（应用化学专业论文）功能单体9乙烯基腺嘌呤的合成及其在分子印迹中的应用.pdf

山东农业大学硕士学位论文 中文摘要 m i t 发展至今已有3 0 多年的历史，它是一种制备对模板分子( 又称 为印迹分子) 具有特异识别m i p s 的技术。在t m 存在下通过功能单体和 交联剂在引发剂的作用下发生自由基聚合制得m i p s 母体。当除掉m i p s 母体内的1 m 后就留有与1 m 在功能基位置、孔穴大小及形状均互补的三 维孔穴，即特异识别位点。利用m p s 内所形成孔穴对模板分子的“识别效 应”来实现对t m 的选择性识别。与抗体和酶等天然的生物识别系统相比， m 口s 具有预定的识别性和强的实用性特点因此，m i p s 已经广泛应用于 高效液相色谱分离、固相萃取、生物传感器、药物传输系统和仿生膜等领 域。 虽然m r r 近年来发展很快，但是还具有很多的局限性目前功能单体 和交联剂的种类选择范围还比较窄，尤其是功能单体的种类太少以至不能 满足某些t m 的需求。新型功能单体和交联剂的合成和使用有待于进一步 研究开发，以提高m i p s 的识别能力、增加结合量和使结合位点更均匀； 天然的识别系统大都在水溶液中进行，而现阶段制备的大多数m i p s 却只 能用于有机溶剂，怎样在极性溶剂或水中较好地制备和应用m i p s 还是一 个急待解决的问题；目前可被印迹的化合物大部分是小分子化合物，而酶、 蛋白质和d n a r n a 等生物大分子化合物的印迹仍然很少 基于此，本文做了如下研究内容： ( 1 )合成了新功能单体9 - v a ，通过熔点测定、元素分析、f t - i r 和1 h n m r 等分析方法确定了其分子结构； ( 2 )利用分光光度法研究了弱极性溶剂乙腈中功能单体9 - v a 和植物 激素i a a 的结合机理。基于此，用i a a 作为模板分子，制备了以9 - v a 为 功能单体的m i m 。用扫描电镜观测了所制得m i m 和n m i m 的表面形态： 通过单分子渗透实验和多分子竞争扩散实验检验了m i m 对i a a 、i b a 和 k t 的选择渗透性。测试结果表明：以9 - v a 为功能单体制备的分子印迹聚 合物膜对模板分子i a a 的渗透选择性要比对i b a 或k t 的高。与以m a a 功能单体9 - 乙烯基腺嘌呤的合成及其在分子印迹中的应用 为功能单体制各的对照m i m 相比，以9 - v a 为单体制备的m i m 对i a a 所 具有的选择渗透性也比较高 ( 3 )使用光度分析法探讨了功能单体9 - v a 和模板分子t 在甲醇中的 结合作用。在此基础上，以d e g d m a 为交联剂，纤维素膜为支撑体。制 备了m i m 。通过扫描电镜观察并比较了m t m 、n m i m 和纤维素载体膜表 面形态的差异，以t 、u 、c 、g 和a 为底物，评价了m i m 的渗透选择性。 结果表明m i m 对模板分子t 及结构最佳类似物u 呈现高的选择性与用 e g d m a 为交联剂制备的对照分子印迹膜比较。也呈现较高的扩散速率和 选择性。 关键词：模板分子：分子印迹膜；传输选择性；9 一乙烯基腺嘌呤；3 一吲 哚乙酸；胸腺嘧啶 山东农业大学硕士学位论文 a b s t r a c t m o l e c u l a r l yi m p r i n t i n gt e c h n o l o g y ( m mi sam e t h o dt h a tc a np r e p a r e m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r s ( m i p s ) w i t l ls p e c i f i cr e c o g n i t i o nf o rt e m p l a t e m o l e c u l ef n d i nt h ep r e s e n c eo f1 m ，t h ep o l y m c d cr e a c t i o no c c u r sb yt h e c o p o l y m e r i z a t i o no fr m c t i o n a lm o n o m e r sa n dac r o s s 一恤l k e rw i t ha ni n i t i a t o r , w h i l et h er e r n o v a lo ft mi nt h ep o l y m e rm a u l , t h r e e - d i m e n s i o nc a v i t i e s c o r r e s p o n d i n gt ot mi ns i z e ，s h a p ea n df u n c t i o n a lg r o u pa r el e f t u s i n gt h e r e c o g n i t i o ne f f e c t so fm i p sc a ns e l e c t i v e l yr e c o g n i s et m i nc o m p a r i s o nw i t h a n t i b o d ya n db z y m ei nn a t u r a lb i o - r e c o g n l t i o ns y s t e m , m i p $ h a v et h e p e c u l i a r i t i e so fp r e d e t e r m i n a t er e c o g n i t i o na n ds t r o n gp r a c t i c a b i l i t y h e r e b y , m i p sh a v eb e e na p p l i e dt o m a n yf i e l d s ，s u c h a sh p l c ，s p e ，d d sa n d b i o - m i m e t i cm e m b r a n e a l t h o u g hm 1 th a st h ef a s td e v e l o p m e n ti nr e c e n ty e a r s ，t h e r ea r cm a n y l i m i t a t i o n s a tp r e s e n t , t h es e l e c t i v e r a n g e o ff u n c t i o n a lm o n o m 豇sa n d c r o s s l i n k e r si sb c t t e rn a r r o w ni san e c e s s a r yt o s y n t h e s i z eo ru s en o v e l f u n c t i o n a lm o n o m e r sa n dc r o s s - l i n k e r sf o ri m p r o v i n gt h er e c o g n i t i o na b i l i t yo f m i p s 田碹r e c o g n i t i o no nm o s tn a t u r a ls y s t e m si so n g o i n gi nw a t e r , b u tn o w m o s to fm i p sa 托o n l yp o l y m c r i z e da n da p p l i e di no r g a n i cs o l v e n t ri sa t h o r o u g l d yu n s o l v e dp r o b l e mt h a th o wt op r e p a r ea n da p p l ym i p si np o l a r s o l v e n to rw a t e r n o wm o s ti m p r i n t e dc o m p o u n d sa r cs m a l lm o l e c u l a rw e i g h t c o m p o u n d s ，w h e r e a sf e wo fb i o l o g i c a l m a c r o m o l e c u l e ss u c ha se n z y m e ， p r o t e i na n dd n a r n aa r es t i l li m p r i n t e ds t i l lf e w b e c a u s eo ft h ea h o v e - m e n t i o n e dc a u $ 髓，t h ef o l l o w i n gs t u d i e sa r ed o n ei n t h i sp a p e r ( 1 ) an o v e lf u n c t i o n a lm o n o m e r9 - v i n y l a d e n i n e ( 9 v a ) w a ss y n t h e s i z e d , i t s m o l e c u l a rs t r u c t u r ew a sc o n f i r m e db ym e l t i n gp o i n tm e a s u r e m e n t , e l e m e n t a l a n a l y s i s ，f t - i ra n d1 hn m rs p e c t r o s c o p y ； ( 2 ) mb i n d i n gm e c h a n i s mb e t w e e nt h i sf u n c t i o n a lm o n o m e r9 - v aa n dt h e n i 功能单体9 - 乙烯基腺嘌呤的合成及其在分子印迹中的应用 p l a n t h o r m o n ei a ai n a c e t o n i t r i l ew a ss t u d i e d w i t h u v - “s i b l e s p e c t r o p h o t o m e t e r i cm e t h o d b a s e do nt h i ss t u d y , u s i n gi a aa st m ，as p e c i f i c 9 - v a - b a s e dm i mw a sp r e p a r e do nc e l l u l o s ea c , e t a t es u p p o r t t h e n , m e r e s u l t a n tp o l y m e r i cm e m b r a n em o r p h o l o g i e sw e r ev i s u a l i z e dw i t hs e 乜a n d t h em e m b r a n ep e r m s e l e c t i v i t yf o rl 蛆i b aa n dk tw a st e s t e dw i t hs e p a r a t e e x p e r i m e n t sa n dc o m p e t i t i v ed i f f u s i o ne x p e r i m e n t s t h e s er e s u l t ss h o w e dt h a t t h em i mp r e p a r e dw i t h9 - v aa saf u n c t i o n a lm o n o m e re x h i b i t e dh i g h e r t r a n s p o r ts e l e c t i v i t yf o rt h et e m p l a t em o l e c u l ei 从t h a ni b ao rk t t h e m e m b r a n ep r e p a r e dw i t h 乒绢a l s ot o o ko nh i g hp e r m s e l e c t i v i t yf o ri a ai n c o m p a r i s o n w i t ht h ei m p r i n t e dm e m b r a n em a d ew i l hm a a ； ( 3 ) t h eb i n d i n gm e c h a n i s mb c t w e e l l9 - v aa n dp y r i m i d i n eb a s eti nm e t h a n o l w a ss t u d i e d 、 ，i t hs p e c t r o p h o t o m c t r i cm e t h o d u s i n gta st i m 9 - v aa san o v e l f i m c t i o n a lm o n o m e ra n dd e g d i aa san e wc r o s s - l i n k e r , as p e c i f i cd i e t h y l e n e # y c o ld i m e t h a c r y l a t e - b a s e dm i m w a s p r e p a r e do v e rc e l l u l o s ea c e t a t es u p p o r t t h e n , t h er e s u l t a n f l yp o l y m e r i cm c r f l b r a n em o r p h o l o g i e sw e r ev i s u a l i z e dw i t h s e ma n di t sp e r m s e l e c t i v i t yw a se x a m i n e d 。u s i n glu ，c ，aa n dga s s u b s t r a t e s t h e s er e s u l t ss h o w e dt h a tt h em i mp m p 盯e dw i t hd e g d m a e x h i b i t e dh i g h e rt r a n s p o r tc a p a c i t yf o rt h et mt h y m i n ea n di t so p t i m a la n a l o g ut h a no t h e rn u c l e i ca c i db a s e s t h em e m b r a n ea l s ot o o ko nh i g h e r p e r m s e l e c t i v i t yt h a n t h e i l l 巾r i n l e dm e m b r a n em 如w i t he g d m aa s a c r o s s l i n k e r w h e nam i x t u r es o l u t i o ni n c h l d i n gf i v en u c l e i ca c i db a s e st ，u c ， 九gp a s s e dt h r o u g ht h ed e g d m a - b a s e dt h y m i n e i m p r i n t e dp o l y m e r i c m e m b r a n e , t h er e c o g n i t i o no ft h ei m p r i n t e dm e m b r a n ef o rt h et e m p l a t e m o l e c u l eta n di t so p t i m a la n a l o guw a sd e m o n s t r a t e d k e yw o r d s ：t e m p l a t em o l e c u l e ；m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dm e m b r a n e ；t r a n s p o r t s e l e c t i v i t y ；9 - v i n y l a d e n i n e ；1 h - i n d o l e - 3 - a c e t i ca c i d ；t h y m i n e i v 符号说明 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科 学研究所取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和 做出重要贡献的个人或集体，均在文中明确说明。本声明的 法律责任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的 规定，同意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论 文纸质本和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东 农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据 库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文 和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：煞益宝 导师签名：虱主， 日期：叮，6 。如 山东农业大学硕士学位论文 第1 章分子印迹技术研究进展 1 1 引言 分子印迹技术( m o l e c u l a ri m p 血血坞t e c h n o l o g y , m i t ) 是指在立体结 构和结合位点上制备对模板分子( t e m p l a t em o l e c u l e , t m ) ( 又称为印迹分 子) 有选择性高分子聚合物的技术，这种聚合物被称为分子印迹聚合物 ( m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r s ，m i p s ) m i p $ 内有许多由模板分子形成 的具有固定形状和大小的孔穴，孔穴内通常带有确定排列的功能基团，它 对模板分子的立体结构具有记忆功能。m i p s 具有三个特性：( i ) 预定性 ( p r e d e t m m i n a f i o n ) ，可使人们根据不同目的制备相应的m t p s ；0 i ) 识别性 ( r e c o g n i t i o n ) ，依据模扳分子定做的m i p $ 具有与t m 的立体结构和官能团相 匹配的孔穴，能选择性识别模板分子；( i i i ) 实用性( p r a c t i c a b i l i t y ) ，主要体现 在它可以与天然的生物分子识别系统如酶与底物、抗原与抗体和受体与激 素等相媲美，具有抗恶劣环境( 酸、碱和熟等) 的能力，表现出高度的稳 定性和较长的使用寿命，且制备过程简单易行。基于此，二十年多来，分 子印迹领域的研究非常活跃，它在高效液相色谱咖g h p c m 锄加l i q u i d c h r o m a t o g r a p h y , m l c ) 、固相萃取( s o l i d - p h a s ee x t r a c t i o n , s p e ) 、膜分离 技术、手性异构体分离等方面获得广泛研究，并且展现了良好的应用前景 ( 孟子晖e ta 1 ，1 9 9 7 ；h a u p ta n dm o a s b a c h , 1 9 9 8 ；周杰a n d 何锡文，1 9 9 8 ) 近年来，国内外对m i p $ 应用已有较多综述( h a u p t a n d m o s b a c h , 1 9 9 8 ；周杰 a n d 何锡文，1 9 9 8 ；何锡文a n d 周杰，2 0 0 0 ；赖家平c ta 1 ，2 0 0 l ；w u l f f , 2 0 0 2 ) 本文从m i t 的回顾入手详细综述rm i p $ 的识别机理、制备技术条 件及应用方面新进展。 1 2 m i l s 的发展历史 早在十九世纪九十年代，菲歇尔, f f i s c h e r , 1 8 9 0 ) 就提出了著名的“锁一 l 功能单体9 乙烯基腺嘌岭的合成及其在分子印迹中的应用 匙”比喻，用来描述酶和底物之间的相互作用，他认为生物大分子酶与较 小的底物分子之间的相互作用就像锁和钥匙的关系，底物好像钥匙一样可 以镶嵌在酶这把锁上如图l 一1 所示：天然存在的生物系统如酶、受体 和抗体中，分子问常以氢键、范德华力和离子间相互作用等多种非共价键 作用形成复合物。相对于较强的共价键而言，单独存在的非共价键是比较 弱的，但多个弱键共同作用形成的复合物却比较稳定。分子间通过非共价 作用的分子识别在生物活性方面发挥着重要作用，这种识别特性源于与底 物相匹配孔穴的存在。 图i 一1 菲歇尔的酶( 镇) 一底物( 匙) 复合结构不意图 f i g u r e1 - 1s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o n o f f i s c h e r s l o c k - a n d - k e y c o n c e p t ma ne n z y m em b 靠略c o m p l e x 二十世纪三十年代b r e i n l 和h a u r o w i t z 研究发现：抗体在遇到其异型 生物质抗原时能产生多交性，后来m u d d 进一步研究提出了一种“当抗原侵 入时生物体会本能地产生抗体”的理论( 赖家平，2 0 0 2 ) 。四十年代p a u l i n g 总 结了前人的研究，把抗体多重作用点的形成归结为抗原的作用使抗体多肽 链的三维结构形状发生变化造成的，抗原作为模板就会“铸造，在抗体的结 合部位，即“模板学说”( p a d i n g ，1 9 4 0 ) 。后继的研究发现“克隆选择”理论 ( b u r n e r , 1 9 5 7 ) 比p a u l i n g 的抗体形成理论更合理。但不管怎样，他们的理 论为现代m i t 奠定了基础，并激发了人们以抗原或待测物为模板合成抗体 山东农业大学硕士学位论文 模拟物的设想有些科学家们从p a u l i n g 理论出发进行了一些尝试，但是 进展不大。 1 9 4 9 年d i c k e y ( d i c h c y , 1 9 4 9 ) 首先实现了染料在硅胶中的印迹并提出 * 分子印迹”这一概念，但很长时间没有引起人们的重视。直到二十世纪七、 八十年代，m r r 才真正有所突破。1 9 7 2 年德国h d n r i c hh e i n e 大学的w u l f f 研究小组( w u l f f a n ds a r h a n , 1 9 7 2 ；w u l f f a ta 1 ，1 9 7 3 ) 首次成功制备出对糖 类、氨基酸衍生物具有较高选择性的共价型m i p s ，实现了有机聚合物的分 子印迹。在以后十多年里主要利用共价作用制备m i p $ ，但是可供选择的试 验材料有限，且结合速度慢，未引起人们的注意，所以进展缓慢。二十世 纪九十年代前后瑞典l u r i d 大学的m o s b a c h 和合作者创立了非共价型m i p s 的制备方法( v l a t a k i se ta 1 ，1 9 9 3 ) ，m i t 的发展速度才有所加快。随着w u l f f , m o s b a c h 等在共价、非共价型m m s 制各上的开拓性工作，m i t 得到了迅速 发展。尤其是1 9 9 3 年m o s b a c h 等( v l a t a l ( i sda 1 ，1 9 9 3 ) 在( n a t u r e ： 上发表有 关可以识别茶碱的m r l p s 报道以来，每年公开发表的论文数几乎直线上升 为了加强交流促进分子印迹技术的快速有效发展，1 9 9 7 年在l u r i d 大学成立 了国际性的分子印迹协会( s o c i e t yo f m o l e c u l a ri m p r i n f i n g , s m i ) 统计表 明：全世界至少有1 0 0 个学术机构和团体从事m i p s 的研究，目前主要从事有 关分子印迹研究工作的国家有德国、瑞典、美国、日本、中国等五十多个 国家和地区国内研究主要是从大连化物所的周良模、孟子晖等( 孟子晖e t a 1 ，1 9 9 7 ；孟子晖c ta 1 ，1 9 9 8 ) 和南开大学的何锡文、周杰等( 周杰a n d 何锡 文，1 9 9 8 ；周杰e ta 1 ，1 9 9 8 ) 开始，近而扩展到北京大学、湖南大学、兰州 化物所等十几个研究单位 1 3 m i p s 的识别机理 分子印迹过程就是制备m i p s 的过程m i p s 的制备一般包括如下三个 步骤：( i ) 通过共价键或，和非共价键使模板分子与功能单体结合产生官能团 和立体结构互补的相互作用，形成复合物；( i i ) 在复合物中加入交联剂和引 发剂，在模板分子功能单体的复合物周围发生聚合反应，产生具有一定 功能单体9 - z , 烯基腺嘌呤的合成及其在分子印迹中的应用 机械性能高交联的高分子聚合物；( i i i ) 采用适当的方法抽提解离出高分子 聚合物中的t m ，以便形成含有识别模板分子的识别位点的m i p s 。m i p s 主要是通过共价键作用或和非共价键作用进行分子识别的 1 3 1 共价键结合作用 圈i - 2 m i p s 的制各路线： f i g u mi - 2s c h m a t i c so f l d l p sp i e p 删i ： ( o 共价作用过程：“k ： ( j i ) 非共价作用过程：h 翻c 在共价型m i p s 的制备过程中，模板分子与功能单体在聚合前已经形 成了以共价键结合的复合物，完成聚合反应后再打开共价键，脱掉模板分 子，得到m i p $ ( 见图l 一2 ( i ) ) i v i p $ 中识别位点的形状和功能基的精确 排列与模板分子是互补的，这是高亲和性和高选择性的基础。共价键作用 的优点：在m i p s 能获得在空间精确固定排列的结合基团；若能以较高百 分比除去m i p s 中的t m 则可以得到一类很好的功能材料。迄今为止，在 m p s 形成过程中人们使用的共价键包括硼酸酯、希夫碱、缩醛酮、酯等 4 山东农业大学硕士学位论文 化学键。其中硼酸酯键的代表性最强，能生成相当稳定的三角形硼酸酯， 在碱性水溶液中或有氮原子( n h 3 、哌啶) 存在的介质中转化成四角形的 硼酸酯，这种四角形的硼酸酯与二醇能极快地达到平衡，其达到平衡的速 度与非共价键作用相当( w u l f f e ta 1 。1 9 8 4 ) 。m i p s 中的孔穴中含有两个硼酸 基团时用于拆分糖类化合物外消旋体呈现出很高的选择性( w u l f fa n d s c h a u h o f f , 1 9 9 1 ) 。但是并非结合位点越多，选择性越好。研究结果表明， 3 个硼酸基团( w u l f f e ta 1 ，1 9 8 0 ) ，3 种不同的共价键结合作用( a n d e r s s o ne t a 1 ，1 9 9 0 ) 均能导致较低的分离能力，因为这类m i p s 的结合位点与t m 之 间的结合速度很慢和含有多个柔性硼酸基的 v i p s 的选择性差。因希夫碱 的共价键作用对平衡有利，所以希夫碱适于模板分子和后来的m i p s 结合， 但是对要求快速的色谱分析而言，平衡速度太慢，用适当的分子内邻近基 团活化可明显增加平衡速度( w u l f fa n dv i e t m e r e r , 1 9 8 9 ) 。s h e a 等( s h e aa n d s a s a l d ，1 9 8 9 ) 利用缩酮引入结合基团，羰基基团之间不同距离的二酮用可 聚合的l ，3 - 二醇处理后，再除去模板分子得到的m t i p s 用二酮重新处理时 对模板分子具有很高的选择性因为酯和酰胺的离解程度差，m p s 中的 模板分子在聚合后不能被完全除去，所以不适用于制备m p s 一般来说， 共价键作用较强，在模板分子识别过程中结合和解离速度慢，难以达到热 力学平衡，不适于快速识别模板分子，而且识别能力与生物识别相差太远， 制备条件苛刻且价格昂贵，所以近年来这种制备方法发展缓慢。 1 3 2 非共价键结合作用 在制备非共价型m i p $ 的过程中，模板分子与功能单体首先在适宜的 溶剂中通过一种或几种非共价键作用预组装成具有多点相互作用和确定 关系的主客体复合物，再加入交联剂和引发剂，聚合后这种相互作用被固 定下来，然后使用淋洗等方法除去模板分子，可以得到i v r l i p s ( 见图1 - - 2 ( i i ) ) 因为通过较弱的非共价键相互作用，在温和的条件下就可以除去模 板分子，底物的结合和解离平衡也可以较快达到，聚合后多余的功能单体、 模板分子和交联剂绝大部分可被除去，m i p $ 对模板分子就会具有较高的 5 功能单体9 - 乙烯基麒嘌呤的合成及其在分子印迹中的应用 结合选择性但这种印迹过程模板分子与功能单体的化学计量数比不怎么 明确，并且难以准确确定常见的非共价键作用有；氢键、静电引力、金 属螫合和疏水作用等。自从瑞典的m o s b a c h 等学者发展了非共价型m i p s 后( v l a t a k i se ta 1 ，1 9 9 3 ) ，大大扩展了m i p s 的应用领域。经过优化选择认为 模板分子与功能单体的摩尔比至少为l ：4 时，所制m i p s 能达到与共价键 作用制得m i p s 的同样性能( y u m a z e ta 1 ，1 9 9 9 ) 使用最多的非共价键作用 是氢键，如果在模板分子的结合和后续分离过程中只有单一氢键作用时， 其识别效果不佳，但是在印迹过程中协同氢键或氢键和其他的非共价键共 同作用时，就会具有很好的识别性能( a n d e r s s o na n dm o s b a c h , 1 9 9 0 ) 。 s e l l e r g r e n ( s e l l e r g r e na n dk 。1 9 9 3 ) 研究了静电作用对选择性的影响，当只有 一种静电作用时，制得的m i p s 选择性较低，而将静电作用与共价作用结 合，其选择性比单个共价作用的选择性好得多。f u j i i 等( f u j i ie ta 1 ，1 9 8 5 ) 首次用金属配基作用制得金属配位m i p $ ，对外消旋体也有很好的拆分效 果。k e m p e 等( k e m p ea n dm o s b a c h , 1 9 9 4 b ) 在用非共价或非离子作用制各的 m i p s 研究手性分离时，考察了水对分子识别的影响，并研究了氢键和疏 水性在手性分离中所起的作用d a u w e 等( d a n w ea n ds e l l e r g r e m , 1 9 9 6 ) 研 究三嗪类农药的l v i i p s 时，发现在含水较少的流动相中，m i p $ 的选择性随 模板分子碱性的增加而增加，与模板分子的疏水性无关；但在含水较多的 流动相中，其选择性同模板分子的疏水性有关总之通过非共价键作用 所制备的m i p s 具有较高选择性和分离能力因为这种方式简单易行，易 于除去模板分子，其分子识别过程类似于天然的分子识别系统，得到人们 的极大关注，近年来发展较快。 1 3 二3 共价键和非共价键共同作用 这种分子印迹方法是将共价印迹和非共价识别相结合，即在聚合时功 能单体和t m 间的相互作用力是共价键，这样就可以获得在空间精确固定 排列的结合基团。而在识别模板分子时。依靠的是非共价作用，功能单体 和模板分子的结合与离解速度较快，易于达到热力学平衡，操作简单，适 6 山东农业大学硕士学位论文 于快速识别，并且识别作用机理和生物识别比较接近从而使m i p s 既有共 价m i p s 的亲和专一性强，又有非共价m i p s 操作条件温和等的优点 ( w h i t c o m b ee ta 1 ，1 9 9 5 ) 1 4 m i p s 的制备 1 4 1 反应条件的选择 在m p s 的制备过程中，模板分子、功能单体、交联剂和溶剂( 致孔 剂) 的用量等聚合条件对制得高识别性能m i p $ 产生重要影响。因此在制 各m i p $ 必须选择适量的反应试剂和适宜的反应条件。 1 4 1 1 模板分子的选择 m i p 8 的形成过程中经过两个相反的步骤，要求模板分子既能参加聚 合反应又能被提取出来，作为模板分子都含有形成弱相互作用力或可逆共 价键的基团，能满足要求的化合物主要有碳水化合物( 包括甘露糖、半乳 糖、果糖) 、有机胺类、羧酸类、二醛、甾醇类、氨基酸及其衍生物、核 酸及其衍生物、嘌呤、嘧啶等生物碱、维生素、酶、抗原、神经递质如乙 酰胆碱、医药及其中的手性物质、农药( 杀虫剂、杀菌剂、除草剂和植物 激素) 、蛋白质乃至金属离子等但是更大的单元如细胞、金属晶体作模 板分子的制各仍有很大的困难通常分子中含有强极性基团的化合物和 或能与功能单体形成氢键的化合物作为模板分子时能制备出高选择性能 的m i p $ 模板分子的选择是提取能否成功的决定性因素，尤其是在微量 待测物的分析中更是如此，在m m s 制备时绝大部分的模板分子被提取出 去，但是仍有微量的模板分子残存于m i p 8 中，在以后的分析使用中有可 能缓缓释放出来干扰定量分析的准确性 7 功能单体9 - 7 烯基腺嘿岭的合成及其在分子印迹中的应用 1 4 1 工功能单体的选择 功能单体的选择主要由模板分子决定，首先功能单体必须能与模板分 子相互作用，且在反应中能与交联剂聚合处于合适位置使模板分子恰好镶 嵌其中并获得预期的取向和定位。共价型m i p s 具有苛刻的合成和断裂条件 等缺点，所以功能单体的选择范围比较窄。常用的功能单体为4 一乙烯苯 硼酸、4 一乙烯苯甲醛、4 一乙烯苯胺、4 一乙烯苯酚和二醇以及硼酸酯的 硅烷混合物等( f i s c h e r , 1 8 9 0 ；s t e i n k e 髓a 1 ，1 9 9 5 ) ，其中硼酸和邻二醇基团形 成的酯键可逆性好，易于形成和断裂，在糖类衍生物异构体分析中占有重 要地位( w u l f f a n ds c h a u h o f f , 1 9 9 1 ) ；非共价型m i p s 的优点突出，新功能单 体的合成和使用不断有报道( t a n a b ee ta 1 ，1 9 9 5 ；v i d y a s a n k a rs ，1 9 9 7 ；h a r t a n ds h e a , 2 0 0 1 ；b a t r aa n ds h e a , 2 0 0 3 ；a n d e r s o ne ta 1 ，2 0 0 5 ；n i s h i n oe ta t ， 2 0 0 6 ) ，可以实用的单体较多( 何锡文a n d 周杰，2 0 0 0 ) 其中甲基丙烯酸 ( m e t h y l a c r y l i ca c i d , m a a ) 是常用功能单体，利用氢键或离子化作用制得 的m i p s 具有较高选择性和结合能力。m a a 作为氢键的供体和受体，常用 于非极性或极性较低的有机溶剂中的聚合。用2 - ( - 氟甲基) - 丙烯酸作单体 时，因三氟甲基有强烈的吸电子效应，酸性较强，更适于印迹碱性化合物 而乙烯基吡啶功能单体则适于印迹酸性化合物。在m i p $ 的制备中，为模板 分子选择出最适宜的功能单体对制得m i p $ 的识别能力有很大影响，但传统 筛选方法即繁琐又不能保证选出最佳的功能单体，有必要创建功能单体数 据库，用计算机筛选方法考察多种功能单体与模板分子之间的所有可能的 相互作用从而快速选择出合适的功能单体( s u b r a h m a n y a m 前a t 。2 0 0 1 ； c h i a n e l l aa n dp i l e t s k y , 2 0 0 2 ；李萍e t a t 。2 0 0 3 ；p i l e t s k ac ta 1 ，2 0 0 4 ；孙宝维 e ta t 2 0 0 4 ) 1 4 1 3 交联剂的选择 交联剂的作用是使模板分子和功能单体形成高度交联、刚性的m i p $ ， “固化”功能单体的功能基团在模板分子周围的特定位置或在提取印迹分子 后形成与印迹分子在形状和功能基团完全吻合的孔穴。为了有效印迹，交 山东农业大学硕士学位论文 联剂的反应活性应当与功能单体的相近( 否则功能单体或交联剂本身的聚 合就会占据主要地位，而二者之间的共聚就退居次席) m p s 要求很高的 交联度( 7 0 9 0 ) ，因此交联剂的种类受到限制，交联剂的溶解性也减少 了交联剂的选择范围。最初人们用二乙烯基苯( d i v i n y l b e n z e n e ) 为交联剂， 后来发现使用丙烯酸类交联剂制备出的s i p s 识别性更高。乙二醇二甲基丙 烯酸酯( e t h y l e n eg l y c o lm e t h a c r y l a t e , e g d m a ) 和二乙烯基苯是分子印迹 中常用的交联剂，最近含有三或四个乙烯基基团的交联剂也被使用。 e g d m a 、三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯( 蛐y d r o x 删y lp r o p a n e t r i m e t h a c r y l a t e ，t r i m ) 和季戊四醇三丙烯酸酯( p e n t a e r y t h r i t o lt r i a c r y l a t e , p e 吼) 均可在有机溶剂和亲水溶剂中使用，而典型的水溶性交联剂是n ， n 亚甲基二丙烯酰胺( n n m e t h y l e n e b i s a c r y l a m i d e ) 。文献( 何锡文a n d 周 杰，2 0 0 0 ) 总结了m r r 中经常使用的交联剂。 1 4 1 4 反应试剂用量的选择 在s i p s 的制备中，模板分子、功能单体j 交联剂和引发剂的相对比例 在很大程度上影响着m m s 的识别性能。 模板分子与功能单体的比例对分子印迹过程中识别孔穴的产生具有 很大影响，对其比例的适当选择应该依据模板分子所含有功能基团的类别 和制备m i p s 过程中所用溶剂体系的性质，一般而言增大功能单体的比例可 以更加充分地预组装模板分子，但功能单体所占的比例并非越大越好，因 为：( i ) 过量太多的功能单体可能增加由未参与组装的功能单体所产生的非 选择性结合位点；( i i ) 过高浓度的功能单体有可能引起自身的缔合而使选择 性结合位点数减少，所以模板分子和功能单体的物质的量比值一般是1 ：4 就是使用复合型功能单体，模板分子与复合型功能单体的总量也保持在1 ：4 的比值左右( 王进防c ta 1 ，1 9 9 9 ) 功能单体和交联剂的比例对s i p s 的性能也有很大的影响当交联剂的 用量较低时，s i p s 会因没有足够的交联度而无法保持稳定的孔穴构型，结 果导致s i p s 识别能力降低：但是过高浓度的交联剂会破坏印迹效果，使单 9 功能单体9 - 7 , 烯基腺嘌峥的合成及其在分子印迹中的应用 位质量m i p s 内含有的功能单体数日降低而减弱m i p s 识别性能，尤其是当模 板分子以非共价键和功能单体相互作用时更为明显稍微增加交联剂的用 量可以减少m i p s 在不同溶剂中的溶胀，提高选择性，尤其是可以增强对结 构类似物质间的区分能力；用量稍稍减少时可增大m i p s 聚合链间的空隙使 待测物较快地通过扩散作用进入识别位点。功能单体和交联剂的物质的萤 比值是1 ：5 ，但在实际应用中交联剂的用量由具体试验确定。 引发剂用量多少在一定程度上也影响着m i p $ 的识别性能分布均匀 的适量引发剂可以使聚合反应平稳进行，使功能单体与模板分子的复合物 和交联剂在一定时间内充分聚合形成识别性能较好的m i p s , 大量的引发 剂虽然可以使它们之间的聚合反应在短时间内完成，但m i p s 表面聚合的 太快而可能使内部不能发生有效聚合，甚至使功能单体或交联剂本身之间 发生大量的聚合而减弱m i p s 对底物的识别性能；太少的引发剂虽然也能 使反应完成，但需要聚合的时间较长，分布过于稀疏的引发剂使m 口s 中 的识别位点在立体结构上与待识别分子相差太大而使m i p s 的识别分离性 能降低。一般而言，交联剂与引发剂的物质的量比值在1 0 ：1 ，但是具体用 量应根据实际情况而定 1 4 1 5 溶剂的选择及作用机理 溶剂在分子印迹过程中具有重要作用，不仅要溶解用于聚合的所有试 剂，还是制各m _ w s 的后续致孔剂，影响功能单体和模板分子间的结合强度、 动力学性质和聚合物的形态结构，特别是在自组装体系中显得尤为重要。 溶剂的用量对m x p s 中孔穴的立体结构也有影响，用量太多会使m i p s 的结构 疏松、硬度变低而影响识别效果；用量太少又会减少 v i l p $ 中立体孔穴的数 量同样，溶剂的极性、质子化等性质也不同程度地影响着印迹效果。极 性大的溶剂可与模板分子竞争功能单体的功能基团，从而使制得的m i p s 识别效果较差。通常低介电常数的溶剂是最佳的选择( 如甲苯、二氯乙烷 等) ，强极性的溶剂必然会减弱模板分子和功能单体的相互作用，使m i p $ 具有较低的识别性能。再就是溶剂的选择对m i p s 的形态、识别位点处功能 l o 山东农业大学硕士学位论文 基的定位和位点的可达到性也有一定的影响溶剂可以使m i p s 溶胀而影响 模板分子结合部位的立体结构，产生弱的结合，所以用于聚合的溶剂和用 于识别的溶剂最好统一