（农业昆虫与害虫防治专业论文）昆虫病原线虫发育相关基因的鉴定以及spi583基因的克隆与表达.pdf

摘要 斯氏属( 龇加e m 绷口) 与异小杆属( 沱把m 施曲讲出) 昆虫病原线虫 ( e n t o m o p a t l l o g e n i cn e m a t o d e ) 是国际上新型的生物杀虫剂，其感染期幼虫在食物信 息的诱导下恢复、发育以及大量繁殖，在这类线虫的产业化培养中发挥着重要作用。 了解线虫在恢复发育过程中差异表达的基因对探讨其代谢途径具有十分重要的意义。 本论文通过构建无菌小卷蛾斯氏线虫& b 觑洲口c 口r p d c e 阳口pa 2 4 在共生细菌 上清液诱导后恢复发育时的c d n a 文库，筛选差异表达的基因，并将其中一个与线 虫生长发育密切相关的丝氨酸蛋白酶抑制剂基因进行了原核表达。 论文叙述了分离共生细菌上清液诱导后恢复发育的e 觑绷绷口c 口唧翻p 阳ea 2 4 线虫总r n a ，通过r l m r a c e ( m 蛆l i 鼬s em e d i a t e dr a p i da m p l i f i c a t i o nc d n ae n d ， r i 肌- r a c e ) 技术获得了全长的c d n a 文库，通过点杂交，筛选到4 8 个差异表达的 克隆，经测序和生物信息学分析获得3 4 个d n a 序列，这些序列按照蛋白质功能包 括多个核糖体大小亚基蛋白( m 0 s o m a l p r o t e i n ) 、延伸因子( t r a i l s l a t i o ne l o n 鼬t i o n f a c t o r l a i p h a ) 、丝氨酸蛋白酶抑制剂( s e r i n ep r o t e i n a s ei n h i b i t o r ) 、细胞分裂蛋白激酶( c e n d i v i s i o np r o t e i nl d n 髂e5 ) 等。 以龇跏e m 硎口，p d c 口脚ea 2 4 总r n a 为模板，通过r 1 ：p c r 扩增获得了 印 霓? 基因，将目的基因与p e t - 1 5 b 表达载体进行体外连接，构建了重组表达载体 p e l 二1 5 b s p i 5 8 3 ；经传代实验证明了重组质粒p e t _ 1 5 b s p i 5 8 3 在重组大肠杆菌中的 稳定性；于重组菌的对数生长期前期加入诱导剂f r g ( 1m m o l l ) ，2 5 下诱导表达 8 h 1 2 h 后，获得分子量约为1 9 5 4k d a 的融合蛋白；融合蛋白以包涵体形式存在， 胞外未有目的蛋白的渗漏表达；利用h i s t a g 融合标签的免疫印迹检测表明融合蛋 白含丝氨酸蛋白酶抑制剂s p i - 5 8 3 。 本研究结果不仅有利于昆虫病原线虫一细菌共生关系的研究，而且将促进这类线 虫的产业化。 关键词：昆虫病原线虫；& e m 卵l e m 口c 口厂p d c 印阳ea 2 4 ：差异表达基因；丝氨酸蛋白 酶抑制剂 i d e n t i n c a t i o no fd e v e l o p m e n t - r e l a t e dg e n e so fe n t o m o p a t h o g e n i cn e m a t o d ea n d c l o n i n ga n de x p r e s s i o no f 置一5 8 3g e n eo fs t e i n e m e m ac a r p o c a p s a ea 2 4 a u t l l o r ：x i ay i n g w e i s u p e f s o r ：d r “r u 西u n ( 舡s o c i a 把p m f e s s o r ) a n dd rh a nr i c 抑u ( p r o f c s s o r ) m a j o r ：a 鲥c i l l i u r a ie n t o m o l o g ya n dp e s tc o n d a b s n 乜c t e m o m o p a t h o g c n i c 龇抽绷绷口a n d 胁耙r d 砌口砌麻n e m a t o d c s ( e p n s ) a r c n c w b i o i n s e c t i c i d e 髓er c c o v e r ya n dd e v d o p m e n to ft h ei i l f e c t i v ej u v i 王c s ( i j s ) o ft h e s e n e m a t o d e sp l a ya ni m p o n 姐tr o l ei nt h c i r 啪m 盯d a lp r o d u c t i o n i d e n t i f i c a t i o no f 山e g 助c sd u n gt l 】e c o o v e r ya n dd w d o p 舶c n tp 删d e sj j l s i 鲂ti n l ot h eu n d c r s t a i l d i n go ft h e m e t a b o l i cp a t h w a y s0 ft h er e c o v e r e d s ac d n ad i 骶r e n t i a lc x p r c s s i o n1 i b r 铷呵f m mr e c o v e r e d so f s c 口p d c 口p 船ea 2 4w a s c o n s t n l c t e da n dt h e ，g e n e so fd i f f c r e n t i a je x p r e s s i o nw e r ei d e n t i f i 酣ag c n en 锄e d 印f 一跚 w h i c hh a sh i 曲h o m o l o g yw i t hs e r i j l ep r o t e 证a s ei n h i b i t o rg e n e sw a ss e l e c t e da n d e x p r e s s e di np m t o c a r y o t i c c _ i l e 曲缸髓) e x p r c s s i o ns y s t e m r 【m - i 乙a c e ( 鼢璩l i g a s em e d i a t e dr a p i da m p l m c a t i o nc d n ae n d ，r u m m c e ) m e t l l o dw 懿u s e d 幻c o n s t m c tm ed i f 色r e n t i a l e x p r e s s i o nl i b m r y 丘d m & c 伊0 ( 螂e a 2 4t o t a lr n a 4 8d i f e r e n t i a le x p r e s s e dc l o n e sw e r ei d e n t i f i e db yd o tb l o t t i n ga n a l y s i s t h e s ed i f 传r c n t i a le x p r e s s e dc l o n e sw e r es e q u e n c e da n da n a l y z e db yb i o - i n f o m a t i o n 3 4 f u l l l e n 蛋hg c n e sw e r eo b a i l l e d ，i n c l u d i l l gr i b o s o m a lp r o t e j ng e n e s ，呦s l a t j o ne l o n g a “0 n f a c t o r1 一a l p h ag e n e s ，s e r i n ep r o t e i n 鹅ei n t l i b i t o rg e n c s ，c c ud i v i s i o np r o t e i l l 虹n a s e5g e n e s e t c ag e n e f 一跚) w a so b t a i n e d b yr t p c r 锄p l i f i c a t i o n 肋mt h eg e n o m i cd n ao f sc p d c 哆芦ea 2 4 p e te x p r e s s i o ns y s t e mw a s 印p l i e dt oc o n s t n l c t r r e dr c c o m b i n a m e 矗b l 2 1 ( d e 3 ) a f i e ro v e r1 0 0p a s s a g c s ，t h er e c o m b i i l a i l ts h o w e ds t a b l ep i a s m i d i i l l l e r i t a l l c ea n dc o n s i s t e n c e w h e nr e 咖b i n a i l te nw a si n d u c e dw i m1m m o l 几i p l g a tt h ee a d ye x p o n e n t i a lp h a s ea t2 5 ，s p i 一5 8 3p i o t e i l lw a sd e t c c t e d a si n c l u s i o nb o d i e s w i t ht h em o l c c l l l a rm a s so fa p p r o x i m a t e l y1 9 5 4k d a w e s t e mb l o ta n a l y s i sc o n f i 哪e dt h e e x p r c s s i o no ft l l es p i 5 8 3p m t e i n t h e s er e s u l t sw o u l db eh e l p f u ln o to n l yt o e x p l o r en e m a t o d e - b a c t e r i u ms y m b i o t i c m e c h a n i s m ，b u ta l s op r o m o t et h ec o m m e r c i a lp m d u c t i o no ft h e s en e m a t o d e s k e yw o r d ：e n t o m o p a t h o g e n i cn e m a t o d e s ；p 加e m 绷nc 日，p d c q p 期已a 2 4 ； d j f f e r e n t i a l e x p r e s s e dg e n e ；s e r i n ep r o t e i n a s ei n h i b i t o r b p b s a b t c a r c d k a m c s m w m g m l n m l o d p a g e 英文缩略词表 b a s e p a i r b o v i n es e n na l b u m i n 矗口c f 腩帕饵泐拈妇 c 缸b e n i c i l l i nd i s o d i 岫 c y c l i n d e p e n d e n tk i n a s e d e i o n i z e d i s t i l l e dw a t e r d i 】旺打e n t i a ld i s p l a yr t - p c r d i c t h y lp y r o c a i b ( m a t e d e o x v r i b o n u c l e i ca c i d d o u b l es t 咖dc d n a e t h i d i 啪b r o m i d e e s c h e r k h i 4 l i e t h v l e n ed i a m i n et e a a c e d ca c i d e p p c n d o r f e m 咖o p a t h o g e n i cn e m a t o d e 舯m 或蓼a v i t y h o u r i n f e c t i v ei u v e i l e i s o p r o p h yt h i o - b d g a l a c t o s i d e k a n a m y c i n l 【i l o b 髂e s k i l o d a l t 0 l i t e r l u i i a b e r t 躏im e d i u m m o l ，l 或m o l e c u l a rw e i 曲tm a r k e r m i l l i 黜p e r c 枷l t i p l ed o n i n g s i t e s m o l e c u l a rw e i g h f m i l l i 孕锄 m i n m e m m i m e t e r o p t i c a l d e n s i t y p o l y a c r y l a m i n eg e le l e c t r o p b o r e s i s 碱基对 牛血清白蛋白 苏云金杆菌 羧苄青霉素 细胞周期蛋白依赖性蛋白激 酶 双蒸水 差异显示p c r 焦碳酸二乙酯 脱氧核糖核酸 双链c d n a 溴化乙锭 大肠杆菌 乙二胺四乙酸 e 口管 昆虫病原线虫 克或离心力 小时 感染期幼虫 异丙基硫代b d 半乳糖 卡那霉素 千碱基数 千道尔顿 升 l b 培养基 摩尔每升或分子量标准参照 物 毫安 多克隆位点 分子量 毫克 分钟 毫升 光密度值 聚丙烯酰胺凝胶电泳 一一一叭一髓一一印麟g h u m要协鼢l m m p b s p c r p h p v d f r d a r l m 二r a c e r n a r p m s a g e s d s s d s p a g e s p i s s h t a p 1 e m 瞳d t m b t n s 、) l r ，v p g “l v p h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n e p o l y m e m s ec h a i nr e a c t i o n h y d r o g e ni o ne x p o n e n t p o l y v i n y l i d e n en u o r i d e r e p r e s e n t a t i o n a ld j f f e r e n c ea n a l y s j s r n a l i g a s em e d i a t e dr a p i da m p l i f i c a - t i o n c d n a e n d r i b o n u c l e i ca c i d r e v o l u t i o np e rm i n u t e s e r i a la i l a l y s i so fg e n ee x p r e s s i o n s o d i u md a c c y ls u l p h a t e s d s p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s r i n ep r o t e i n a s ei l l l i i b i t o r s u p p r c s s j o ns u b t m c t i v eh y b 棚i z a t i o n t o b a oa c i dp y r o p h o s p h a t a s e n ，n n n 一t c t r a m e t h y l c t h y l e n c d i a i n i n e 3 ，3 ，5 ，5 _ 1 色t 删m e b e n a i d i n e t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t b a n e w e i g b “、，o l u m m i c r 0 掣a m m 咖l i t e r v o l t 磷酸盐缓冲液 聚合酶链式反应 酸碱值 聚偏二氟乙烯 代表性差异分析 m q a 连接酶介导的c d n a 末 端快速扩增 核糖核酸 每分钟转数 基因表达序列分析 十二烷基磺酸钠 s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳 丝氨酸蛋白酶抑制剂 抑制性扣除杂交 烟草酸性焦磷酸酶 n ，n ，n n ，四甲基乙二胺 3 ，3 ，5 ，5 四甲基联苯胺 三( 羟甲基) 氨基甲烷 重量体积比 微克 微升 伏特 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑i 垦盛些盘兰或其他教育机构的学 位或证书面使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：夏鞍书签字日期：7 年占月j ，日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑韭壅些盘鲎有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权塑韭壑些盘茎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：礅名参 签字日期：伽6 年石月才日 一学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签名： 物牵专 签字日期：饥讲年6 月l 厂日 电话： 邮编： 昆虫病原线虫发育相关基因的鉴定以及印i 5 即基因的克隆与表达 1 1 概况 第一章引言 昆虫病原斯氏属( 龇跏e 埘e ，l 口) 与异小杆属( 觇把m 砌口6 击咖) 线虫 ( e n t o m o p a l h o g e n i cn e m a t o d e ，e p n ) 是国际上新型的生物杀虫剂【1 】o 与其它生物杀虫 剂相比，这类线虫具有广泛的寄主范围：对寄主具有主动搜寻能力，特别是对土栖性 及钻蛀性害虫；可规模化培养，使用方便；对人畜、环境安全，在大多数工业化国家 可以豁免注册使用1 2 j 。近年来，已广泛应用于防治农林、花卉及牧草等害虫，受到国 内外学者及产业界的高度重视，并走向商业化【3 4 】。目前，全球有4 0 多个国家在研制 昆虫病原线虫杀虫剂，商品化生产的线虫品系超过百种【5 t 6 】。据“s a n s k v 甜以( 1 9 9 4 ) 统计，在工业化国家的生物农药市场中，此类线虫的市场销售额仅次于苏云金杆菌 ( 肌c f 池s 腩h r 加鲴州s 括，b t ) ，占第二位1 7 】o 在我国，昆虫病原线虫也已经商业化生产 和销售，并应用于防治多种农林、草地、花卉以及卫生害虫等，结果令人鼓舞f 4 ，8 叫。 因此，在农药污染日益严重、害虫抗药性发展迅速的今天，昆虫病原线虫己成为当前 国际生物防治领域研究热点之一【2 】。 1 2 昆虫病原线虫及其共生细菌 嗜线虫致病杆菌属( 娩甩d 砌口6 d 淞) 和发光杆菌属( 珊咖捕口抛心) 【l o l 细菌，是一 类分别与昆虫病原斯氏线虫属( e 拥e m e 肌口) 和异小杆线虫属( 月j f e m 砌n 6 出出) 线虫互惠共生的昆虫病原细菌。此类细菌为革兰氏阴性，属肠杆菌科 ( e n t e r o b a c t e r i a c e ) 【1 1 1 。 这类线虫作为昆虫的“蛔虫”是与其体内专化性携带的共生细菌一起致死寄主昆 虫的。在自然界，共生细菌存在于三龄感染期线虫( h f 酏t i v ej u v e n i l e s ，u s ) 的肠道 内，此龄期的虫态不取食，于土壤中能存活一段时间，主动搜索并随时入侵可能的寄 主昆虫。线虫随寄主食物或从昆虫的自然开口( 如肛门、气门) 、节间膜或伤口进入 昆虫体内，随后释放肠腔中携带的共生细菌。尽管昆虫会对外来入侵产生细胞防御机 制及体液防御机制，共生细菌一旦被释放后，在昆虫血腔内大量繁殖，破坏昆虫的生 理防御机能，分泌毒素( 毒性因子) 使昆虫患败血症在4 8 小时内死亡，产生胞外酶 等分解昆虫尸体为线虫的生长繁殖提供营养，产生抑菌物质抑制其它杂菌的生长，为 线虫提供良好的生长环境。线虫及细菌在寄主体内繁殖若干代后，新一代的感染期线 虫携带共生细菌从昆虫尸体爬出，寻找新的寄主昆虫【1 2 ，1 3 l 。表1 所示为线虫和细菌于 昆虫体内的生长循环过程。 昆虫病原线虫对害虫有很强的致病力，共生细菌在其中起到关键性的作用。近年 来，随着研究的不断深入，这类昆虫病原细菌的多种生物学功能亦不断被发现1 1 2 1 。 皿n o r 口6 d 属和f 啦d f d 砌n 6 咖s 属的共生细菌通过线虫携带、注射以及口服进入昆虫 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 表昆虫病原线虫一细菌共生系统生活史的关键阶陉 t a b 1l i f e c y d ei 。e ys t a g ei nt h en e m a t o d e b a c t e r i as y m b i o s j s 体内均能致死宿主【14 1 5 】，并可从共生细菌中分离到蛋白质毒素和相关基因【”1 扣1 9 l 。 因此，昆虫病原线虫共生细菌在害虫防治方面的应用也受到重视。这类细菌已应用于 防治火蚁f 14 l 和白蚁 巩2 l l 。杀虫蛋白毒素的发现，为进一步研制新型微生物农药以及创 建防虫转基因植物提供了新的微生物杀虫资源和杀虫基因【琏盟国i 。共生细菌杀虫蛋白 基因已被转入烟草、玉米和水稻等作物中，所构建的转基因植物对烟草天蛾和玉米根 叶甲幼虫表现出致死和抑制生长的效果i 2 4 j 。最近发现，这类共生细菌除产生杀虫的毒 素蛋白外，也分泌具驱避作用的物质瞄矧，共生细菌产生多种抗生素，对多种动植物 及人类病原菌有广泛的抑菌活性，一些抗生素具有商业开发前景1 27 捌，因而，共生细 菌是一种具有医用价值的细菌；共生细菌还能分泌一些抗肿瘤物质，对人类多种肿瘤 细胞有强抑制效果，为研制抗癌新药提供了新材料【2 3 0 l 。昆虫病原线虫共生细菌已成 为一类新型的具有开发潜力和应用前景的生物资源。 1 2 1 昆虫病原线虫的生活史 昆虫病原线虫的生活史比较简单，包括卵、幼虫和成虫三个阶段。幼虫四个龄期， 经4 次蜕皮后成为成虫。斯氏线虫科与异小杆线虫科生活史略有不同。斯氏科感染期 幼虫可发育为雌雄异体的第一代大母虫，雌雄虫交配，大母虫产卵得到下一代的雌、 雄虫或直接发育为感染期线虫。但是，异小杆科感染期幼虫全部发育为雌雄同体的第 一代大母虫。这些大母虫产卵、卵发育为雌雄同体的雌虫和雄虫，或部分发育为感染 期幼虫。第二代的雌虫所产的卵可全部或部分直接发育为感染期幼虫1 3 1 讲l 。图1 为 异小杆线虫的生活史。 2 昆虫病原线虫发育相关基因的鉴定以及印f 一跚基因的克隆与表达 图1 昆虫病原异小杆线虫的生活史f 1 习 f j 昏1u 协c y d eo f 届啦，啪4 6 d 泌n 恤a t o d 嚣i 切 两科线虫均以第3 龄幼虫侵染寄主，故该期幼虫也被称为侵染期幼虫。侵染期 幼虫具有第2 龄幼虫蜕下的但没有脱下的“鞘”，形成两层表皮，因此具有较强的抵 抗外界不良环境的能力，是昆虫病原线虫一生中唯一侵染寄主昆虫的阶段。昆虫病原 线虫侵染期幼虫一旦寻找到寄主，即通过昆虫的自然孔口和体壁进入昆虫体腔内，开 始了一个新的生活史循环。 1 2 2 昆虫病原细菌的型态变异 型态变异( p h 船ev a r i a t i o n ) 是昆虫病原线虫共生细菌的一个重要生物学特性( 见 图2 ) 。初生型菌可由感染期线虫肠腔内分离获得，在离体培养时易发生型态变异， 转变为稳定的次生型，二者的代谢产物及生物活性有较大差异，主要区别在于菌落形 态、吸收染料能力、代谢产物、粘着性、呼吸强度、荧光和色素以及对营养物质的要 求等，但两型菌对昆虫的毒性无差异。鼢d 肭6 出s 次生型虽然与初生型一样都有毒 性，但某些菌株的次生型不能与线虫共生，也不支持线虫在昆虫宿主体内生长【1 3 】。初 生型能把一系列物质转化为适于线虫生长繁殖的培养基，而次生型不能。在大量培养 中，培养基必须接上初生型的共生菌。要想获得稳定的生物活性物质，保证线虫的致 病力，必须控制共生细菌型态变异的产生【”。】。 为探索共生细菌的型态变异，研究者从不同方面对共生细菌的型态变异机制进行 了研究1 4 l j 。a k h u r s t 等利用r f i 卫未检测到两型的染色体有差异l “。b o e m a r e 等人利用 d n a 杂交技术，通过两型共生菌d n a 图谱分析，证明两种菌型确是同一个种，具有 3 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 圈2 昆虫病原细菌的初生型与攻生型l 柏1 n 昏2 p h a 辩v 8 一柚蚰o f e n t 哪哪t h 孵e n i c b a c l e r i q m 1 携带共生细菌的菌囊( 箭头所指部位) 2 韧生型细菌3 次生型细菌 1 0 0 的同源性l 埘，只是在培养过程中表现出不同的形态、特征。它不同于一般细菌 的型态变异，与免受寄主防御反应及噬菌体的侵染无关。此外，细菌中质粒的缺失 ( 4 3 朋l 、染色体的重组嗍、噬菌体的存在【4 5 删以及，b 叫基因【4 可均没有参与菌型的转变 过程。随着研究的深入，研究者对共生菌型变机制的研究不断深入，目前认为共生菌 发生型态变异可能机制归纳于表2 。 表2 共生菌发生型态变异的可能机制 t i b 2n 峋廿柚m h 4 m s mo f p h a 辩憎d a 岫o f 置啊计觑1 6 d h 柚d 珊硼叩h 涮函 型态变异机制 m c c l i a n i s i no f p h a v a r i a 曲n 型态变异因素 ， f a 咖r0 f p h a v 耐a n o n 环境适用性 功能基因失活 调控基因调控 转录水平调控 转录后调控 膜结构改变 抑制剂产生， 营养吸收、呼吸酶、渗透压 c 州面坩基因；阳，基因失活 叫基因调控 鞭毛蛋白基因 血x 基因，脂肪酶基因 膜的流动性、外膜蛋白 蛋白酶抑制剂 共生菌的型态变异引起诸多形态和生理生化特性的变化，在一系列的变化过程 中，可能是某个关键的调解基因调控数个调节因子，或是多个调节基因的协同调控的 4 昆虫病原线虫发育相关基因的鉴定以及印f ，跚基因的克隆与表达 结果，也许是某个基因产物控制转录后调节因子，或是蛋白加工和蛋白分泌的过程， 即多因子在不同水平的调控，而且在不同种或同种不同菌株间存在差异。总之，共生 菌发生型态变异的机制目前还不完全清楚，为了利用此类细菌稳定地产生杀虫、防病、 抗人类癌症等生物活性物质，因此有必要明确其型变机制，才能更好地利用昆虫病原 细菌这一特殊的微生物资源。 1 3 昆虫病原线虫的培养及产业化 这类生物杀虫剂的大面积田间应用需要产业化的培养技术。目前，这类线虫的大 量培养是应用无菌操作技术，于人工培养基中分别加入单一共生细菌和无菌线虫，即 线虫的单菌体外培养系统。根据培养基质可分为固体( 触1 4 9 】和液体培养【州2 l 两种。这一 系统中，共生细菌将一系列培养基转化为适宜于线虫繁殖的营养物质，供线虫的生长、 繁殖。 目前世界上杀虫剂包括杀螨剂的销售额估计己达约6 0 亿美元，并且预计每年将 阻2 3 的适度增长率增长，其中1 5 亿美元是用来防治为害玉米、水稻、蔬菜、 烟草、草地和观赏植物的地下害虫。这些原则上都是线虫产品的市场销售领域。值得 注意的是，在这一领域，实际上没有其它生物农药与线虫产品竞争。由于9 0 以上 的昆虫种类其生活史中至少有部分时期是在土壤里度过的，大部分可以考虑以昆虫病 原线虫加以防治，并且业已发现3 0 0 0 种以上的昆虫能被线虫寄生，这类线虫的应用 前景变得十分明朗。人工廉价培养基的选配成功，特别是线虫共生细菌在线虫繁殖过 程中地位的明确，线虫的应用走入商品化阶段。根据防治对象和害虫的虫口密度，目 前利用线虫产品防治害虫的费用为每公顷4 0 4 0 0 美元。在生产上应用大规模工厂化 的生产技术，更有利于昆虫病原线虫应用于害虫生物防治。目前，全球有4 0 多个国 家在研制线虫杀虫剂，美国、德国、澳大利亚、荷兰、加拿大、日本及其它一些国家 的数十家生物工程公司，均可提供线虫商品制剂。先进的固体和液体发酵培养技术是 目前多数厂家采用的主要生产方法1 5 3 ，5 4 j 。 1 4 昆虫病原线虫一共生细菌共生关系的研究 b o v i e n 首先发现细菌与线虫的共生关系( s y m b i o s i s ) 【55 1 ，后来a l 【h u r s t 发现共 生细菌的两型现象，促进了线虫与共生细菌关系的研究【3 5 】。昆虫病原线虫与共生细菌 的组合表现出高度的专化性，这一专化性至少表现在以下几个方面【5 6 l ：细菌对线虫的 信息诱导【明，细菌对线虫的营养作用【5 ”，线虫对细菌的保护和携带作用f 5 8 1 。目前， 这种共生关系的研究仍是线虫作为生防因子的重要理论基础。 1 4 1 信息诱导作用 在共生体系中，信号物质广泛地调节着二者之间的关系，不同的信号物质控制着 线虫不同时期的生长发育，主要包括使线虫由侵染期恢复发育，和在食物匮乏时进入 侵染期虫态的信号物质。研究表明，线虫进入昆虫血腔后，由不取食的三龄感染期虫 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 态向取食虫态发育是化学信息物质( f o o ds i 皿a 1 ) 诱导的结果i 。异小杆线虫发育成 雌雄同体的大母虫而斯氏线虫恢复发育成雌虫或雄虫f 删。体外实验表明，斯氏线虫和 异小杆线虫的感染期幼虫均可在没有其共生细菌的无菌昆虫中发育为成虫【6 ”。因此， 昆虫血淋巴中的信号物质是诱导线虫恢复的主要信号来源。另外，砌d 埔口6 d 姆属 和鳓d 幻施口6 如s 属共生细菌也产生化学信息物质诱导感染期幼虫发育i5 9 t 6 2 删。 砌d 胁口胁心属细菌产生的信息物质未能诱导异小杆线虫发育，但是朋o f d 砌4 地s 属的有些共生细菌菌株可诱导甄嘲p m 绷口硼c 印跚e 线虫发育【6 。食物信号物质 在细菌的对数生长后期产生，因此不是侵染期线虫恢复发育信号的直接来源，它只在 线虫后期的生长发育中起作用，为后代提供足够的食物。此外，也有一些侵染期线虫 不用任何食物信号物质诱导就可以恢复【硎。 由于大量生产的需要，人们已对诱导线虫进入侵染期虫态的信号物质进行了多方 面的研究。h 卸d4 f ( 2 0 0 0 ) 测定了1 4 种非线虫共生细菌的培养液及其上清液、斜 纹夜蛾跏d d d p 把r 口砌r 4 昆虫细胞系对无菌的小卷蛾斯氏线虫a 2 4 品系 c 口，p d c 叩阳ea 2 4 和无菌的嗜菌异小杆线虫啪6 品系王k 把r d 施4 砌麻 6 d c 抛，f d 肼d 阳啪6 发育的影响。结果表明，上述培养物均未能使啪6 线虫发育。此 外，虽然明亮发光杆菌砌占幻妇c 佗r f m 坍础砷d ，叫m 菌液可致死a 2 4 线虫，但是其 上清液可诱导线虫恢复；无菌的斜纹夜蛾昆虫细胞系可繁殖a 2 4 线虫产生下一代侵 染期幼虫。结果进一步说明了诱导h 0 6 线虫发育的化学信息物质要比a _ 2 4 线虫的 专一；而具有很多活性物质的鸡蛋清却不能使昆虫病原线虫恢复【6 1 】。关于发育信号物 质的理化性质及其在生理水平上的作用模式的研究也已展开。a u m 籼等将异小杆线 虫培养基上清液进行超滤，证实了诱导恢复的信号物质可能至少由两种物质组成，分 子量分别小于5k d a 和2 0k d a ，两者存在协同作用，无累加效应撙j 。这个信号物质 可通过阴离子交换色谱纯化，带负电，只有在甲醇溶液中才能被检测到活性，且热稳 定，具挥发性，当p h 值小于4 或大于1 0 时活性降低，二氧化碳可使信号物质增 效【6 4 1 。 在昆虫病原线虫与共生菌株组合培养时，共生细菌产生的化学信息物质可控制感 染期线虫种的发育速度，进而影响线虫的繁殖代数、最后产量以及线虫成本【5 1 捌。这 是昆虫病原线虫产业化培养过程中的关键技术问题，被誉为“线虫培养这皇冠上的 明珠”。然而，参与这些化学信息物质的合成的相关基因，以及其成分和作用方式仍 未清楚陬6 5 捌l 。 i 4 2 营养作用 业已证明，线虫与菌株的组合具有不完全的繁殖专化性( 即支持线虫繁殖方面的 专化性) ，没有一线虫品系能在所有共生菌株中生长，也无一共生菌株支持所有试验 线虫品系【6 1 舯6 7 锕l 。目前，不少学者已报道了影响昆虫病原线虫与共生细菌自然组合 ( 即一种线虫与其携带的共生细菌的组合) 的相关基因a 例如，咖，p h o s p h o p a l l t e t h e i n y l t r a n s f c r a s eh o m 0 1 0 9 ，艇州h o m o l o g u e ，苫雎o p c 啪，蹦i 基因参与了p a 硼口m 口础淞 昆虫病原线虫发育相关基因的鉴定以及印f 一5 船基因的克隆与表达 属共生细菌与异小杆线虫的营养支持作用【”。“。两者的专化性组合是线虫大量培养、 线虫应用和线虫一细菌共生机理研究的基础，对这类生物杀虫剂的产业化培养意义重 大。 昆虫病原线虫虽然可消化并利用共生细菌细胞体，但侵染期幼虫并不消化这些共 生细菌，它们利用这些细菌协助杀死下一个新的寄主昆虫【“。在侵染期以外的其它 阶段，一方面线虫以共生细菌为食，一方面共生细菌在对数生长期后的生长阶段产生 不同的蛋白酶、脂肪酶、几丁质酶和磷脂酶，转化昆虫尸体，为线虫繁殖发育提供营 养基质f 7 7 7 8 】。同时，共生细菌在代谢过程中会产生多种抑菌物质阻止来自肠道和土 壤环境中的微生物对虫尸的二次感染、避免其它昆虫对被侵染的昆虫尸体的取食以及 控制共生菌之间的竞争【4 8 ，7 6 例。 1 4 3 携菌作用 共生细菌不能单独在土壤中存活，需要线虫作为载体使之进入昆虫的血腔l 帅】。在 携菌过程中，线虫所携带的细菌种类和细菌型态及部位有一定的专化性。与营养专化 性相比较，携菌专化性要比营养专化性表现得严格。异小杆线虫科和斯氏线虫科的携 菌部位是不同的。嗜线虫致病杆菌被携带于斯氏线虫感染期线虫的一个由肠腔组成的 特化的囊泡内【鹋m 8 1 】。而发光杆菌则位于异小杆线虫感染期线虫的整个中肠。把无 菌的异小杆线虫与其它不同线虫的共生菌组合就可发现，虽然线虫有不同程度的生长 发育，但是它不能携带这些共生菌l 田一7 0 罔。虽然次生型细菌可以支持麒妇m 删m 口 低水平的生长发育，但是它不被线虫所携带【6 lj 。此外，业已发现，恐n d 施口触博属共 生细菌的御s ，臣d e ，f r p ，口，叫，s 盯c ，玎f 晒，d 印u ，n 潮，厅甜c ，一娃d ，和 渊纠危虻8 d 7 出o p e m n 基因参与了共生细菌于龇加e m 删口线虫肠腔中的携带 i 站6 1 。 除以上几方面外，更令人感兴趣的是，最近的研究发现，当昆虫病原线虫与不同 的共生细菌菌株组合培养时，有些共生细菌菌株对非自然共生的组合线虫产生致死作 用l 删。无菌的h 幻c 舸如砌d 阳h 0 6 线虫与分离自h 加d f c 口线虫的旦m 肌加卵c e 船 l n 2 共生细菌组合培养时，l n 2 共生细菌产生的对热敏感的毒素可致死h 0 6 线虫【吲。 虽然共生细菌可产生代谢产物( 二硫吡咯类3 ，5 d i h y d r o x y 4 i s o p r o p y l s t i b e n e 和吲哚类 i n d 0 j e ) 可致死植物线虫，但是这些代谢物质未参与线虫与共生细菌的专化性组合1 8 u 。 显然，这一现象对探究昆虫病原线虫与不同的共生细菌组合的专化性提供了很好的思 路。并且影响不同昆虫病原线虫与共生细菌非自然组合( 即线虫与非其携带的共生细 菌的组合) 的营养专化性和相关基因对阐明这类线虫的共生机理和促进其产业化培养 具有重要的意义。 1 5 大肠杆菌原核表达系统 大肠杆菌( 豇曲盯f c 妇c d “) 属于典型的原核生物，有关于大肠杆菌及其噬菌体 的研究，在分子生物学的发展进程中占据着重要地位，基因工程的重要目标之一是制 河北农业人学硕士学位( 毕业) 论文 备按照其它方法难以生产的大量纯化的目的蛋白质产物，这就需要选择一个良好的重 组蛋白表达系统。尽管目前可供选择的表达系统有细菌、酵母、昆虫和哺乳动物细胞 等，比较而言，大肠杆菌具有遗传背景清楚、生长速度快、生长周期短、安全性好、 可以进行高密度培养、有大量可供选择利用的克隆和高效表达外源基因的载体和适合 表达不同来源的基因产物等特点，大肠杆菌表达系统成为人们克隆和表达外源基因首 选的表达系统。大量的有价值的基因产物在大肠杆菌中获得了表达。 本论文使用n o v a g c n 的p e t 系统是目前在大肠杆菌中克隆表达重组蛋白功能最 强大的系统。重组质粒转化到带有染色体t 7 鼢舱聚合酶基因的大肠杆菌中，后者都 是噬菌体d e 3 的溶源菌。噬菌体d e 3 带有噬菌体2 j 抗性区和缸c ，基因，缸c 研石启 动予以及t 7 对q a 聚合酶基因，这一区域被插入加f 基因，因此阻止了d e 3 在没有辅 助噬菌体感染时整合到染色体上或从染色体切出。p e t 质粒载体上的目的基因，受噬 菌体t 7 强转录及翻译( 可选择) 信号控制，表达由宿主细胞提供的1 7r n a 聚合酶 诱导。t 7m q a 聚合酶机制十分有效并且具有选择性：充分诱导时，几乎所有的细胞 资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋 白的加5 0 。尽管该系统十分强大，仍能通过降低诱导物的浓度、选用t 7 ，r 7 陆c 启动子、p l y s s 或p l y s e 宿主菌以及培养基外加葡萄糖等方法严密控制蛋白表达水平。 降低表达水平可能可以提高某些目的蛋白的可溶部分的产量。 该系统的另一重要特点是，在非诱导条件下，可以使目的基因完全处于沉默状态 而不转录。用非表达型宿主细胞克隆，将质粒转入带有受缸c u v 5 控制的t 7 鼢骢聚 合酶基因的表达型细胞，通过在细菌培养基中加入口i b 来启动表达，尽管有时可以 直接将目的基因克隆到表达型宿主细胞中，但这种策略并不是通用的做法。即使在没 有i p r r g 存在的情况下，也会有少量缸c u v 5 启动子表达的盯时慵聚合酶，因此存 在目的蛋白的本底表达。控制基础表达的手段之一是采用带有硎口c 启动予的载体。 这些质粒在紧邻t 7 启动子的下游有一个k c 操纵子序列，它们同样具有常规启动子 以及编码缸c 阻遏蛋白( 缸c ，) 的序列，1 7 肠c 和肠c ，启动子位置交错。采用这种载体 及d e 3 溶源菌，如c 阻遏蛋白可以作用于宿主染色体肠c u v 5 启动子，抑制宿主聚合 酶转录t 7r n a 聚合酶，也作用于载体t 7 缸c 启动子，以阻断任何t 7r n a 聚合酶导 致的目的基因转录。 1 6 本论文的研究目的和主要内容 _ 1 6 1 研究目的 国内外的研究表明，昆虫病原线虫在昆虫或共生细菌活性物质的诱导下从侵染期 虫态恢复并发育成为取食虫态是这类线虫生活史的重要发育阶段，在其产业化培养中 发挥着重要作用。因此，本论文选择昆虫病原线虫发育相关基因的鉴定、克隆和表达 作为研究内容。 论文将小卷蛾斯氏线虫c 口r p d c 口出n e a 2 4 品系在共生细菌诱导下恢复发育，构 建其发育过程中的c d n a 表达文库，利用差异显示法( d i 圩e r e n f i a ld i s p l a y ) 筛选特 昆虫病原线虫发育相关基因的鉴定以及印j 一5 韶基因的克隆与表达 异表达的基因，然后筛选感兴趣的基因进行原核表达，为从分子水平研究线虫生长发 育机制奠定基础，以及从文库中筛选有价值的功能基因进行深入的研究。这不仅有利 于线虫一细菌共生机制的探索，而且对促进线虫的产业化生产，具有重要的理论意义 和实践价值。 1 6 2 研究内容 本论文从被共生细菌诱导和未被诱导的小卷蛾斯氏线虫c 口，妒c 印跚ea 2 4 品系 的总r n a 出发，通过r l m r a c e 技术获得全长的c d n a ，构建c d n a 文库，通过 s o u t l l e m 印迹分析，筛选差异表达的基因：然后对其中感兴趣的基因进行原核表达。 具体内容如下： ( 1 ) 提取诱导和未诱导线虫的总r n a ； ( 2 ) 构建c d n a 表达文库； ( 3 ) s o u t h 啪印迹杂交，筛选差异表达的基因： ( 4 ) 分析、比对测序结果； ( 5 ) 选择差异表达的丝氨酸蛋白酶抑制剂( s c r i n ep r o t e i i l a s ci n l l i b i t o r ) 构建其高效 原核表达载体： ( 6 ) 诱导、表达和检测目的蛋白。 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 第二章昆虫病原线虫发育相关基因的鉴定 高等生物大约有1 0 万个不同的基因，但在生物体内任一细胞中只有1 5 的基因 得以表达。而这大约1 5o o o 个基因的表达是按时间和空问顺序有序地进行着，这种表 达方式即为基因的差别表达( d i f f c r e n t i a lc x p r e s s i o n ) 【8 羽。生物体表现出各种各样的特 性，主要是其基因表达的差异引起的。基因差异表达的变化有两种，即新出现的基因 表达与表达量差异的基因表达。由于基因表达的变化是调控细胞生命