 。 一些超量积累植物能同时超量吸收、积累两种或几种重金属元素。根据植物积累 的金属元素种类，可把超量积累植物分为n i 超量积累植物、z n 超量积累植物、c o 或c u 超量积累植物、p b 超量积累植物等( 沈振国和刘友良，1 9 9 8 ) 。许多实验证明超 量积累植物在净化重金属污染的土壤具有极大的潜力( m c g r a t he ta l ，1 9 9 3 ；r o b i n s o n e ta l ，1 9 9 7 ：s h e ne ta l ，1 9 9 7 ) 。m c g r a t h 等( 1 9 9 3 ) 报告生长在污染土壤( 含z n 4 4 4 p , g g - 1 ) 上的遏蓝菜( zc a e r u l e s c e n s ) 地上部含z n 量是土壤全z n 的1 6 倍，从土壤中吸收的全 z n 量为3 0 1k g h m 之。假定后季植物能吸收同等数量的z n ，若把土壤含z n 量从 4 4 4 1 x g g j 降低到3 0 0 i _ t g g 。1 的欧盟允许标准，则需要种植1 3 或1 4 次。如种植油菜和 萝卜，则各需要8 3 2 次和2 0 4 6 次。最近，r o b i n s o n 等( 1 9 9 7 ) 报告了一种高生物量的n i 超量积累植物b c o d d i i 。这一植物的干物质产量达2 2 th a 1 ，植株平均含n i 量为7 8 8 0 m g k g ，植株吸收提取的n i 总量为1 6 8k g h a l 。据计算，种植两年可把中度n i 污染 土壤的含n i 量从1 0 0m gn i k g 降到5 9m gn i k g 。对于含2 5 0m gn i k g 的土壤，也仅 需种植4 次可把土壤含n i 量降到欧盟允许标准( 7 5m gn i k g ) 以下。 兰坪铅锌尾矿区共生固氮菌研究 尽管超量积累植物在污染土壤修复方面有很好的应用前景，但目前发现的超量积 累植物除少数几种外，大多数植物生长速度很慢，植株矮小，单株干物质重量小，这 为实际应用带来了很大困难【2 1 】。 综合法即将上述几种方法综合利用，效果更好。方法是先用覆盖法或化学法固结 尾砂，再进行植物栽种。这样既可防止尾砂有害成份对植物的危害，又可减少了水分 蒸发与阳光反射，有利于种子发芽。美国克莱马克思公司研制了一种库赫列克思 ( c o h e r e x ) 石油树脂合成乳化液，将其稀释到9 ：1 喷洒的于尾砂表面，其表面呈黑色， 不但可以固结尾砂，还可以促进植物生长，而且呈黑色的表面能吸收热量加速种子发 芽，减少枝叶枯萎【2 2 1 。 1 5 国内外固氮植物和非豆科植物在尾矿区生态恢复的研究 1 5 1 豆科植物根瘤菌共生 根瘤皮层，位于根瘤表皮，由4 - - , 1 0 层薄壁细胞组成，不含根瘤菌，细胞较小， 排列紧密，根瘤皮层具有保护作用，分生组织一般位于根瘤的先端，有一堆小型细胞， 保持着细胞活跃分裂和生长作用，产生新的细胞形成皮层、维管束，增加含菌组织， 使根瘤不断张大；分生组织位于皮层内，若在根瘤顶端，则形成棒状根瘤，如苜蓿、 三叶草、豌豆的根瘤，根瘤单个或聚集在一起；若在顶端不同部位，形成分枝状根瘤； 若在根瘤周围呈带状分布，则形成球状根瘤；含菌组织，位于根瘤中部，是根瘤内部 组织的重要组成部分，由含菌细胞组成。在三叶草，豌豆、花生的有效根瘤内，几乎 1 0 0 的细胞都含有类菌体，而在菜豆、锦鸡儿、田箐的有效根瘤内，通常只有 5 0 糊o 的细胞受感染；维管束系统，位于皮层内，呈网状分布，与根中柱木质部 和韧皮部相连，成为根瘤的疏导组织。光合产物输入根瘤和固氮产物供给植物利用， 都需要通过维管束。苜蓿和三叶草有2 或4 条维管束，豌豆、大豆、田箐等较大的圆 形根瘤中，维管束分枝形成疏导组织网。发育完全的维管束由木质管道，韧皮纤维， 筛管和伴胞组成；包在一层薄壁细胞鞘内，鞘外有凯氏内皮层环绕着，维管束常有几 层未受感染的薄壁组织细胞将维管束与内部组织隔开。由此可见，豆科植物的根瘤具 有十分复杂的组织结构和高度的组织分化【2 3 1 。 6 1 绪论 1 5 2 根瘤菌研究 早在1 8 3 8 年，b o n s s i n g a b l t 根据他的田间实验结果指出，豆科植物的营养生理和 禾本科植物不同，三叶草和豌豆都可以从空气中取得氮素营养，后来l a c h a m a n n ( 1 8 5 8 ) 和b o p o m c ( 1 8 8 6 ) 发现豆科植物根瘤中含有微生物，并且指出根瘤的形成是微生物侵 入植物的结果。到1 8 8 6 年，德国植物化学家h e l l r g e l 和w i l f a r t h 等人在柏林一次科学 大会上发表研究报告证明豆科植物根瘤是由细菌感染引起的，只有形成根瘤才能固定 大气中的氮素。1 8 8 8 年，荷兰学者b e i j e r i n c kmw 用植物叶片汁加天门冬酰胺，蔗 糖和明胶缓冲液配制的培养基，从豌豆根瘤中第一次成功分离到根瘤菌。并将其命名 为b a c i l l u sr a d i c i c d a 。一年后，波兰学者p r o z m o w s k i 用根瘤菌纯培养物接种豆科 植物，形成了根瘤，并将之改称为b a c t e r i u mr a d i c i c o l a 。1 8 8 9 年，f r a n k 建议将可 在豆科植物根上结瘤的细菌属名改为根瘤菌属( r h i z o b i u m ) ，并一直沿用至今。当时， f r a n k 以为感染所有豆科植物结瘤的都是同一种根瘤菌，并取名为豆类根瘤菌，它只 包括了3 种根瘤菌：豌豆根瘤菌，苜蓿根瘤菌和百脉根根瘤菌，但自1 9 8 4 年以后， 随着根瘤菌寄主范围的不断扩大和分子生物学技术的不断应用，根瘤菌分类突飞猛 进，新属新种不断建立。目前，已由原来的2 属4 种发展到了7 属3 6 种【2 4 1 。 1 5 3 豆科植物一根瘤菌的共生关系 豆科是被子植物中的第三大科，按照恩格勒分类系统，分成三个亚科，即 含羞草亚科、云实亚科和蝶形花亚科。全世界约有豆科植物7 0 0 多属，2 万种左 右，至今只对约1 5 的植物做过结瘤调查，对其中o 3 一0 5 的豆科植物做过 共生关系研究，豆科植物与根瘤菌形成的共生体系是生物固氮系统中一类特殊 的植物一微生物共生体，是自然界最为重要的氮源。尽管自然界存在多种多样 的生物固氮体系以，但是在大多数根际微生态系统中生物固氮量的8 0 是由土 壤微生物r h i x o b i u m ，b r a d ) r r h i x o b i u m ，s i n o r h i z o b i u m ，a z o r h i z o b i u m 一豆科植 物共生固氮固定的。全球豆科植物的种植面积约为2 5 亿h m 2 ，每年固定的氮 量为9 0 t g 。如果通过h a b e r b o s c h 方法人工合成豆科植物固定的氮需要2 8 8 t g 的燃料，花费约3 0 0 亿美元。 根瘤菌一豆科植物共生固氮是高等植物与低等原核生物之间形成的一种互惠互 7 兰坪铅锌尾矿区共生固氮菌研究 利、和睦共存的共生固氮微生态系统。豆科作物为类菌体提供充足的能量物质一有机 酸，包括苹果酸和琥珀酸等，而类菌体将其固定的氮以酰脲或酰胺类物质传递给豆科 作物【2 5 1 ，根瘤菌通常存在于土壤内，当种子发芽时，在植物的根际繁殖。这些根瘤 菌进入植物根内的机制尚不清楚，目前认为通过两种途径，一种是通过根毛( 苜蓿、 三叶草) ，另一种是利用侧根基表皮的创伤( 落花生) 。在显微镜下，有一种侵染丝状 体在根的外皮细胞之间流通，分权成网状，然后破裂，在细胞内释放出细菌，形成原 基根瘤，此时尚不能固氮。寄生植物细胞增殖引起根瘤菌也在每一个细胞内增殖，最 后形成完善的根瘤。寄生植物内充满了根瘤菌，从而成为膨胀或分枝形状，成为类菌 体。这种形状下的根瘤菌含有一种酶，即固氮酶，可以固定空气中的氮素。这种酶含 有铁和钼，用于输送还原反应必需的中子