（植物学专业论文）悬铃木果实生长发育的化学调控.pdf

摘要 本文以南京市郊公路边的生长2 0 3 0 年的二球悬铃木( 尸，口疗m 刀“s 办f s p 口挖f c 口) 为研究对象，采用化学调控的方法，研究多种植物生长调节剂等化学药剂对悬铃 木果实生长发育的影响，从而为悬铃木果毛污染的控制提供理论和技术依据。 本文实验地分a 、b 两个区，分别研究不同的化学药剂对悬铃木当年和次年 果实生长发育的影响。主要研究结论如下：( 1 ) 在a 区9 个药剂组合中，与c k 相比，e t h ( 4 0 ) 和e t h ( 1 0 ) + 草甘磷( 1 0 ) 的处理效果最佳，使悬铃 木当年果实减少率达7 0 以上，对悬铃木叶片的副作用相对较小，明显抑制了悬 铃木当年果实的生长发育生理指标测定结果表明：a 区这两种处理的悬铃木果 实鲜重和含水率明显降低，细胞质膜透性明显增大，可溶性蛋白质和可溶性糖含 量降低；s o d 活性降低，p o d 活性增强；超微结构的观察表明：e t h ( 4 0 ) 和 e t h ( 1o ) + g l y ( 1 0 ) 的处理使得悬铃木的小坚果皱缩细小，果序轴细胞出 现核质不丰富、细胞质降解等衰老性状。( 2 ) 在b 区3 0 个不同药剂及浓度的组 合中，与c k 相比，g a 3 ( 2 0 0 0 0 m g l ) 、g a 3 ( 4 0 0 0 0 m g l ) 以及2 硫尿嘧啶 ( 2 0 0 0 0 m g l ) 的处理效果最佳，使得次年新果与老果的比值减小了5 0 ，比较 明显的抑制了悬铃木次年果实的生长发育生理指标测定结果表明：b 区这几个 处理的悬铃木芽和果实的可溶性蛋白质含量升高，可溶性糖含量降低，s o d 活 性降低，p o d 活性增强。 关键词：二球悬铃木；果实；生长发育；化学调控 英文缩写 0 d e d t a n b t f w c k s o d p o d d b h e t h 2 4 一d g l y t c a g a p p 3 3 3 m h b 9 f n b t f n a t d p f n r n o f 缩略词表 中文名称 光密度 乙二胺四乙酸 氯化硝基四氮唑蓝 鲜重 对照 超氧化物歧化酶 过氧化物酶 胸径 乙烯利 2 ，4 一二氯苯氧乙酸 草甘磷 三氯乙酸 赤霉素 多效唑；氯丁唑 青鲜素；马来酰肼； 二甲基氨基琥珀酰胺酸 处理前球果数 处理后球果数 果实减少数 新老果比例 英文名称 o p t i c a ld e n s i t y e t h y l e n ed i a m i n e t e t r aa c e t i ca c i d n i t r o t e t r a z o l i u mc h l o r i d e b l u e f r e s h w e i g h t c o n t r o l s u p e r o x i d e p e r o x i d a s e d i a m e t e ra t e t h r e l d i s m u t a s e b r e a s th e i 曲t 2 ，4 一d i c h l o r o p h e no x y a c e t i c a c i d g l y p h o s a t e t r i c h l o r o a c e t i ca c i d g i b b e r e l l i n s p a c l o b u t r a z o l m a l e i ch v d r a z i d e d i m e t h v la m i n o s u c c i n a m i ca c i d f r u i tn u m b e rb e f o r et r e a m e n t f r u i tn u m b e ra f t e rt r e a m e n t d e c r e a s e dp e r c e n to ff l r u i tn u m b e r r a t i oo fn e wa n do l df r u i t 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行的研究工作 所取得的成果。尽我所知，除文中已经特别注明引用的内容和致谢的地方外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做 出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式注明并表示感谢。本人完全意 识到本声明的法律结果由本人利旦。 学位论文作者( 本人签名) ：问聿乞沙孑年占月沙日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解南京林业大学有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版( 中国科学技术 信息研究所；国家图书馆等) ，允许论文被查阅和借阅。本人授权南京林业大学 可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以汇编和综合 为学校的科技成果，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论 文全部或部分内容。 保密口，在年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密刚 ( 请在以上方框内打。 ” ) 学位论文作者( 本人签名) ：问建- 指导教州本人签舢冲研 y 懈z 月w 日 州多年莎月嵋日 致谢 光阴荏苒，岁月如箭，三年的研究生生活己经接近尾声，回首往事，历历在 目，感慨颇多。但是，令我最难以忘怀的是，身边有很多热心人给我关心与帮助， 使我在求学路上顺利走过，能顺利完成本次论文。 首先，感谢我的导师谢寅峰副教授! 谢老师积极进取的工作态度、严谨务实 的科研精神以及宽容的胸襟、朴实的风格、做人的态度深深地感染了我，时刻激 励我知难奋进、孜孜以求。同时，谢老师在论文的方案拟定、实验操作及论文的 定稿等过程中对我进行了悉心的指导，给我无私的帮助，使得我的论文得以圆满 完成。在此特向导师致以最崇高的敬意! 特别感谢南京市园林科学研究所的苏纪申所长及其员工们，感谢他们在实验 样地选择、药剂的注射和采样过程中的大力支持和鼎力相助，感谢他们在实验过 程中的不辞辛苦和团结协作! 感谢南林大森林资源与环境学院植物教研组的何开跃老师、尹增芳老师、陈 颖老师、汪志农老师、陆晓燕老师及彭冶老师等在实验理论和物质方面提供的帮 助，使得实验得以顺利进展。 感谢南京林业大学徐力安老师及南京农业大学蔡庆生老师对本实验的特别 关注及提出的宝贵建议。 感谢南林大电镜教研室的徐柏森老师及杨静老师，感谢她们为完成本实验给 予的无私的实验指导和技术支持。 感谢师兄林候、师姐徐丽、汤玉香，同学杨万红、王莹、毕慧敏以及师弟李 博、蔡贤雷、师妹姚晓华等，感谢一起完成本实验的本科生赵娇、钱向科、吴东 霖、徐新等，正是因为有了他们的大力协助和热情帮助，我的实验和论文才得以 顺利完成，在此向他们表示衷心的感谢! 感谢我的师母及其家人孙军、孙浩文等，是她们在生活上给了我无私的帮助， 在精神上给了我莫大的支持，使我终生感激不尽。 感谢我的亲密室友严海宁，是她陪伴了我三年的学习生活，并给了我学习和 生活上的热情帮助；感谢南林大森环院打印室的支宝庆、崔文霞等为完成本论文 所做的图片整理及排版工作，在此期间与她们建立的友情将终生受益无穷。 感谢南京林业大学森林资源与环境学院这个大家庭培养了我，今后无论我走 到哪里，都会以南京林业大学森环院为荣! 最后，感谢我的家人三十年来，我成长的每一步都倾注着父母的心血与期 盼，是他们给予了我最无私的爱与关怀，无怨无悔地陪我走过每一步，感谢他们 不辞辛苦对我和我的小女儿的抚养和教育；感谢我可爱的女儿，是她的聪明乐观 健康懂事，使我的学业少了很多后顾之忧。家人是我的坚强后盾，每当思及他们， 我心中就会产生无穷的动力，无论遇到什么困难，这股力量都必将激励我不断奋 进! 作者：周艳 二oo 八年六月十二日 1 悬铃木概述 第一章文献综述 悬铃木佃肠砌玎“j 口c p ，咖，f 口) ，为悬铃木科落叶大乔木，高可达3 5 米；枝 条开展，树冠广阔，呈阔钟形；树皮灰绿色，不规则片状剥落，剥落后呈粉绿色， 光滑。叶片三角状，长9 l5 厘米，宽9 17 厘米，3 5 掌状分裂，边缘有不 规则尖齿和波状齿，基部截形或近心脏形，嫩时有星状毛，后近于无毛。球形花 序黄绿色，直径2 5 3 5 厘米，通常2 个一串，状如悬挂着的铃；花长约4 毫米； 萼片4 ；花瓣4 ；雄花有4 8 个雄蕊；雌花有3 8 个分离心皮，花柱细长，直 生胚珠l 2 ，悬垂。小坚果窄长倒圆锥形，基部围有长毛，花柱宿存。种子1 ， 胚乳少，胚直伸。花期5 月，果熟期9 10 月。果实由多数小坚果集合成球形的 聚花果，3 6 球成一串，小坚果基部围有长绒毛，宿存花柱亦长，呈刺毛状， 果柄长而下垂【1 1 。 悬铃木科悬铃木属有l 属1 0 种，分布于北美至中美墨西哥、欧洲东南部、 亚洲西南部至印度。我国引种3 种，即一球悬铃木( p 肠细疗甜jd c c f 如，l 细，括) 又称美 国梧桐、三球悬铃木俨砌行幻刀”sd ，f p 甩胁，捃) 又称法国梧桐和二球悬铃木( p 砌玎，口删苫 办f 印口甩f c 口) 称英国梧桐。二球悬铃木是一球悬铃木与三球悬铃木的杂交种，于 l9 6 4 年在英国伦敦育成，现广泛种植于世界各地1 1 1 。 悬铃木为世界著名的行道树和庭荫树，我国引种已有1 0 0 多年历史，俗称“法 桐”，广为栽培，享有“行道树之王”的赞誉。据测试，悬铃木夏日可降低地面温 度3 6 ，相对湿度提高2 0 3 0 ，可使空气中的降尘量减少3 5 ，飘尘量减少 5 3 6 0 ，具有较强的净化空气和遮荫能力。由于它生长快，适应性强，繁殖容 易，且树干高大，枝叶茂盛，覆荫面积大，抗烟尘，耐修剪，已成为我国大中城 市重要的行道树及园林绿化树种1 2 j 。美中不足的是，每年4 6 月间，悬铃木老 果脱落时，大量的果毛从树上飘落，造成环境污染，引发呼吸系统疾病，严重影 响人们的生活及身体健康。据统计，一株1 0 年生，胸径为10 厘米的悬铃木，每 年可结2 0 0 4 0 0 个球果，而每个球果均可产生2 0 0 万5 0 0 万根左右的果毛【3 】。 此外，在果毛脱落的同时，新生的雄花序也要散落大量的花粉。因此，悬铃木季 节性的果毛和花粉污染已成为一大公害，亟待解决。为此，国内外众多研究者在 控制悬铃木飞毛污染方面做了多方探索【4 j 。 2 国内外研究现状及水平 2 1 无果品系的选育 2 1 1 自然突变 自然界中的各种射线，如宇宙射线、紫外线及土壤中的放射线等引发的突变 或生物偶然的复制错误均可能影响植物的育性。此外，如果发生杂交的两个亲本 的遗传性状差异较大，造成子代生理上的不协调，也可导致植物不育。根据以上 原理，我们可以从大量的实生r w 铃木中选出个别少果或无果的单株然后通过 对悬铃木单株选育和无性系繁育，经过对比和筛选，从中选育出极少果球的优良 无性系品种【5 】。刘志福对河南省内外10 多个城市的悬铃木进行了调查，从中选 出3 株少果植株，连续5 年观察结果均很少，对它们进行无性繁殖，其无性系后 代保持了优树少果的优良性状。然而该方法具有相当大的随机性，常常花费大量 工作在庞大的选择系统中筛选也不能寻找到满意的植株。而且，选育出的品种有 时会发生不育性状退化现象，其长期稳定性难以保证。 2 1 2 人工诱变 人工诱变是在人工产生的各种物理化学诱变因素如辐射、温差巨变及化学诱 变剂的影响下引起的生物体的变异。 ( 1 ) 物理因素诱发突变( 辐射育种) 采用6 0 c o 等放射性物质辐射处理悬铃木种和芽，培育出的多年生植株在枝 条、叶形、芽器官等方面均具有明显变异：芽切片镜检未发现正常的花芽；显微 镜观察发现染色体数也发生了变化；过氧化物同工酶电泳分析发现，辐射组分与 c k 组分的过氧化物同工酶酶谱有差异，说明经处理的悬铃木确实发生了变异。 导致该突变的原因可能是由于高能辐射导致基因组缺失、重复和重组造成的，并 且这些突变均发生在与花发育相关的阶段，所以突变体表现为花发育过程受阻， 但营养生长过程可以正常进行。鲍时来等【6 7 j 已用基因组相减技术分离出一个2 0 k b 的d n a 片段。d n a 杂交结果表明该片段存在于野生型基因组中而在突变体 中缺失。 ( 2 ) 化学因素诱发突变( 诱变育种) 目前采用的化学诱变剂主要有：烷化剂、碱基类似物、抗生素、植物碱等。 周业恒等【8 j 用秋水仙素对悬铃木进行浸种处理，从中选育出悬铃木不育品种，对 超过始果期( 悬铃木的始果期一般为4 6 年) 的多年生苗保持观察，未见开花结 果；对染色体镜检发现其染色体数目也发生了变异，非整倍体由于在减数分裂过 程中无法联会，所以不能开花结果。 通过物理因素或化学因素诱变而形成的变异常发生在体细胞内，需及时将变 2 异部分从母体上分割下来，采用扦插、压条、嫁接或组培等无性繁殖方法加以繁 殖，使其保存下来，否则变异性状易丢失。另外，突变植株通常是嵌合体，因而 性状也不稳定。 2 2 树冠嫁接 用少果悬铃木良种作接穗，以普通悬铃木主干高截树桩做砧木进行高枝嫁 接、换冠改造，充分利用现存的大批大中龄悬铃木，既保持了优良品种少果、少 毛的特征，又可在保留原植株的基础上快速推广良种，减少公害。该方法己在许 多城市推广，改造了市区内结果量大的悬铃木，并取得了良好的社会效益，这确 实是一种对现有树种进行改造的行之有效的方法。但改造的程序复杂，费用高， 需耗费大量的人力物力p j 。 2 3 修剪控果 很多研究者在修剪控果方面做了探索性工作。蒋淮军【lo 】采用抹头重剪法减 少果枝，达到减灭花果的目的。李延成等【i l 】采用空心圆头形悬铃木，结合冬季 修剪、夏季抹芽，使树木保持每年抽出新枝，不能结实。章利民【1 2 j 提出了三级 分枝理论，具体内容包括：一级分枝为主干分支，决定了主干的高度；二级分枝 为一级分枝的次生分枝；三级分枝是由二级分枝顶部外侧留取的2 3 个健壮芽 生长形成的，主要起着遮荫作用，由于其为1 年生枝条，不存在结果问题。三级 分枝的最大保留年限定为3 年，一般宜为2 年，通常情况下可以逐步更新。由于 悬铃木蘖性强，抹芽工作是养护管理中的一个重要措施，主要的抹芽工作量集中 在5 7 月，根据实际生长情况，一般要抹3 5 次芽。通过这种方法处理的悬铃 木会出现少量结果，并且危害程度不大。 运用修剪控果能有效控制悬铃木的结果量，不需要引进良种，在原有品种基 础上即可实施，但是剪枝工作十分繁重，同时还需要配合定期的管理，工作量大， 并且年年都要不断地重复操作，不能彻底解决问题而达到一劳永逸的目的。 2 4 化学调控 利用对植物花果有催熟脱落作用的化学药剂在开花期间喷洒或注射于悬铃 木上，促进花和幼果萎缩、脱落，从而达到控制悬铃木果毛污染的目的。目前己 被采用的化学试剂主要有乙烯利、脱落酸、赤霉素、石硫合剂等药剂，也有人使 用含有碘化钾、三氯醋酸、乙烯利等的配合制剂【l3 1 。 施药方法有：( 一) 树冠喷洒法：用机动或手压喷雾器直接将药液喷洒在枝 叶表面产生作用。该方法操作比较麻烦，尤其是对高大树木难以施药，而且药剂 用量大，成本高，影响操作人员的身体健康并造成环境污染，随着人们环境保护 意识的迅速增强，该法有被逐步取代的趋势。( 二) 树干钻孔注射法：用电钻或 专用树干注药机在树干基部每隔一定距离钻一斜孔，然后在孔内注入一定浓度和 3 剂量的化学药剂，药液借助叶片蒸腾拉力，沿着树干的输导组织分布树冠全周。 该方法具有不污染环境，不受施药环境条件的限制，药期长，防效高等显著优点。 沈国华等1 3 1 应用化学药剂控制悬铃木果毛污染，在施药后除果率达8 5 ，周守标 等研究适度的a c 合剂配方可以使悬铃木的落果率达8 7 5 6 ，但尚未推广利用。 2 5 基因工程 近年来，随着分子生物学的迅猛发展，基因工程为改造生物性状开辟了一条 崭新的途径。人们可以通过转基因的方法改变生物基因型或引入新的基因控制其 性状向人们预期的方向发展。大量转基因植株的研究表明该方法在植物育种上具 有以下优点：( 1 ) 植物基因工程是在基因水平上改造植物的遗传物质，因而可以 从根本上改变其表型。( 2 ) 定向改造植物遗传性状，提高了育种的目的性和可操 作性。( 3 ) 大大扩展了育种的范围，打破了物种之间亲缘隔离障碍，实现基因在 生物界的共用性，丰富了基因资源。( 4 ) 基因型的改变在遗传上具有稳定性，改 良后的性状能保持稳定的延续，因此，通过转基因改变生物性状是一种十分有效 的方法【14 1 。 目前，利用基因工程创造植物不育的主要策略有：( 1 ) 细胞剔除法，即通过 细胞毒素基因如刚忆s pt 1 p x d ，d x f 刀a r 伫s 等在生殖器官的组织特异性表达杀死 相应的细胞，从而导致植物生殖发育受阻1 1 5 】。该方法最早由m a r i a n i 等人【1 6 j 提 出，他们将烟草的花药绒毡层特异表达基因t a 2 9 启动子与r n 口j p 基因r s p 丁j 相融合，导入烟草和油菜基因组中，结果发现转基因烟草和油菜中雄性不育者的 比例分别有10 和7 1 ，从而开创了利用基因工程创造植物不育的先河。( 2 ) 基因抑制法，即利用共抑制或反义抑制等方法阻碍花器官发育所必需的基因如 c 加删d s6 d x 基因等正常表达，以破坏花器官发育的正常进行i l7 。人们已成功 地将拟南芥控制花发育的基因转入到杨树、菊花等植物中，并得到了预期的结果。 表明这些基因在与拟南芥亲缘关系很远的植物中同样能表达i l 引。( 3 ) 基因定向 突变法，即采用基因工程的方法定向突变植物生殖发育的功能基因，从而导致植 物不育。但该方法需要突变不同等位基因的同一位点或通过连续自交使突变位点 达到纯合，实际应用起来效率较低【l9 1 。此外，通过打乱线粒体的正常功能、打 乱花器官内源激素的平衡、导入细胞质雄性不育基因等手段也可导致植物育性下 降或丧失【2 0 。2 2 1 。植物不育基因工程的兴起以及转基因技术在木本植物中的应用 将为悬铃木的无球果育种提供新的途径。 植物转基因的前提条件是建立高效的植株再生系统。目前涉及悬铃木组织培 养的研究很少。卫志明等【2 3 】曾对悬铃木原生质体培养再生植株做过相关报道， 王磊等【2 4j 也深入探讨了各种因子对悬铃木组织培养和叶片再生芽诱导的影响， 建立了稳定、高频的悬铃木再生系统。在此基础上，初步建立了悬铃木转化体系， 并将反义磷脂酶基因( p l d ) 导入到悬铃木中，经p c r 和s o u t h e m 杂交检测证明该 基因已成功整合到悬铃木基因组中，转基因植株的表现型尚在鉴定中。 4 3 本研究的目的和意义 悬铃木是一种优良的行道树种，适应性极强。北京、太原以南，以至整个华 东、华中地区都有分布。悬铃木在我国用于行道树也有近百年历史，因此许多城 市都有大量的悬铃木成年大树，而南京更有二十万株之多，目前用嫁接方法改良 的只有几万株。大量的悬铃木还需要改造，本项目研究关键技术的推广应用前景 十分广阔。悬铃木果毛污染程度将显著降低，将大大改善城市道路的环境质量， 符合以人为本，建设生态城市的要求，社会效益显著。 植物生理学研究表明：多种植物生长调节物质对植物的生长发育及开花结实 调节的作用都有一定的规律性。不同的植物生长调节物质之问的相互作用也具有 一定的规律性1 25 。悬铃木植株内就有多种天然的生长调节物质，并以适宜的浓 度和比例存在着，如此使得悬铃木正常开花结实，通过在适宜的时期注入植株内 一定浓度和一定剂量的某些植物生长调节物质，即可打破这种平衡，导致悬铃木 的开花结实受到抑制，出现少开花、少结果或落花、落果的情况，从而有效地抑 制悬铃木的果毛污染。 近年来，国内采用换冠嫁接，辐射育种培养无果品系、重复修剪等措施减灭 悬铃木球果，其周期长，工程量大，成本高。化学控制法进行防治成为当今和今 后研究的主要方向，其他科研单位有采用根施和叶面喷施法防治悬铃木果毛污 染，有一定的效果，但对城市中心的成年悬铃木不适用，不仅耗量大，而且容易 造成对环境的污染。本研究采用化学调控手段，在悬铃木的茎干注射化学药剂， 药液借助叶片的蒸腾作用，随水分向上运输，分布于树冠各部分，破坏球果的正 常生长发育1 26 。，可以解决现有成年悬铃木球果的落毛问题，这种方法成本低， 见效快，简单易行，为减轻和消除悬铃木果毛对城镇环境的污染，开辟了一条途 径。 本文以南京市郊区马路边的二球悬铃木( 尸肠刀加以”s 办f s p 口刀f c 口) 为研究对象，通 过对悬铃木基干注射不同种类、不同浓度、不同剂量的化学试剂，进行可溶性 糖含量、可溶性蛋白质含量及酶活性等生理指标的测定，比较分析研究几种化学 试剂对悬铃木生理生长的影响，找出最为显效且副作用小的l 2 种药剂及较为 适宜的浓度、剂量等，在一定程度上控制悬铃木的果实生长发育，从而为悬铃木 果毛污染的控制提供理论和技术依据。本次实验选取的生理指标( 可溶性糖含量、 可溶性蛋白质含量及酶活性等) 与植株的生长发育都有密切的关系。 本研究得到南京市建设局、南京市园林局及南京市园林科学研究所的“悬铃 木果毛污染防治新技术研究”项目的支持与资助。 第二章材料与方法 1 材料 本文以南京市郊区生长2 0 3 0 年的成年二球悬铃木( 尸肠刀m 甩甜s 办f 印口，2 f c 口) 为研究对象。 本实验地分a 、b 两个区：a 区位于南京市尧化门，样树为废弃马路边的约 2 0 年树龄的二球悬铃木，主要探讨e t h ( 乙烯利) 、2 ，4 d ( 2 ，4 二氯苯氧乙酸) 等化学药剂对悬铃木当年果实生长发育的影响；b 区位于南京市蒋王庙，样树为 生长于马路两边的约3 0 年树龄的二球悬铃木，主要探讨g a 3 ( 赤霉素3 ) 、尿嘧 啶等化学药剂对悬铃木次年果实生长发育的影响。 2 实验设计与处理 2 1a 区 在南京市尧化门废弃马路边随机抽取三十棵悬铃木，分为十个处理组，每组 三个重复，其中选取一组作为对照( c k ) ，a 1 a 2 7 为注射药剂处理对象，于2 0 0 6 年4 月1 6 日在树干基部注射化学试剂，其药剂名称及处理浓度见表l 。 表1a 区悬铃木处理及浓度 t a b l e1t r e a t m e n ta n dc o n c e n t r a t i o no f 尸，口，口玎甜s f s p 口 f c 口i na r e aa 药剂名称处理浓度 垦皇璺墨呈翌! 旦垒堡皇! ! ! 璺! 婴呈望! ! 旦翌! 呈璺! ! 璺! ! 里翌 2 ，4 一d + t c a ( 三氯乙酸)1 0 0 0 0 m g l + 1 0 2 ，4 - d + g l y ( 草甘膦) 1 0 0 0 0 m g l + 1 0 2 ，4 - d l0 0 0 0 m g l 2 ，4 一d 2 0 0 0 0 m g l 2 ，4 d4 0 0 0 0 m g l e t h + t c a1 0 + 1 0 e t h + g l y1 0 + 1 0 e t h2 0 f t h4 0 注：本文中“”指质量百分数( g 儋) 。以下同 药剂按不同浓度共9 种处理，c k 注射清水。 每株( 分支) 注射量根据胸径( d b h ) 大小，注射位置在主干5 0 厘米左右， 电钻、油钻打孔( 约深5 c m ，直径7 m m ) ，高压注射器注射药剂，注射完毕用悬 铃木相应小枝封孔。 胸径与注射量对应关系见表2 ： 表2 胸径与注射量的对应关系 t a b l e2t h ec o r r e s d o n d e n c eo fd b ha n di n i e c t i o nv o l u m e j 胸径( c m )d b h ( c m )l0l52 03 04 05 0 注射量( m 1 ) i n j e c t i o nv o l u m e ( m i ) 47 51 53 05 58 0 6 处理树号及注射药剂、注射量见表3 。 表32 0 0 6 年a 区处理树号、日期及注射药剂、注射量等的统计 t a b l e3s t a t i s t i c sa n a l y s i so ft r e en u m b e r ，d a t e ，r e a g e n ta n di n j e c t i o nv o l u m ee ta l o ft r e a t m e n ti na r e aa 2 0 0 6 7 以2 0 0 6 4 2 5 ，2 0 0 6 4 3 0 ，2 0 0 6 5 1 1 ，2 0 0 6 6 2 为四个采样日期，在标记样 地上选取悬铃木中部树冠的向阳面的二年生标记枝条的球果和球果下紧邻的叶 片，采集后立即带回实验室，称重，测电导率，含水率，剩余剪碎，每份称量 0 5 9 ，放入超低温冰箱冷冻保藏，待测其他指标。 2 2b 区 在南京市蒋王庙马路边随机抽取三十棵悬铃木，分为十个处理组，每组三个 重复，每棵树选四个主分枝，分别编0 3 号，其中1 3 为注射药剂处理对象， 0 号为c k 枝。于2 0 0 6 年4 月l3 l6 日在分枝基部注射化学试剂，其处理及浓 度见表4 。 表4b 区悬铃木处理及浓度 t a b l e4 t r e a t m e n ta n dc o n c e n t r a t i o no f p ，口，口以材s f 点p 口玎f c 口i na r e ab 注：本文中“”指质量百分数( g g ) 。以下同 药剂按不同浓度为3 0 种处理，对照( c k ) 注射清水。 注射量：每株( 分支) 注射量根据胸径大小，从分枝方向用油钻打孔( 约深 5 c m ，直径7 m m ) ，高压注射器注射药剂，注射完毕用悬铃木相应小枝封孔。胸 径与注射量关系见表5 ： 表5 胸径与注射量对应关系 t a b l e5t h ec o r r e s p o n d e n c eo fd b ha n di n j e c t i o nv o l u m e 处理树号、时间、药剂及注射量等见表6 。 8 树号日期d a t e药剂分枝胸径浓度注射量( m 1 ) t r e e ( 月一日) r e a g e n t b r a n c h d b h c o n c e n t r a t i o n i n j e c t i o n 翌坚巴! 皇! f 里旦翌! 垒：垒垒! ! ! 塑! 旦! 旦婴皇 b l5 4 一l5m h b 1 6 4 - 1 6m h b 1 7 4 一1 6m h b l8 4 一1 5 c u s 0 4 b 1 9 4 1 5 c u s 0 4 b 2 0 4 - 1 5 c u s 0 4 b 2 l 4 - 1 6 c o s 0 4 b 2 2 4 - 1 6 c o s 0 4 b 2 3 4 一1 6 c o s 0 4 b 2 4 4 - 1 6 l a n 0 3 b 2 5 4 - 1 6 l a n 0 3 b 2 6 4 1 6 l a n 0 3 b 2 7 4 1 6 2 硫尿嘧啶 b 2 8 4 - 1 6 2 硫尿嘧啶 3 8 0 2 6 0 l9 7 4 5 0 3 0 o 3 6 o 3 2 o 4 5 0 2 6 0 4 1 0 3 5 0 3 7 0 4 3 0 3 2 0 3 9 o 3 5 0 3 7 0 3 7 0 31 0 3 6 0 2 7 0 3 9 0 31 0 31 0 16 0 2 5 0 2 9 0 2 5 0 31 o 2 7 0 3 5 0 2 1 0 l8 0 3 8 0 4 3 0 2 0 0 2 4 0 2 2 0 4 3 0 31 0 3 8 0 3 3 0 3 5 0 3 5 o 2 0 0 0 0m g l 4 0 0 0 0m g l 5 0 0 0m g l 2 0 0 0 0m g l 4 0 0 0 0m g l 5 0 0 0m g l 2 0 0 0 0m g l 4 0 0 0 0m g l 5 0 0 0m g l 2 0 0 0 0m g l 4 0 0 0 0m g l l 5 1 0 1 5 10 1 5 10 1 5 l o 1 5 10 l 5 10 l 5 l0 1 5 l o 1 5 l o 5 0 0 0m g l 1 0 0 0 0m g l 2 0 0 0 0m g l 5 0 0 0m g l 1 0 0 0 0m g l 2 0 0 0 0m g l 5 0 2 4 1 6 5 6 7 5 15 4 5 3 5 6 7 5 2 4 5 7 5 4 2 5 4 7 5 6 2 5 3 5 5 0 4 2 5 4 7 5 4 7 5 3 2 5 4 5 2 5 5 5 2 5 3 2 5 3 2 5 12 2 2 5 2 8 5 2 2 5 3 2 5 2 5 5 4 2 5 1 6 5 l3 5 5 0 6 2 5 1 5 2 l l8 6 2 5 3 2 5 5 0 3 7 5 4 2 5 4 2 5 b 2 9 4 - 1 6 2 一硫尿嘧啶 l3 4 05 0 0 0m g l 4 0 一_一_一 1 0 2 3 1 2 3 1 2 3 l 2 3 1 2 3 l 2 3 l 2 3 1 2 3 l 2 3 1 2 3 l 2 3 l 2 3 1 2 3 l 2 3 l 2 3 树号日期d a t e药剂分枝胸径 浓度 注射量( m i ) t r e e ( 月一日)r e a g e n t b r a n c hd b h c o n c e n t r a t i o n i n j e c t i o n 璺坠巴! ! !f 磐2 望! 坠：璺璺z 211 堡! ! 旦! 旦里1 22 9 o10 0 0 0m g l2 8 5 32 7 02 0 0 0 0m 2 l2 5 5 一一 以2 0 0 7 0 1 0 6 ，2 0 0 7 0 4 0 3 为两个采样日期，在标记样地上选取悬铃木中部 树冠向阳面的二年生标记枝条的芽和球果，采集后立即带回实验室，称重，剩余 剪碎，每份称量0 5 9 ，放入超低温冰箱冷冻保藏，待测其他指标。 3 测定的指标与方法 3 1 鲜重和含水率的测定 取样称量每果鲜重( 称量多果重，再除以果实数目，重复3 次) ，然后置10 5 度烘箱( h g l0 1 3 ，南京电器三厂) ，8 小时后称干重，按薛应龙方法【2 7 1 测含水 率。 含水率= ( 鲜重一干重) 鲜重10 0 3 2 细胞质膜透性的测定 参照山东农学院主编【2 8 】实验方法：取叶片的混合样品，用打孔器( d = 1 c m ) 取叶片上半部2 0 个叶盘置于小烧杯中，加入2 0 毫升蒸馏水，或取新鲜球果，2 个为一组，三个重复，先用蒸馏水洗涤数次，滤纸吸干后加4 0 m l 蒸馏水，3 0 度恒温浸提l 小时，震荡摇匀。用d d s 一3 0 7 型直读电导仪测电导率c 1 ，再将样 品放在沸水浴上浸提1 0 分钟，冷却，测电导率c 2 。 球果质膜透性用相对电导率表示。相对电导率= c l c 2 10 0 3 3 可溶性蛋白质含量的测定 参照南京林业大学植物生理实验指导【2 9 1 ，采用考马斯亮蓝g 2 5 0 染色 法，实验步骤如下：称取材料0 5 9 ，加5 m l 蒸馏水研碎于3 0 0 0 r p m m i n 离心15 m i n 。 取滤液0 5 m l 加5 m l 考马斯亮蓝g 2 5 0 试剂，充分混合，放置2 m i n ，于5 9 5 n m 下测定o d 值，对照标准曲线求出样液中的可溶性蛋白质含量浓度( m g 蛋白 儋。f w ) 。 计算公式：蛋白质含量( m g g f w ) = 查标准曲线读数( m g ) 稀释倍数样品 重量 = o 1 2 o 1 叫 三o 0 8 删o 0 6 篷o 0 4 面o 0 2 啪 o 3 4 可溶性糖含量的测定 00 20 40 60 8 光密度值 图1蛋白质标准曲线 ( 1 ) 试剂：葸酮乙酸乙酯试剂：分析纯葸酮1g ，溶于5 0 m l 乙酸乙酯中，贮 于棕色瓶中；浓硫酸( 1 8 4 9 c m 3 ) ：葡萄糖0 1 m g l 。 ( 2 ) 参照薛应龙【3 0 】实验步骤：取材料0 5 9 ，剪碎混匀，加10 m l 蒸馏水， 塑料薄膜封口，沸水中提取2 0 m i n ，取上清液待用。吸取样品提取液0 1m l 于2 0 m l 刻度试管中，加蒸馏水1 9 m l ，其他步骤同标准曲线，测定样品光密度。 计算可溶性糖含量：可溶性糖含量( u g g f w ) = 查标准曲线读数( m g ) 稀释倍数样品重量 o 9 0 8 0 7 0 6 0 d 值0 5 0 4 o 3 o 2 0 1 0 可溶性糖标准曲线 05 01 0 01 5 0 葡萄糖含量( u g m 1 ) 3 5s o d 活性的测定 图2可溶性糖标准曲线 系列1 一线性( 系列1 ) 按照改进的d h i n d s a 等方法【3 1 1 测定。将每份0 5 克的样品于研钵中冰浴研磨 成粉，加磷酸缓冲液( p h 7 0 ) 使终体积为5 毫升。于3 0 0 0 r p m m i n 下离心2 0 分 钟，上清液即为s o d 粗提液。4 m l 反应体系中含磷酸缓冲液( p h 7 8 ) 3 1m l ，甲 1 2 硫氨酸2 0m g ll0 2 m l ，氮蓝四唑( n b t ) 1 0 m g l0 2 m l ，e d t a n a 2 1 0 m g l0 2 m l 和核黄素l0 m g l0 2 m l ，最后是0 1 m l 的酶液。混匀后将1 支c k 管( 不加酶液， p b s 3 2 m 1 ) 和其他试管置于4 0 0 0 l p x 的日光灯下进行光化学反应2 0 分钟，然后 用黑暗终止反应，立即在5 6 0 n m 下以不加酶液( p b s 3 2 m 1 ) 并放于暗处的参比 管为空白进行比色，s o d 的活性单位以抑制n b t 光化还原的5 0 为一个酶活性 单位表示。 s o d 活性( u g f w ) ：j 丝兰生坐总_ 。 a c l c 5 0 w v 溯 公式中：s o d 活性以每克鲜重酶单位表示。 a 。k 一照光c k 管的光吸收值 a 。一样品管的光吸收值 v 总一样液总体积( c m 3 ) v 测一测定时样品用量( c m 3 ) w 一样重( g ) 3 6p o d 活性的测定 参照李合生等的方法【3 2 】，略有变动，具体操作如下： ( 1 ) 称取鲜样0 5 9 左右于预冷的研钵中，加1 m l p b s 7 0 的磷酸缓冲液在冰 浴上研磨，加缓冲液使终体积为5 m l 。 ( 2 ) 将提取液于5 0 0 0 r p m m i n 冷冻离心1 0 分钟，取上清液。 ( 3 ) 在试管中依次加入3 8m lo 3 愈创木酚，1 0 0 l h 2 0 2 ，1 0 0 “l 酶提取液， 空白以缓冲液代替酶提取液，摇匀，以开始加入酶提取液开始记时，在4 7 0 n m 波长下测定光吸光值，每隔1 分钟读数一次，连续记录5 分钟，做三次重复。以 1 分钟内a 4 7 0 变化0 0 1 的酶量为1 个酶活单位( u ) 。按以下公式计算p o d 活 性： p o d 活性( u g f w ) = d a 4 7 0 ( 0 0 1 f w ) 1 a 4 7 0 ：反应时间内吸光值的变化 d ：稀释倍数，即提取的总酶液酶为反应系统内酶液体积的倍数 f w ：样品鲜重 3 7 扫描电镜观察 参照徐柏森电镜方法3 3 】：取材漂洗( 生理盐水或缓冲液) 固定( 2 5 戊二醛2 小时以上) 漂洗( 0 1 m 磷酸缓冲液，3 次，4 5 分钟) 固定 ( 1 锇酸，2 小时) 脱水( 5 0 、7 0 、8 0 、9 0 、9 5 各15 分 钟，换醋酸异戊酯1 5 分钟或叔丁醇1 5 分钟) 干燥( 零界点干燥或冷冻 干燥) 镀膜( 真空镀膜仪或离子溅射仪) ( 飞利浦s e m 5 0 5 ) 电镜 观察。 3 8 透射电镜观察 参照徐柏森电镜方法【3 3 】：取样一戊二醛固定一0 1 m 磷酸缓冲液清洗3 次 锇酸固定0 1 m 磷酸缓冲液清洗3 次丙酮梯度脱水( 3 0 5 0 7 0 9 0 1 0 0 1 0 0 ) ，每级1 5 m i n 8 1 2 树脂渗透、包埋聚合 ( l k b 超薄切片机) 切片铀铅染色( 日立h 6 0 0 透射电子显微镜) 电镜观察。 数据处理与统计分析 本次实验测定的样品各项指标重复数为3 ，测定数据用e x c e l 2 0 0 3 处理，s t s t 软件进行单因素随机区组方差分析及多重对比。 1 4 1 a 区结果与分析 第三章结果与分析 1 1a 区不同处理对悬铃木植株形态及果实数目的影响 对a 区处理植株的观察表明，部分处理株比c k 株( 图3 a ) 在叶片和果实 形态上发生了很大的变化，用2 ，4 d ( 1 0 0 0 0 m g l ) + g l y ( 1 0 ) 处理的植株变 化比较明显，处理后一个星期即出现叶片萎蔫干枯，果实枯黄皱缩( 图3 d ) ； 用e t h ( 1 0 ) + g l y ( 1 0 ) 和e t h ( 4 0 ) 处理的植株，处理后一个月果实 发生明显萎蔫、缩小，而叶片形态基本保持正常( 图3 - b 、c ) ；其他植株受处理 药剂的影响效果较小，有的叶片受到部分影响，但果实没有明显变化；跟踪观察 发现，大部分受影响的叶片都能在两个月后( 即夏季来临时) 得到恢复( 图4 ) ， 1 1 月份采叶、枝条实和果实样品观察，果实的区别比较明显( 图3 - e p ) 。 2 0 0 6 年1 1 月3 日对果实数目的统计( 表7 ) 可以看出，e t h ( 4 0 ) 、2 ， 4 d ( 1 0 0 0 0 m g l ) + g l y ( 1 0 ) 、e t h ( 1 0 ) + g l y ( 1 0 ) 的果实减少百分 率达到百分之七十以上，方差分析及多重对比( 表8 ) 也可以看出，与c k 相比， e t h ( 4 0 ) 及含g l y 处理的果实减少率( d p f n ) 都达到极显著差异( f = 4 7 6 6 ， f o 0 l = 3 6 ) 。 处理前期，化学药剂对悬铃木叶片生长有轻微的抑制作用，后期药效减弱， 直至消失，叶片恢复生长，而且生长较快，在酷暑来临之前叶片恢复正常，不影 响遮荫效果，并且翌年生长正常。另外，草甘膦及e t h ( 4 0 ) 的处理对胸径较 小的悬铃木枝条具有一定的生长抑制作用，并使得部分枝条枝间缩短( 图3 m ) 。 实验还观察到，向阳面和高处的叶片较阴面和低处的叶片在上述变化上更为 明显，这与药物随蒸腾作用运输到树项和向阳面蒸腾作用较强的生理效应是相吻 合的。 图3 ac k2 0 0 6 年5 月16 日 f i g 3 a c o n t r o lm a y ，16 t h ，2 0 0 6 图3 be t h ( 4 0 )2 0 0 6 年5 月16 日 f i g 3 - be t h ( 4 0 ) m a y ，l6 ，2 0 0 6 图3 ce t h ( 1 0 ) + g l y ( 1 0 ) 2 0 0 6 年5 月l6 日 f i g 3 一ce t h ( 1 0 ) + g l y ( i o ) m a y ，16 t h ，2 0 0 6 图3 - d 2 ，4 - d ( 1 0 0 0 0 m g l ) + g l y ( 1 0 ) 2 0 0 6 年5 月1 6 日 f i g 3 - d2 ，4 一d ( 10 0 0 0 m g l ) + g l y ( 10 ) m a y ，16 t h ，2 0 0 6 图3 - ec k ( 叶)2 0 0 6 年1 1 月3 日图3 - fe t h ( 4 0 ) ( 叶) 2 0 0 6 年l1 月3 日 f i g 3 - ec o n t r o i ( 1 e a f ) d e c ，3 t h ，2 0 0 6f i g 3 一fe t h ( 4 0 )( 1 e a dd e c ，3 t h ，2 0 0 6 图3 g e t h ( 1 0 ) + g l y ( 1 0 )( 叶) 2 0 0 6 年11 月3 日 f i g 3 - ge t h ( 1 0 ) + g l y ( 1 0 ) ( 1 e a f ) d e c ，3 t h ，2 0 0 6 图3 - hc k ( 枝) 2 0 0 6 年l1 月3 日 f i g 3 hc o n t r o l ( b r a n c h ) d e c ，3 t h ，2 0 0 6 1 6 图3 - ie t h ( 4 0 ) ( 枝) 2 0 0 6 年l1 月3 日 f i g 3 ie