（食品科学专业论文）固态发酵豆粕制备大豆肽发酵条件的优化.pdf

1 i 一 ，_ j at h e s i ss u b m i t t e df o rt h ea p p l i c a t i o no f t h em a s t e r sd e g r e eo fe n g i n e e r i n g o p t i m u m c o n d i t i o n sf o rp r e p a r a t i o no f s o y b e a np e p t i d e sb y s o l i d - - s t a t e f e r m e n t a t i o n c a n d i d a t e ： s p e c i a l t y ： j i a n gm a n f o o ds c i e n c e s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rs o n gj u n m e i s h a n d o n gi n s t i t u t eo fl i g h ti n d u s t r y , j i n a n ，c h i n a j u n e ，2 0 1 0 、 、 舢 i ，厂 i 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文 中引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义七 已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或 成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 论文作者签名： 同期：兰! ! ! 年芝月皇望二几 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的沦义及相关的职务作品，知谚 产权归属山东轻工 业学院。山东轻工业学院享有以任何方式发表、复制、公丌阅览、借阅以及申请 专利等权利，同意学校保留并向困家有关部门或机构送交沦文的复印件和电子版， 本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名 单位仍然为山东轻工业学院。 论文作者签名： 导师签名： 同期： 幻 年6 月涕f t v l i h 曩 i 山东轻t 业学院颂i ：学位论文 目录 摘要i a b s t r a c t ：i 第1 章绪论1 1 1 引言1 1 2 火豆肽的分离纯化方法1 1 2 1 离子交换色谱1 1 2 2 凝胶过滤法2 1 2 3 萨交轴逆流色谱法2 1 2 4 高效液柏色谱法2 1 2 5 超滤2 1 3 大豆肽分子量分布的测定力法3 1 3 1t r i c i n e p a g e 电泳法3 1 3 2 高效液相色谱法3 1 3 3 质谱法4 1 4 本课题的立题依据及研究内容。4 第2 章大豆肽分子量分布的测定5 2 1 引言5 2 2 实验材料与方法5 2 2 1 原料5 2 。2 2 试剂及其配制5 2 2 3 主要仪器6 2 2 4 实验方法6 2 3 结果与讨论8 2 3 1 标准样品的选择8 2 3 2 黑曲霉同念发酵豆粕的研究9 2 3 3 米曲霉固念发酵豆粕的研究1 2 2 3 4 黑曲霉、米曲霉混合菌种固态发酵豆粕的研究1 4 2 4 小结2 0 第3 章水解度与大豆肽分子量分布相关性的确定2 1 i ：1录 3 1 引言2 1 3 2 实验材料与方法2 l 3 2 1 原料2l 3 2 2 试剂及其配制2 l 3 2 3 仪器设备2 2 3 2 4 实验方法一2 2 3 3 结果与讨论2 2 3 3 1 黑曲霉固态发酵豆粕的研究一2 2 3 3 2 米曲霉崮态发酵粕的研究2 3 3 3 3 黑曲霉、米曲霉混合菌种固态发酵豆粕的研究一2 5 3 4 小结2 7 第4 章酶系分布与大豆肽分子量分布相关性的确定2 9 4 1 引言2 9 4 2 实验材料与方法2 9 4 2 1 原料2 9 4 2 2 试剂及其配制一2 9 4 2 3 仪器设备一3 0 4 2 4 实验方法3 0 4 3 结果与讨论3 0 4 3 1 黑曲霉阎态发酵豆粕的研究3 0 4 3 2 米曲霉同念发酵豆粕的研究3 l 4 3 3 黑曲霉、米曲霉混合菌种崮念发酵豆粕的研究3 2 4 4 j 、结3 4 第5 章大豆肽最优发酵条件的确定3 7 5 1 引言3 7 5 2 实验材料与方法3 7 5 2 1 原料3 7 5 2 2 试剂及其配制3 7 5 2 3 仪器设备3 7 5 2 4 实验方法3 7 5 3 结果与讨论3 8 5 3 1 黑曲霉同态发酵豆粕的研究3 8 2 山东轻t 业学院帧i j 学位论文 5 3 2 米睦霉固态发酵豆粕的研究4 0 5 3 3 黑曲霉、米曲霉混合菌种固态发酵豆柏的研究4 1 5 3 4 大豆肽最优发酵条件的确定4 2 5 4 小结4 2 结论4 5 进一步工作设想一4 7 参考文献4 9 致 谢5 3 攻读硕士期间发表的论文5 5 蝣 山东轻丁业学院硕i ：学位论文 摘要 大哆肽是l 大豆蛋白经水解所得到的 h3 6 个氨基酸残基组成的低分子肽混 合物，分了最以低于1 0 0 0 d a 的为主。由于它们刁i 仅具有良好的加工特性，还具有 多种对人体有益的生理功能，如抗疲劳、抗氧化、降胆同醇、降血压等。大豆肽 在食品、医药、化妆品等很多领域得到了广泛应用，并被视为一种很有前途的功 能性食品而备受科研人员的关注。目前，我困火豆肽处丁研制的高潮阶段，但是 有关水解度、蛋白酶酶系分布与大豆肽分子量分布范i n c h 天性的研究较少，尚未 见报道。 本研究以豆粕为原料，以黑曲霉a s 3 3 5 0 、米曲霉a 9 0 0 5 及二者的混合菌种 为发酵菌株，进一步探讨了运用固念发酵法发酵豆粕制备人豆肽的最优发酵条件。 主要研究以下几个方面的内容：( 1 ) 大豆肽分子量分行情况的测定；( 2 ) 水解度与分 子量分布情况相关性的确定；( 3 ) 蛋白酶酶系分布与分子量分析】t 占况相关性的确定； ( 4 ) 大豆肽最优发酵条件的确定。主要研究结果如下： 1 黑曲霉a s 3 3 5 0 ： ( 1 ) 分子量分布：主要集中在m w 1 3 5 5 d a 范围内，游离氨基酸的分子量分布 百分比率偏低，低聚肽的分子量分布百分比率中等。发酵8 4 h 时低聚肽的百分比 率达到最大，为4 7 3 2 。 ( 2 ) 水解度：一直升高。 ( 3 ) 蛋白酶酶活：0 - 6 0 h 逐渐，j 二升，7 2 h 达到最大值后歼始下降。 ( 4 ) 肽转化率：一直升高，最人值为6 8 。 ( 5 ) 低聚肽转化率：发酵8 4 h 时达到最大，为2 8 3 9 。 2 米曲霉a 9 0 0 5 ： ( 1 ) 分子鼍分布：更大程度地集中在m w 1 3 5 5 d a 范【；l 内，游离氨基酸的分子 量分布百分比率稍低，低聚肽的分子量分布百分比率中等。发酵7 2 h 时低聚肽的 百分比率达到最大，为3 1 2 l 。 ( 2 ) 水解度：一直升高。 ( 3 ) 蛋白酶酶活：0 - 6 0 h 逐渐上升，7 2 h 达到最大值后丌始下降。 ( 4 ) 肽转化率：一直升高，最火值为4 8 。 ( 5 ) 低聚肽转化率：发酵9 6 h 时达到最大，为1 2 2 4 。 3 黑曲霉a s 3 3 5 0 和米曲霉a 一9 0 0 5 混合菌种： ( 1 ) 分子量分布：大分子量肽的分子量分伟百分比率先减少而后增加；游离氨 基酸的分子量分布百分比率很低；低聚肽的分子量分布百分比率比黑曲霉和米曲 霉单菌种发酵时都要高，平均在5 0 以上，发酵1 3 2 h 时达到最大，百分比率为 摘要 6 9 9 0 。 ( 2 ) 水解度：一直升高。 ( 3 ) 蛋白酶酶活：先升高后下降，发酵1 3 2 h 时达到最大值，蛋白酶酶活大约为 1 2 1 9 u g 。 ( 4 ) 肽转化率：一直升高，最人值为7 5 5 4 。 ( 5 ) 低聚肽转化率：发酵1 3 2 h 时达到最大，为4 9 2 9 。 4 在水解度和蛋白酶酶系分布与大豆肽的分子母分布均没有明显相关性的条 件下，选择大砭肽转化率较高、分子量分砸j 最合理( 分子量分前i 在2 0 4 d a 1 3 5 5 d a 之l i l j ) 的发酵条件为最优发酵条件。即：自然p h 值条件下黑曲霉a s 3 3 5 0 与米曲 霉a 9 0 0 5 菌种比为2 ：1 ，发酵温度为3 0 ，发酵时问为1 3 2 h 。在此条件下低聚 肽的百分比率约为7 0 左右，低聚肽转化j 钲约为4 9 。 关键词：豆粕；大豆肽；分子量分布；水解度；酶系分布。 山东轻t 业学院硕i j 学位论义 a b s t r a c t s o y b e a np e p t i d ei st h eh y d r o l y s a t eo fs o yp r o t e i na n dam i xo fl o wp e p t i d e sw h i c h c o m p o s e so f t h r e et os i xr e s i d e n c e s i t sm o l e c u l a rw e i g h ti sb e l o w10 0 0 d a t h e yw e r e a l s od e f i n e da ss o y b e a nb i o a c t i v i t yp e p t i d eo rs o y b c a nf u n c t i o n a lp e p t i d ed u et ot h e i r g o o dp r o c e s sf u n c t i o na n db i o a c t i v i t yb e n e f i c i a lt oh u m a nb o d y , f o re x a m p l e ，i th a st h e r e s i s t a n tt ot i r e d n e s sa n do x i d a t i o n ，l o w e r e dc h o l e s t e r o la n db l o o dp r e s s u r ea n ds oo n s o y b e a np e p t i d eh a sb e e nw i d e l yu s e di nf o o d ，m e d i c i n ea n dc o s m e t i cf i e l d s ，a n d f o c u s e db yr e s e a r c h e r sf o rt h e i rp o t e n t i a lo ff u n c t i o n a lf o o d a tp r e s e n t ，t h er e s e a r c ho f s o y b e a np e p t i d ei sb o o m i n g h o w e v e r , t h e r ei sm u c hl e s s r e s e a r c ho nt h ec o r r e l a t i o n b e t w e e nd e g r e eo fh y d r o l y s i s ，p r o t e a s ee n z y m es y s t e md i s t r i b u t i o na n dm o l e c u l a r w e i g h td i s t r i b u t i o n ，w h i c hh a sn o tb e e nr e p o r t e ds of a r i nt h i sr e s e a r c h ，t h eo p t i m a lf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sf o rt h ep r o d u c t i o no fs o y b e a n p e p t i d eb ys o l i d - s t a t ef e r m e n t a t i o nw a sd i s c u s s e d ，w h i c hu s i n gs o y b e a nm e a la sr a w m a t e r i a l ；a s p e r g i l l u so r y z a e a 一9 0 0 5 ，a s p e r g i l l u sn i g e r 3 3 5 0 a n dd o u b l es t r a i na s f e r m e n t a t i o ns t r a i n t h i s p a p e r f o c u s e do nt h e f o l l o w i n g f o u r a s p e c t s ：f i r s t ， d e t e r m i n a t i o no ft h em o l e c u l a rw e i g h td i s t r i b u t i o no fs o y b e a np e p t i d e s e c o n d ，m a k e s u r et h ec o r r e l a t i o nb e t w e e nd e g r e eo fh y d r o l y s i sa n dm o l e c u l a rw e i g h td i s t r i b u t i o n t h i r d ，m a k es u r et h ec o r r e l a t i o nb e t w e e np r o t e a s ee n z y m es y s t e md i s t r i b u t i o na n d m o l e c u l a rw e i g h td i s t r i b u t i o n f o u r t h ，o p t i m i z et h ec o n d i t i o n so ff e r m e n t a t i o no f s o y b c a np e p t i d e t h em a i nr e s u l t sw e r ed e s c r i b e da sf o l l o w i n g ： 1 a s p e r g i l l u sn i g e r 3 3 5 0 ( 1 ) m o l e c u l a rw e i g h td i s t r i b u t i o n ：m a i n l yd i s t r i b u t i n gi nm w 1 3 5 5 d a ；t h er a t t oo f l o w - m o l e c u l a r - w e i g h tp e p t i d ew a sl o w ；t h er a t t oo fo l i g o p e p t i d ew a sm o d e r a t e ，w h e n f e r m e n t a t i o nt i m ew a sa t8 4 h ，t h em a x i m u mr a t t ow a s4 7 3 2 ( 2 ) d e g r e eo fh y d r o l y s i s ：r i s ea ta l lt i m e s ( 3 ) p r o t e a s ea c t i v i t y ：0 - 6 0 h l i v i n gi n c r e a s eg r a d u a l l y ，7 2 h a f t e rl i v e - s t a r t e dt o d e c l i n e ( 4 ) p e p t i d ec o n v e r s i o nr a t e ：r i s ea ta l lt i m e s ，t h em a x i m u mw a s6 8 ( 5 ) o l i g o p e p t i d ec o n v e r s i o nr a t e ：w h e nf e r m e n t e d a t8 4 h ，t h em a x i m u mw a s 2 8 3 9 2 a s p e r g i l l u so r y z a e a 一9 0 0 5 ( 1 ) m o l e c u l a rw e i g h td i s t r i b u t i o n ：m a i n l yd i s t r i b u t i n gi nm w 1 3 5 5 d a ；t h er a t t oo f l o w - m o l e c u l a r - w e i g h tp e p t i d ew a ss l i g h t l yl o w ；t h er a t t oo fo l i g o p e p t i d ew a sm o d e r a t e ， a b s t r a c t w h e nf e r m e n t a t i o nt i m ew a sa t7 2 h ，t h em a x i m u mr a t t ow a s31 21 ( 2 ) d e g r e eo fh y d r o l y s i s ：r i s ea l lt h ew h i l e ( 3 ) p r o t e a s ea c t i v i t y ：0 - 6 0 h l i v i n gi n c r e a s eg r a d u a l l y ，7 2 ha f t e rl i v e s t a r t e dt o d e c l i n e ( 4 ) p e p t i d ec o n v e r s i o nr a t e ：r i s ea l lt h ew h i l e ，t h em a x i m u mw a s4 8 ( 5 ) o l i g o p e p t i d ec o n v e r s i o nr a t e ：w h e nf e r m e n t e da t9 6 h ，t h em a x i m u mw a s 1 2 2 4 3 t h em i x t u r eb a c t e r i ao f a s p e r g i l l u sn i g e r 3 3 5 0a n d a s p e r g i l l u so r y z a e a 一9 0 0 5 ( 1 ) m o l e c u l a rw e i g h td i s t r i b u t i o n ：m a i n l yd i s t r i b u t i n gi nm w i3 5 5 d a ；t h er a t t oo f l o w - m o l e c u l a r - w e i g h tp e p t i d ew a sm u c hl o w ；t h er a t t oo fo t i g o p e p t i d ew a sh i g h e rt h a n s i n g l es t r a i na b o v e ，t h ea v e r a g eo fw h i c hw a sm o r et h a n5 0 w h e uf e r m e n t a t i o nt i m e a tl3 2 h t h em a x i m u mr a t t ow a s6 9 9 0 ( 2 ) d e g r e eo fh y d r o l y s i s ：r i s ea l la l o n g ( 3 ) p r o t e a s ea c t i v i t y ：f i r s ti n c r e a s e dt h e nd e c r e a s e d ，w h e nf e r m e n t a t i o nt i m ew a sa t l3 2 h ，t h em a x i m u mo f p r o t e a s ea c t i v i t yw a s12 19 u g ( 4 ) p e p t i d ec o n v e r s i o nr a t e ：r i s ea l la l o n g ，t h em a x i m u mi s7 5 5 4 ( 5 ) o l i g o p e p t i d ec o n v e r s i o nr a t e ：w h e nf e m a e m e da t l3 2 h ，t h em a x i m u mw a s 4 9 2 9 4 u n d e rt h ec o n d i t i o no fn o tm u c hm o r eo b v i o u sc o r r e l a t i o nb e t w e e nd e g r e eo f h y d r o l y s i s ，p r o t e a s ee n z y m es y s t e md i s t r i b u t i o na n dm o l e c t r l a rw e i g h td i s t r i b u t i o n ， h i g h e rc o n v e r s i o nr a t eo fs o y b e a np e p t i d ea n dr e a s o n a b l em o l e c u l a rw e i g h td i s t r i b u t i o n w a sd e t e r m i n e da st h eo p t i m a lf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s t h er e s u l t ss h o w e dt h eb e s t f e r m e n t a t i o np a r a m e t e rc o m b i n a t i o n sw e r et h em i x t u r eo fa s p e r g i l l u sn i g e r 3 3 5 0a n d a s p e r g i l l u so r y z a e a 一9 0 0 5 ，n a t u r a lp h ，t h ec o n t e n to fs o y b e a nm e a lw a s91 ， i n o c u l a t i o na m o u n tl0 ，t h er a t i oo fi n o c u l a t i o nw a s2 ：l ，t h ef e r m e n t a t i o n t e m p e r a t u r ew a sa t3 0 ，t h ef e r m e n t a t i o nt i m ew a sa tl3 2 h u n d e rt h i sc o n d i t i o n t h e r a t t oo ff u n c t i o n a ls o y b e a n p e p t i d ew a s7 0 a n do l i g o p e p t i d ec o n v e r s i o nr a t ew a s4 9 k e yw o r d s ：s o y b e a nm e a l ；s o y b e a np e p t i d e ；m o l e c u l a rw e i g h td i s t r i b u t i o n ；d e g r e eo f h y d r o l y s i s ；p r o t e a s ee n z y m es y s t e md i s t r i b u t i o n i i h 东轻i ：业学院硕l j 学位论文 第1 章绪论 1 1 引言 大豆肽是水解大豆蛋白后所得到的由3 , - - - 6 个氨基酸组成的低分子量肽混合 物，优质大豆肽的主要溶出峰位置分布在分子量3 0 0 7 0 0d a 范围内。与大豆蛋白 相比，大豆肷的氨基酸组成均衡、全面，更易被人体吸收，有着良好的保健功 效。随着科学技术的发展和人们，l 活水平的h 益提高，大豆肽的营养功能受到了 重视。生物体内源肽常常作为激素发挥主要功能，它们通过与激素受体作用连接， 而后递呈信号，发挥着控制腺体分泌，调节血脂的优良功能，影响着机体的q i 长， 它们也会作用于人体的中楸神经系统，影响人的r 常生活和学习等等。大豆肽仃 着各种各样的功能性质，比如降胆固醇、降血压等等。另外，大豆肽还具有提高 记忆力、增强免疫力等独特的，l 理活性功能。大豆肽在原大豆蛋白序列中并不具 有活性，但在体外f 叮以通过水解将这些肽释放出来，加以浓集之后可作为治疗药剂、 功能性食品添加剂或饲料添加剂来应用【1 1 。大豆肽由于具有良好的稳定性和溶解性， 可用于同常生活中的大多数普通食品中；另外，由于其具有各种各样的生理活性 功能，还可用于功能性保健食品和运动员专用食品等其他多类特殊食品中【2 】。冈此， 大豆肽是一种十分有前途的功能性食品原料。它以其独特的，七理活性功能和优良 的特性，越来越多地被人们认识和应用，在食品、医药等很多领域具有广泛的用途 和广阔的应片3 日订景 3 】。 1 2 大豆肽的分离纯化方法 随着大豆肽的戍用范h 爿变得越来越广，人们开始把目光聚焦在大豆肽后期分 离纯化的研究。目前常用的大豆肽分离纯化方法一般有离子交换色谱、凝胶过滤 层析、正交轴逆流色谱法、超滤等几种。 1 2 1 离子交换色谱 离子交换色谱发展最早，它的原理是溶液中的溶质带有不同的电荷及电荷鼍， 可以在移动相和固定相之问发生i 叮逆交换作用，这样就可以改变溶质的移动速度， 从而达到分离纯化的目的1 。实验中常用的离子交换剂包括离子交换交联葡聚糖 等等。目前，离子交换层析已经成为实验室中分离纯化蛋白质等物质最常川的方 法。据统计显示，在蛋白质、多肽的分离纯化方案中，使用离子交换色谱的所占比 例高达7 9 。 s p s e p h a d e xc 2 5 用于分离低分子量的核酸、蛋白质、多肽等等，或者是分离 分子量极大的物质。钟芳等【1 3 】选用s p s e p h a d e xc 2 5 分离和纯化了对乙醇浓度为 第1 章绪论 7 6 时从大孔吸附树脂洗脱f 来的低聚肽，效果很好。 1 2 2 凝胶过滤法 凝胶过滤层析法就足利用带有孔径的多孔凝胶，作用于混合物中的各组分后， 根据各组分的分了量大小不i r d ，以此来进行分离的一种层析技术。当混合液各组 分通过凝胶颗粒的网孔缝隙时，溶液中儿是大小比例4 l d , 的溶质分子，都能进入 到凝胶颗粒内部，但足比网孔大的溶质分子不能自由地进入。因此，在上秆洗脱 的过程中，分了量较人的物质要先于分子量较小的物质向下移行，这样就能达到 分离各组分的目的。邹存媛等【1 4 】采用s e p h a d e xg 1 5 分离分子黾大小在1 2 0 0 d a 以 下的大豆肽，分离出的人哆肽f j 丁以采用高效液相色谱法进一步分离纯化，可以得 到更高纯度的人哆肽产：品，效果良好。 1 2 3 正交轴逆流色谱法 i f 交轴逆流色谱足指不需要固态载体作支撑的分配溶液层析法。它具有很多 优点，比如再回收率高、对样品无污染吸附等等。由i t o 1 5 l 发明豹适用于分离纯化 极性物质和乍物活件功能物质的萨交轴逆流色谱法，目前得到了广泛地推广及应 用。逆流色谱法作为一种新型方法，既能应用于生物、医药领域，义能适用于化 学化工等领域。 魏芸等【j 报道了采用二氟乙酸：正丁醇：水( 1 ：1 2 0 ：1 6 0 ，v v ) 的比例作 为溶剂系统，利用5 5 0 0 r m i n 的高速离心机转速，分离纯化大豆肽。这项研究为分 离纯化纯天然多肤提供了新的思路和方法，研究意义重大。 1 2 4 高效液相色谱法 目前，分离、分析和制备大豆肽等生物样品等领域的研究已经越水越多地应 用到高效液相色谱i j a ( h p l c ) ，尤其是反相高效液相色谱分离法更是许多实验室所 采用的主要分离纯化方法。 卢鹤等1 1 7 】采用反桐高效液相色谱法，建立了大豆肽的p r h p l c 的分析纯化方 法。流动相从水：t f a = 1 0 0 ：0 1 到乙腈：t f a = 1 0 0 ：o 1 ，梯度方式为凸形梯度，时 间：8 0 m i n ；进样帚为：5 u l ；检测波长为：2 2 0 r i m ：流速：l m l m i n 。与其它实验方案 相比，该方法具有渚如分辩率高，操作简便等优点，这为f 少i i - 使用液相色谱质 谱联抖j 测序的研究奠定了基础。 1 2 5 超滤 超滤法近似于机械筛分作用，利用膜两侧的能最差使得各组分改变迁移速率 而得以分离。陈山等1 1 8 】采用超滤法处理低聚肽发酵产物的实验证明，在不添加任 何化学试剂的条件下，采用超滤处理叮以直接从发酵物中提纯出低聚肽纯化产品。 超滤法不仅町以用f 低聚肽的分离提纯，同时还可用于检测发酵物中各组分的相 2 山东轻t 业学院硕i j 学化论文 对分子量的分布情况，这为评价鉴定大豆蛋白质的水解效果提供了一种简单的方 法。 1 3 大豆肽分子量分布的测定方法 蛋白质的主要特征参数之一就是分子最的分布情况，大豆肽分子量分布情况 的测定方法有很多种，比如凝胶过滤层析法以及聚丙烯酰胺凝胶电泳等等。现阶 段，在实验室中分离大分子物质应用最多的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，而分离相对 分子量小的物质常用的足凝胶过滤层析法。近年来质谱技术领域成绩斐然，电喷 雾离子化技术同益成熟，使得质谱不仅可以测定小分子物质的分子量，而且也可以 测定生物大分子物质的分了量，灵敏度、准确度为各种方法之首。 1 3 1t r i c i n e p a g e 电泳法 p a g e 是分离蛋白质及低聚肽物质最常用的方法。常规的而s g l y c i n e s d s p a g e 是分离相对分子量大小在1 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 d a 的大分子肽类。 s c h a g g e r 等【l9 】最早对卜述方法作了改进，使其更适_ f 低聚肽的分离纯化。他 在常规胶的基础上又增加了灌注分离凝胶，使得电流降低，电泳时间变长。凝胶 的交联度为1 9 5 、浓度为7 0 时的分离纯化效果最佳，基本能分离分子量大小 在40 0 0 1 00 0 0 d a 范围内的蛋白。王旭等【2 0 】也证实使用t r i c i n e 电泳系统对二于= 分 离及纯化分子量大小在l0 0 0 - - 2 10 0 0 d a 范围内的大豆肽具有良好的分辨率。 b a u m a n n 等1 2 2 j 采用微制备凝胶电泳，成功地分离纯化了3 种难溶的小分子淀 粉样肽。这种将连续洗提微制备凝胶电泳装置与 i r i s t r i c i n e s d s p a g e 相结合的 方法，还能将分子量分别为43 2 9 d a 和32 8 9 d a 的小肽清楚地分离丌。 s a r f o 等【2 3 j 发展了一种经济、灵敏且重复性好的小分子肽分离方法。此法使用 比上述几种t r i c i n e s d s p a g e 便宜得多的传统g l y c i n e s d s p a g e 系统。与常规 p a g e 比较，凝胶系统中s d s ( o 1 ) 浓度更低。他们还用g l y c i n e s d s p a g e 和醋 酸尿素两种凝胶分别分离1 0 种小肽并进行比较，发现后者仅适用于低p h 值下 碱性肽类的分离，前者则能快速分离具有不同等电点、分子大小和疏水性的分子 量l0 0 0 - 30 0 0 d a 小分子肽。 1 3 2 高效液相色谱法 高效液相色谱法( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y ，h p l c ) 是一种现 代液相色谱法，其基本方法是用高胍输液泵将流动相泵入到装有填充剂的色谱柱， 注入的供试品被流动相带入柱内进行分离后，各成分先后进入检测器，用汜录仪 或数据处理装置记录色谱图并进行数据处理，得到测定结果。其测定分子量的计 算方法为：将实验中所得的分子量对数值和保留体积线性凹归，得到一个同归方 程。将待测蛋白样品的保留体积代入得到的方程中，从而得出分子量大小。利用此 第1 章绪论 法不仅实验所需时间短，效率高，而且还可以用来制备低聚肽等活性物质，现已 经成为人们研究的热点。 1 3 3 质谱法 质谱法足精确测定物质分子餐的一种方法。质谱测定的分子疑给出的是分子 质量m 对电荷数z 之比，即质荷比( m z ) 过去的质谱难于测定高分子的分子鞋。 但近2 0 余年幽于我困离子化技术的发展，使得质谱可用于测定分子量高达百万的 高分子化合物。这些新的离子化技术包括场解吸技术，快离子或原子轰击技术， 基质辅助激光解吸技术和电喷雾离子化技术。由激光解吸电离技术和离子化飞行 时问质谱相结合而构成的仪器称为“基质辅助激光解吸一离予化飞行时间质谱” ( m a l d i t o fm s 激光质谱) ，可测量分子量分布比较窄的高分子的重均分子量。 出电喷雾电离技术和离子阱质谱相结合而构成的仪器称为“电喷雾离子阱质谱” ( e s i i t m s 电喷雾质谱) ，可测量高分子的重均分子量。 1 4 本课题的立题依据及研究内容 近年来，人们对大谨肽的研究越来越深入，但是有关水解度、蛋白酶酶系分布 与大豆肽分子量分钮情况相关性韵研究较少。本课题的主要目的是通过微生物阔 态发酵法产酶水解豆粕中的大豆蛋n 质，以获得具有生理活性的大豆肽。通过测 定大豆肽的分子鼍分布情况并进行定量分析，得到水解度、蛋l 上i 酶酶系分布与分 子量分布情况的相关系数，以此优化固念发酵工艺，对大豆肽的后期研究具有极 其重要的意义。 本课题通过测定人哆肽的分子鼍分布情况并进行定鼍分析，考察水解度 ( d h ) 、蛋白酶酶系的分布与分子量分布的相关性，从而进一步优化发酵j 1 二艺， 为大豆肽的研究与丌发提供一定的理论依据。主要研究内容分为以下几部分： ( 1 ) 大豆肽分子量分和情况的测定。 ( 2 ) 水解度与大豆肽分子量分布相关性的确定。 ( 3 ) 蛋白酶酶系分印与大豆肽分子量分布相关性的确定。 ( 4 ) 根据测定的人豆肽分子量分布情况，优化固态发酵条件。 4 膏 山东轻_ ：业学院硕i ：学位论文 第2 章大豆肽分子量分布的测定 2 1 引言 本课题研究的大豆肽是指大豆蛋白经过水解、分离、精制等过程得到的，通 常由3 - 6 个氨基酸构成、相对分了质鼍主要分和在3 0 0 - - 7 0 0 d a 范围内的低肽混合 物，又称低聚肽。这一类型的大豆肽氨基酸组成均衡、全面，更易被人体吸收， 有着良好的保健功效。因此，研究人豆肽的分子量分确j 情况有着重要的意义。 大豆肽的分子量分布范围可以采用电泳法、凝胶过滤层析法等方法测定。电 泳法一般足测定分子量较大的物质，本实验选用的是凝胶过滤层析法。凝胶过滤 层析法又称分子筛过滤层析、排阻层析，是利用凝胶把不同大小分子最的物质分 离丌的一种方法。凝胶过滤层析法最突出的优点就是过滤层析所选用的凝胶属于 惰性载体，不带任何电荷，吸附力弱，除此之外，它还具有操作简啦方便、设备 简单、分离不影响分子生物学活性等优点，因而用途广泛。实验中，根据要求的 不同可选j j 不同型号的凝胶，常见的有筒聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝 胶三种。利 l j 凝胶过滤层析法测定待测物的分子量分斫n 占况时，需要选取相对分 子质量不同的两个标准物，测定他们的洗脱体积，用待测物质的洗脱体积与之相 比较，便可确定出待测物质的分子量分布情况。 本章拟利用葡聚糖凝胶( s e p h a d e xg 一1 5 ) 过滤层析法测定大豆肽的分子量分布 情况，为人豆肽的后期研究提供一定的理论基础。 2 2 实验材料与方法 2 2 1 原料 豆粕，【i j 东万得福集团生产； 麦麸，市场购买； 黑曲霉a s 3 3 5 0 ，购自山东大学微生物实验室； 米曲霉a 9 0 0 5 ，本实验室提供。 2 2 2 试剂及其配制 ( 1 ) 葡聚糖凝胶s e p h a d e xg - 1 5 ，s i g m a 公司出品； ( 2 ) 蓝色葡聚糖2 0 0 0 ，上海博奥生物技术有限公司出品； ( 3 ) 维生素b 1 2 ( v b l 2 ，m w13 5 5 3 7 d a ) ，分析纯，s i g m a 公司出品； ( 4 ) l 一色氨酸( m w 2 0 9d a ) ，分析纯，s i g m a 公司出品。 ( 5 ) 色氨酸( l t r y ) 溶液：精确称取2 m g 分析层次的色氨酸溶于小烧杯中， 而后定容至1 0m l 。 ( 6 ) v a l 2 溶液：精确称取2 m g 分析层次的v b 1 2 溶于小烧杯中，定容至1 0m l 。 5 第2 章人豆肽分了最分布的测定 ( 7 ) p h 7 2 磷酸磷酸盐缓冲溶液： 0 2 m o l l 磷酸二氢钠溶液( a 液) ：称取3 1 2 9 磷酸二氢钠( n a i l 2 p 0 4 1 2 h 2 0 ) ， 用水溶解并稀释至1 0 0 0 m l ：0 2 m o l l 磷酸氢二钠溶液( b 液) ：称取7 1 6 9 磷酸 氢二二钠( n a 2 h p 0 4 - 1 2 h 2 0 ) ，用水溶解并稀释至1 0 0 0 m l 。 p h 7 2 磷酸缓冲溶液