（食品科学专业论文）刺嫩芽皂甙的提取纯化及抗氧化性质的研究.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得沈阳农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 研究生签名倒 1 帆砂7 钐月亿日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解沈阳农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送 交论文的复印件和磁盘，允许论文被套阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文同意沈阳农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 魏7 司妒 帆砂7年只f 涉 黜名：五姆帆仞矿翻r 归 沈阳农业大学硕士学位论文 摘要 本文以刺嫩芽为原料详细研究了提取分离皂甙的方法与条件，确定了最佳提取工 艺，初步鉴定了刺嫩芽总皂甙的类型，并研究了皂甙作为抗氧化剂在猪油中的应用及其 在自由基反应体系中清除自由基的能力，这些都为刺嫩芽在保健食品的应用中打下了良 好的基础。 本文用正交试验法探讨了刺嫩芽中总皂甙的最佳提取工艺条件，确定了刺嫩芽中总 皂甙的最佳提取工艺条件即：以9 5 乙醇为提取溶剂，温度7 0 ，固液比1 ：1 5 ，提取时 间3 h 。影响因素从大n d , 依次为温度、提取时间、固液比、乙醇浓度，经验证试验得到 皂甙提取率为：1 。6 9 通过对h p d 6 0 0 、h p d 4 5 0 、h p d l 0 0 、h p d 3 0 0 、h p d 7 0 0 、n k 9 、l s a 2 1 、l s a 4 0 、 a b 8 型九种大孔吸附树脂对刺嫩芽总皂甙的吸附性能研究，筛选出适宜分离刺嫩芽总 皂甙的树脂为a b 8 型。并研究了利用a b 8 型大孔吸附树脂纯化处理刺嫩芽提取液的 工艺条件，确定a b 8 型树脂分离皂甙的最佳上样液浓度0 6 7 m g m l ，最佳原液p h 值 为8 0 ，最佳流速为0 6 m l m i n ，最佳洗脱剂为7 0 乙醇溶液，最佳解吸液体积为4 0 0 m l 。 对利嫩芽中皂甙抗氧化性质作了研究，试验结果表明，刺嫩芽皂甙对猪油具有较 强的抗氧化作用，且具有剂量效应关系；在短时间内1 的刺嫩芽皂甙抗氧化能力可与 0 0 2 b h t 、p g 相当；柠檬酸、抗坏血酸对刺嫩芽皂甙的抗氧化能力均有协同增效作用； 刺嫩芽皂甙对氧自由基和羟自由基都有良好的清除能力，且随着刺嫩芽皂甙溶液浓度逐 渐增大其清除能力逐渐增强。 关键词：刺嫩芽，皂甙，提取，纯化，抗氧化 a b s t r a c t a b s t r a c t i nt h i sp a p e r ，t h ee x t r a c tc o n d i t i o no fs a p o n i n sf r o ma r a l i ad a t a ( m i q ) s e e mw a ss t u d i e d f i r s t ，a n dt h e nw ef o u n dt h eo p t i m u me x t r a c ta n dp u r i f i c a t i o nt e c h n o l o g y f u r t h e r m o r e ，t h e s a p o n i n st y p ei np r o d u c tw a si n i t i a l l yi n s p e c t e d f i n a l l yt h ea n t i o x i d a t i o na b i l i t yo fs a p u n h a s w a ss t u d i e di nl a r da n dd e t e r m i n e di np o t e n t i a lf r e e r a d i c a lr e a c t i o n t h u st h e o r e t i c a la p p l i e d f o u n d a t i o nw a s p r o v i d e df o rh e a l t hf o o da n dt r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n e t h et e c h n o l o g yo fe x t r a c t i n gt o t a ls a p o n i n sf r o mt h e a r a l i ae a t a ( m i q ) s e e ms e e mw a s s t u d i e d t h eo r t h o g o n a ld e s i g nw a st oo p t i m i z et h ee x t r a c t i o np r o c e s so f a r a l i ad a t a ( m i q ) s e e m s e e mw i t hc o n t e n to ft o t a ls a p o n i n s t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h eo p t i m u me x t r a c t i o nc o n d i t i o n s o b t a i n e dw e r et e m p e r a t u r e 7 0 c ，9 5 a l c o h o l ，s o l i d l i q u i do f1 ：2 0a n dr e f l u xt i m eo f 3 hw i t h 3 t i m e s t h eo r d e ro ft h e s ef o u rf a c t o r so na f f e c t i n gt h ee x t r a c t i n gy i e l do ft o t a lc o n c e n t r a t i o no f s a p o n i n sw a s ：t e m p e r a t u r e ，r e f l u xt i m e ，s o l i d l i q u i d ，o p t i m u me x t r a c t i o nc o n d i t i o n s i nt h e c o n d i t i o n ，t h ec o n c e n t r a t i o no ft o t a ls a p o n i n sw a s1 6 9 n i n ek i n d so fm a c r o po r o u s ad s o r b e n b ，h p d 6 0 0 、h p d 4 5 0 、i - i p d l 0 0 、h p d 3 0 0 、 h p d 7 0 0 、n k - 9 、l s a 2 1 、l s a 4 0 、a b 8w e r es t u d i e do na d s o r p t i o np e r f o r m a n c ef o rt o t a l s a p o n i n so f a r a l i ad a t a ( m i q ) s e e m i tw a ss h o w e dt h a ta b 一8w a sag o o da d s o r p t i o nr e s i nf o r t o t a ls a p o n i n so f a r a l i ad a t a ( m i q ) s e e m t e c h n o l o g i c a lp r o c e s so fp u r i f i c a t i o nw a ss t u d i e dw i t h t h em a c r o p o r o u sa d s o r b e n to f a b 8 t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sw e r e ；a f t e re x t r a c t i n gc o a r s e s o l u t i o no fs a p o n i n s ，a d s o r p t i o na n d s e p a r a t i o nb ya b 一8r e s i nw i t h7 0 e t h a n o l ，w h i c hw a s u s e da se l u t e ds o l v e n t ，p r i m eo r i g i n a ll i q u o ri s0 6 7 m g m l ，t h ep ho fs o l v e n t si s8 0 ，p r i m e v e l o c i t yo ff l o wi s0 6 m l m i n ，p r i m eo u t f l o wv o l u m ei s4 0 0 m l a m i o x i d a t i o ne x p e r i m e n ts h o w e ds a p o n i n so fa r a l i ae & m ( m i q ) s e e m h a da n t i o x i d a t i v e a b i l i t yt ol a r da n dt h a tt h ea c t i v i t yw a sd i r e c t l yp r o p o r t i o nt ot h eu s a g eo fe x t r a c t s ；w h e ni t s a d d i n ga m o u n tw a s1 s a p o n i n s a n t i o x i d a t v ea c t i v i t yw a sc o r r e s p o n d i n gw i t h0 0 2 b h t , p gi ns h o r et i m e ；w h a t sm o r e ，a n t o x i d a t i v ea c t i v i t yo ft h ee x t r a c tm i x e dw h i hc i t r i co r v cm a ye x h i b i ts y n e r g i s t i ce f f e c t r e s p e c t i v e l y i nf r e e r a d i c a lr e a c t i o ne x p e r i m e n t st h e s a p o n i n so f a r a l i ad a t a ( m i q ) s e e m h a ss h o w ns t r o n gs c a v e n g i n ga b i l i t yo n0 2 a n d o h ；i n 2 沈阳农业大学硕士学位论文 a d d i t i o n ，t h es c a v e n g i n ga b i l i t yi n c r e a s e dw i t hi n c r e a s i n gc o n c e n t r a t i o n k e yw o r d s ：a r a l i ae l a t a ( m i q ) s e e m ，s a p o n i n s ，e x t r a c t ，p u r i f y ，a n t i o x i d a t i o n 3 第一章前言 第一章前言 皂甙( s a p o n i l l s ) 是存在于植物界的一类较复杂的甙类化合物。因其水溶液形成持久泡 沫，像肥皂_ 样而得名。目前人们已经在1 0 0 多种植物中发现了皂甙，由于皂甙对动物 及人体生理代谢的有益调节作用及其在许多植物体中的集中存在，为其开发利用展示了 广阔前景。研究表明，皂甙是一种具有广泛应用价值的天然生物活性物质，具有多种生 理活性和良好的药理作用，除用作药物、食品添加剂外，皂甙还以作为高级化妆品和表 面活性剂应用于化学工业。目前，在养殖业中饲料添加剂的发展趋势是由无公害的天然 物质替代化学合成物质。植物皂甙作为非营养性、活性物质替代抗生素用于促进动物生 长的研究也正是顺应了这种潮流而成为新的研究热点。 皂甙广泛存在于自然界，一半以上的植物中含有皂甙，海洋生物如海星等中也含皂 甙，由于结构较复杂，水溶性、分离纯化及结构测定难度较大，直到近2 0 年随着分离技 术和结构研究方法的飞速发展，其化学结构、药理作用等研究和应用有了突破性的进展， 才对皂甙的化学、生理活性和应用有突破性发展( 魏均娴，1 9 9 9 ) 。 随着对合成抗氧化剂b h t 、b h a 、t b h k 等毒性问题的提出( 文峰，2 0 0 0 ) ，天然 抗氧化剂越来越受到食品行业的青睐，特别是植物抗氧化剂因其具有来源广泛、提取率 高、抗氧化性强、与机体亲和力强和安全性高等优点( 郑德勇，2 0 0 4 ) ，使天然抗氧化 剂的研究逐渐成为广大科研工作者研究的热点。 1 1 植物皂甙的研究现状 1 1 1 皂甙的存在形式以及分布 皂甙是一类比较复杂的化合物，它是由皂甙元和糖、糖醛酸或其他有机酸所组成， 皂甙植物中的成分，因不同地区、不同季节栽培有所不同。组成皂甙的糖常见的为葡萄 糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖及其他戊糖类。根据其化学结构可分为三萜皂甙 和甾体皂甙两大类，三萜通过碳氧键与糖链相连的为三萜皂甙，甾体通过碳氧键与糖链 相连的为甾体皂甙。三萜皂甙类在豆科、五加科、伞形花科、报春花科、葫芦科等植物 中比较普遍，药用植物中含三萜皂甙类的有人参、甘草、牛膝、远志、黄芪、续断、旋 4 沈阳农业大学硕士学位论文 花、地肤子、沙参、王不留行、酸枣和大枣等；甾体皂甙类主要存在于单子叶植物的百 合科的丝兰属、知母属、菝葜科、薯蓣科、龙食兰科等，双子叶植物也有发现，如豆科、 玄参科、茄科等。甾体皂甙在植物中已发现近百种。通过世界各国大量的筛选，发现含 有甾体皂甙及甾体皂甙元的植物，主要分布于被子植物的1 5 科中，其中单子叶植物9 个科，占被子植物科中的6 0 ；双子叶植物6 个科，占被子植物科中的4 0 ；若以属 来计算，含甾体皂甙元的有4 8 个属，其中单子叶植物有4 1 个属，而双子叶植物仅占7 个属；若以种来计算，单子叶植物的种数，可能占被子植物种数的9 0 以上。大部分集 中在单子叶植物的百合科、薯蓣科、龙舌兰科、延龄草科、菝葜科( 后二科在有的分类 系统中也归于广义的百合科中) ；双子叶植韧仅在毛莨科、玄参科、茄科、豆科、蒺藜 科、苦木科、菊科少数种属中有分布。含有甾体皂甙的常用中药有穿山龙、绵萆薜、粉 萆薅、重楼、菝葜、土茯苓、知母、麦冬、天门冬等。 三萜皂甙中又分五环三萜皂甙和四环三萜皂甙，而以五环三萜皂甙为常见。五环三 萜皂甙中作药用的以齐墩果烷( o l e a n o l a n et y p e ) 分布最广，研究最多；四环三萜皂甙中以 达玛烷型( d a m m a r a a e t y p e ) 皂甙研究较多较深入。甾体皂甙中的皂甙元是由2 7 个碳原予 组成，分为螺旋甾型( s p i m s t a n o l st y p e ) 皂甙和呋喃甾型( f u r o s i a n c l st y p e ) 皂甙，螺旋甾型 皂甙生理活性较显著。这些皂甙由于三萜或甾体上取代基、连结糖的种类和数目的、糖 链的不同而生理作用有差剔或强弱之分。随着皂甙化学深入研究，各种皂甙的生物活性 和药用价值也受到重视，尤其是对一些著名中草药中皂甙研究已形成热点，如人参、三 七、西洋参、黄芪、甘草、柴胡、升麻、商陆、大枣、绞股兰、薯蓣、麦冬、蒺藜子等 ( 赵红霞，2 0 0 4 ) 。 1 1 2 皂甙的基本结构 1 1 2 1 三萜皂甙 其皂甙元为3 0 个碳原子组成的三萜类衍生物。大多数甙元在c 2 4 或c 2 8 位有c o o h 基，故又称酸性皂甙；少数甙元只含醇羟基而呈中性，如人参皂甙、柴胡皂甙等。三萜 皂甙元的结构可分为五环三萜( p e n t a c y c l it r i t e r p e n o i d s ) 及四环三萜( t e t r a c y c l i c t r i t e r p e n o i d s ) 。五环三萜包括齐墩果烷型、羽扇豆烷型、乌索烷型。四环三萜包括达玛 烷型、原萜烷型、羊毛脂烷型、5 大戟烷型、葫芦烷型。结构式为： 5 第一章前言 圈1 - 1 三聒是甙结柯式 f i 9 1 1t d t e i p e n cs a p o u m sm l c c i l i es t r u c t u r a l 1 1 2 2 甾体皂甙 甾体皂甙的皂甙元是由2 7 个碳原子组成，其不含羧基，呈中性，故又称中性皂甙。 甾体皂甙的基本骨架为螺旋甾烷或其异构体异螺旋甾旋，其中e 环是c 1 7 上的侧链和 c 1 6 结合成并合的五元含氧环，e 环与f 环共用一个碳，形成螺旋甾烷。c 3 大多有- o h 基，和糖常在此部位结合；羟基多在c 1 2 位上。 依照螺旋甾烷结构中c 2 5 的构型和f 环的环合状态，又可将其分为以下四种类型。 ( 1 ) 螺甾烷醇型：q 5 为s 构型。( 2 ) 异螺甾烷醇型：c 2 5 为r 构型。( 3 ) 呋甾烷醇型：f 环 为开链衍生物。( 4 ) 变形螺甾烷醇型：f 环为五元四氢呋喃环。一些甾体皂甙元的结构如 下： 6 厂，沪，v 、l厂，矿f v 、1 一一烈一 慨删嘏献蝴删 。，l 、9 矿二轳刘 _ ：中一，k 7 一。一。一羔 聃7 、 啪。二 y v ；一 沈阳农业大学硕士学位论文 1 1 3 皂甙的理化性质 皂甙大多为白色或乳白色的无定形粉末，味苦而辛辣，具吸湿性，能刺激粘膜而引 起喷嚏，无明显的熔点。可溶于水，易溶于热水、热甲醇、热乙醇，不溶于乙醚、苯等 极性小的有机溶剂。皂甙易溶于水饱和的丁醇或戊醇中，因此常从水溶液中用丁醇或戊 醇提取，借以与糖、蛋白质等亲水性成份分开。皂甙经酶或酸水解生成的皂甙元为结晶 状物质，可溶于丙酮、乙醚、氯仿等有机溶剂。 皂甙水溶液大多能破坏红细胞而有溶血作用，因此含有皂甙的药物不能静脉注射， 但口服毒性较小，可能在胃肠道被水解所致。皂甙的溶血作用与血细胞的种类和皂甙的 结构有关，如对冷血动物的毒性较大，三萜皂甙的溶血作用比甾体皂甙大。皂甙的最低 溶血浓度称为溶血指数。皂甙的水溶液可以和一些金属盐类如铅盐、钡盐、铜盐等产生 沉淀。酸性皂甙的水溶液加入硫酸铵、醋酸铅或其它中性盐类即产生沉淀。中性皂甙的 水溶液则需加入碱式醋酸铅等碱性盐或氢氧化钡等才能产生沉淀。由此可用于皂甙的提 取和分离。 。 甾体皂甙在乙醇溶液中能与胆甾醇生成分子复合物而沉淀，当沉淀用乙醚回流时， 胆甾醇可溶于乙醚，而皂甙不溶，从而达到分离的目的。 1 1 4 皂甙的生物活性 1 1 4 。l 增强机体的免疫功能 研究表明黄芪皂甙和人参皂甙均能增强网状内皮系统的吞噬功能，促进抗体生成， 加快抗原抗体反应和淋巴细胞转化。党参皂甙及其水溶性成分均能提高动物巨噬细胞功 能，使细胞内的脱氧核糖核酸、糖类酸性磷酸酮、琥珀脱氢酶的活性增强：黄芪皂甙对 增强体液免疫、细胞免疫和免疫调节作用有广泛影响。周小玲等实验结果表明，三七总 皂甙可降低外周血白细胞移行抑制指数，增强机体的全身性特异性细胞免疫功能。外周 血中性粒细胞和肺泡巨噬细胞具有趋化、粘附及吞噬杀菌的功能，因此在抗细菌感染及 清除入侵病原方面具有重要作用；三七总皂甙还能明显提高外周血中性粒细胞和肺泡巨 噬细胞的吞噬率，说明它对机体的非特异性细胞免疫功能有增强作用。研究结果显示皂 甙对体内形成抗体的b 淋巴细胞增殖方面无明显的影响( 周小玲，2 0 0 1 ) 。王斌通过检测脾 细胞增殖反应以及白介素i ( i l - 1 ) 和白介素2 ( i l - 2 ) 活性，研究绞股蓝总皂甙体外对免疫细 胞功能的影响，结果表明，2 - 5 0 m g l 可明显促进刀豆蛋白a 诱导小鼠t 淋巴细胞增殖反 7 第一章前言 应和脂多糖诱导b 淋巴细胞增殖反应；还可促进大鼠腹腔巨噬细胞产生i l - 1 活性以及脾 细胞产生i l - 2 活性( 王斌，1 9 9 9 ) 。王先远等研究苦瓜皂甙对衰老小鼠免疫功能的影响，发 现苦瓜皂甙不影响脾脏指数，但胸腺指数有升高趋势，实验组吞噬指数、血清i l - 2 水平 明显升高。苦瓜皂甙能明显增加胸腺中c d s t 细胞数，显著降低胸腺和脾脏中c d 4 + 、c d s + 双阳性t 细胞数。体外实验表明，苦瓜皂甙不但可促进脾脏分泌i l - 2 ，还可显著增强腹 腔巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子a ( r n f a ) ，但不影响胸腺细胞凋亡百分率。这表明苦瓜皂 甙可通过改变t 细胞各亚群比例，促进1 i , - 2 分泌，增强吞噬指数，提高衰老小鼠免疫功 能( 王先远，2 0 0 1 ) 。王庭富对人参皂甙r 9 3 的免疫功能进行实验研究，结果表明人参皂甙r 能明显提高小鼠碳粒廓清速率、免疫器官重量、血清溶血素含量、脾淋巴细胞转化和自 然杀伤细胞( n k ) 活性，其结果均具有显著性差异：高瑞兰等报道了人参总皂甙通过刺激 健康人和再生障碍性贫血患者的红系、粒系和巨核系祖细胞增殖而促进血细胞生成( 王 庭富，1 9 9 9 ) 。陈小红观察发现，人参皂甙能够明显地刺激红系、粒单系、巨核系细胞数 的增殖及转录因子的诱导作用，有效调控血细胞与增殖或分化有关基因的表达( 陈小 红2 0 0 1 ) 。 1 1 4 2 调节机体的物质代谢 研究表明皂甙能够促进核酸及蛋白质的合成，对血糖有调节作用，可使高胆固醇症 动物体内胆固醇降低，但对正常动物则能促进脂质合成。苦瓜皂甙可通过调节糖皮质激 素水平，调节酶活力，刺激糖原合成来降低血糖水平。文献报道，苦瓜皂甙可抑制葡萄 糖6 一磷酸酶和果糖1 ，6 - 二磷酸酶活力，从而抑制糖异生：调节细胞色素氧化酶p 4 5 0 活 性，增强红细胞、肝脏中葡萄糖6 磷酸脱氢酶活力，加速葡萄稽氧化；同时，葡萄糖6 - 磷酸酶是糖原分解代谢酶糖原磷酸化酶的抑制剂，葡萄糖6 磷酸酶活性下降，对后者 活性的抑制减轻，糖原分解代谢减弱，机体转而依靠血糖供能，这既降低了血糖水平， 又可使糖原保持较高水平。王先远实验结果表明，苦瓜皂甙虽不影响禁食大鼠血浆胰岛 素含量，却可明显升高血糖和皮质醇水平；显著降低进食后大鼠血糖和胆固醇水平，并 维持适度的皮质醇水平，而肌糖原和肝糖原含量明显增加。人参皂甙不仅抑制试验型高 脂动物甘油三脂( t g ) 升高，而且能显著降低胆固醇( t g ) 、低密度脂蛋i ! i ( l d l ) 、极低密 度脂蛋白( v l d l ) 、磷脂质( p l ) 、过氧化脂质( h d l 0 。饲喂高糖、高脂饲料引起肥胖、脂 肪肝、体内脂肪沉积的小鼠，在其饲料中添加人参皂甙时，小鼠体重明显降低和接近正 常组水平( 王先远，2 0 0 1 ) 。k o h n o 等研究表明柴胡皂甙能诱导脂皮质素合成，抑制磷脂酶 沈阳农业大学硕士学位论文 a 活性。实验表明，柴胡皂甙具有促进糖原、肝细胞核糖核酸合成及脂质代谢作用 1 1 4 3 抗氧化作用 王先远等( 2 0 0 1 ) 实验结果表明，苦瓜皂甙具有良好的抗氧化功能，可显著增强超氧 化物歧化酶( s o d ) 、谷胱甘肽过氧化物酶f g s h g x ) 活力，其机理可能与干扰素a ( i n f a ) 作 用有关( n i w a ，1 9 9 6 ) ，i n f a 具有诱导和增强s o d 和g s h - p x 活力的功能：苦瓜皂甙能够增 强巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子f i n f a ) 但是苦瓜皂甙对血清、骨胳肌、肝脏g s h p x 活力 的影响是不一样的。苦瓜皂甙明显增高血清、肝脏中g s h p x 活力，却不影响骨胳肌中 g s h - p x 活力。郭颂等研究表明，人参茎叶皂甙按1 0 0 ，2 0 0 m g k g 给小鼠连续腹腔注射7 天，能明显降低阿霉素中毒小鼠血清及心肌组织中过氧化脂质( l p o ) 并提高s o d 活性( 郭 颂，1 9 9 6 ) 。范盘生报道，人参皂甙对脂质过氧化有明显的对抗作用，能显著降低血脂及 过氧化脂质的含量( 范盘生，1 9 9 8 ) 。张嘉麟等研究表明，人参皂甙r b l 及g g l 均具有较强的 抗脂质过氧化作用，显著地降低血脂及脂质过氧化终产物丙二醛。王银萍等实验证明， 大豆皂甙能减轻自由基对细胞的损伤，增力h s o d 的含量，降低脂质过氧化物浓度，消除 自由基等f 张嘉麟，2 0 0 1 ) 。 1 1 4 4 抗茵、抗病毒、抗炎及抗诱变作用 近年来的研究表明，皂甙具有抗菌、抗病毒、抗炎及抗诱变作用。据应用药理学记 载，甘草皂甙具有广谱抗菌作用，它对溶血性金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、肺炎双 球菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌、副伤寒杆菌、霍乱弧菌、大肠杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌、 百日咳杆菌及其常见的致病性皮肤真菌均有较强的抑制性；对白色念珠有抑制作用。甘 草皂甙还能抑制艾磁病病毒、水痘病毒、带状疱疹病毒、乙型肝炎病毒的增殖。柴胡皂 甙对许多炎症过程包括渗出、毛细血管通透性、炎症介质释放、白细胞游走和结缔组织 增生等都有影响。 w a l l a c e 等报道，丝兰属植物提取物浓度为1 0 0 0 1 0 0 0 0 1 m g l 能抑制牛链球菌和痢疾 杆菌生长( w a l l a c e ，1 9 9 4 ) 。在体外试验中，可刺激瘤胃中类菌体生长，减少原生动物 的溶菌活动。h u s s a l n 等( 1 9 9 s ) 发现丝兰提取物可能有选择抑制消化道微生物( 细菌、酵母 和原生动物) 的作用。实验发现油茶皂甙对单细胞真菌( 如白色念珠菌、新型隐球菌等) 及多细胞丝状真菌的生长均有抑制作用( 高仕瑛，1 9 9 0 ) 。王俊湛等( 1 9 9 9 ) 用小鼠试验， 结果表明，党参皂甙对动物瘤株有较明显的抑制作用。李平亚等( 2 0 0 1 ) 实验表明，人参 皂甙r 9 3 具有抗单纯疱疹病毒i 型( h s v - 1 ) 和脊髓灰质炎病毒活性，人参皂甙r b 3 具有抗 9 第一章前言 h s v - 1 和滤泡性口炎病毒活性。研究发现，醉鱼草皂甙可显著抑制对酞酸( t e r e p h t h a l i c a c i d ，t e a ) 诱发耳性水肿，抗炎强度与消炎痛相等；对苯丙炔酸乙酯( e t h y l p r o p i o l a y l p h e n y 1 a c e t a t e ，e p p ) 诱发小鼠耳性水肿和5 羟色胺诱发的小鼠足肿表现出相当强的抗炎 活性，同时也可轻度抑制角叉菜胶引起的小鼠足肿( r e c i o ，1 9 9 5 ) ：郑钦岳等( 1 9 9 2 ) 研究 表踢，商陆皂蕺甲对多种急、慢性炎症模型也有明显抑制作用。研究表明，苦瓜皂甙能 显著抑制环磷酰胺诱发的小鼠微粒染色体畸变，精子畸变。通过以阿地平、柔红霉素、 迭氮化钠、丝裂霉素c 作为沙门菌诱变菌株因子，观察苦瓜皂甙的抗诱变作用，发现苦 瓜皂甙有较强的抗诱变力且具有明显的剂量效应关系。高铭鑫等( 1 9 9 8 ) 试验结果表明， 人参根总皂甙具有明显的抗d n a 损伤及抗突变效应( 赵红霞，2 0 0 4 ) 。 1 1 4 5 应用方面的研究 在食品行业中的应用：皂甙具有发泡性和乳化性，可在食品中做添加剂，日本一些 学者在此领域中研究较为深入，开发研制了含皂甙的保健食品，减肥食品及皂甙汁皂甙 饮料等。植物皂甙能代替抗生素作生长促进剂，主要成分为三萜皂甙和总糖的糖萜素饲 料添加剂具有增强机体免疫力和抵抗力，提高成活率，促进生长，提高目增重及饲料转 化率；改善畜禽产品品质等作用。 在药品行业中的应用：皂甙的多种生理功能如降血脂、抗氧化、抗动脉硬化、免疫 调节等决定了它在药物方面具有广泛的应用前景。国於报道皂甙有可能被开发为治疗心 血管疾病的药物及减肥药品，通过降低血浆中胆固醇含量，抑制血栓形成，从而降低心 血管疾病的发生。同时，根据皂甙可降低血中胆固醇和甘油三酯含量这一特性，国外有 学者已将其作为减肥药品进行研制，并取得一定成果。 在化妆品上的应用：日本学者己研究出含有大豆皂甙的化妆品并申请了专利， 其 实用效果已得到证实。皂甙可阻止由脂质过氧化引起的皮肤病，减少皮肤病发生。 1 1 5 皂甙的提取与精制 皂甙结构复杂、极性大，存在同一植物中的皂甙大多结构相近，分离困难。随着科 学技术的发展，近1 0 年来对其研究已取得较大进展，大大提高了分离效果。本文就这些 问题进行论述。 1 1 5 1 皂甙的提取 皂甙是一类极性较强的大分子化合物，不容易结晶，易溶于水和醇，难溶于有机溶 1 0 沈阳农业大学硕士学位论文 剂，而且在同一植物中往往有很多结构相近的皂甙共存，为其分离纯化带来一定的困难。 由植物中提取皂甙可以用乙醇或甲醇为溶剂提取，回收溶剂，将残渣溶于水中，滤 除不溶物，于水溶液中加石油醚、苯或乙醚等亲脂性强的有机溶剂作两相萃取，不溶于 这些强亲脂性溶剂，留溶于水中，丽油脂、色素等亲月旨性杂质则转溶于亲脂性溶剂中， 与皂甙分离。除去杂质后，改用亲水性强的丁醇为溶剂继续由溶液中作两相萃取，则皂 甙转溶于丁醇，一些亲水性强杂质包括糖类仍留于水中，与皂甙分离。收集丁醇溶液， 减压蒸干，获得粗制的总皂甙。也可以先用石油醚等强亲脂性溶剂处理原料，然后用乙 醇为溶剂加热提取，放冷提取液，由于多数皂甙难溶于冷乙醇，就可是能析出沉淀。 1 1 5 2 皂甙的分离、精制 由前述方法提出的粗皂甙，可用下列方法进行分离、精制。目前使用最多仍是所有 正相硅胶。为了提高分离效果，可采用细粒度( 1 0 加弘m ) 硅胶和低压柱层析。除此之外， 现应用较多其他方法。 1 反相柱层析 近年来反相键合相得到普遍应用。使用较多的预填充反相硅胶柱主要有 l i c h r o p r e pr p 一8 ( m e r c k ，6 0 8 0 醇洗脱) 和l o b a rr p 一8 ( m e r c k ，6 0 8 0 甲醇洗脱) ，常使 用的反相多孔聚合物有d i a i o nh p 一2 0 ，k o g e lb g 4 6 0 0 ( 以不同比例的和水洗脱) 。利用 这些方法，分离五加科植物中多种新三萜皂甙。 2 离子交换树脂 在分离含葡萄糖醛酸时，常使用阳离子交换树脂除去离子，常用的有 a m b e r l i t em b 一3 和d o w e x5 0 w x l ，x 8 ，等。竹本常松等在分离纯化绞股蓝和丝瓜的皂甙， 使用a m b e r l i t e ，x a d 2 树脂，以水、2 0 醇依次洗脱，分离丝瓜皂甙。 3 高效液相层析 现在国外已普遍应用i - i p l c 分离结构相似的皂甙。虽比较费时摸索最佳分离条件， 但效果较好。近年分离皂甙使用的层析柱主要有o d ss i l i c a g e l ，u b o n d a p a kc 1 8 ， s - 1 0 - o d s ，o d s 1 2 0 a ，n u c l e o s i lc 1 8 ，羟基磷灰石等。周俊等使用制备型反向明l c ， 在o d s 硅胶柱上，用甲酵：水( 1 ：9 ) 作为流动相，成功地分离三七皂甙。 4 葡葡糖凝胶l h 2 0 和液滴逆流层析法 葡萄糖凝胶l h 2 0 是在葡萄糖分子中引入一些亲脂性基团，从而使它不仅具有亲水 性能吸水性而胀，也有一定程的亲脂性溶剂而膨胀，这就扩大了它的应用范围。葡萄糖 第章前言 凝胶l h - 2 0 对甾体皂甙分离效果较好。典型一例是k o n i h i 等用硅胶柱和葡萄糖凝胶l h 2 0 相结合，有效地分离了天门冬中呋甾醇的低聚糖皂甙。液滴逆流分配层析技术较常用的 液液分离技术。原理是利用物质在互不混溶的两相液滴中分配系数不同而达到分离目 的。其最主要的优点是没有固定吸附剂，不存在着被分离物质的不可逆吸附问题，尤其是 极性大的皂甙化合物特别有意义。 5 大孔吸附树脂法 大孔吸附树脂是一类不带离子交换基团的多孔性结构的高分子吸附剂，以二乙烯 苯、苯乙烯为原料聚合而成，通常分为非极性和极性两大类，根据极性大小还可分为弱 极性、中等极性和强极性。大孔吸附树脂一般为乳白色球状颗粒型粒度多为2 0 6 0 目。 理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶媒。具有对有机物的选择性较好、吸附容量大、 解吸容易不受无机盐类及强离子低分子化合物存在的影响、可反复使用和流体阻力小等 优点。 大孔吸附树脂为吸附性和筛选性相结合的分离材料。它本身具有吸附性是由于范德 华力或产生氢键的结果。筛选原理是由于其本身多孔型结构决定。由于吸附性和筛选性 原理，有机化合物根据吸附力的不同及分子量的大小在大孔树脂上经一定溶剂洗脱分 开。这使得有机化合物尤其是水溶性化合物的提纯得以大大简化。大孔吸附树脂根据孔 径、比表面积及构成类型被分为许多型号，在应用中，可根据实际要求及样品特性加以 选择。 大孔吸附树脂近年来广泛应用于天然产物的分离。为分离有机化会物尤其是水溶性 化合物的有效手段，在工业废水、废液的净化，抗生素及天然产物化学成分的提纯等方 面显示独特作用。对化学物质的分离作用主要由其吸附性产生。大孔吸附树脂主要应用 于在高效液相色谱法中对植物样品的预处理、对植物提取物的分离纯化。对植物提取物 中甙类成分、黄酮、生物碱的分离纯化效果良好，有的已经实现工业化生产。但应根据 植物的实际情况选用适宜的纯化条件。 1 2 刺嫩芽的研究概况 1 2 1 刺嫩芽的生物学特征 刺嫩芽( a r a l i ae l a t a ( m i q ) s e e m ) 俗称辽东搀木、刺龙芽、树头菜、五郎头、刺老 鸦等。为落叶小乔木，高1 5 m 3 m ，树皮灰色，密生坚刺，老时渐脱落，仅留刺基。叶 大，连柄长4 0 8 0 c m ，三回或四回羽状复叶，总叶轴和羽片通常有刺，羽片有小叶子7 - 1 1 沈阳农业大学硕士学位论文 片，基部另有一对小叶。小叶卵形至卵状椭圆形，长约5 1 l c m ，宽2 5 8 e r a ，尖端渐尖， 基部圆形至心形，稀楔形，边缘疏生锯齿，上面绿色，下面灰绿色。伞形花序，聚生为 顶生伞形状圆锥花序，主轴短，长为2 ，5 e m 。花白色，花期7 8 月份。果为核果球形，5 棱，果期9 1 0 月份，成熟时黑色。 刺嫩芽可食用部分是植株的新嫩叶芽，营养十分丰富，每1 0 0 9 柬j 嫩芽中含胡萝h 素4 2 3 m g 、维生素b 2 0 1 5 r a g 、维生素c3 8 m g 、天门冬氨酸3 0 7 9 9 、苏氨酸0 9 9 9 、丝氨 酸1 0 5 6 9 、谷氨酸4 7 2 2 9 、甘氨酸0 9 5 8 9 、丙氨酸1 1 9 8 9 、缬氨酸1 4 4 8 9 、异亮氨酸1 0 0 4 9 、 亮氨酸1 6 3 6 9 、酪氨酸1 4 7 5 9 、组氨酸0 3 0 1 9 、精氨酸1 4 1 3 9 、脯氨酸0 8 9 2 9 。 刺嫩芽还是一种药用植物，具极高的药用价值。刺嫩芽和人参为同科植物，具有 相似的药效成分。其叶和根中含有皂甙，根含三萜皂甙，龙芽榴木皂甙a 、b 、c ，甙元 均为齐墩果酸，根中还含有醛类物质、生物碱及挥发油。其根皮中含总皂贰量为人参总 皂甙的3 倍左右。叶片、花蕾、果实总皂甙含量与人参相应部位接近或略高。花梗和花 柄总皂甙含量与人参的根茎接近。根本质部总皂甙含量比人参茎杆略高。因此，可用做 人参的代用品。刺嫩芽根皮入药能补气、健胃、利尿、祛风除湿、活血止痛以及治气虚 无力、神经衰弱、肾虚阳痿、糖尿病、风湿性关节炎及胃肠溃疡等疾病，疗效很好。每 次用5 0 9 的总皂甙片，日服2 3 次，对过度疲劳而引起的无力、抑郁症疗效最佳，对神经 衰弱和感病后的无力症有显著的疗效。刺嫩芽做成的菜，对腹泻和痢疾有疗效。其根皮 浸膏，制成保健品，也深受广大消费者的欢迎。刺嫩芽还具有一定的经济价值，其种子 中含油3 0 左右，可供制肥皂。树干材质致密坚硬，可用制手杖( 赵洪新，2 0 0 1 ) 。 刺嫩芽分布于东北、华北及河南北部，朝鲜、苏联西伯利亚地区，日本也有分布。 生于海拔1 0 0 0 m 以下，阔叶林或杂灌木内或林缘，时常成群落分布。 1 2 2 刺嫩芽的化学成分 1 2 2 1 皂甙类 如前所述，大量的生物活性实验结果表明，刺嫩芽中的皂贰类成分为其主要有效成 分。迄今已从刺嫩芽的各个部位如根、茎、嫩芽和叶等中均分离出皂甙类成分，且这些 皂甙皆为b 一香树脂醇型( b a m y r i nt y p e ) t 舵萜类皂甙，其皂甙元主要是齐墩果酸 ( o l e a n o l i ca c i d ) 、常春藤皂甙元( h e d e r a g c n i n ) 和刺囊酸( e c h i n o c y s t i c a c i d ) 等三种。它们经 常在3 位及或2 8 位与糖连接形成甙。这些皂甙的构成糖多为d 一葡萄糖、d 葡萄糖醛酸、 第一章前言 l 广阿拉伯糖、d 半乳糖、l 鼠李糖和d 木糖及其衍生物。 1 根皮及茎皮中的皂甙类成分 1 9 6 3 年，前苏联学者n k k o c h c t k o v 等人首次报道自莉嫩芽根为甲醇提取物中分离 得到3 种皂甙，分别命名为榴木皂甙a 、b 、c ( a r a l o s i d e a 、b 、c ) ，并分别确定了它们的 化学结构( m i y a s e ，t e t a l ，1 9 9 6 ) 。此后d z h u i b a v at 用硅胶色谱法又从刺嫩芽根中分离 出7 种皂甙，其水解产物中含齐墩果酸、葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖。波兰学者l u t m o k i j e r z y 等人用两种t l c 方法从辽东楹木根皮中分离t b 9 种皂甙，分别称为格木皂甙a 、b 、 c 、d 、e 、f 、g 、h 、i ( a r a l o s i d ea - i ) ，这些化合物通过熔点、旋光度的测定及m 和u v 光谱分析，证明它们的皂甙元皆为齐墩果酸，但具体化学结构未见报道。近年，日本和 我国学者对刺嫩芽根皮及茎皮的皂甙类成分进行了深人研究，并取得了重大的进展。 1 9 9 3 年以来，日本学者y o s h i k a w a , m 等人相继报道从日本产刺嫩芽茎皮中先后分离得到 命名为e l a t o s i d e a 、b 、c 、d 、e 、f 等6 种皂甙并确定了它们的化学结构，此外，还从根 皮中得到l o 种皂甙，并进行了构效关系的研究。s a k a i ，s 和s a t o h ，y 等共分离得到1 3 种 以齐墩果酸为皂甙元的皂甙，且其中有6 种为新化合物。m i y a s e ，t 等亦从其根皮中分离 出7 种新的齐墩果酸皂甙及1 4 种己知皂甙( m i y a s e ，t e ta l ，1 9 9 6 ) 。国内姜永涛等从刺嫩 芽根皮中分离得到2 2 种单体化合物，其中的皂甙类化合物的皂甙元亦均为齐墩果酸( 姜 永涛，1 9 9 2 ) 。 2 嫩芽中的皂甙类成分 日本学者y o s h i k a w a ，m 等从日本产刺嫩芽的嫩芽中共分离出9 种皂甙类成分，即 e l a t o s i d e a 、b 、c 、d 、g 、h 、i 、j 和k ( y o s h i k a w a ，1 9 9 5 ) 。 3 叶中的皂甙类成分 近年，人们亦注意到了对刺嫩芽叶中化学成分的研究。日本学者s a i t o ，s 等从日本产 刺嫩芽叶中共分离出1 1 种三萜皂甙类化合物( y o s h i k a w a ，1 9 9 5 ) ，经对各种光谱数据分 析分别确定了它们的化学结构，且证明其中4 种皂甙为新化合物。国内杨国宏等从吉林 产刺嫩芽叶中分离出6 种皂甙类化合物，经理化和光谱分析鉴定它们均为已知化合物( 杨 国宏，1 9 9 5 ) 。匡海学等研究组对黑龙江产刺嫩芽叶进行了系统的药用研究，结果己从 中分离得到1 3 种皂甙类化合物，通过理化鉴定和各种光谱分析确定了1 1 种皂甙的化学结 构，其中4 种皂甙为新化合物，分别命名为稳木皂甙a 、b 、c 、d ( c o n g m u y e n o s i d e a 1 9 ) ， 另有6 种皂甙为国内外首次从该植物中分离得到的已知化合物( 孙晖，1 9 9 4 ) 。 1 4 沈阳农业大学硕士学位论文 1 2 2 2 黄酮类及其它成分 日本学者s a i t o ，s 等从日本产刺嫩芽叶中分离获得2 种已知的黄酮类化合物，即山奈 酚3 - 0 a l - 鼠李糖甙和槲皮素3 0 - a l - 鼠李糖甙。匡海学等从黑龙江产刺嫩芽叶中分 离得到1 秘命名为搬木叶素a 的新黄酮类化合物( 崔树玉，1 9 9 3 ) 。 刺嫩芽的根皮及嫩芽中尚含有1 5 种以上氨基酸，其中必需脂肪酸分别有7 种和9 种。 亦有报道刺嫩芽根皮中含香精油，其主要成分为单萜、倍半萜等。此外，刺嫩芽还含有 c a 、f e 、p 等元素，以及维生素k 、f ，脱氢抗坏血酸，生物碱，鞣质等多种成分。 1 2 2 3 刺嫩芽的含量测定 刺嫩芽中皂甙的含量。据苏联s h r e t e r g k 等人报道，苏联产刺嫩芽皮中皂甙的含量 为2 8 4 7 ，木质部的含量为1 9 。含量的多少随地区的不同而异，6 年以上的皮含皂甙 量多达6 3 - 7 ，这为充分利用资源提供了科学依据。波兰学者用光密度计测定刺嫩芽中 皂甙水解成齐墩果酸的含量为1 8 。苏联w p c t c p v k 等人对刺嫩芽皂甙的含量做了进一 步的研究。先经氯仿脱酯，用甲醇提出襁木皂甙，加醋酸水