基于聚苯胺纳米纤维复合膜界面构建电化学细胞传感器及其对癌细胞的识别检测.doc

基于聚苯胺纳米纤维复合膜界面构建电化学细胞传感器及其对癌细胞的识别检测摘 要 合成了聚苯胺纳米纤维，直径在5070 nm之间；基于静电作用构建聚苯胺纳米纤维-纳米金复合膜界面，并在此界面上层层组装修饰叶酸分子，构建叶酸功能化传感界面，基于叶酸分子与癌细胞表面过量表达的叶酸受体之间的特异性识别作用，将此传感界面应用于对癌细胞的识别和捕获。结果表明： 叶酸功能化传感界面能够特异性识别和捕获叶酸受体过量表达的癌细胞。采用电化学阻抗技术，以hela细胞为模型，应用于对癌细胞的识别和检测，细胞在1.01046.4106 cells/ml浓度范围内与阻抗变化值rct呈良好的线性关系；检出限为2000 cells/ml。本方法简单、快速灵敏、重现性和稳定性良好；制备的传感器可以再生使用。关键词 细胞传感器; 聚苯胺纳米纤维; 纳米金; 癌细胞1 引 言基于电化学检测的细胞传感器，是通过测量电化学信号（如电流、阻抗及电容等）分析评价细胞，目前已成为生物传感器研究领域的热点。电化学技术可对细胞生长发育以及细胞功能变化等方面提供相关信息。近年来，一系列电化学细胞传感器已用于对细胞的类别、浓度、活性、增殖、扩散、调亡及细胞内外分子的分布等的研究。电化学阻抗技术因其对细胞无创伤性及细胞在电极界面的高阻抗性而被用于研究细胞的生理学、形态学及细胞功能变化等。目前，用于构建电化学细胞传感器界面的材料主要有壳聚糖、纳米金、碳纳米管等生物相容性好的材料。chen等基于键合生物相容性的壳聚糖（cs）和具有良好导电性的碳纳米管（cnf）形成复合膜，控制电沉积形成的cs-cnf纳米复合物膜具有良好的生物相容性，可用于固定k562细胞。zhang等基于功能化碳纳米管（pdcnx）、硫堇（th）和纳米金（aunps），通过层层组装方式形成三维结构基底，制备了可用于评价细胞表面p-gp表达量的生物传感器。ding等在丝网印刷碳电极上电聚合聚苯胺，利用电聚合聚苯胺界面吸附细胞，通过测量细胞吸附后阻抗的变化研究和监测k562细胞的粘附和增殖；实验表明，细胞可以在聚苯胺界面生长增殖，说明聚苯胺具有良好的生物相容性。目前，利用聚苯胺纳米纤维（pani-nf）作为基底材料构建电化学细胞传感器界面尚未见报道。 图1 叶酸的分子结构fig1 structure of folic acid（fa）叶酸（fa），即维生素b9，是亲水性的小分子，其分子结构式如图1。叶酸受体（fr）被称作高亲和性叶酸结合蛋白，膜表面的fr可与fa特异性结合。fr在正常组织表达高度保守，而在大部分恶性肿瘤中高度表达, 有时比正常组织高100300倍。本研究将pani-nf与aunps复合形成纳米复合膜界面，在pani-nf/aunps界面上层层组装修饰上叶酸（fa），构建了新的传感界面电化学细胞传感器（图2）。以pani-nf为基底，具有高的比表面积和带正电荷，对aunps有较好的吸附能力，有利于界面修饰生物分子；同时用bsa封堵传感界面上空余的活性位点，提高传感界面的特异性识别能力，可应用于癌细胞的识别与检测，进一步应用于其它细胞功能性研究。2 实验部分2.1 仪器、试剂与材料chi660a电化学工作站（上海辰华仪器有限公司）；tecnai-10透射电镜（tem，美国philips公司）； autoprobe cp research原子力显微镜（afm，美国thermo microscopes公司）。苯胺、过硫酸铵（广州化学试剂厂），叶酸、谷胱甘肽、nhs、edc（ar，aldrich公司），其它试剂均为分析纯。实验用水为二次蒸馏水。磷酸盐缓冲溶液（pbs，ph 7.4，含有8 mmol/l na2hpo4, 1.5 mmol/l kh2po4，137 mmol/l nacl和27 mmol/l kcl）。hela细胞（中国科学院上海生命科学研究院细胞库）。人淋巴细胞和血红细胞由健康人外周血中分离获得。细胞培养所用培养液为rpmi1640（sigma公司）；新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）。rpmi1640培养基在使用前加入新生牛血清和双抗储备液（青霉素十链霉素），使血清的含量为10%，青霉素和链霉素的终浓度分别为100 u/ml和100 mg/l。2.2 复合膜修饰电极的制备制备聚苯胺纳米纤维和纳米金参考文献。取10symbolma l 0.2 g/l pani-nf溶液滴涂在新鲜玻碳电极表面，室温干燥后，浸入新制纳米金溶液（1012 mol/l）即得pani-nf/aunps纳米复合膜；将复合膜修饰电极在谷胱甘肽（5.0 g/l）溶液中反应后得gce/pani-nf/aunps/gsh；将此传感界面在15 mmol/l nhs/75 mmol/l edc存在条件下与叶酸（50 mmol/l）反应得gce/pani-nf/aunps/gsh/fa；用5 g/l bsa封堵空余的活性位点（图2）。每步处理后均用去离子水清洗，氮气吹干。2.3 hela细胞的培养取hela细胞置于含有10%胎牛血清、青霉素和链霉素的终浓度分别为100 u/ml和100 mg/l的rpmi 1640培养液中，在37 ，5% co2培养箱常规培养，隔天更换培养皿中的培养基。取对数生长期细胞进行实验，使用前加入胰蛋白酶消化液，消化后用pbs（ph 7.4）溶液反复清洗3次，然后用pbs溶液配制成一定浓度。实验前用细胞计数板确定细胞的浓度。2.4 hela细胞的特异性识别以及电化学检测取10symbolma l一定浓度的细胞悬浮液浸润pani-nf/aunps/gsh/fa-bsa传感界面，37 条件下孵育2 h，再将所得传感界面浸入pbs（ph 7.4）溶液2 min，除去传感界面上没有特异性识别的细胞。采用循环伏安法和电化学阻抗技术研究传感界面对hela细胞的捕获和特异性识别情况。2.5 afm研究电极界面的修饰过程以洗净的玻片为基底，按照2.2节的方法模拟电极修饰过程。在空气中用afm研究电极修饰过程界面形貌的变化情况以及修饰界面对hela细胞的识别情况。选用ul20b硅探针（硅探针的曲率半径小于10 nm），接触模式下对样品扫描成像。细胞用4%多聚甲醛处理20 min，再用pbs和去离子水清洗，4 干燥待测。所得数据用ip2.1软件处理。3 结果和讨论3.1 pani-nf/aunps复合物膜的tem表征用tem观察制备的pani-nf的形貌。由图3a可见,pani-nf呈均一的纤维状结构，其直径在5070 nm范围，分散性良好。由图3b可见，合成的aunps呈球状且大小均一，其直径约为15 nm。pani-nf浸泡在aunps溶液2 h后，aunps大量吸附在pani-nf表面（图3c和图3d）。这是由于在酸性介质条件下，合成的pani-nf带有正电荷，用柠檬酸还原法合成的aunps带有负电荷，aunps通过静电作用吸附在pani-nf表面。aunps的吸附一方面有利于增加传感界面的表面积，促进电子在溶液和电极间的传递；另一方面，aunps的引入有利于进一步在界面上修饰特定生物分子。图3 pani-nf（a），aunps（b）和pani-nf/aunps（c, d）的tem图fig3 tem characterization of pani-nf（a）, aunps（b） and pani-nf/aunps（c, d）3.2 pani-nf/aunps复合物膜界面的电化学性质以3/4为探针，对纳米复合膜的电化学性质进行研究。如图4所示，pani-nf和aunps引入到电极界面后，峰电流增加，峰电位差减少，这说明纳米材料对氧化还原探针有明显的电催化作用。 比较了纳米材料修饰前后电位扫描速度对峰电流的影响。在纳米复合膜界面上，氧化还原探针的峰电流与扫描速率的平方根成正比，说明此时电极表面反应动力学过程是受参与反应离子的扩散控制。对于可逆过程，由randles-sevcik公式 计算得电极有效面积a：ipc（2.69105）n3/2ad1/21/2c0（1）由n1，d6.5106 cm2/s，计算gce、gce/pani-nf和gce/pani-nf/aunps的电极有效面积分别为0.15, 0.24和0.27 cm2; 修饰电极的表面积约是gce的2倍，说明纳米材料增大了电极界面的有效面积。3.3 pani-nf/aunps复合膜界面叶酸功能化过程的电化学表征采用循环伏安法（cv）对复合膜界面叶酸功能化过程进行表征（图5）。在pani-nf/aunps复合膜界面， gsh与纳米金通过aus键结合，由于gsh为非电活性物质，降低了界面的导电能力，峰电流明显下降；其次，在生物偶联剂edc和nhs作用下，gsh的nh2与叶酸的cooh形成酰胺键，界面的导电能力和峰电流进一步下降；为减少细胞在界面上的非特异性吸附，用bsa封堵传感界面上未修饰的空余位点，bsa同样为非电活性物质，峰电流继续下降。将叶酸功能化传感界面用于特异性识别hela细胞，可观察到峰电流明显下降，表明hela细胞被成功捕获到传感器复合膜界面。采用电化学阻抗技术考察复合膜界面叶酸功能化过程阻抗的变化情况。如图6所示，当电极形成pani-nf/aunps复合膜后，氧化还原探针fe（cn）63/4 在溶液/电极界面上的电荷转移电阻rct明显减少，这同样是由于纳米材料的引入引起界面性质的变化。当gsh和fa偶联到界面后，界面rct显著增大，电化学阻抗值增大；bsa封堵未修饰传感界面上空余位点后，阻抗值进一步增大。将叶酸功能化复合膜界面用于特异性识别hela细胞，阻抗值增大，表明细胞被成功捕获到传感界面，eis结果与循环伏安法所得结果一致。以上实验结果表明，电化学阻抗技术和循环伏安法均能监测到传感器对hela细胞的特异性识别。比较两种方法，对hela细胞特异性识别后，循环伏安氧化还原峰形变差，峰电流值灵敏度下降；而电化学阻抗变化值明显。同时电化学阻抗测量过程中没有电流通过界面，对界面的生物分子和细胞无损伤作用。因此，本实验采用电化学阻抗技术对细胞的特异性识别和检测进行研究。3.4 细胞传感器复合膜界面afm的表征传感界面的层层修饰和分子组装可通过afm探测进行可视化表征。在pani-nf-nf/aunps复合膜界面修饰上gsh与fa后，界面粗糙度略有降低；平均高度明显增大（图7a7c）。将叶酸功能化复合膜界面用于特异性识别hela细胞，afm观察结果表明，细胞被成功捕获到传感界面（图7d）。3.5 叶酸功能化界面构建过程的实验条件优化及其对hela细胞的识别3.5.1 pani-nf膜厚度的优化 pani-nf膜的厚度决定aunps的吸附量，进而影响fa的修饰量。本实验改变pani-nf滴涂浓度，从而改变pani-nf膜的厚度。实验表明，低浓度pani-nf能够促进电子在溶液的电极间的传递，高浓度阻碍电子的传递。为了能吸附更多的aunps，同时得到最优的阻抗信号；综合考虑，取10symbolma l 0.2 g/l pani-nf滴涂在电极表面。室温干燥后再浸入新制aunps溶液（1012mol/l）2 h，即得pani-nf/aunps纳米复合膜界面。3.5.2 pani-nf/aunps复合膜修饰gsh时间的优化 考察pani-nf/aunps复合膜修饰gsh时间对阻抗信号的影响。结果表明，反应3 h后, 阻抗值变化趋于平稳。本研究中修饰gsh的时间选择为3 h。3.5.3 fa偶联时间的优化 在生物偶联剂edc和nhs作用下，gsh的-nh2与叶酸的-cooh发生偶联反应，当反应2 h后,阻抗值变化趋于平稳。本研究gsh与fa的偶联反应时间选择2 h。3.5.4 hela细胞特异性识别的作用时间 pani-nf/aunps复合膜界面修饰的fa与hela细胞表面大量表达的fr之间能够特异性的结合，从而达到识别检测癌细胞的目的。当hela细胞的浓度为5.0104 cells/ml，随着传感界面与hela细胞孵育时间的增加，阻抗值增加，2 h后，阻抗值趋于稳定，说明传感界面对hela细胞的识别捕获达到饱和。本研究选择2 h作为hela细胞特异性识别的时间。3.6 叶酸功能化传感界面对癌细胞识别的特异性为了考察叶酸功能化传感界面对癌细胞识别的特异性，比较了人淋巴细胞、血红细胞和hela细胞在传感界面识别后阻抗的变化情况。当传感界面与人淋巴细胞、血红细胞孵育后，界面阻抗未发生明显的变化，说明界面未能捕获到细胞；而传感界面与hela细胞孵育后，阻抗明显增加，表明所构建的叶酸功能化传感界面对hela细胞具有良好的特异性识别及捕获能力。3.7 叶酸功能化传感界面对hela细胞浓度的检测在优化实验条件下，将所构建的传感器对不同浓度hela细胞进行检测。如图8所示，随着hela细胞浓度的增加，阻抗值线性增大。以叶酸功能化传感界面的阻抗值为rct（0），以测得对应浓度hela细胞识别后的阻抗值为rct（c），以阻抗的变化值rct（rctrct（c）rct（0）对细胞浓度的对数值logccell作图，细胞在1.01046.4106 cells/ml浓度范围内与rct呈良好的线性关系，线性方程为rct2.41741056.2895103logccell，r0.9905；检出限可达2000 cells/ml（图8内插图）。用倒置显微镜观察修饰界面对不同浓度癌细胞的识别情况，随着癌细胞浓度的增加，界面上捕获的癌细胞的数目也随之增多。同时，这也说明阻抗的增加是由于界面上识别了更多的癌细胞引起的。本研究构建的传感界面能特异性识别表面叶酸受体超量表达的细胞；且与文献报道的电化学细胞传感器相比，具有较高的灵敏度（表1）。3.8 传感器的重现性、稳定性和再生利用构建的传感器连续10次测定2000 cells/mlhela细胞识别后的电化学阻抗谱，rct的相对标准偏差为1.9%，说明所构建的传感器具有良好的重现性。将构建的传感器放置4 冰箱保存备用，4 星期后传感器rct未发生明显变化，说明所构建的传感器具有良好的稳定性。用0.1 mol/l柠檬酸-氨基乙酸-盐酸（ph 3.0）溶液洗脱传感界面上已捕获的细胞。实验表明，细胞被洗脱后，与原修饰传感界面相比，阻抗未发生明显变化，说明所构建的传感器经处理后可以再生利用，且效果良好。references1 du d, liu s l, chen j, ju h x, lian h z, li j x. biomaterials, 2005, 26（33）: 648764952 du d, cai j, ju h x, yan f, chen j, jiang x q, chen h y. langmuir, 2005, 21（18）: 839483993 yan f, chen j, ju h x. electrochemistry communications, 2007, 9（2）: 2932984 cheng w, ding l, lei jp, ding s j, ju h x. anal. chem., 2008, 80（10）: 386738725 chen h, ding l, zhang x j, ju h x. anal. chem., 2007, 79（12）: 444244476 zhou y m， zhang x b, tan w h. sci. china chem., 2011, 54（8）: 121812267 shen q, you s k, park s g, jiang h, guo d d, chen b a, wang x m. electroanalysis, 2008, 20（23）: 252625308 jia x e, tan l, zhou y p, jiang x f, xie q j, tang h, yao s z. electrochemistry communications, 2009, 11（1）: 1411449 zhong x, bai h j, xu j j, chen hy , zhu y h. adv. funct. mater., 2010, 20（6）: 99299910 weng j, zhang z, sun l, wang j a. biosensors and bioelectronics, 2011, 26（5）: 1847185211 zhang j j, 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ju h x. electrochemistry communications, 2007, 9（6）: 13591364construction of electrochemical cytosensor based onpolyaniline nanofiber/gold nanoparticle interfaceand its application to detection of cancer cellwang hui1, wang tian2, ye yan-xia3, zhang ya-xing3,yang pei-hui*1,4, cai huai-hong1, cai ji-ye1,4（1department of chemistry, 2school of pharmacy, 3institute of tissue transplantation and immunology,4key laboratory of optoelectronic information and sensing technologies of guangdong highereducation institutes, jinan university, guangzhou 510632）abstract polyaniline nanofiber（pani-nf） was synthesized with diameters about 6080 nm. the polyaniline nanofiber/gold nanoparticle（pani-nf/aunps） nanocomposite was then fabricated with a simple electrostatic reaction between the presence of positive charges on the surface of pani-nf and the negatively charged of aunps. therefore, a novel electrochemical cytosensor w