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离子液体辅助介质中抗h i v 药物分子印迹聚合物的合成及其在固相萃取中的应用 分子印迹聚合物的合成及其在固相萃取中的应用 环境工程专业 研究生：郭娟指导老师：赖家平教授 摘要：本论文以三种抗h i v 药物( n r t i s ) 一西他滨( d d c ) 、恩曲 他滨( f t c ) 和拉米夫定( 3 t c ) 为模板分子，在离子液体有机溶剂混合介质 中合成它们的分子印迹聚合物( m d s ) ，并通过溶胀实验、紫外、红外光谱以 及平衡吸附实验对所合成的聚合物进行表征，最后探讨了该聚合物在固相萃取 ( s p e ) 上的应用。 本论文首先探讨了能溶解水溶性抗h i v 药物n r t i s 的离子液体( i l s ) 种 类，并优化其用量，最终选用离子液体 e m i m s c n 作为助溶剂，并确定了 i l s n o c ( 3 2 ，v ) 的溶剂体系。通过比较不同溶剂体积、不同模板分子、 功能单体及交联剂摩尔比、不同引发剂质量分数所合成的m i p s ( n 口s ) 的印 迹因子( i f ) ，确定选用溶剂体积为5m l ( 3m li l s + 2m l 乙腈) 的本体聚合 法，以m a a 为功能单体、e g d m a 为交联剂、a i b n 为引发剂( 模板分子用 量为0 2 5m m o l ，模板分子、功能单体、交联剂的摩尔比为1 ：4 ：2 0 ，引发剂用 量为单体总质量的5 ) 。通过在乙腈中的平衡吸附实验得到扎西他滨、思曲 他滨和拉米夫定印迹聚合物的印迹因子为分别为1 1 8 、1 1 3 和1 2 8 。 将此聚合物作为固相萃取小柱的填料，对装载溶剂、清洗剂、洗脱剂的组 成和流速进行优化。固相萃取实验结果表明，采用乙腈溶液上载，各自的m i p s 对对应的模板分子有最高的回收率，分别达到9 7 1 ( d d c ) 、9 6 9 ( f t c ) 和 9 7 8 ( 3 t c ) 。另外，s p e 实验结果还表明，分子结构与模板分子越相似，其 s p e 回收率也越高，这说明分子印迹的空腔对分子识别起到主要的作用。此外， 用2 0 0m l5 0n g m ln r t i s 、没有经过任何处理的尿液直接装载，它们在各自 的m i p s s p e 柱上的回收率分别为：7 1 3 ( d d c ) 、6 9 i ( f t c ) 和7 1 6 ( 3 t c ) ， 四川师范大学硕十学位论文 而在n i p 上的回收率则要低得多。 关键词：分子印迹离子液体扎西他滨恩曲他滨拉米夫定 固相萃取 i i 离子液体辅助介质中抗h i v 药物分子印迹聚合物的合成及其在固相萃取中的应用 s y n t h e s i so fm o l e c u l a r l yi m p r i n t e d t h e i r a p p l i c a t i o n si ns o l i d - - p h a s e m a j o r ：e n v i r o n m e n te n g i n e e r i n g p o l y m e r sa n d e x t r a c t i on g r a d u a t e ：g u oj u a n s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rl a ij i a - p i n g a b s t r a c t ：i nt h i sd i s s e r t a t i o n ，m o l e c u l a ri m p r i n t i n gp o l y m e r s ( m i p s ) f o r z a l c i t a b i n e ( d d c ) ，e n t r i c i t a b i n e ( f t c ) a n dl a m i v u d i n e ( 3 t c ) w e r es y t h e s i z e di ni o n i c l i q u i d sa n da c e t o n i t r i l em i x t u r e t h ep o l y m e r sw e r ec h a r a c t e r i z e db ys w e l l i n g e x p e r i m e n t ，u f i i ra n dr e b i n d i n ga s s a y t h eo b t a i n e dm i p sw e r ea p p l i e dt o e n r i c ha n ds e p a r a t et h ea n t i h i vd r u g si nu r i n eb ys o l i d - p h a s ee x t r a c i o n f i r s t l y , t h ek i n d sa n da m o u n t so fi l sw e r eo p t i m i z e di nd e t a i l a sar e s u l t ， e m i m 【s c n 】w a sc h o s e da s t h ea s s i s t a n ts o l v e n ta n dt h ev o l u m er a t i oo f e r n i m l s c n a n da c e t o n i t r i l ew a s3 ：2 t h es y n t h e s i sc o n d i t i o n s ，i n c l u o d i n gt h e v o l u m eo fi l s ，t h em o l a rr a t i oo ft e m p l a t em o l e c u l e ，f u n c t i o n a lm o n o m e ra n d d i f f e r e n tm a s sf r a c t i o no fi n i t i a t o r , w e r ei n v e s t i g a t e di nt h eb u l kp o l y m e r i z a t i o nb y c o m p a r i n g t h e i m p r i n t i n g f a c t o r so fm i p s h e r e i n ，t h em i p s ( n i p s ) w e r e p o l y m e r i z e di nat h e r m o s t a t e dw a t e r b a t ha t6 0 cf o r2 4 hu t i l i z i n gm e t h a c r y l i ca c i d ( m a a ) a sf u n c t i o n a lm o n o m e r , e t h y l e n eg l y c o ld i m e t h a c y l a t e ( e g d m a ) 嬲 c r o s s l i n k i n ga n da z o b i s i s b u t y r o n i t r i l e ( a i b n ) a si n i t i a t o rw i t ho 2 5 m m o lt e m p l a t e m o l e c u l ea n d1 ：4 ：2 0m o lr a t i oo ft e m p l a t em o l e c u l e ，f u n c t i o n a lm o n o m e ra n d i n i t i a t o r t h ei m p r i n t i n gf a c t e ro fd d c ，f t c ，3 t c - m i p sw e r e1 18 ，1 13a n d1 2 8 ， r e s p e c t i v e l y s e c o n d l y , t h em i p sw e r ea p p l i e di ns o l i d - p h a s ee x t r a c t i o n ( m i s p e ) t h e c o m p o n e n t so fs o l v e n ta n de x t r a c t i o ns p e e dw e r eo p t i m i z e dd u r i n gl o a d i n g 、 w a s h i n ga n de l u t i n gs t e p s u n d e rt h eo p t i m i z e ds p ec o n d i t i o n s ，t h es e l e c t i v i t yo f i i i 四) l lg i l i 范大学硕士学位论文 t h em i p s ( n i p s ) w a se v a l u a t e db ye x t r a c t i o nt h es t r u c t u r a la n a l o g so ft e m p l a t e m o l e c u l ei na c e t o n i t r i l e t h er e c o v e r i e so fn r t i so nt h e i r c o r r e s p o n d i n g m i p s s p ec o l u m n sw e r e9 7 1 ，9 6 9 a n d9 7 8 f o rd d c ，f t ca n d3 t c ， r e s p e c t i v e l y 弛e r e s u l t sa l s oi n d i c a t e dt h a tt h em o r es i m i l a rt h ea n a l o g u e s c h e m i c a ls t r u c t u r ei s ，t h eh i g h e rt h er e c o v e r yi s f i n a l l y , t h eo b t a i n e dm i p sw e r ed i r e c t l ya p p l i e dt oe x t r a c tt h en r t i si nu r i n e w i t h o u ta n yp r e t r e a t m e n t t h er e c o v e r i e sb yl o a d i n g2 0 0m lu r i n es a m p l e ( c o n t a i n i n g2 0r i g m eo fn r t i s ) o nm i p sc o l u m n sw e r e7 1 3 ，6 9 1 a n d7 1 6 f o rd d c ，f t ca n d3 t c ，r e s p e c t i v e l y , w h i l et h er e c o v e r i e so fn i p sc o l u m nw e r e m u c hl o w e rt h a nt h a to fm i p sc o l u m n k e y w o r d s ：m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r s ( m i p s ) a n t i h i vd r u g s r o o mt e m p e r a t u r ei o n i cl i q u i d s z a l c i t a b i n ee n t r i c i t a b i n e l a m i v u d i n e s o l i d - p h a s ee x t r a c t i o n ( s p e ) i v 四) ii n 范大学学位论文独创性及 使用授权声明 本人声明：所呈交学位论文，是本人在导师麴塞垫蕉指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含 任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品或成果。对本文的研究做出重要 贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承 担。 本人承诺：已提交的学位论文电子版与论文纸本的内容一致。如因不符而 引起的学术声誉上的损失由本人自负。 本人同意所撰写学位论文的使用授权遵照学校的管理规定： 学校作为申请学位的条件之一，学位论文著作权拥有者须授权所在大学拥 有学位论文的部分使用权，即：1 ) 已获学位的研究生必须按学校规定提交印 刷版和电子版学位论文，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库供 检索；2 ) 为教学、科研和学术交流目的，学校可以将公开的学位论文或解密 后的学位论文作为资料在图书馆、资料室等场所或在有关网络上供阅读、浏览。 本人授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文 全文数据库，并通过网络向社会公众提供信息服务。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 蚕f 此一够 籀睥 名 以 签 期 师 日 导 字签 詹飙籼 日 易，寸 寻月 厂 离于液体辅助舟质中抗h i v 药物分子印迸聚台物的台成厦其在周相萃取巾的应用 1 1 分子印迹的原理及现状 分子印迹技术( m o l e c u l a r i m p r i n t i n g t e c h n i q u e ，m i t ) 是制各在空间结构 和结合位点上对特定目标分子( 也称模板分子或印迹分子) 具有特异预定选 择性的高分子印迹聚合物( m o l e c u l a r l y h n p r i n t 印p o l y m e r s ，m i p s ) 的技术n 主要通过在聚合或缩聚过程中引入模板，模板与功能单体通过共价、非共价 或者其他键结合形成印迹识别位点，经交联剂固定功能残基于聚合物网络中， 然后除去模板，形成孔穴状聚合物，通过特异性印迹识别位点及其孔穴的空 间匹配共同作用来识别模板，其印迹过程见图1 - 1 口j 。 塞：。k 詈镰 o n 呻、磊；= ：；：- 1 瞄岬 图1 - 1 分于印迹过程示意图 f i g1 1s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no ft h em o l e c u l a ri m p r i n t i n gp r o c e s s 分子印迹技术具有三大特点：即构效预定性、特异识别性和广泛实用性。 基于m i t 所制各的m i p s 具有抗干扰性强、亲和性和选择性较高、稳定性好、 使用寿命长以及应用范围广等特点。因此m 1 t 自上个世纪7 0 年代发展以来， 受到了极大的关注。经过4 0 年的迅猛发展，目前m i p s 已经广泛应用于分析 化学豹各个领域，如色谱分离【3 卅、固相萃取0 1 以及生物化学传感器坩喀 研究领域。据分子印迹协会( s m i ) 的不完全统计，至今发表有关m i p s 的s c i 盏一 四川师范大学硕士学位论文 文献已经超过4 0 0 0 篇。然而，m i t 领域至今仍然存在许多待解决的问题，主 要体现在一下几个方面：一是目前m i p s 多在有机相中合成并用于有机体系中 的分子识别，但有机体系中合成的m i p s 在水相中识别效果较差，而直接在水 等极性介质中合成和识别的研究还远远不够；二是m i p s 应用研究多停留在实 验室研究阶段，而m i p s 在具有复杂机体的实际样品中的应用以及工业规模化 应用研究却很少；三是有机小分子的印迹研究较多，而生物大分子的印迹研 究较少。造成以上现象的主要原因是：目前采用分子印迹聚合过程大多是自 由基聚合，这种聚合在有机相里更容易发生，另一方面，水等极性介质会影 响模板分子和功能单体之间的氢键等相互作用，从而影响印迹效果，故一般 印迹过程都在有机介质里进行。但事实上，生物及临床分析中的绝大多数样 品多为水溶性介质，而大多数研究表明，在有机相中合成的m i p s 虽然在合成 介质中具有较好的分子识别特性，一旦用于水溶液介质的分子识别时，其识 别效果就会大打折扣，有的甚至完全失去识别能力。因此，在有机相中合成 和在水相中识别是主要矛盾，它阻碍了m i p s 的进一步应用和推广，这是分子 印迹界已达成的共识【l 酬。此外，对于许多分析物质，如蛋白质一类的生物大 分子以及极性极强的水溶性化合物，它们很难溶解于m i t 常用的乙腈、氯仿、 甲苯等有机溶剂，或者在有机溶剂中很快变性或降解，所以在有机相中合成 此类物质的m i p s 是根本不可能的。由此可见，m i p s 要迈向工业规模化应用 还有很长的路要走，其中必须要解决的一个关键问题，就是直接在强极性介 质中有效印迹分子和识别分子。 1 2 分子印迹聚合物的制备 1 2 1 本体聚合 一般制备m i p s 都使用( 并将继续使用) 本体聚合方法。本体聚合是乙烯 基混合物经热、光或电引发游离自由基后，发生链式聚合反应生成的块状聚 合物。得到的块状聚合物在使用前必须粉碎、研磨后过筛以获得相应的m i p s 。 本体聚合物的优点是合成简单、选择性高，但需经过研磨、过筛等操作程序， 操作比较繁琐；而且研磨的聚合物形状不规则、单分散性较差，在许多应用 特别是高效液相色谱( h p l c ) 1 7 2 1 】、毛细管电色谱( c e c ) 2 2 - 2 7 及固相萃 2 离子液体辅助介质中抗h i v 药物分子印迹聚合物的合成及其在固相萃取中的应用 取( s p e ) 1 8 , 2 8 - 3 3 中的效率较低。但对于有些分析对象，如本研究所涉及的 水溶性分子，由于其水溶性的特点，无法采用其它方法得到这类分子的印迹 聚合物微球，只好采用本体聚合法来合成其m i p s 。 1 2 2 原位聚合 原位聚合是指在色谱柱内部聚合生成多孔团块状聚合物或者在毛细管中 制备用于电色谱分离的块状聚合物或者涂层的方法。而在小瓶中或微滴度板 上制备的原位m i p s 较少( 用于高通量筛选试验) 。原位聚合法避免了研磨和 装填色谱柱带来的不便【3 4 3 5 1 。在原位聚合时，必须加入极性较强的溶剂( 例 如如正十二醇和环己醇的混合溶剂) 作为致孑l 剂，从而使色谱柱或毛细管有 良好的通透性，而极性较强的溶剂会影响模板分子和功能单体间的非共价键 合，从而降低m i p s 对模板分子的亲和力和选择性；另外，原位聚合反应程 度难于控制，所制得的色谱柱柱效及柱容量都不高，所以该方法适用范围受 到一定的限制。 1 2 3 沉淀聚合 沉淀聚合是一种于本体聚合基础上发展而来的在低浓度溶剂体系中制备 m i p s 微球的方法。在聚合反应时通过低聚物的团聚成核，同时捕捉低聚物和 单体最终形成高交联粒径均一的微球状聚合物。该方法既不需要在反应体系 中另加入稳定剂，也不需进行研磨等过筛等繁琐操作，所以成本低廉，操作 简单方便，产率高。y e 等人首次用沉淀聚合法在乙腈中印迹了雌二醇，所制 备的m i p s 微球( 平均粒径为o 3 r t m ) 有较好印迹效果【3 6 3 7 】；另外，通过沉淀 聚合法所制备的微米级微球应用在色谱分离和固相萃取领域效果优良。沉淀 聚合的诸多优点使其得到了广泛的应用 2 1 3 8 巧6 1 。 1 2 4 水相非水相悬浮聚合 悬浮聚合是指在悬浮于连续相( 通常是包含稳定剂的水相) 的聚合混合 物液滴中发生的聚合反应。悬浮聚合能够获得单分散性较好的分子印迹微球 【5 7 - 6 6 。然而聚合反应中大量水或会妨碍模板分子与功能单体非共价键合，影 3 四川i 师范大学硕士学位论文 响印迹的效果，所以液态全氟化碳也被用作悬浮介剧6 7 ，6 8 1 。也有人使用非水 相悬浮聚合以及水相的悬浮聚合法合成磁性分子印迹微球，其分离更方便 【6 9 7 1 1 2 5 表面聚合 表面聚合是一种对粒子( 例如硅胶) 表面进行修饰从而通过缩合聚合将 印迹层接枝粒子表面得到m i p s 的方法【2 9 ，7 2 别】。在表面印迹中，既可用氮引发 剂来修饰硅胶表面，还可以用引发转移终止剂来作表面键合的引发剂，从而 将聚合地点限制在聚合物表面。另外，多孔硅胶球的机械稳定性使其能作为 传统m i p s 形态上的“模板”，因此在没有固定模板分子时就能较好的控制相应 聚合物颗粒的粒径和孔隙度【8 2 - 8 4 1 。由于表面聚合所得m i p s 的结合位点在其表 面，模板分子更容易洗脱和重新键合，缩短了键合平衡时所用的时间【8 5 8 6 】。 但因表面聚合只是在颗粒表面修饰，m i p s 的吸附容量有限。 与2 缴1 3 分子印迹聚合物的应用 。m i p s 成本低廉、制作简单，并且物理化学性质稳定，能够忍耐酸、碱、 有机溶剂、高温、高压等恶劣环境，所以坚固耐用、适用范围广；同时由于 分子印迹具有可预定性及特异识别能力，被誉为“万能的分子识别材料”。其 应用研究领域包括生物、医药、食品、环境、军事等。近年来，m i p s 的应用 研究主要集中在手性分离【8 7 - 9 2 1 、固相萃取 1 8 2 1 ，9 3 1 0 、模拟酶催化1 0 2 - 1 0 9 和 传感器材料【4 1 ，1 1 0 - 1 1 5 1 几个方面。 1 3 1 手性分离 近年来，手性分离一直是分子印迹研究中的活跃领域。由于手性药物数 量较多，其对映异构体在生物体内分布、代谢、生理活性、毒性等方面存在 较大差异，所以大多数手性拆分工作集中在手性药物分子的分离上。传统的 手性拆分技术效率低且适用范围窄。而m i p s 具有可设计性及特异识别能力， 能够识别分子结构上微小的差别，在分离异构体方面有其独到之处。因此， 将m i p s 作为高效液相色谱的固定相对混合物进行分离分析，能够除去含量较 4 离子液体辅助介质中抗h i v 药物分子印迹聚合物的合成及其在固相萃取中的应用 少的对映异构体，近年来己成为最有前景的分离对映异构体手段之一。然而 在实际应用中，m i p s 作为色谱固定相，分离效果受填充色谱柱方法、传质过 程、键合位点数目及分布的影响。为了提高m i p s 色谱柱的分离效果，可以将 m i p s 包覆于有机聚合物支持体中或金属氧化物外以及发展新型功能单体和 交联剂。 w u l f f 6 】等最早把m i p s 引入液相色谱固定相用于手性分离，他们将a d 甘露吡喃苷为模板分子制备的m i p s 应用于拆分其外消旋体，改进后可以达到 完全拆分。k e m p e 1 1 7 】等以s 布洛芬为模板分子、4 乙烯基吡啶作为功能单体 合成m i p s ，从外消旋体中分离出s 布洛芬，并将布洛芬及结构类似物酮基布 洛芬分离开。h a g i n a k a e l l 8 j 等以4 乙烯基吡啶为功能单体合成尼伐地平 ( n i l v a d i p i n e ) 的m i p s ，分离其对映异构体。此外，m i p s 己用于多种氨基酸 及其衍生物、肽和有机酸的手性分离【1 1 9 1 2 0 】。 1 3 2 固相萃取 固相萃取( s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ，s p e ) 是从复杂基质和低浓度溶液样品中 萃取和分离分析物的一种技术。它将分离与浓缩合二为一，通过使用不同溶 剂选择性的清洗杂质以及洗脱出目标物质，达到分离浓缩的目的。同时s p e 可以与h p l c 、g c 和i c 等设备联用，具有消耗溶剂少、回收率高、操作简 单、使用灵活、易于自动化等优点。传统s p e 常用的吸附剂对复杂生物、环 境样品很难进行净化和富集，它主要利用吸附剂和分析物间的相互作用( 如 反相、正相及离子交换作用) 进行萃取，这种作用力是非特异性的，缺乏选 择性，因此清洗和洗脱条件要根据样品的化学性质来仔细确定。而m i p s 具有 特异识别性，可以选择性地吸附混合物中的某一种或某一组结构相似的化合 物，非常适用于色谱分析前样品的提纯和富集【1 8 1 2 1 m 羽。将m i p s 引入s p e 中，传统s p e 吸附剂存在的问题就会得到简化。s e l l e r g r e n 1 3 4 最早使用m i p s 作为吸附剂用于样品的前处理，他将五咪( p e n t a m i d i n ) 的m i p s 用做s p e 吸附 剂，完成了对生物体液尿样中五咪的提纯和浓缩，使之达到能够被直接检出 的浓度。d u y 等p j 以n r t i s 中的a z t 为模板分子，合成对a z t 及其结构类 似物d 4 t 具有较好特异性吸附的m i p s ，并用于人体血清的s p e ，a z t 和d 4 t 四川师范大学硕士学位论文 的回收率分别达到8 0 和8 5 。因此近年来分子印迹固相萃取联用技术 ( m i s p e ) 的研究与日俱增【4 3 ，5 4 ，5 6 ，1 0 1 , 1 2 4 , 1 3 5 14 2 1 。 分子印迹固相萃取( m i s p e ) 过程见图1 2 ，包括活化平衡、样品过柱、 除杂和洗脱四个步骤。为了保证每一个步骤的效果，各种溶剂的优化选择是 m i s p e 最主要的工作。 o o 活化柱 ( 非极性溶剂) 样品过柱 去除杂质 ( 非极性溶剂) 洗脱底物 ( 极性溶剂) 图1 - 2 分子印迹固相萃取( m i s p e ) 步骤图 f i g 1 2s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no fm o l e c u l a ri m p r i n t i n gs o l i dp h a s ee x t r a c t i o np r o c e s s 1 3 3 模拟酶催化 由于自然界中的酶提取困难、耐受性差、难以回收和重复使用，因此它 在工业生产中的应用受到很多限制。为了解决这一难题，化学家们模仿和学 习自然界酶的催化机制，合成人工接受体用作化学催化剂，分子印迹技术应 运而生。与天然酶相比，分子印迹模拟酶可以针对不同底物和反应需要对接 受体进行自由设计，真正做到量体裁衣，并且能抵抗恶劣环境、具有高度的 稳定性和较长的使用寿命、价格便宜、便于存储和规模化生产1 0 4 ，1 0 6 , 1 0 7 , 1 0 9 , 1 4 3 。1 4 5 1 。目前，研究较多的m i p s 模拟酶催化反应主要有水解反应、合成反应、 转移反应、脱h f 反应、异构化反应等，而且，研究发现，分子印迹模拟酶 6 离子液体辅助介质中抗h i v 药物分子印迹聚合物的合成及其在固相萃取中的应用 还可催化四氯噻吩与马来酸酐之间的d i e l s a l d e r 反应，到目前为止还未曾发 现天然酶能催化这个反应【1 4 4 9 1 。 1 3 4 传感器材料 生物传感器由于具有极高的灵敏度和特异性而备受关注。由于m i p s 对于 模板分子的具有高选择性，与生物传感器中极易失活变性的生物活性组分相 比，还具有抗恶劣环境、可重复使用和易于保存的优点，因此有望可以代替 生物材料用作仿生传感器的分子识别敏感元件。近年来，将m i p s 作为传感器 的敏感材料得到广泛的应用【4 1 ，1 1 0 。1 15 1 。p e r c i v a l 1 5 0 等将m i p s 材料涂布在电极 上，研制出声波传感器，用于筛选激素类兽药诺龙。目前，国内唯一关于分 子印迹传感器应用的相关专利是关于有机磷农药仿生识别检测试剂盒的制备 1 5 1 。 lv 药物分析进展雩0 铆施饧缪 前被批准的治疗艾滋病药物主要包括核苷逆转录酶抑制齐0 ( n r t i s ) 、 非核苷逆转录酶抑制剂( n n i u i s ) 和逆转录酶工作蛋白酶抑制剂( p i s ) ，其 中n r t i s ( 化学结构见图1 3 ) 作为其骨架药物，至今仍在治疗艾滋病中发挥 着重要作用【1 5 2 ，1 5 3 1 。目前分析检测生物体液中n r t i s 的方法主要包括高效液 相色谱法( h p l c ) 1 5 2 - 1 5 9 1 和毛细管电泳法( c e ) 1 1 5 2 - 1 6 7 ，近年来n r t i s 及其 代谢物的分析检测方法见表1 1 【1 52 | 。这些检测方法多采用固相萃取( s p e ) 来进行预富集前处理，n r t i s 及其代谢物试样预处理分析方法见表1 2 1 5 2 】。 s p e 柱多采用市售的一些极性柱如p o l a r i t yd c l 8 s i l i c a 柱【l 咧和多孔型吸附柱 粥】。然而，萃取机制主要基于疏水作用【5 3 1 ，对于极性太强的n r t i s 及其磷酸 代谢物并没有很好的保留效果和理想的选择性，尤其对具有复杂基体的生物 样品，其选择性、灵敏度和回收率更差 1 5 2 。因此，体液中n r t i s 及其代谢 物的分析面临极大的困难和挑战。 近年来分子印迹聚合物( m i p s ) 作为分子识别的新材料受到了广泛的关 注。m i p s 区别于传统预处理吸附材料的主要优点就是对目标分析物的高选择 性和亲和力【1 6 9 1 。大量文献报道了通过m i p s 富集净化的生物体液药物分析【4 4 ，5 3 ， 四川师范大学硕士学位论文 1 7 0 , 1 7 1 1 。例如从血样和尿样中提取阿巴卡韦【17 2 1 、氨甲叶酸【1 7 3 1 、羟嗪【4 8 】、阿夫 唑嗪 1 7 1 】等。然而，少有文献报道基于核苷酸药物前体【1 7 4 ，1 7 5 】和n r t i s 【1 5 2 ，1 7 2 】 的m i p s 。d u e 副等以齐多夫定( a z t ) 和司他夫定( d 4 t ) 为模板分子，m a a 为功能单体，在乙腈中本体聚合得到其m i p s 并用于s p e ，得到了较好的回收 率。而以扎西他滨( d d c ) 、恩曲他滨( f t c ) 和拉米夫定( 3 t c ) 为模板分 子的m i p s 未见报道，其主要原因是因为这几种化合物的水溶性比较强，很难 溶于有机溶剂中，因此很难在单纯的有机溶剂中来印迹它们。 导。p o 帕、夸 叫d r帕d t e n o l o v id 临, o p r o x nf u r n a t a t e fb i $ ( p o c ) - ( p m p a ) ) v i n h 图1 3f d a 已批准上市治疗h i v 的核昔类逆转录酶抑制剂 f i g 1 - 3f d aa p p r o v e dn r t i sf o rt r e a t m e n to fh i v 蛆 人 0 0 i = ( n 脯 匿 一嵌 酗 离了液体辅助介质中抗h i v 药物分子印迹聚合物的合成及其在固相萃取中的应用 n r t i s 及其代谢物 分析方法 d d c f r c 3 t c 陬 d 4 t a b c d d i l c - u v 、l c - m s ( m s ) c e ( c ) - u v 、c e ( c ) - m s ( m s ) 、l c - u v 、l c - m s ( m s ) c n ( c ) - u v 、c e ( c ) - m s ( m s ) 、l c - u v 、l c - m s ( m s ) c e ( c ) - u v 、c e ( c ) - m s ( m s ) 、l c u v 、l c - m s ( m s ) c e ( c ) - u v 、c e ( c ) 一m s ( m s ) 、l c u v 、l c - m s ( m s ) c e ( c ) - m s ( m s ) 、l c - u v 、l c - m s ( m s l c e ( c ) u 、，、c e ( c ) - m s ( m s ) 、l c - u v 、l c - m s ( m s l 表1 - 2n r tis 及其代谢物试样预处理分析方法 t a b 1 2s a m p i ed r e t r e a t m e n tm e t h o d sf o ra n a i y s iso f n r t isa n dm e t a b o ii t e s 1 5 离子液体助溶一分子印迹研究进展 近年来，室温离子液体( r t i l s ) 在普通化学领域受到了广泛的关注【1 7 1 8 0 1 ， 它被认为是有机化学反应、贵金属回收、催化、分离、电化学和合成领域的 绿色溶剂。r t i l s 具有许多独特的物理化学性质，总的来说，有9 大特点：“零” 蒸汽压，这是r t i l s 被认为是率彩色溶剂的重要依据；低熔点，可达一1 0 0 ； 宽液程，可达2 0 0 ；强静电场，这是他区别于分子型介质与材料的重要特征； 宽电化学窗口，可达5 v 7 v ，这意味着在如此宽的范围内，r t i l s 可以不发 9 四川师范大学硕士学位论文 生电化学反应或降解，并保持惰性，这是通常电解液所不具备的；良好的离 子导电、导热性、高热熔以及高热能存储密度性能；高热稳定性，其分解温 度高达3 0 0 ；选择性溶解能力，因此r t i l s 又称为“液体”分子筛；多样性和 可设计性，从理论上讲，有近万亿种r t i l s 可供选择，其多样性再加上各种 特性的组合，使得设计大量性质与用途不同的功能材料与介质成为可能。 r t i l s 的这些特点，特别是它们特殊溶解能力和可设计性的特点，给在极性 介质中进行分子印迹与识别带来希望。 b o o k e r 【1 8 1 ，1 8 2 1 等人以反乌头酸( t a a ) 为模板分子，分别在有机溶剂、 b m i m b f 4 】和 b m i m p f 6 】两种r t i l s 介质中合成了t 从的m i p s ( 粒径 2 0 0 n m ) ，并比较了他们的合成温度、溶剂体积、合成速率、转化率和印迹效果 等。发现r t i l s 不但增加了对吖a 的溶解性，提高了聚合速度，缩短反应时 间，增加了产量，还增加了m i p s 对t 从的选择性。与此同时，w a n gu 8 3 】等 人采用非水系溶胶凝胶法，r t i l s 做添加剂，在毛细管中原位聚合了s 萘普 生的m i p s ，避免了传统方法合成的m i p s 在使用过程中的断裂和溶胀级收缩 性等缺点。在他们最新的报道中，又采用佐米曲坦( z o l m i t r i p t a n ) 为模板分 子，合成其m l p s 毛细管整体柱，发现r t i l s 的引入增加了印迹的空穴，使得 其m i p s 柱的选择性更 1 8 射。最近，h e 1 8 5 】等人以 b m i i l l 【b f 4 为溶剂，采用共 价键预组装在硅胶表面上合成了睾丸激素的m i p s ， b m i m b f 4 表现出优良 的溶解能力和致孔性能，合成的表面聚合有m i p s 的硅胶对睾丸激素具有良好 的吸附能力和选择性识别性能。虽然以上这些工作只是初步探索了r t i l s 对 m i p s 的的合成和识别能力的影响，但是证明了在分子印迹过程中，适当的 r t i l s 存在不会影响模板分子和功能单体之间的相互作用，而且所得的印迹 聚合物呈现出良好的机械性能。这些给了我们很大的启示，对于难溶于有机 溶剂的强极性水溶性目标物，选择适当的r t i l s 或r t i l s v o c 二元体系，既 能溶解模板分子又不影响模板分子与功能单体之间的相互作用，将有希望合 成对此类目标物具有专一识别别能力和较好吸附性能的m i p s 。由于r t i l s 性 能稳定，在聚合过程中有利于电子或自由基的传递和聚合链的增长【1 8 1 ，1 8 2 1 ， 而r t i l s 极性可调控，可以预期这种介质中合成的m i p s 相对于传统介质中合 成的m i p s 具有更好的印记效果，能有效富集纯化体液中的模板分子，这是本 1 0 离子液体辅助介质中抗h i v 药物分子印迹聚合物的合成及其在固相萃取中的应用 课题的依据之所在。 1 6 本课题的背景和研究意义 据联合国艾滋病规划署和世界卫生组织最新统计，艾滋病流行至今，全 球大约已有6 0 0 0 万人感染了艾滋病病毒，2 5 0 0 万人死于艾滋病相关疾病。 2 0 0 9 年全球大约有3 6 0 0 万艾滋病病毒感染者，2 7 0 万新发感染者，2 0 0 万人 死于艾滋病。艾滋病死亡率从刚发现的几乎1 0 0 下降到而今的不足7 ，完全 得益于“鸡尾酒”式药物治疗。作为“鸡尾酒”药物之骨架药物的核苷逆转 录酶抑制剂( n r t i s ) 作用重大。因此研究n r t i s 在体内的作用机理和代谢途 径就显得尤为重要。准确分析和检测n r t i s 及其代谢物在体内的浓度，是研 究该类药物代谢的基础，但也是分析家们头疼的问题。因n r t i s 及其代谢物 是一类极性很强的核苷或核苷酸类化合物，很难溶于有机溶剂中，所以不能 用液液萃取法来对样品进行预富集处理，只能采用固相萃取( s p e ) ，但目前 市售的s p e 柱都很难达到理想的效果。因此，为模板分子量身定做m i p s ，用 作s p e 填料，可望有较好的预富集效果。然而n r t i s 及其代谢物极性很强， 很难溶解于m i t 常用的乙腈、氯仿、甲苯等有机溶剂，这就给在有机相合成 n r t i s 的m i p s 带来极大的困难和挑战。 本研究提出采用离子液体辅助溶解一分子印迹技术( i o n i c1 i q u i d a s s i s t a n ts o l u t i o n m o l e c u l a r l yi m p r i n t i n gt e c h n i q u e ，i l s s m i t ) 来合 成水溶性抗艾滋病药物分子n r t i s 的m i p s ，从而解决传统分子印迹中水溶性 分子的溶解难题。通过各种物理、化学手段对m i m s 进行表征，筛选出具有最 佳选择性的m i p s ，应用于艾滋病患者体液中n r t i m b s 的分离富集，解决目前 临床上n r t i m b s 的分离富集和分析难题。因此，本研究的意义在于：第一， 通过对水溶性抗h i v 药物n r t i m b s 的分子印迹研究，解决n r t i m b s 在市售 s p e 和h p l c 柱上选择性差、萃取回收率低以及保留难的分析难题，从而提高 n r t i m b s 分析方法的选择性和灵敏度。第二，采用i l s s m i t 方法，解决传统 分子印迹方法中因水溶性分子在有机介质中的溶解问题而难于被印迹的难 题，并积累一些有关水溶性分子印迹的研究成果和经验，为更多的m i p s 研究 者提供一种新的思路；第三，通过筛选合成水溶性分子的m i p s 的最佳路径， 四川i 师范大学硕士学位论文 可以为其它水溶性分子的印迹提供实验方法和理论依据，拓宽分子印迹的应 用范围，如环境水样中一些水溶性污染物的富集与分离。 1 2 离子液体辅助介质中抗h i v 药物分子印迹聚合物的合成及其在固相萃取中的应用 2 扎西他滨( d d c ) 分子印迹聚合物的合成、 2 1 扎西他滨( d d c ) 分子印迹聚合物的合成和 2 1 1 实验部分 l ，d 2 1 11 试剂与仪器 而氟 扎西他滨( z a l c i t a b i n e ，d d c ，分析纯，太原市瑞和丰科贸有限公司) 1 乙基3 甲基咪唑硫氰酸盐( e m i m s c n ，纯度= 9 7 ，上海成捷化学 有限公司) 1 丁基3 甲基咪唑四氟硼酸盐( b m i m b f 4 】，纯度= 9 7 ，上海成捷化 学有限公司) 1 丁基3 甲基咪唑六氟磷酸盐( b m i m p f 6 ，纯度- - - 9 7 ，上海成捷化学 有限公司) 甲基丙烯酸( m a a ，分析纯，成都市科龙化工试剂厂) 乙二醇二甲基丙烯酸酯( e g d m a ，纯度= 9 8 ，泸州化工科研所) 偶氮二异丁腈( a i b n ，化学纯，上海试四赫维化工有限公司) 甲醇( m e t h y la l c o h o l ，分析纯，天津大茂化学试剂厂) 乙酸( a c e t i ca c i d ，分析纯，天津大茂化学试剂厂) 甲苯( t o l u e n e ，分析纯，天津富宇精细化工有限公司) 乙腈( a c e t o n i t r i l e ，分析纯，天津大茂化学试剂厂) 丙酮( a c e t o n e ，分析纯，广州化学试剂厂) ( 2 ) 仪器 电热恒温水浴锅( h w s2 6 型，上海一恒科技有限公司) 恒温培养振荡器( z h w y 1 0 3 d ，上海智城分析仪器制造有限公司) 循环水真空泵( s h z 1 1 i 型，上海亚荣生化仪器厂) 红外光谱仪( d i 4 0 0 ，美国v a i l a l l 公司) 紫外可见分光光度计( u v - 1 9 0 0 ，日本岛津) 四川师范大学硕士学位论文 2 1 1 2 聚合物的制备 ( 1 ) 溶剂的选择 选用 e m i m s c n 、 b m i m b f 4 和 b m i m 【p f 6 三种离子液体( i l s