（食品科学专业论文）刀豆凝集素提取分离纯化及性质研究.pdf

摘要 摘要 凝集素( l e c t i n s ) 是一类非免疫原性、具有糖结合专一性、能凝集细胞和( 或) 沉 淀含糖高分子的蛋白质或糖蛋白。广泛存在于植物、动物和微生物中。 本实验以成熟洋刀豆( c a n a v a l i ae 以s i f o r m i s ( l ) d c ) 干豆粒为原料，提取、分离纯 化刀豆凝集素( c o n c a n a v a l i na ，简称c o n a ) ，并对其性质进行了初步的探索研究。 血凝法适宜于凝集素的含量检测，具有操作简便，反应迅速，效果明显，受条件影 响较小等优点。实验采用浓度为1 7 5u m l 的胰蛋白酶修饰人血红细胞来检测洋刀豆干 豆粒中c o n a 的含量，可使其血凝活力测定值提高三个数量级( 8 倍) ，增加了血红细 胞的敏感性以及凝集素活力检测的灵敏度。样品的检测参数为：洋刀豆干豆粒粉碎过 6 0 目筛、脱脂剂选用3 0 6 0 沸程的石油醚，脱脂剂与原料的料液比( w v ) 为1 ：8 ， 脱脂时间8h ，样品浸提液选用p h7 4 ，0 0 1m o l l 的p b s 缓冲液。 本课题对c o n a 的提取工艺条件进行了优化研究。根据单因素实验结果设计了三因 素三水平的响应面分析实验，得至u c o n a 的提取优化工艺参数为：提取液料比( w w ) 为8 8 8 ：1 ，提取时间8 6 5h ，p b s 提取液中含n a c i 的离子强度为0 1 7m o l l ，离心转速为 1 0 0 0 0g 。最佳工艺条件下提取，得到的c o n a 比活力为1 6 7 6 1h u m g 。选择7 0 饱和度 的固体( n h 4 h s 0 4 进行分级盐析，c o n a 比活力提高至2 3 7 4 3h u m g 。 采用d e a e 5 2 离子交换层析和s e p h a d e xg 10 0 凝胶过滤层析进一步分离纯化刀豆 凝集素粗提物，得到c o n a 纯品，纯品在s d s p a g e 凝胶电泳上显示单一的蛋白谱带， 测定c o n a 的亚基分子量为2 96 0 0d a ，与s i g m a 公司的c o n a 标准品迁移率相同，其 总活力回收率为5 7 0 6 ，比活力较洋刀豆浸提液的初始活力提高了5 0 1 5 倍，并与s i g m a 公司的c o n a 标准品进行了血凝活力的对比测定，两者血凝活力接近，仅相差一个数量 级，这说明了本实验所采用的分离纯化方法是可行的。 实验针对c o n a 的性质研究表明：c o n a 是一种对热较稳定的凝集素，6 0 以下时 c o n a 很稳定，1 0 0 。c 保温2 0m i n 后，血凝活力完全丧失。在p h 值范围5 8 8 3 时， c o n a 的血凝活力较高，当p h 1 1 9 时，血凝活力完全丧失。d 葡萄糖和d 甘露糖是 c o n a 的专一性结合糖。c o n a 对人的a 、b 、o 、a b 四种血型及供血动物( 兔，鸡， 鸭，鸽，鲤鱼，鲫鱼) 的血红细胞均能发生凝集作用，无血型专一性和供体细胞专一性； c o n a 的血凝活力依赖于c a 2 十和m n 2 + 存在，用e d t a 络合c o n a 中的金属离子，发现 c o n a 的血凝活力丧失，并且这种反应也是可逆的，可通过补充c a 2 + 和m n 2 + ，使c o n a 的血凝活力恢复。氨基酸组成分析表明，除色氨酸( t r p ) 因水解破坏未被测出外，c o n a 可测出1 7 种水解氨基酸，其中富含天冬氨酸( a s p ) 、谷氨酸( g l u ) 等酸性氨基酸。紫 外吸收光谱是凝集素的特征光谱之一，c o n a 在2 2 0n 1 1 1 到3 4 0n i n 之间有一个紫外吸收 峰，最大峰值在2 7 6n n l 左右。实验利用内源荧光方法研究了c o n a 在不同条件下的溶 液构象变化和t r p 残基微环境的构象特征。研究表明，c o n a 在天然状态下，激发波长 为2 8 0n r n 和2 9 5h i 1 时，其荧光发射光谱均呈现最大荧光发射峰3 3 4n i n 。和游离t r p 最大荧光强度的波长3 4 8n i n 相比，蓝移了1 4n m ，表明t r p 残基位于c o n a 较为疏水区 江南大学硕士学位论文 域。p h 和变性剂脲都能使c o n a 的荧光强度降低，但荧光光谱的形状和荧光发射峰的 位置没有明显的变化，这说明c o n a 的结构比较稳定。 关键词：洋刀豆，刀豆凝集素，提取，分离纯化，性质 a b s t r a c t a b s t r a c t l e c t i n sa r eak i n do fp r o t e i n st h a tc a ns p e c i f i c a l l ya n dr e v e r s i b l yb i n d 、析t h c a r b o h y d r a t e s ，b u tu s u a l l yw i t h o u ta n ye n z y m a t i co ra n t i b i o t i ca c t i v i t y t h e yw e r ew i d e l y d i s t r i b u t e di np l a n t s ，a n i m a l sa n dm i c r o o r g a n i s m s i nr e c e n ty e a r s ，t h er e s e a r c ho nl e c t i n sa r e m o r ea n dm o r ep o p u l a r ac o n v e n i e n t , s e n s i t i v ea n dr e l i a b l e p r o t o c o l w f l qe s t a b l i s h e dt od e t e r m i n et h e h e m a g g l u t i n a t i o na c t i v i t yo fc o n c a n a v a l i na ( c o n a ) w h i c hf e a t u r e s s e n s i t i z a t i o na n d f i x a t i o no ft h ee f f e c t o rr e db l o o dc e l l sb yg l u t a r a l d e h y d ee r o s s l i n k i n g w h e nt h eh u m a n e r y t h r o c y t ew a s t r e a t e d 、析t l l1 7 5u m lt r y p s i n , i t sa g g l u t i n a b i l i t yw a si n c r e a s e db y8t i m e s i no r d e rt oo b t a i ng o o dr e s u l t s ，s a m p l e ss h o u l db ec r u s h e dt o6 0m e s h ，r a t i o ( w v ) o fs a m p l e t oa e t h e r i sw a s1 ：8 ，l a s t i n gf o r8h t h eo p t i m u me x t r a c t i v ec o n d i t i o no fc o n aw a sd e t e r m i n e dt h r o u g hs i n g l ef a c t o rt e s t a n dr e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y ：b u f f e r m a t e r i a lr a t i o8 8 8 ：1 ，e x t r a c t i o nt i m e8 6 5kt h e b e s te x t r a c t i n gs o l u t i o nw a sp h7 4 ，o o l m o l li s o t o n i cp h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e ( p b s ) ( c o n t a i n e do 17 m o l ln a c l ) ，u n d e rt h e s ec o n d i t i o n s ，t h eh e m a g g l u t i n a t i n ga c t i v i t yo fc o n a w a s16 7 61 h u m g t h e nf r a c t i o nw i t h7 0 ( n h 4 ) 2 8 0 4 ，t h eh e m a g g l u t i n a t i n ga c t i v i t yo f c o n ar e a c h e dt o2 3 7 4 3h u m g a m a n g l c s p e c i f i c ( c o n a ) w a sp u r i f i e df r o ms e e d so fc a n a v a l i ae n s i f o r m i s ( l ) d c ) b yap r o c e d u r ei n c l u d i n ge x t r a c t i o n ，f r a c t i o n 谢t l l0 n i h 4 ) 2 s 0 4 ，i o n - e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y o nd e a e - 5 2c o l u m na n df o l l o w e db yg e lf i l t r a t i o no ns e p h a d e xg 一10 0 t h ep u r i f i e dc o n a s h o w e das i n g l eb a n do ns d sp o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ，n l ea g g l u t i n a t i n ga c t i v i t y o ft h ep u r i f i e dc o n as h o w e da na c t i v i t yi n c r e a s eo f5 0 15f o l da n da na c t i v i t yr e c o v e r yo f 5 7 0 6 t h em o l e c u l a rw e i g h to ft h es u b u n i tw a s2 96 0 0d a l t o n c o n aw a sak i n do fl e c t i ns t a b l et oh e a tt r e a t m e n t i tw a ss t a b l ea tb e l o w6 0 ，b u ti t w a sc o m p l e t e l yi n a c t i v ea ta b o v e10 0 ( 2f o r2 0 m i n c o n ah a dh i g h e rl e c t i na c t i v i t ya tp ho f 5 8 8 3 ，b u ti t sl e c t i na c t i v i t yw a si n a c t i v ea tp ha b o v e11 9 c o n ac a na g g l u t i n a t ea ，b ，o ， a b t y p e so fh u m a nb l o o da n dt h ee r y t h r o c y t e so fr a b b i t ，c h i c k e n ，d u c k ，p i g e o n ，c o m m o nc a r p a n dc m c i a nc a r p ，w i t h o u ts p e c i f i c i t yo fe r y t h o c y t ea g g l u t i n a t i o n t h ea g g l u t i n a t i n ga c t i v i t yo f c o n av a n i s h e da f t e rd e m e t a l i z a t i o nb yd i a l y s i sa g a i n s te d t a f o l l o w e db yd i a l y s i sa g a i n s t n a c l ，f u l la c t i v i t yw a sr e s t o r e db ya d d i t i o no fc a 2 + ，l i n 2 + a m i n oa c i da n a l y s i ss h o w e dt h a ti t c o n t a i n e d17k i n d so fa m i n oa c i d s ，i nw h i c ht h ec o n t e n t so fa s p a r t i ca c i da n dg l u t a m i c a c i d w e r er e l a t i v e l yh i g h 2 7 6 n mi st h eo p t i m u mu va b s o r p t i o no fc o n ai np h y s i o l o g i c a ls a l i n e t h ev a r i a t i o no fc o n ac o n f o r m a t i o ni nd i f f e r e n ts o l u t i o nc o n d i t i o n sw e r ef o l l o w e db y i n t r i n s i cf l u o r e s c e n c e t h ef l u o r e s c e n c es p e c t r u mo fn a t u r a lc o n ae x c i t e da t2 8 0 n ma n d 2 9 5 n ms h o w e dam a x i u mp e a kb o t ha t33 4 n m t h ec h a r a c t e r i s t i cp e a ko ft y rd i dn o te x i s t ， a n di ts h o w e dt h a tt h ef l u o r e s c e n c ee n e r g yo ft y rw a st r a n s f e r r e dt ot r pa n ds t r e n g t ht h e i i i 江南大学硕士学位论文 f l u o r e s c e n c eo ft r p ；p hv a l u e ，d e n a t u r a n tu r e ac o u l da l lr e d u c et h ef l u o r e s c e n c es t r e n g t ho f c o n a ，b u tc o u l dn o tl e a dt oc h a n g e si nt h ep r o f i l eo ff l u r e s c e n c es p e c t r aa n dt h ep o s i t i o no f e m i s s i o np e a k ，w h i c hs u g g e s t e dt h a tt h es t r u c t u r eo fc o n aw a ss t a b l e k e y w o r d s ：c a n a v a l i ae n s i f o r m i s ，c o n c a n a v a l i na ，e x t r a c t i o n ，p u r i f i c a t i o n ，c h a r a c t e r i z a t i o n i v 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 关于论文使用授权的说明 珈舅占1 l 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 导师签名1 日 期： 珈富多i2 - 第一章绪论 第一章绪论 1 1 刀豆和洋刀豆概述 刀豆属于豆科，因豆荚形似刀而得名“刀豆。又因荚形似人挟剑横斜，故又名“挟 剑豆。刀豆属有1 2 5 0 个种，但一般认为只有两个种被人类栽培。一种是洋刀豆 ( c a n a v a l i a e n s i f o r m i s ( l ) d c ) ，英文名j a c k b e a n 另一种为小刀豆( c a n a v a l i a g l a d i a t a ( j a c q ) d c ) ，英文名s w o r db e a n ，在文献中常将这两种刀豆相混淆。这两个种的最大 区别在种脐的长短，洋刀豆的种脐长度不到种子长度的一半，而小刀豆的种脐长度与种 子等长或接近种子长度i l j 。 洋刀豆( c a n a v a l i ae n s i f o r m i s ( l ) d c ) 属于豆科植物刀豆属( c a n a v a l i a ) ，亦称 “矮刀豆、“直立刀豆。原产墨西哥南部、秘鲁、巴西以及西印度群岛。史前由美洲 印第安人在现美国西南部驯化，现在作为一种覆盖作物和绿肥已在整个热带种植。1 5 0 0 年前，我国已有栽培，现在主要集中于我国的广东、广西、四川、云南、湖南等南方一 些省份【1 1 。 1 1 1 洋刀豆的营养成分 洋刀豆干豆粒的营养组成大致是：水分1 1 1 5 5 ，蛋白质2 4 8 3 5 3 ，脂肪 2 3 4 9 ，碳水化合物4 5 2 5 6 9 ，纤维素4 9 8 ，灰分2 7 3 9 。每1 0 0 9 含钙3 0 1 5 0m g ，磷5 4 2 9 8m g ，钾1 4 1m g ，铁7m g ，尼克酸( 烟酸) 2m g ，泛酸 0 4 m g ，维生素b l8 5m g ，维生素b 2 8 5m g l l l 。 蛋白质的氨基酸组成( m e , 斟) 为：谷氨酸6 4 4 ，苏氨酸2 7 5 ，丝氨酸3 1 6 ，丙氨酸 2 7 5 ，甘氨酸2 4 1 ，缬氨酸2 8 8 ，蛋氨酸8 5 ，异亮氨酸2 5 0 ，亮氨酸4 5 3 ，酪氨酸2 1 9 ， 苯丙氨酸3 2 2 ，赖氨酸3 4 4 ，组氨酸1 6 9 ，精氨酸2 9 4 ，色氨酸7 5 。 1 1 2 洋刀豆的植物学特征 1 1 2 1 形态学特征 洋刀豆为一种丛生型、一年生的半直立植物，也可变为多年生的攀援性的，株高可 达6 0 1 2 0c m 。根系可深入土壤，结瘤性良好。茎上有稀疏的粗毛，有不很明显的棱； 有时中空而无毛，随着植株变老而木质化，顶端稍有攀援性，特别是在荫蔽条件下有此 种表现。三处复叶，互生。叶柄长约1 1 1 7c m ；小叶全缘，较厚，呈革质状，小叶下 面有绒毛，长约7 5 1 2 5c m ，椭圆形到卵圆形。花序腋生，每花序3 5 组，每组有 花可达6 0 朵，白花梗上瘤状突起外生出。通常为白花授粉。旗瓣大，边缘弯曲，宽倒 卵形，红到紫色，管状部分白色；翼瓣分离，狭窄，稍扭曲或镰刀状；龙骨瓣较翼瓣宽， 向内弯，基本分离；雄蕊l o 个，单体，花药同型，子房无柄，通常有绒毛，柱头内弯； 雌蕊小，头状，顶生。荚果剑形，下垂，果皮坚硬而结实，有喙，成熟时呈草黄色，一 般长约2 2 3 5c m ，宽2 5 3 5c m ，每裂片有一棱，脊稍明显。每荚含种子1 0 2 0 粒， 种子稍扁平，长椭圆形，大种子长约1 5 2 5c m ，小的长1 1 5c m ，厚约1c m ，白色 或象牙色，或浅褐色。种皮光滑而有光泽，种脐位于中部，一般为褐色或灰色，狭长， 长度不到种子长度的一半。花期6 月，果期8 月。百粒重约7 5 1 7 5g ，干豆产量一般 江南大学硕士学位论文 约1 3 5 0k g h a 1 i 。 图1 - 1 洋刀豆干豆粒 f i g1 - 1c a n a v a l i ae n s i f o r m i ss e e d 1 1 2 2 生态学特征 洋刀豆成熟期一般在1 8 0 3 0 0 天之间，齄各地的气候条件而不同。它可种在很多 土壤类型上，可适应的土壤p h 值在4 5 8 0 之间，但以土壤p h 值在5 0 6 0 之间为 好。洋刀豆因为根系入土较深，所以定苗后相当耐早，并且它还相当耐涝、耐盐碱和较 耐荫蔽，但不耐霜冻。洋刀豆是一种短日照性植物，要求有足够长的生长季节和1 5 3 0 度的温度。由于洋刀豆比较耐旱，耐荫，还耐涝和耐盐，因此在许多地方，主要用途为 作绿肥和防止浸蚀的土壤覆盖作物。 1 2 凝集素的研究概况 1 2 1 凝集素的定义 凝集素是非免疫来源的、不具有酶活性、能较专一地和糖类结合的蛋白质，其本身 可阻是不含糖类的简单蛋白质，也可以是糖蛋白口】。凝集素是具有至少一个非催化性的 能够可逆性地与特异性单糖或低聚糖结合结构域的蛋白质i j 。 1 2 2 凝集素在自然界的含量与分布 凝集素分布广泛，植物、动物、微生物( 包括真核生物、原核生物、单细胞生物、 多细胞生物) ，整个生物界几乎无处不在。在植物中，不只种子中存在凝集素，其他 部位，如根、茎、叶、皮、果实汁中亦发现有凝集素。凝集素在植物中的分布，以豆科 植物研究地最为深入，在成熟的种子中，绝大多数凝集素位于子叶；在某些情况，胚中 有较多量的凝集素：在种子外壳也能检测到少量凝集素。植物凝集素在不同品种、同一 品种的不同成熟阶段、同一成熟阶段的不同部位含量均不相同。一般豆科植物的凝集素 在成熟种子中含量为15 3 ，有的甚至可达蛋白质总含量的1 0 左右。 1 2 3 凝集素的分类 根据对不同凝集素的分子生物学研究，凝集素主要有以下几个分类系统u 6 1 。 ( 1 ) 按来源分类：可分为植物凝集素、动物凝集素、微生物凝集素和b e a ( b i n d i n g ， e n 时，a c t i v ec e n t e r ，即同时具有结合部位、进入部位和活性中心) 类毒素。 ( 2 ) 按凝集素在细胞中存在的部位分类：可分为可溶性凝集素和膜结合凝集素。 第一章绪论 例如，菜豆凝集素( p h a s e o l u sv u l g a r i sa g g l u t i n a t i o n ，p h a ) 是典型的可溶性凝集素， 可溶于0 8 5 的生理盐水，可采用经典的蛋白质纯化方式纯化。唾液酸糖蛋白( m a j o r s i a l o g l y c o p r o t e i n ) 是红细胞膜上面结合的凝集素蛋白，这种凝集素需要用缓冲溶液，甚 至采用去垢剂溶解才能进一步纯化1 7 1 。 ( 3 ) 按凝集素的糖结合专一性，大致可分为七类【8 】：与d 甘露糖和( 或) d 葡 萄糖结合；与n 乙酰氨基1 3 一脱氧一d 葡萄糖结合；与n 乙酰氨基一d 一脱氧d 半乳糖 结合；与d 半乳糖结合；与l 岩藻糖结合；与唾液酸结合：其它：例如，不 与单糖或寡糖结合，而与某些糖蛋白、聚糖或复合寡聚糖专一结合，有少数凝集素被以 上六种糖以外的单糖( 如鼠李糖) 抑制。 ( 4 ) 根据凝集素总体结构分类：可分为部分凝集素( m e r o l e c t i n s ) 、整体凝集素 ( h o l o l e c t i n s ) 、嵌合凝集素( c h i m e r o l e c t i n s ) 和超级凝集素( s u p e r l e e t i n s ) 1 3 1 。部分凝 集素仅有一个单独的糖结合区，由于它以单体形式存在，所以不能沉积缀合糖或凝集细 胞。整体凝集素也仅由糖结合区组成，但至少含有两个相同或十分相似的糖结合区，由 于它们是二阶或多阶的，故它们能够沉积缀合糖或凝集细胞。大多数植物凝集素为整体 凝集素。嵌合凝集素是“融合”蛋白，由糖结合区与一个独立功能区组成，后者具有明 显的催化或其它的生物活性，它不依赖于糖结合区而独立起作用。 ( 5 ) 从进化和结构相关性分类，凝集素可分为7 个不同家族【9 】：豆科凝集素， 例如，刀豆凝集素( c o n a ) 和大豆凝集素( s o y b e a na g g l u t i n a t i o n ，s b a ) ；单子叶植 物甘露糖结合凝集素，例如，朱顶兰凝集素( a m a r y l l i sv i t t a t al e c t i n ，a v l ) 1 1 0 1 ；包 含h e v e i n 结构域的壳多糖结合蛋白，h e v e i n 是从橡胶树的乳液中分离到的一种由4 3 个氨基酸残基组成的小分子量蛋白，为含一个单一壳多糖结合域的单凝集素，人们把这 个壳多糖结合域称为h e v e i n 结构域【l l 】；i i 型核糖体失活蛋白( t y p e2 r i b o s o m e i n a c t i v a t i n gp r o t e i n ，r i p si i ) ，例如，苦瓜籽核糖体抑制蛋白1 1 2 1 葫芦科韧 皮部凝集素，该凝集素专一识别n 乙酰氨基半乳糖【1 3 】；木菠萝素( j a c a l i n ) 家族，例 如，木菠萝凝集素；苋科凝集素，例如，尾穗苋菜凝集素1 1 4 。 1 2 4 凝集素的分离纯化 目前，人们已经分离纯化了1 0 0 0 多种凝集素，其中大多是植物凝集素，仅豆科植 物凝集素就达6 0 0 余种。凝集素分离纯化的方法很多，主要有：离子交换层析、凝胶过 滤层析、亲和层析、快速蛋白质液相层析( f p l c ) 、膜层析和疏水层析等方法【l 引。 在众多的分离纯化技术中，离子交换层析是最常用的分离纯化技术，其原理是凝集 素分子主要靠与固定相的可解离基团进行交换，吸附于固定相上，用改变p h 或不同盐 浓度的溶液将各组分分别洗脱下来，这样混合物中各组分即被分开，从而达到纯化的目 的。 凝胶过滤层析是一项重要的蛋白质纯化技术，是利用凝胶的网状结构，根据样品中 各组分的分子量大小和形状分离的方法，将被分离的物质按分子大小分开，达到分离纯 化的目的。这种方法利用分级分离，而不需要凝集素的化学结合，这就明显降低了因不 可逆结合所导致的凝集素损失和失活。 江南大学硕士学位论文 亲和层析主要基于凝集素特定及可逆地结合糖的能力用以实现凝集素的分离。常用 的载体物质为s e p h a r o s e4 b ，至于受体或配体种类则有所变化。不同亲和配体可通过使 用单糖或寡糖进行凝集素活性抑制分析来确定【1 6 , 1 7 l 。 快速蛋白质液相层析( f p l c ) 是在1 9 8 7 年美国p e r s e p t i v eb i o s y s t e m s 公司首推灌 注层析介质后诞生的一种新型快速分离蛋白的方法。层析介质采用双孔结构，即除了常 规层析介质的大量微孔外，还含有纵横交错贯穿介质的“大孔”。其操作压强介于常规 和高效液相层析之间【l 引。 膜层析则是以膜为载体，对膜的内外表面进行修饰，接上官能团来分离纯化凝集素。 由于膜具有良好的通透性和耐压性，使得层析可以高效、快速进行，灌注层析介质与膜 介质的开发是层析技术的新突破【1 9 j 。 另一种较常用的分离纯化方法疏水层析，可以不考虑凝集素的糖结合活性，用水作 洗脱剂【2 0 1 ，如m a t s u m o t o 等利用高效疏水层析分离了p h a 等的同功凝集素【2 1 1 。 1 2 5 凝集素的生物学功能 凝集素在生物界的广泛分布及其在生物体内的丰富程度说明它们在生物体中的地 位十分重要。凝集素在不同生物中及同一生物不同组织中的结构、分布的多样性，表明 其在进化过程中适应并产生了许多独特的功能。最早被注意到并研究最多的是凝集细胞 作用和促细胞有丝分裂作用。其他还有如免疫作用、抗营养作用( 致毒作用) 、使细胞 表面成分的再分布、修饰细胞膜酶的活力、阻断卵受精、对脂肪细胞具有类似胰岛素的 活性等也逐渐被研究和证实【8 2 2 】。 1 2 5 1 与细胞结合 凝集素作用于细胞，必须先与细胞表面结合，细胞凝集可作为凝集素与细胞表面分 子结合的证据。凝集素与细胞的结合，不像激素或药物与受体结合那么专一，它能和含 有与其结合位点互补的糖基的任何细胞结合，因此几乎所有细胞和许多亚细胞结构都会 与凝集素结合。值得注意的是，并非任何一类细胞能与每一种凝集素结合。与凝集素专 一结合的糖，会抑制凝集素与细胞的结合，表明与凝集素结合的细胞表面结构是从细胞 伸出的糖蛋白或糖脂的糖链部分1 2 引。 1 2 5 2 免疫作用 e h r l i c h 于1 9 世纪末借蓖麻素和相思豆素确立了免疫学的一些最基本的原理，包括 免疫反应的专一性和抗体抗原相互作用的可逆性【2 4 】。他给小鼠多次皮下注射小剂量蓖麻 素后，小鼠对致死剂量的蓖麻素获得免疫力。并证明免疫的小鼠血清能中和蓖麻素的毒 性，但不能中和相思豆的毒性；同样，相思豆的抗血清也不能中和蓖麻素的毒性。凝集 素的免疫作用是复杂的，它能激活免疫系统，但在不同的条件下它又有抑制作用。 1 2 5 3 防御功能 凝集素在植物保护上起着重要作用。植物凝集素可识别并结合入侵者的糖结构域， 从而干扰该入侵者对植物产生的可能影响1 2 引。许多植物凝集素可结合到诸如葡萄糖、甘 露糖或半乳糖的单糖上，尤其对植物中不常见外来的寡糖具有更高的亲和性。 4 第一章绪论 1 2 5 4 抗营养作用 凝集素是植物在长期进化过程中形成的抵御病虫害和动物消化的成分之一，因此对 动物具有一定的抗营养作用。植物凝集素的抗营养作用与其本身的结构和生物学特性有 关。在动物营养学中，植物凝集素是一种重要的抗营养因子，它能影响动物生长与代谢 的各个方面，从而影响动物的生长性能。 植物凝集素的抗营养作用主要有如下几个方面：作为抗原，引起机体对其产生变 态反应；降低动物的采食量；增加体内糖原、脂肪组织和蛋白质分解代谢；抑制 胸腺生长，引起小肠、肝脏、胰腺增生肥大。此外，它还降低肠道一些酶如肠激酶等的 活性，降低脂肪、葡萄糖和无机电解质的吸收及改变肠道微生物的生态环境，并对肠道 产生的免疫球蛋白( i g a ) 有拮抗作用。在动物生长中，凝集素作为一种抗营养因子能 引起动物日增重下降，阻碍消化道内营养物质的消化和吸收过程，并影响免疫系统【2 6 j 。 植物凝集素对动物的抗营养作用途径如下图1 2 所示暖7 】： 诱发上皮细胞代谢 变化( 肥大和增生) 增强多胺代谢和多 胺吸收能力等 大多植物凝集素在消 化系统能够抗酶的降解 抗降解凝集素结合 于消化道表面受体 与受体结合的凝集 素被内吞入细胞 穿过上皮细胞 进入血液循环 影响肠道内分泌 细胞的功能 诱导黏膜免疫系 统变化，干扰肠 道菌群平衡 产生抗凝集 素i g e ( 过敏 反应) 和i g g 类抗体 胸腺萎缩 对细胞免 疫有潜在 影响 促进胰 腺和肝 脏的增 生刺激 肌 肉 萎 缩 调控内分泌系 统增加机体蛋 白质和脂肪、 糖的分解代谢 图1 - 2 植物凝集素对动物的抗营养作用途径 f i g 1 - 2t h ep o s s i b l ep a t h w a y so f t h ea n t i - n u t r i t i o n a la c t i v i t i e so f l e c t i nt oa n i m a l s 1 2 5 5 作为专化的识别因子参与某些代谢过程 根瘤菌与宿主豆科植物之间建立的特有的共生关系中，凝集素可能参与了识别作 用。b o h l o o 提出，凝集素在识别中起到了宿主植物专一性决定因子的作用，豆科植物 凝集素在豆科植物根表面的特异性多糖产生特异性的相互作用。d a z z o 发现，三叶草根 5 江南大学硕士学位论文 表面的凝集素能够凝集具有感染能力的根瘤菌，并提出了交联桥假说【2 引。微生物所具有 的凝集素专一识别寄主细胞膜的糖基，继而感染寄主。如流感病毒的凝集素在寄主细胞 表面与唾液酸化的糖类结合，并吸附到细胞膜上，导致病毒与寄主细胞膜融合，允许病 毒基因组释放到细胞质并复制，引起感染。 1 2 6 凝集素的应用 ( 1 ) 分离和纯化含糖高分子 凝集素能够专一性地结合单糖、寡糖、糖蛋白、糖脂等化合物，在凝集反应中，结 合也能被特异的单糖、寡糖所抑制，基于这个特性，凝集素己广泛用于分离各类含糖化 合物。这种固定化凝集素亲和层析技术具有如下优点：便于大量纯化：专一沉淀或吸附 的含糖化合物通常易于被专一的单糖解离或洗脱；洗脱可在中性或接近中性的条件下进 行，不破坏糖蛋白等的活性，得率也较高；同时能够分离糖链结构差异很小的糖蛋白。 例如，已用c o n a 分离纯化不同变种的甲胎蛋白，乙型肝炎表面抗原( h b s a g ) 亚基， 绒毛膜促性腺激素( h c g ) ，促黄体激素( l h ) ；分离猪脂肪细胞膜上的糖蛋白和猪大 网膜脂肪细胞质膜糖蛋白，胰岛素受体；纯化碱性磷酸酶，免疫球蛋白( i g g ) 等1 2 9 1 。 ( 2 ) 凝集素作为生物探针 凝集素具有多种生物活性，可凝集各种细菌，活化淋巴细胞及沉降复合糖质等，可 以作为生化及临床试剂被广泛应用。一种凝集素具有对某一种特异性糖基专一性结合的 能力，如麦芽素与n 乙酰糖胺结合；菜豆凝集素与n 乙酰乳糖胺结合。因此，凝集素 可以作为一种探针来研究细胞膜上特定的糖基【3 0 】。另一方面，凝集素具有多价结合能力， 能与荧光素、生物素、酶、胶体金和铁蛋白等示踪物结合，从而在光镜或电镜水平显示 其结合部位。 ( 3 ) 凝集素用于研究分子互作 凝集素是分离纯化和研究糖复合物结构与功能的重要工具，是阐明糖和蛋白质相互 作用机制的理想模型【3 1 1 。凝集素由于专一的识别某一特定单糖或多糖中的特定糖基序 列，可用于糖链的结构分析。它们可识别糖链的不同类型、不同核心结构，探测糖链分 布，选用多种凝集素反复核对糖链的结构可获得较为准确的结论【3 1 1 。 ( 4 ) 凝集素在药物研究和疾病治疗中的应用 最新研究发现可以利用凝集素的特殊功能来设计一类像临床化疗中运用的单克隆 抗体那样具有导航作用的药剂，把杀伤癌细胞的药物定向运送至肿瘤组织以减少药物的 毒副作用1 3 2 。如肝脏细胞凝集素可以与半乳糖特异结合，就可以选用含半乳糖的凝集素 与治疗肝病的相应药物结合成复合物，使药物定向导入至肝细胞，发挥针对性的治疗作 用。 一些凝集素优先凝集哺乳动物中发生癌变的组织细胞，可能是癌变细胞的表面凝集 素的糖基受体与正常细胞相比，产生了特定的变化，导致癌变细胞易于为凝集素识别和 结合。近年来，已将凝集素作为分子探针，检测肿瘤细胞表面及细胞内糖基受体的分布， 研究肿瘤细胞的分化、变异情况。凝集素的标记应用于组织化学分析的研究有其相对特 异性，它可以对肿瘤细胞的生物学行为进行分子水平上的探讨，为肿瘤分子病理学研究 6 第一章绪论 开辟了一条新途径。由于细胞膜和细胞浆内存在凝集素受体，正常情况下，这种凝集素 受体是相对稳定的，当细胞恶变时，受体的数量和性质亦随之发生改变，并可反应在对 凝集素结合的能力方面【3 3 1 。 ( 5 ) 凝集素在农业上的应用 凝集素的防卫作用可应用于植物抗病、抗虫基因工程，为植物育种提供新的途径。 目前，已克隆了几个对害虫抗性较好的凝集素基因，经农杆菌介导或微弹轰击等方法导 入作物中。在植物抗蚜虫基因工程中得到广泛应用的植物凝集素基因主要有雪花莲凝集 素( g n a ) 基因，另有苋菜凝集素( a h a ) 基因及半夏凝集素( p t a ) 基因。雪花莲 凝集素( g n a ) 基因已经成功地导入了烟草、水稻、菜豆、西红柿、马铃薯、小麦中。 这些转基因植物都表现出了对蚜虫生长、发育和生殖力的抗性和抑制作用1 3 4 1 。 最近的研究发现识别根瘤菌的因子是豆科植物根上的凝集素【3 5 1 。目前，固氮工程尝 试将豆科植物的凝集素基因转化到非豆科植物，再接种豆科植物的根瘤菌，使该种非豆 科植物被侵染和结瘤，豌豆根瘤菌( r h i z o b i u ml e g u m i n o s a r u m ) 能在豌豆上形成根瘤， 但不能在白三叶草根中形成根瘤。将豌豆凝集素( p 括u ms a t i v u ml e c t i n ，p s l ) 基因转 入白三叶草后，白三叶草根毛上也产生了根瘤。p s l 定位于转基因白三叶草根表皮细胞 的外表面和根毛间，但正常的三叶草和根毛中则没有p s l 。这种固氮方法应用于粮食作 物和经济作物将有很大的意义。 1 3 刀豆凝集素国内外研究进展 1 3 1 刀豆凝集素的概述 刀豆凝集素又称伴刀豆球蛋白( c o n c a n a v a l i na ，简称c o n a ) 。c o n a 是刀豆活性 蛋白的一种，也是豆科植物凝集素的一种。s u m n e r 和h o w e l l 于1 9 3 6 年首次从洋刀豆 种子中纯化了c o n a ，并且发现纯化的c o n a 不仅能凝集红细胞，而且还能沉淀溶液中 的糖元和黏蛋白，c o n a 血凝作用被蔗糖抑制。c o n a 在植物体内的作用是：促进种子 的成熟和发芽，储存蛋白质，转移糖，防御病原微生物，识别非己，促进细胞生成等。 它通过各种机制对动物产生抗营养的作用，为洋刀豆种子中的抗营养因子。在洋刀豆种 子中c o n a 的含量较为丰富，占其总蛋白的2 5 3 3 0 , 3 。 c o n a 是目前唯一阐明了立体结构的凝集素，通过x 射线晶体图像研究，获得了c o n a 的完全立体结构图像( 如图1 3 所示) 。c o n a 的单体( 亦称原体，p r o t o m e r 或完整亚基) 由2 3 7 个氨基酸组成，呈穹隆形，大约高4 2a ，宽4 0 a ，厚3 0a 。单体通过二倍对称轴， 形成椭圆形的二聚体。二聚体通过另一二倍对称轴形成大致呈四面体的四聚体，其极性 和非极性基团的部分与其它蛋白质相似，极性基团在分子表面，疏水基团主要在分子内 部。分子中有大量的b 结构，5 7 的氨基酸组成两个反平行折叠层，“背”折叠层由6 4 个氨基酸组成，“前 折叠层由5 7 个氨基酸组成，其余氨基酸则呈无规卷曲，分子中没 有0 【螺旋结构。c o n a 分子中极性和非极性基团的分布，一般与其它蛋白质相似。极性基 团在分子表面，疏水基团主要在分子内部。形成二聚体的作用力除依赖氢键和范德华力 外，亦依赖盐桥，即一个二聚体中的1 1 4 和1 1 6 氨基酸基和另一个二聚体中的谷氨酸基之 7 江南大学硕士学位论文 间的盐桥连接嗍。 图1 - 3c o n a 的立体结构 f i g 1 - 3t h et r i d i m e n s i o n a ls t r u c t u r eo fc o n a 1 3 2 刀豆凝集素功能性质的研究 随着凝集素纯化方法的发展和凝集素性质研究的日益深入，凝集素应用的范围越来 越广阔，已广泛应用于化学，生物化学，生物学，免疫学，医学等各个领域，是临床诊 断，治疗，工业生产中极其有用的工具。基于凝集素与糖分子专一性和可逆性地结合， 凝集素已被广泛应用于分离纯化含糖高分子，分离纯化细胞，鉴定微生物，选择突变株 细胞，研究细胞的表面特征，探索免疫反应的机理，作为组织化学和细胞化学试剂等。 在临床上用于疾病的鉴定诊断，研究肿瘤细胞生长及影响因素、迁移特征，研究疾病的 病理变化。 ( 1 ) 在临床医学方面的应用 c o n a 具有强烈的促有丝分裂作用，c o n a 可激活人体淋巴细胞转变为淋巴母细胞， 但并不产生相应的细胞毒性，从而可增强人体的免疫作用，并能凝聚癌细胞和各种致癌 物质所引起的变形细胞，而对正常细胞无害，故具有抗肿瘤作用。它还能选择性激活抑 制t 细胞( t s 细胞) ，对调节机体免疫反应具有重要作用，因此通过使用c o n a 来活化病 态( 或老年) 时的t s 细胞这一途径，可望改观一些自身免疫疾病，甚至器官移植排斥反 应，并对恶性肿瘤的免疫治疗具有良好的前景【3 3 j 。 另多 l c o n a 可促进淋巴细胞分裂，作皮内注射可反映肿瘤，肝炎等患者的细胞免疫 能力。且c o n a 皮试不需要事先致敏，在监测各种免疫治疗方面可反复多次地进行，而 不改变机体的反应强度。因此采用c o n a 作细胞分裂原可评价各种疾病患者的免疫功能。 ( 2 ) 在分离、纯化含糖高分子方面的应用 目前糖蛋白、糖肽或其它含糖高分子物质的分离多采用离子交换层析、凝胶过滤层 析、薄层色谱、高效液相色谱等方法，基于c o n a 对糖基的识别和可逆结合的特性，使 上述方法不可能分离的糖基完全可以得到分离和纯化