（分析化学专业论文）硅胶涂敷高效液相色谱固定相的制备及应用研究.pdf

摘要 聚合物涂敷硅胶是一种新型复合型液相色谱填料，它冈拓宽了硅胶的应用范围而引起人们的 广泛关注。本文综述了液相色谱填料的发展、涂敷硅胶的制备方法和研究进展；探索了一种新的 聚合物( 甲基丙烯酸环氧丙酯) 涂敷硅胶的合成方法，以此聚合物涂敷硅胶为基质采用新的化学改 性方法制备了一系列新型液相色谱同定相，并应用于生物火分子的分离纯化。本论文分以下几部 分： 首先，利用溶液聚合法和分散聚合法，以甲基丙烯酸环氧丙酯为单体，以甲基丙烯酸乙二醇 双酯为交联剂，制备了甲基丙烯酸环氧丙酯( g m a ) 涂敷硅胶。详细研究了聚合方法、单体浓度、 反应温度、反应介质、引发剂含量等对涂敷硅胶的影响，得出制备聚合物涂敷硅胶的最佳方法和 条件。 其次，以自制的甲基丙烯酸环氧丙酯( g m a ) 涂敷硅胶为基质，采用新的化学改性方法制备了 新型弱阳、强阳和弱阴离子交换色谱固定相，并用于生物大分子的分离。详细考察了它们的离子 交换特征、盐种类、p r i 值，流速等因素对蛋白质在色谱柱上保留行为的影响；结果表明，两种 阳离子交换色谱填料分离性能优良，化学稳定性好，可在p h = 1 1 的流动相中长期使用，适用于快 速分离，并将其应用于鸡蛋清中溶菌酶和胰蛋白酶粗品中胰蛋白酶的纯化，同收率均达9 0 以上。 但是阴离子交换色谱填料只能分离三种酸性蛋白，且重现性差，分析失败原冈提出改进方法。 最后，以自制的甲基丙烯酸环氧丙酯( g m a ) 涂敷硅胶为基质，制备了新型正相和疏水色谱填 料。分别考察其正相色谱性能和疏水色谱性能，结果表明止相色谱填料完全可以用丁碱性化合物 的分离，这是键合硅胶柱无法实现的；疏水色谱填料可以在1 1 分钟内分离人种蛋白( 包括疏水性 很强的胰岛素) ，比文献报道的分离时间短，有利于蛋白质的快速分离和纯化，并将其应用于鸡蛋 清中卵清蛋i 刍( o v a ) 的纯化，纯化后o v a 的纯度高达9 2 。 关键词- 高效液相色谱填料，聚合物涂敷硅胶，生物大分子分离 a b s t r a c t p o l y m e rc o a t e dp a c k i n g sa r en o v e ll i q u i dc h r o m a t o g r a p h i cp a c k i n g sa n dt h e yh a v ea r o u s e dw i d e l y i n t e r e s tt ot h ef i e l do fu s e di ns e p a r a t i o nm e d i a 1 1 1 i sa r t i c l es u m m a r i z e dt h ed e v e l o p m e n to fl i q u i d c h r o m a t o g r a p h i cp a c k i n g s ，p r e p a r a t i o na n dr e s e a r c hp r o g r e s so fs i l i c ac o a t e dh p l cp a c k i n g s t h i s t h e s i se x p l o r e dan o v e lk i n do fp o l y m e rc o a t e ds i l i c a b a s e do nt h i sm e d i a ，as e r i e so fn e ws t a t i o n a r y p h a s e sf o rh p l cw e r es y n t h e s i z e db yn e wc h e m i c a l l ym o d i f i e dm e t h o d s ，w h i c hc a nb ea p p l i e df o r s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no f b i o m a e r o m o l e c u l e t h et h e s i si n c l u d e st h r e ep a r t s 弱f o l l o w i n g ： f i r s t l y , t h ev i n y l s i l i c ar e a c t e dw i t hg l y c i d y l m e t h a c r y l a t e ( g m a ) t oo b t a i ng m a - c o a t e ds i l i c ab y s o l u t i o np o l y m e r i z a t i o na n dd i s p e r s i o np o l y m e r i z a t i o n p o l y m e r i z a t i o nm e t h o d ，m o n o m e rc o n c e n t r a t i o n ， r e a c t i o nt e m p e r a t u r e ，r e a c t i o nm e d i u ma n di n i t i a t o rc o n t e n tw e r ei n v e s t i g a t e dd e t a i l e d l y , a n dt h eb e s t m e t h o da n dc o n d i t i o nf o rp r e p a r a t i o no ft h eg m a - c o a t e ds i l i c aw e r eo b t a i n e d s e c o n d l y , n o v e lw e a kc a t i o ne x c h a n g e ，s t r o n gc a t i o ne x c h a n g ea n dw e a ka n i o ne x c h a n g eh p l c s t a t i o n a r yp h a s e ，w h i c hw e r ep r e p a r e db yc h e m i c a l l ym o d i f i e do fg m a - c o a t e ds i l i c a ，u s e df o r s e p a r a t i o no fb i o m a c r o m o l e c u l e n ee f f e c to fr e t e n t i o no fs t a n d a r dp r o t e i n s ，d i f f e r e n tk i n d so fs a l t s ，p h v a l u e ，f l o wr a t eo fm o b i l ep h a s ew e r ei n v e s t i g a t e di nd e t a i l s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h et w oc a t i o n e x c h a n g ep a c k i n g sh a v ee x c e l l e n ts e p a r a t i n gp r o p e r t ya n ds t r o n gc h e m i c a ls t a b i l i t y ( c o u l db eu s e di n m o b i l ep h a s eo fp h = llf o rl o n gt i m e ) t h e yw e r eo u t s t a n d i n ge n o u g ht o $ e l v ef o rp u r i f i c a t i o no fc r u d e p r o t e i n b u tt h ea n i o ne x c h a n g ep a c k i n g sj u s tc o u l ds e p a r a t et h r e ea d dp r o t e i n sa n dt h er e p r o d u c i b i l i t y i s b a d t h i r d l y , b yu s i n g g m a c o a t e ds i l i c a ，n o v e ln o r m a lp h a s ea n dh y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o n c h r o m a t o g r a p h i cp a c k i n g sw e r ep r e p a r e d t h ec h r o m a t o g r a p h i cb e h a v i o ro ft h en o r m a lp h a s ea n d h y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o np a c k i n g sw e r ei n v e s t i g a t e d 1 1 1 ep r e p a r e dn o r m a lp h a s ec h r o m a t o g r a p h i c p a c k i n g sc o u l dc o m p l e t e l ys e p a r a t eb a s i cc o m p o u n d s ，w h i c hw e r eb e t t e rt h a nt h es i l i c ab o n d e d p a c k i n g s t h eh y d r o p h o b i ci n t e r a c t i o nc h r o m a t o g r a p h i cp a c k i n g sh a sg o o da b i l i t yf o rs e p a r a t i o no fs i x k i n d so fs t a n d a r dp r o t e i n si ne l e v e nm i n u t e s ，t h et i m eo fs e p a r a t i o nw a ss h o r t e rt h a nt h er e p o r t e dp a p e r s ， a n di tu s e df o rp u r i f i c a t i o no fc r u d ep r o t e i n ，s a t i s f a c t o r yr e s u l t sw e r eo b t a i n e d k e yw o r d s ：h p l c ，s i l i c ac o a t e dh p l cp a c k i n g s ，s e p a r a t i o no f b i o m a c r o m o l e c u l e ， i i i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得宁夏大学或其它教育机构的学位或证书而使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的 说明并表示了谢意。 研究生签名：力鸪 时间： 脚年j 月7 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解宁夏大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送交 论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。同意宁夏大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位 论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 躲埘夥 导师躲嘭 时同： 瑚年 窍 e t 时间： 耐年奎月夕日 宁夏人学硕f 学位论艾筇一章绪论 1 1 引言 第一章绪论弟一早珀 1 = 匕 高效液相色谱是二十世纪七十年代以来发展最为迅速和应用最为广泛的分离技术之一，现已 广泛应用于石油化工、生物化学、临床医学、食品卫生、环境监测、医药工业、商品检验、地质 勘探、油田开发等领域的分离分析。然而面对科技的进步和工业生产的发展，人们对色谱技术提 出了更高的要求，其无论从技术到理论，到各种分离模式，还是在各个科学领域内的应用都得剑 了突飞猛进的发展【lj 。 目前现有的色谱技术已可以满足当前各个领域对色谱柱的需求；但生化分离的特殊要求、发 展新药和基冈组的研究，尤其是组合化学和蛋白质组学的研究，又对色谱柱提出了高效、高选择 性、快速分离与检测以及多通道快速分离分析等要求，因此色谱柱技术的改进与提高一直在不断 进行之中。 色谱柱是整个色谱系统的心脏，色谱填料又是色谱柱的核心。发生在色谱柱中的分离过程， 受热力学因素和动力学冈素的控制。在色谱分离过程中，色谱填料的物理结构是影响色谱动力学 行为的重要因素；填料的化学结构，特别是颗粒表面和内孔表面的化学结构，是影响色谱热力学 行为的主要冈素。色谱柱技术对于填料在物理性质方面的基本要求是：( 1 ) 具备合适的颗粒大小和 较窄的粒度分布范围，当然最好能实现颗粒单分散；( 2 ) 具备一定的颗粒强度，特别对于高效填料 来说，应能满足在高速高压操作条件下使用的颗粒刚性；( 3 ) 若为多孔结构的填料，则应达到一定 的孔径大小和孔径分布要求，并且应尽可能避免形态复杂的微孔结构；( 4 ) 在使用的条件下，填料 的溶胀或收缩现象不能超出所允许的限制范围。同时，液相色谱技术对其所使用的填料的化学结 构，既要求能在相应的色谱模式淋洗条件下，具有特定选择性分离作用，又要求具有良好的化学 稳定性和热稳定性，同时还要求能避免不可逆的非特异性吸附作用【2 】。但目前没有一种高效液相 色谱填料能完全满足这些要求。色谱填料的发展情况直接关系到色谱柱性能的提高。因此，在 h p l c 发展进程中关于高效液相色谱填料的开发与改进的研究工作非常必要，而且意义深远。 1 2 色谱填料的发展 液相色谱法是基于样品分子在固定相和流动相之间特殊的相互作用而实现分离的。液相色谱 分离技术的实旌，除了必要的输液系统，检测系统等设备之外，最关键的还需要有色谱柱，色谱 柱是色谱技术的心脏。色谱填料的研究、选择与应用是各种液相色谱方法赖以建立和发展的基础。 色谱填料若依其基质材料来分，可分为三大类，即无机基质填料、有机基质填料和无机一有机复 合填料。 1 2 1 无机基质填料 无机基质填料主要包括：硅胶、氧化铝、氧化锆、氧化钛、可控孔径玻璃、羟基磷灰石、石 墨化碳。 1 硅胶 宁夏尺学硕l 学位论文第1 幸绪论 在无机基质材料中最重要、最基本的是硅胶。正是微粒型硅胶的出现，促进了高效液相色谱 法的产生，同时碑胶也成为开发最早、研究最为深入、应用最为广泛的高效液相色谱填料。作为 分离材料基质的硅胶，有规则的几何形状，即球形硅胶更有利于传质，且使色谱柱的操作压力较 低；适宜的粒子大小及尽可能窄的粒度分布；适宜的孔径及孔径分布；适宜的孔度及比表面积。 硅胶表面含有丰富的硅羟基，这是硅胶可以进行表面化学键合或改性的基础。硅胶具有良好的机 械强度和热稳定性。然而，硅胶填料在色谱应用中存在两个难于解决的问题：( 1 ) 可使用的p h 范 围窄：一般只能在p h 为2 8 的流动相条件下使用。碱度过大，特别是当季铵离子存在时，硅胶 易于粉碎溶解；酸度过大，连接有机基团的化学键容易断裂。( 2 ) 硅胶表面残余的硅羟基和金属 离子等杂质的存在易对碱性物质，尤其是含氮化合物产生不可逆吸附作用，使生物大分子，特别 是多肽、蛋白质等样品产生变性和非特异吸附，造成峰形变差和回收率降低，限制了硅胶基质填 料在生物体系分离分析中的应用【3 】。为此，色谱工作者一直致力于改进和完善硅胶基质填料的研 究工作。 2 氧化铝 氧化铝表面上也含有活性羟基位点，机械强度高，在p h = 1 1 2 的宽p h 值范同内均很稳定， 它所具有的稳定性和对一些化合物的独特的选择性，有时恰好与硅胶具有互补性【4 1 。p e s e k 5 】利用 氧化铝与二氯亚砜反应，再与丁基锂反应，所制备的丁基化氧化铝填料以反相模式分离蛋白质特 别是碱性蛋白质时，可得到对称性的峰，表明这种填料对生物大分子的非特异性吸附很小。以碳 八链和碳十八链为配基的烷基化氧化铝已合成且被用于反相模式的分离，结果表明，氧化铝基质 的反相填料的化学稳定性，特别是碱性介质中的稳定性比硅胶填料好。氧化铝独特的特性使得氧 化铝类填料有可能成为硅胶类固定相的一个重要补充。但是，氧化铝在p h 值大于1 2 及小于3 时，表现出一定程度的可溶性。与硅胶相比，氧化铝的表面化学修饰要困难得多，使得氧化铝多 使用于一些小分子有机化合物的分离，在生化分离上则使用较少。 3 氧化锆 二氧化锆独自作为h p l c 填料的研究始于1 9 7 9 年【6 】，在低l 绷b q ( 9 m 2 g ) 的氧化锆上吸附季 铵盐以形成反相结构，并对其h p l c 中应用的可能性进行了初步探讨，然而在随后儿年里很少有 这方面的研究报道。然而自1 9 8 9 q = u n g e r 7 1 和c a 一剐报道了二氧化锆的h p l c 研究以来，人们又对 它表现了极大的兴趣。氧化锆具有极好的耐酸碱稳定性，二氧化锆基质柱填料在i m o l l 氢氧化钠 溶液中于1 0 0 。c 下淋洗数小时都不变质【9 , 1 0 ，p h 值使用范围达1 1 4 ，机械强度高，耐高温，粒径、 孔径可控，适合于生物工程产品的分离，在正相色谱中由于对氨基等碱性基团无吸附而具有很好 的峰对称性，在做离子交换色谱填料时，是无需键合的。氧化锆表面既存在酸性位点又存在碱性 位点，在它表面上可以发生四种l e w i s 酸碱作用，它们的这种特殊的化学表面性质使其同时具有 阴离子和刚离子交换特征。b l a c k w e l l 等l 在流动相中加入强l e w i s 碱，如f 等，消除了氧化锆基 质的l e w i s 酸中心，使固定相的保留机理类似于羟基磷灰石。但是，由于氧化锆比表面积低，在 氧化锆表面很难得到与硅胶上类似的表面键合，限制了其通用性。 4 氧化钛 氧化钛是八十年代后期开发出的具有发展前景的新型基质填料，它表面具有很强的亲水性、 2 宁夏人学硕l ：学 t 论艾第一一节绪论 曼曼皇鼍i i。! i iii iiii i i i 曼璺窟曼曼曼曼曼曼曼! 曼曼曼皇篡 良好的耐腐蚀性、较高的化学稳定性、热稳定性、无毒、高分散等独特的性能而应用于色谱分离 中，甚至有望在某些领域，特别是在生命科学中成为取代或部分取代硅胶的基质。 t a n i t l 2 l 通过水解正硅酸乙酯和正钛酸丁酯得到平均粒径为4 4 u m 的s i 0 2 和3 7 岫的t i 0 2 ，键合 十八烷基后分离硝基苯衍生物，发现两种填料的保留行为差异较大。t a n i 等【l3 1 以氧化钛为同定相， 通过改变酸度分离了无机阴、阳离子。但是t i 0 2 表面非常活泼，水分子既能以分子形式在其上吸 附，也能以解离方式在其上吸附。羟基基团既能接受一个质子成为阳离子，也能给出一个质子成 为阴离子。这些使t i 0 2 表面羟基的状态变得异常复杂和难丁二清楚表征。因此，用作h p l c 柱填料 的二氧化钛的制备及改性尚未成熟，仍处于探索和研究阶段。 5 可控孔径玻璃 可控孔径玻璃表面具有可以进行修饰与衍生的游离硅羟基，可以通过化学修饰方法得到具有 不同官能团的表面，因此它是几乎可以用丁所有色谱模式的色谱填料的基质。它的机械强度高， 耐受非常剧烈的、反复的处理和操作，孔径分布窄而均匀。这样的特性使得它可以应用于酶的固 定化、色谱填料、催化剂载体、化工分离等众多领域。例如，使用7 肚m 填料，以5 e m 短柱，在 l o m i n 内将6 种标准蛋白质完全分离。将可控孔径玻璃用于疏水作用色谱的基质材料，键合上聚 乙二醇配基，可以仅以改变盐浓度的方式分离蛋白。以胰蛋白酶为样品，经可控孔经玻璃基质的 疏水色谱分离后，其活性同收率接近1 0 0 t 1 4 l 。但是它表面游离的硅羟基会造成对强极性物质的 非特异性吸附乃至蛋白质的变性失活，且它的p h 值适用范围较窄。加之，制造成本高，限制了 它更广泛的使用。 6 羟基磷灰石 羟基磷灰石是一种不经表面化学修饰而直接用于液相色谱填料的基质，它具有很好的生物兼 容性，很高的吸附容量，在大多数情况下对蛋白质的非特异性吸附极低，分离诸如酶、抗体等物 质时，可获得很高的活性回收率。 自t i e s h u s ”j 首次将羟基磷灰石应用于高效液相色谱分离生物大分子以来，以羟基磷灰石为 基质的填料成功地分离了黑色素瘤、单克隆抗体和肉毒碱衍生物【l6 1 、核酸、天然d n a 和r n a 及变性的d n a 和r n a 。目前，羟基磷灰石填料主要用于生物分子的分离和分析，特别是多肽、 蛋白质及糖类的分离与纯化。在蛋白质分离纯化方面的应用中，酶和抗体的分离中应用最多。用 羟基磷灰石分离单克隆抗体具有简单、快速、高效和成本较低的特点。然而羟基磷灰石耐酸性不 佳，处理后的耐酸能力也仅能达剑p n = 4 0 ，限制了它在酸性条件下的应用。 7 石墨化碳 由于石墨化碳具有良好的稳定性，吸附性和选择性，而被应用于液相色谱领域中。石墨化碳 是通过分子间相互作用而对溶质进行分离的1 7 , 1 s ，其优点是在很宽的p h 值范围内都可使用n 9 l ； 可获得完全非极性的反相高效液相色谱固定相，用于分离结构相似的化合物( 包括同分异构体) 、 苯胺衍生物和各种药物 2 0 , 2 1 】。在石墨化碳反相色谱中，随着溶质极性加大，保留反而增强。这种 现象可以称之为“石墨表面的极性增强效应”，这种特殊效应，使得它可以分离些重要强极性 化合物，如糖、多羟基、多羧基和多氨基取代的化合物以及表面活性剂等。u n g e r 等人【2 2 1 和k a 一2 3 1 对多孔石墨化碳的制备及其在高效液相色谱分离中的应用进行了综述。石墨化碳表面由片层状的 3 宁夏人学硕i j 学1 近论文第一帝绪论 六方晶体的碳所组成，因而不同于硅胶无规则非晶犁的表面，它的表面是规则、均匀、平坦的。 但石墨化碳不存在活性位点，对其改性很困难，不易重复，不能承受规模级的溶剂洗脱，并且很 难使石墨化碳颗粒的刚性结构、大比表面积、孔的中一性和表面组成单一性等多方面协凋【2 4 1 。因 此，活性炭同定相的应用还是受到了限制。 1 2 2 有机基质填料 常见的有机高分子类的基质树酯，大体上可为多糖型和聚合物型两火类。前者是以天然多糖 化合物为原料，用物理方法加工成微球并经交联而得到的凝胶；后者是以合成单体与交联剂为原 料，用化学聚合方法制得的交联高聚物微球。 1 多糖型基质填料 多糖类软质凝胶主要包括葡聚糖( s e p h a d e x ) 、琼脂糖( s e p h a r o s e ) 和纤维素( c e l l u l o s e ) ，它们 普遍具有很好的亲水性和生物兼容性，而且对样品的负载量高，价格也便宜，被广泛用丁各种生 化物质的分离纯化，主要应用于生物大分子的低中压液相色谱的分离和制备【2 5 1 ，具有分辨率好， 选择性高，颗粒分布窄，柱压低等优点。 2 聚合物型填料 聚合物微球柱填料早在6 0 年代初就已用于商品化仪器中，普遍使用的聚合物填料是苯乙烯一 二乙烯苯的共聚物，这类填料化学稳定性好，价格便宜，但疏水性强，不适合用于生物人分子的 分离。近年来发展了更多类型的有机聚合物填料，如聚丙烯酸酯类、甲基丙烯酸酯类、聚乙烯醇 类、苯乙烯和甲基丙烯酸酯一二乙烯基苯的共聚物。聚合物微球被广泛地用作各种色谱技术的填 料【2 6 】。有机聚合物柱填料与硅胶基质相比，其色谱性能有如下优点：( 1 ) 柱的重现性好；( 2 ) 柱寿 命长；( 3 ) 样品负载量高；( 4 ) p h 值范围宽。因此，其在生命科学领域的研究很活跃。然而，多数 聚合物填料有其难以克服的弱点：一是在不同的溶剂中溶胀收缩差别很大，难以进行梯度淋洗； 二是其机械强度远远不如硅胶，即抗压性差，长期使用会使死体积增加并产生沟流：三是在反相 色谱中保留时间过长，常常出现峰形不对称。由于这种原因，这类填料多用于低柱效、高选择性， 并伴有强酸强碱流动相的色谱分离中。时至今日有机聚合物填料的使用也不足2 0 。 1 2 3 无机一有机复合填料 无机一有机复合填料是以无机材料为载体，通过物理或者化学方法制各成核一壳结构的复合粒 子或在其表面覆盖一层有机聚合物薄膜。无机材料基质经聚合物包覆后，其表面的羟基可以很好 的被屏蔽，从而避免了无机基质表面羟基与溶质的相互作用。无机一有机复合填料已在光学器件、 分离、药品、农业、涂料等很多领域有广泛和潜在应用2 7 捌，它将是以后色谱填料的一个重要发 展方向。万剑砥等 2 9 , 3 0 制备了m 9 0 2 、s i 0 2 - z r 0 2 复合氧化物色谱填料，并从制备、表征到 正相、反相色谱性能等方面进行了较为系统的研究，并利用溶胶一凝胶方法制备了z 内2 - a 1 2 0 3 复 合氧化物微球，研究了其物理性质、化学性质和色谱性能。无机一有机复合填料作为一种新型的 色谱填料，将是以后色谱填料的一个重要发展方向。这类固定相有以下优点： ( 1 ) 同时兼备无机载体的刚性和聚合物填料的化学稳定性； 4 宁疆人学 够! i 学 墨论文第一帚绪论 ( 2 ) 聚合物所含功能基几乎不受限制，此类固定相很容易具备不同的官能团； ( 3 ) 有机聚合物膜是纳米级的，它在流动相中的溶胀几乎可以忽略； ( 4 ) 核壳结构的复合粒子单分散性好，粒度均匀。 1 3 硅胶表面改性的研究 硅胶基质的液相色谱固定相网具有很好的机械强度，耐高压，溶胀性小，占h p l c 固定相的 9 0 i ”】。作为色谱填料的硅胶均需进行改性修饰，以适应于各种色谱模式的分离之需。随着改性 方法的完善，硅胶基质的缺点逐渐得到克服，并因分离对缘的扩大，其需求将日益增加。这种改 性般可通过三种途径进行，即表面化学键合，整体改性和聚合物涂敷。 1 3 1 硅胶的表面结构及化学键合 硅胶表面有丰富的硅羟基和暴露于表面的s i o s i 键，硅羟基具有较高的反应活性，硅胶微 粒的表面( 主要指孔的表面) 一般含有下图所示的四种硅羟基，其中游离型硅羟基比例较少，然而 其酸性最强，对硅胶微粒的表面极性贡献最大，对色谱性能影响也最人。 0 h l s i i h o ,d h s i h h 、o 甲甲 - - s i o s i il 游离型挛位型邻位型 h 一h g ，、 o oo o li s i 一0 一s i il 氢键型 图l 一1 硅胶表面不同类型的硅羟基 f i g 1 - 1d i f f 饿n tk i n d so f s i l a n o lg r o u p si ns i l i c as u r f a c e 化学键合固定相大致可以分为以下三种类型： ( 1 ) 以s i - c 键直接进行的化学键合 硅羟基通过卤素的取代反应氯化后，再与有机锂或格氏试剂反应可制得s i - c 键合相。从理论 上讲，以s i c 键制备出来的键合相，应属于刷型结构，且具有单分子键合层的填料。其稳定性和 传质均很好，耐高温，在高达3 0 0 下使用也不容易发生水解。但是，使用格氏试剂很不方便， 制备步骤比较繁琐，且硅胶和所用试剂均须保持干燥，否则会生成许多不期望的副产物而影响最 终产品的质量。因此，在实际制备填料时，多不采用这种化学键合相。 ( 2 ) 以s i - x r 型结构进行的化学键合 s i - x r 型化学键合相包括s i o - c 和s i - n c 两种。含s i - n c 键的填料，因其较窄的p h 使用 范围( p h = 4 - - 8 ) 而未被普遍使用。含s i - o - c 结构的填料是一种硅酸酯型的填料，它是色谱发展早 期所使用的填料之一。其特点是柱效较高，但稳定性较差，现在已不大应用了。 ( 3 ) 以s i - o s i - c 型进行的化学键合 s i 0 s i - c 是以有机氯硅烷或者有机烷氧基硅烷与硅胶表面硅羟基反应，生成的s i 0 s i - c 化 5 宁爱人学顾l ：学位论文第帚绪论 学键合相。这种键合相以其结构优良和制备方便的优点，得到最广泛的应用，是化学键合硅胶最 主要的结构形式。 有机氯硅烷虽然是常用的硅烷化试剂，但是它有一些明显的缺点。有机氯硅烷会和空气中的 微量水反应，放出具有腐蚀性和刺激性的h c l 气体，易对环境和人造成污染和危害。制各过程中 放出的h c i 还会强烈地吸附于所制备的填料中，从而造成s i o s i c 键的断裂。 有机烷氧基硅烷对环境和人体的危害性要小得多，因此广泛地使用在反相色谱、离子交换、 疏水作用、凝胶过滤以及亲合作用等色谱填料的制备中。然而在实际应用中，特别是在生化体系 的分离中，经常需要使用较高的p h 值。甚至，有的生物大分子在制备过程中，需要以稀n a o h 溶 液除去杂蛋白对体系消毒。这样就限制了硅胶基质的化学键合填料在某些领域中的应用。 完全羟基化的硅胶表面的硅羟基浓度8l u m o 1 2 ，这就意味着所有的烷基配基都按最紧密的 竖直排列方式覆盖在硅胶表面，则恰恰是8 p m o l m 2 ，但是由于空间位阻，在键合硅胶中很难达到 这一数值，就会有大量未反应的残留硅羟基。在分离碱性和极性物质时，常常出现严重的拖尾现 象，从而限制了分离效率，给组分定量带来困难。 1 3 2 硅胶整体改性 硅胶整体改性产生的硅胶整体柱具有高速、低压、高效、适于极性和流速梯度洗脱、机械强 度高，柱性能稳定等诸多优势，这使其很适合高通量分析和快速分离，在分离领域中发挥着越来 越重要的作用。 硅胶整体柱的制备方法一般采用双宫能团或三官能团的有机硅烷的白缩聚反应和溶胶一凝胶 反应。溶胶一凝胶法的基本过程为：易于水解的金属化合物( 无机盐或者金属醇盐) 在某种溶剂中 与水反应，发生水解和缩聚过程而逐渐胶化。事实上，醇盐的溶胶一凝胶化过程是在较低的温度 下进行的，它是一种通过溶液中的化学反应合成无定形网络结构的过程，区别于溶液的析晶过程， 该技术的关键在于获得高质量的溶胶和凝胶。 硅胶整体柱孔径均匀，机械性能好，同时由于硅胶紫外透明，因此可以直接用于柱内检测。 它的缺点是有一定的p n 使用范围限制，p h 使用范围一般是p h - - 4 9 。 1 3 3 聚合物涂敷 聚合物涂敷型填料既是硅胶改性的一种方式，又是一种无机一有机复合型材料。它兼备无机 基质的刚性和有机涂层的化学稳定性，其特点是在硅胶表面包上一层薄的聚合物膜，避免洗脱液 与硅胶的直接接触和溶质与硅羟基间的诈特异性吸附。此类同定相将硅胶基质和聚合物基质固定 相的诸多优点结合起来。 聚合物涂敷法依据所用有机物和涂敷方法的不同，通常把聚合物涂敷填料的制备方法分为物 理涂敷法和化学涂敷法。物理涂敷法是将聚合物以物理吸附的形式覆盖在硅胶的表面。按其制备 过程的不同可以分为以下两种： 一、物理涂敷法 ( i ) 把有机物单体直接物理吸附在载体上，然后发生聚合、缩聚反应，形成聚合物层。 h o r v a t h l 3 2 1 等把苯乙烯与- - 7 烯基苯的混合物聚合于改性后的微粒多孔硅胶时，发现硅球孔 6 宁夏人学硕f 学位论文第一章绪论 体积和比表面积减少，引起同定相峰容量降低，且孔中的聚合物块可导致严重的慢传质等不良效 应，从而使柱效降低。s u z u k y 等 3 3 1 将该方法加以改进，把氯甲基苯乙烯和二乙烯基苯溶于n n 一 二甲基甲酰胺中，加入硅球搅拌，慢慢使溶剂挥发，使单体吸附于多孔硅球表面并聚合。过量的 单体用溶剂洗涤，过滤除去，但硅胶的比表面积与孔容仍有减少的趋势，且很难避免孔中聚合物 块的形成【3 3 3 4 】。 ( u ) 将有机单体预先聚合或缩聚成聚合物，再物理涂敷于基质表面。h i a t t 等【35 】把聚乙烯氧化 物用动态涂敷法涂于多孔玻璃珠表面，在分离时阻止了载体对病毒的吸附。s h c o m b u r g 等【3 6 】将硅 胶置于溶有有机单体的溶剂中，缓慢蒸发溶剂，使有机单体均匀涂敷在硅胶表面，再通过加热使 有机单体聚合。这种方法简单，可适用于任何无机基质和不同的可交联的聚合物。a n a z a w a 等1 3 把甲基八烷基聚硅氧烷涂敷于多孔硅球上制得反相色谱确定相，考察了涂敷量对硅球比表面积、 孔径、孔容的影响，发现随着硅球表面涂敷量的增大，硅球的比表面积减小，孔径增大，孔容减 小，可见部分聚合物堵塞了硅球孔，造成硅球比表面积和孔容减小。另外，由于交联的聚合物形 成一部分孔，使平均孔径增大。 物理涂敷型固定相虽然克服了硅胶基质的部分缺点，但也存在以下不足： ( 1 ) 在不同的有机溶剂流动相中，聚合物层易流失； ( 2 ) 基质表面的聚合物易形成不均匀的覆盖层； ( 3 ) 在分离碱性、极性溶质时，溶质与硅羟基之间仍然有非特异性吸附； ( 4 ) 堵塞在硅胶孔中的聚合物往往引起同定相的传质慢和柱容量的降低。 二、化学涂敷法 化学涂敷法即通过化学反应使聚合物层以化学键形式与基质相连而制备同定相的方法。按其 制备途径的不同，可分为两类： ( i ) 将硅球与含不饱和双键的硅烷化试剂发生键合反应，生成的键合相再与带不同官能团的 有机单体共聚。左育民【3 8 】以硅胶为基质先键合上一层硅烷化试剂，然后将其与二乙烯基苯交联共 聚制备成反相色谱填料用于有机小分子的分离。 硅烷化的作用，一是给硅胶基质提供活性基团以参与和有机单体的共聚；二是更大程度地减 小了溶质与硅羟基间的1 f 特异性吸附1 3 9 1 。 ( i i ) 化学涂敷法的另一途径是，将有机单体与硅烷试剂预先共聚，聚合物再通过化学反应与 硅胶基质相连。k u r g a n o v 等 柏】描述该类反相填料的合成方法，他们把苯乙烯和甲基乙烯基二乙氧 基硅烷的共聚物化学涂敷至硅胶表面制得反相固定相。可以想象，每条共聚链与硅羟基均形成几 个共价键，所以该类固定相耐碱性能良好，并具有很好的化学稳定性。 与物理涂敷法相比，此类固定相稳定性好，不易流失，且表面的聚合物层能有效覆盖硅胶表 面的硅羟基，在分离极性化合物和碱性化合物时色谱峰对称性好。与键合硅胶相比体现出诸多优 越性： ( 1 ) 溶质与基质之间的不可逆吸附小，在高效液相色谱应用过程中可以被忽略； ( 2 ) 适用的p h 值范围较宽； ( 3 ) 可制得不同容量的固定相； ( 4 ) 制备方法简单，易重复，且重现性好； 此类固定相具有很大的发展潜力，本文在前人已有的研究基础上，对此类固定相进行了深入 7 宁夏大学硕l j 学f 囊论文第一章绪论 研究。 1 4 本课题的研究意义、目的和内容 随着液相色谱技术的发展和分离范围的拓宽，特别是液相色谱技术在生物化学领域内的推广 及分析分离问题的出现，人们正在努力寻找更理想更能解决新问题的新型色谱填料。到目前为止， 大部分的色谱填料是以硅胶为基质的，这类固定相具有高效、高选择性、耐压等优势，但这类同 定相在实际应用中也存在一些不足，如只能在p h 值为2 8 的范围内操作，p h 8 时，硅胶本身不稳 定易溶解；p h n i - h + n a + ，这与阳离子交换色谱 的置换规律相一致。本实验选用k c ! 可以达到较好的分离效果。 4 3 5 离子交换填料的动态吸附容量 柱容量是离子交换色谱同定相的一个重要性能指标，色谱柱的动态吸附容量是在某种流动相 2 5 8 6 4 2 0 8 6 4 2 o i i l 宁夏大学形! f 学佗论文第阳节以涂敌犁符胶为琏顾的强阳离r 交换色谱陶定市兀的制需及j 够用 !iiiii 一i i i , , i i 鼍! 罡! ! 舅 中测得的填料对某种样品的吸附量，其值随测定方法、流动相的成分和样品的变化而变化，该结 果用动态吸附曲线表示。图4 4 为s c x ( 1 0 x o 4 6 c m i d ) 柱，流速为o 5 m l m i n ，流动相为2 0 m m o l l n a h 2 p 0 4 + 2 0m g m ll y s ，测定的填料的动态吸附容量，该填料的动态吸附容量为 4 3 5 8 m g g ，高于文献报道的硅胶键合强阳离子交换色谱同定相的吸附容量1 6 引。 图4 - 4 吸附量测定突破曲线图 f i g 4 - 4b r e a kt h r o u g hc u r v eo fl y sa taf l o wr a t eo f 0 5 m l m i n 4 3 6 强阳离子交换柱对标准蛋白的质量回收率 表4 2 为四种蛋白在硅胶涂敷强阳离子交换柱上进行的三次平行测定的质量同收率，可以看 出，其质量同收率 9 3 。这进一步表明，所合成的两性离子交换固定相的1 f 特异性吸附非常小， 亲水性强。 表4 2 蛋白质在强阳离子交换柱上的质量回收率 t a b l e4 2m a s sr e c o v e r yo f f o u rp r o t e i n sb yu s i n gt h es i l i c ac o a t e ds c xc o l u m n 蛋白质( p r o t e i n s )质量i 口j 收率( r e c o v e r y ( ) ) 4 3 7 硅胶涂敷强阳离子交换柱对蛋白质纯化的应用 本文用自合成的涂敷型强阳离子交换色谱柱在l o m i n 姨对胰蛋白酶粗品中的胰蛋白酶进行分 离纯化。根据蛋白质的性质和p h 值的相互关系，在色谱运行过程中，选择流动相的p h 为7 。目标 蛋白质是胰蛋白酶( p i - 7 8 ) ，它的分离纯化在p h 值小于p i 的环境中；而其它杂蛋白在p h 大于p i 的 条件下分离，因而目标蛋白质胰蛋白酶在阳离子交换柱上保留非常强，有利于它的纯化。采用离 子强度梯度洗脱，图4 5 是胰蛋白酶分离纯化图。收集纯化后的胰蛋白酶馏分，用s d s p a g e 检测 收集液中胰蛋白酶的纯度( 图4 6 ) ，纯化后的胰蛋白酶的纯度达到了9 0 。 圣耋茎窒：，茎錾耋耋 篓塑薹坠耋塞呈茎垩耋薹些墼耋呈銎耋茎耋堡耋坚塞塑墼些耋篓i 星 呻1 图t 5s c x 柱对胰蛋白酶租昌十的胰白酶 快速# 离纯化目 f i 9 4 c h r o m a t o g m m o f t h e r y p s i n “t m c t b ys c x i 杂* 1 ；1 ；2 t o p gj n 4 4 小结 图4 胰白m 粗品中的胰蛋白酶的s d s p a g e 自泳图 f i g46s d s - p a g ea n a l y s i s o f e g g w h i t e l m m n i lr , s m , 2 t i n ；3o u t c l 1 以甲基丙烯酸环氧丙醑凉散硅胶为基质，台成了新型涂敷型强阳离子交换色谱填料，测试 了填料的分离性能，考察，小l 埘流迷对蚩白分离散果的影响，及不同口h1 直和不同盐种类对蛋白 保留的影响，结果表明所台成的滁救型强刚离f 交换色谱崮定相完争符合蛋f i 在刚离子变换色 谱填料上的保留规律，姓一种性能优异的新理填料。 2 以涂敷璎强离子交换色谱填料为介质，测试了蛋白质的质精同收率和动态吸附窭量，井 将其用1 胰蛋白酶租拈中的胰垒自酶的分离纯化地化后的胰蚩白酶具有较高的纯度。实验结果 表蜡，所台成的s c x 枉只有优良的刚离子空换色谱性能，可以刚r 胰蛋向酶的分离纯化。 宁夏大学硕l + 学位论文第五章以涂敷掣砰睃为链质的弱阴离了交换色讲附定桐的制需及膨用 第五章以涂敷型硅胶为基质的弱阴离子交换色谱固定相的制 备及应用 5 1 引言 阴离子交换树脂具有广泛用途，如可用于工业水处型删，有机药物及生化产品【6 8 】的分离纯 化等，尤其是在生物技术制取蛋白质的多级纯化过程中，阴离子交换树脂也是分离生物入分子中 应用很广的一种模式。目前在高效液相色谱法中盛行的柱填料主要是孔径为6 - - 1 0n m 的多孔硅胶 微粒、高分子微球、少量氧化物基质填料和多孔碳填料。 硅胶键合离子色谱固定相同聚合物微球固定相相比，具有不溶胀、耐压等优点，而且具有良 好的传质特性，这是因为分析物易于通过相对较人的孔进入到离子交换部位上去。因此，该类固 定相能极好地分离生物大分子。硅胶键合离子交换色谱l 司定相的缺点是残留硅羟基对生物大分子 产生非特异性吸附，且不能在强酸、强碱介质中操作。为了克服上述弊端，多年来研究人员进行 了大量的研究，找到了一些改进的方法。本文将亲水性强的甲基丙烯酸环氧丙酯涂敷于大孔硅胶 上可以克服以上弊端，使硅胶基质的离子交换色谱固定相的应用范围更广。s c h o m b u r g e 6 9 】把聚乙 二胺丁二烯涂敷于硅胶，制备出强阴离子交换色谱同定相，对几种常见的无机离子进行了分离。 以涂敷型硅胶为基质的弱阴离子交换色谱填料，目前还没有文献报道。 本章以自合成的涂敷型硅胶为基质，采用两种改性方法，合成新型涂敷型弱阴离子交换色谱 固定相。但是这两种方法都没有达到很理想的分离效果，只在此做简单介绍。 5 2 实验部分 5 2 1 仪器与试剂 二乙胺( 上海化学试剂总厂，分析纯) ，3 3 n ( c h 3 ) 2 水溶液( 国药集团化学试剂有限公司，化 学纯) 。三羟基甲基氨基甲烷( t r i s ) ( 西安化学试剂厂) 标准蛋白质均购自美国s i g m a 公司：卵清蛋白( o v a ，鸡蛋清) ，牛血清白蛋白( b s a ，牛) ， p 乳球蛋白( 1 3 - l a c t ，牛奶) ，伴清蛋白( c o n ，鸡蛋) 。 其他主要试剂与仪器同第三章。 5 2 2 两种涂敷型弱阴离子交换色谱填料的合成 1 涂敷型弱阴离子交换色谱填料州ax 1 ) 的合成 取2 0g 聚合物涂敷硅胶放入圆底烧瓶中，加