（食品科学专业论文）固定化酶降解壳聚糖的研究.pdf

， 一 浙江人学硕i j 学位论史 固定化酶降解壳聚糖的研究 ，摘要 ，甲壳素是一利t 丰富的i 三i 然资源，足地球上仪次于纤维索的第一二人丰 富i 苛更新有机资源。壳聚枇是i f 壳素经脱乙酰化处理的产物。在j 1 1 壳素 壳聚糖大分子l 1 ，出于其分f 结构i i ，内外氢键的相互作用，形成了有序 的大分子结构，溶解性能很差。经过脱乙酰化处理生成的壳聚糖大分子 巾存在大量的游离氨基，使其溶w l l - ：f i k 大大改观，特别是分子量低1 ：l j 低聚壳聚糖，更由于其独特的的q - n i 舌性和物化性质，使壳聚糖的应 用范围大大加宽。 同壳聚糖大分子相比低聚壳聚糖具有一些独特的功能性质，这些性 质包括低聚壳聚糖良好的水溶性、保湿增湿性、抑菌抗菌作用、抗肿瘤 和免疫促进作用等。同寸山于低聚壳聚糖所特有的各种生理活性和功能 性质，使其在保健食鼎、生物医约、用化妆品、医疗诊断, l l u - 物生理 等方面具有独特的应用价值。 壳聚糖分子量通常在) l 4 一j 上开j ，若在适当的条件下，对其进行 降解反应，则能得到平均分子量小1 ：l 万的可直接溶于水的水溶性壳聚 糖。通过降解反应得到低聚水溶性壳聚糖的制备方法大致可分为酸降解 法、氧化降解法和酶降解法三大类。 利用各种降解方法对壳聚糖进行降解处理，都可以得到低聚水溶性 壳聚糖。酸降解法降解过程较难控制，所得降解产物的分子量范削很 宽。虽然这种方法早已用于工业化，j i 产，各种分子量范围的壳聚糖产品 都能得到。但要得到特定分予星范围且具有较高收率的壳聚糖产品还是 比较困难的；酸解过程引入了强酸，还会造成一定的环境污染。氧化降 滞f f f ：人1 坝i 。学t ) = 沦史 解法普遍采用了多种试剂进行降解反应或降解产物的后处理，这给，“品 的分离、纯化增添了闲难。川刘l ；，氰化降解方法在制备较岛分r 量 范幽( 1 万止右) 的壳聚槠，“l 川0 业为彳j 利。酶降解法降解条件温阐j ，反应 过程易于控制，易于得到所需分f - b 池刚的壳聚糖j “1 6 。但在选择合适 的酶利以适合工业化火规模生产_ j ：尚存在困难。 阎定化酶比游离酶具有l ：多j ：- “的技术优点，国内外已有很多j i j 壳 聚糖作为载体来固定化酶的 j | 。究报道，醣明以壳聚糖柬固定化酶是叨实 、 n j 行的技术：1 本实验选取较为廉价的：卅专性酶：木瓜蛋白酶、果胶酶 和纤维素酶，以壳聚糖为载休、戊：醛为交联剂来圈定化酶，探索湖定 化的最佳条件。然后用固定化木瓜蛋白酶、果胶酶和纤维素酶对蝉虾壳 聚糖进行降解并寻找降解反应的最佳条件，最后采取甲醇一丙酮溶剂分级 沉淀法剥降解产物进行料i 分离，从而得到低聚壳聚糖。 本实验说明用壳聚糖为载体、戊- 醛为交联剂来固定化木瓜蛋白 f 酶、果胶酶和纤维素酶是可行的且效率较高。i 酶活回收率分别达到 7 8 0 1 、8 2 5 3 和8 4 8 6 ，最佳阎载量均为2 5 m g g 壳聚糖。在固定化 条件的选择上，戊二醛处理温度均为室温，处理删间均以8 h 为宜，木瓜 蛋白酶和纤维素酶的固定化p i 以8 较好，而果胶酶固定化p 1 1 以7 较 好。 采用非专一性酶来降解壳聚糖，已有不少这方面的研究。但足采用 固定化非专性酶来降解壳聚糖的撇道还比较少见。本部分实验川阎定 化木瓜蛋白酶、果胶酶和纤维素酶来降解壳聚糖，以还原糖含量来测定 降解程度。结果说明用固定化木瓜蛋白酶和果胶酶降解壳聚糖的适宜条 件为反应p h 3 5 、温度5 0 。c ，吲定化酶：壳聚糖( w ：w ) 为8 ：l ；j 1 j 固定 化纤维素酶降解壳聚糖的适宜条件为反应p i n 5 、温度5 0 。c ，固定化酶： 壳聚糖( w ：w ) 为8 ：l 。固定化纤维索酶降解壳聚糖的效果明显要比固定 浙江人学坝 。学位论史 化木瓜蛋白酶柑果胶酶高得多，而果胶酶比木瓜蛋白酶略高些。三种固 定化酶都是在反应初期降解壳聚糖很快，4 小时后趋于缓和，8 小时厉趋 于稳定。三种固定化酶连续使川1 0 次( 每次1 2 j 、i l , j ) ，反应时间达到 1 2 0 小时，仍然还有活力；其f f 固定化纤维素酶活力下降更为迅速，连 续反应1 0 8 小时后还原糖含量就降到初始的半以下。 三种固定化酶降解壳聚糖1 0 小时后用甲醇一丙酮溶剂分级沉淀法柬 分离产物，固定化木瓜蛋白酶和粜胶酶的产咧组成类似，以组分a ( d p 1 6 ) 为主，没有组分c ( i ) 1 ( 8 ) ；而固定化纤维素酶的产物以组分 1 3 ( d i ) 8 1 6 ) 为主，没有组分a 。j 关键词：壳聚糖；固定化酶0 降解；小瓜蛋白酶；果胶酶；纤维素酶： 、，。 一 浙江人学坝i 学位论史 致谢 本论文是在导师吴汉民教授、陈有亮副教授的悉心指导下完成的。 在| ；i 一年半的学j = | 过程- l t ，陈老n j ( i i 学j = | 和生活各方面给予了我极大的 支持和无微不至的关怀，在他的督促f 顺利地完成了学习任务。在后 年半的课题研究过程t 1 吴老师严谨踏实的工作作风、实事求是的治 学风格和不断追求真理的学者风范，让弟子肃然起敬，也使我受益非 浅。论文的完成离坷i j f ：俩位导师的关怀和指导。 感谢宁波大学食一铺科学研究所的黄晓春、董叫敏和周湘池老j j l l i 坩我 在做课题过程f | _ l 极大的支持和帮助，特别是黄晓春老师帮助我解决了许 多凼难，在此表示衷心的感谢。还要感谢宁波大学食品科学 ：程系的张 芝芬、桑卫国、杨文鸽、工扬、翁佩芳、娄永江、裘迪红等老师在我做 实验过程中对我的帮助。 感谢浙江大学动物科学学院林嘉老师在学习和生活上对我的关怀和 照顾；感谢陈功师兄在各方面对我的帮助；还要感谢同窗好友张英君、 徐海军等人在学习生活上列我的帮助。 最后向参加本论文评阅和答辩的全体专家致以最诚致的谢意! 一文献综述 i j i 苦甲壳素( c h il i n ) 又名儿j 质、甲壳质、壳多糖、虫膜质、明 角壳蛋白、蟹壳素等，是一种维持和保护甲壳动物和微生物躯体的线 性氨基多糖，广泛存在r ：壮肢动物、软体动物、环：书动物、原生动物和 腔肠动物| j ，也存在于真菌和藻类t , j 匀l l 胞壁中，另外蚕蛹的壳i ，甲壳素 也f ；少”“1 “。甲壳素是一种丰富的舟然资源，是地球上仅次于纤维素的 第二大丰富可更新有机资源，每年全球生物合成近1 0 0 亿吨之多，在 蟹、虾、龙虾等水产品加工后的q i 壳废弃物中甲壳素的含量达到1 0 3 0 。甲壳素一般与蛋白质或碳酸钙或两者同时紧密缔合在一起形成一种 络合体。甲壳素的化学名为b 一( 1 ，4 ) - 2 一乙酰氨基- 2 - 脱氧一d 一葡聚糖，也 称为聚( n 一乙酰基d 一葡糖胺) 。山t ：- o h - o - 型及0 i _ n 一型氨键的作 用，使甲壳索大分子闯存在有序结构。甲壳索因晶态结构不同，有n 、 8 、y 三种晶型”。1 。n 一甲壳素具有紧密的组成，大多数结晶的多晶区 是逆平行( a n t 卜p a r a l l e ) 链状排列，b 甲壳素的多晶型是平行链状排 列，丽y 一甲壳素是两条链之间上一f 排列。 壳聚糖( c h i t o s a n ) 又称脱乙酰儿丁质、聚氨基葡萄糖、可溶性甲 壳素、粘性甲壳素，是由甲壳素经脱乙酰化反应转化变成的分子量为 1 2 5 9 万的生物大分子。壳聚糖的化学名为聚( 1 ，4 ) - 2 一氨基一2 一脱氧 0 一d - 葡聚糖。其分子链中因脱乙酰基不完全通常台有2 乙酰氨基葡萄 糖和2 一氨基葡萄糖两种结构单元，两者的比例随脱乙酰化程度而异。甲 壳素含有羟基，壳聚糖同时含有氨基和羟基，二者可通过其修饰反应形 成不同结构和不同性能的衍生物。化学名称为聚b 一( 1 _ 4 ) 一2 - n 一乙酰 基一d 一葡糖胺。甲壳素和壳聚糖的化学结构式如图1 所示。 ，一 浙f i ：人学埘 i 学位论艾 夺绎c | 4 2 0 h 花积n h 2 辞铃c h 2 0 h ( b ) 幽1 甲壳素( a ) 和先聚糖( b ) 的结构式 1 国内外利用甲壳素资源的历史和现状 作为甲壳质成分提取的研究，最早分离出甲壳质的是法国人 h 8 r a c o n n o t ，他于1 8 1 1 年首次从蘑菇中分离得到这种物质，并将其命 名为f u n g i n e 。1 8 2 3 年法国人a o d je f 又发现在昆虫的坚壳中也含有大 量的这种物质，并用希腊语改名为c h n i n 。1 8 5 9 年法国人c r e u g e t 用浓 k o h 处理甲壳质，使其脱乙酰化，得到能溶于有机酸的物质。1 8 9 4 年德 国人f h o p p e s e y l e r 将这种脱乙酰化的物质命名为壳聚糖c h i t o s a n 。 追溯甲壳质资源在医学上的应用，1 8 世纪美国印第安人用龟壳治疗创 伤，有促进伤口愈合的作用”1 。 浙江人学硕i 学他沦史 尽管甲壳质发现较早，但是人舰模的研究丌发利用还是本世纪8 0 年 代以后的事情。1 9 7 7 年诒：美波一i j 坝引) 门由m i ts e ag r a n dp r o g r a m 主办的第一届国际甲壳质、壳聚柑学术会议，1 9 8 2 q - ：f f 几冰召：_ j 1 ：了第二 届幽际会议，此后每两年召j 卜一次琢会议。近二l | j d f l - 来，国际，j 二的 研究突飞猛进，成果累累。从最初f j 乍产壳聚糖作为一般的污水处理剂 转变到高附加值的具有生物活性的新材料和新产品，在医药、生物工 程、食品、化妆品、农业等领域u 得到j 。泛应j ，已获得专利的产6 有 上盯种，如人造肾膜、防水农、植物生长凋：肖剂、及抗癌药物等“”。 人类利用甲壳资源始于中国，中国在古医一| 5 本草纲目1 1 就有记 载：蟹壳具有破瘀消积的助能，川j j 治疗淤血积滞、肋痛、乳痛、冻疮 等。中国近代研究起始于本世纪5 0 年代。自8 0 年代后期发展_ f | 分迅 速，至今我国研制的高科技产品有“人造皮肤”、“创伤愈合海绵”、 “免拆手术缝合线”、“庚肷灵”、“庚特肤生物敷料膜”等几十个品 利t ，作为保健食品她有十多种如“幽：多安”、“儿丁单糖”、“蛹之 宝”等。中国甲壳资源丰富，足1 1 - ：i “j 1 i 壳素及其衍生物的大闯，f j ij 。的 企业有一百多家，由乡镇企业逐步发展成现代化的海洋生物化工人型企 业也有j l - t 一家，并形成群体优势，遍佰沿海各地和四川等内陆，总产量 约有3 0 0 0 - - 5 0 0 0 吨。 2 低聚壳聚糖的性质和应用研究进展 2 1 低聚壳聚糖的性质 低聚壳聚糖( c h i t o o l i g o s a c c h a r i d e s ) ，从广义上来说，是指分子量 约1 0 0 0 0 以下、水溶性好的低分子壳聚糖：从狭义上而苦，是指聚合度 为2 1 0 的几丁寡糖( c h i t i nn l j g o s a c c h a r i d e s ) 或壳寡糖( c h i t o s a n 0 1 i g o s a c c h a “d e s ) 。同壳聚糖大分了相比低聚壳聚糖具有一些独特的功 ，v - - - _ 浙汀大学倾i 学他论史 能性质，这些性质包括低聚壳聚糖良女r 的水溶性、保湿增湿性、抑菌抗 菌作用、抗肿瘤和免疫促进作用等等。 2 1 1 水溶性 壳聚糖是含氮多糖类天然生物活性物质，在其大分子链结构中含有 大量的一n 也和一o l i 。当壳聚糖降解i | 、j ，其均分予量降低，壳聚糖分了内的 氢键作用随之减弱，使壳聚糖分厂r i ：溶液中具有更火的扩展趋势，从而 引起壳聚糖分子构象发生一定的变化。而链长度的缩短和分子构象的变 化使得壳聚糖在水溶液小的无序程度增加，分子链上游离- n i l ：水合作用 增强，从而使其水溶性能火为改善。低聚壳聚糖( m w l 5 0 0 ) 水溶性高达 9 8 8 8 ，而相对于壳聚糖其水溶性仪为6 8 4 。说明低聚壳聚糖的分子 大小是决定其水溶性高低的主要闪素”1 。 2 1 2 吸湿保湿性质 低聚壳聚糖分子中大量的一n l i ：和一0 | 强极性基团的存在，4 i 仪使低聚 壳聚糖的水溶性大为改观，也使其具有良好的吸湿保湿功能。夏文水等”1 研究表明：均分子量一定的低聚壳聚糖具有优于甘油和透明质酸的吸湿 保湿功能，且在一定的分子量范围内，随均分子量的降低，保湿增湿性 能逐渐增强；分子量为1 5 0 0 时吸湿和保湿能力最大，当分子量上升到 3 0 0 0 时，吸湿和保湿能力基本不变，然而当分子量达到5 0 0 0 时，吸湿 和保湿能力明显下降，各项指标仪为分子量3 0 0 0 时的一半。 2 1 3 抗菌抑菌作用 低聚壳聚糖具有明显的抗茵抑汹作用。夏文水等”1 通过对大肠杆菌 的抗菌抑菌活性的试验，证明壳聚糖的抑菌作用也是随着壳聚糖均分子 量的降低而逐渐增强的，尤以均分予鞋为1 5 0 0 左右的低聚壳聚糖的抗菌 效果最好：而且通过l 乙较实验，还b e i 抛了游离氨基的存在是壳聚糖抑菌抗 菌作用的基础。杨继生等“”研究表叫将低聚壳聚糖添加到酱油中，对引 _ _ p 浙江人学坝f 学位论史 起酱油变质的酵母菌群有明显的抑制作用，可以延长酱油的存放时间， 而不影响其口感、颜色、体态、香味与成分；证明酱油中添加0 1 的低 聚壳聚糖，在夏季敞开条件下，可存放3 0 天而无白花变质。余萍等“0 1 研 究了低聚壳聚糖对八叠球菌、枯草杆菌、大肠杆菌、放线菌。和金黄色 葡萄球菌生长的影响，发现低聚壳聚糖在0 5 条件下对5 种细菌有不同 程度的抑制作用。郑连英等1 研究发现对革兰氏阴性菌随壳聚糖的分子 量减小，抗菌作用逐渐增强，分子量为5 0 0 0 以下抗菌作用最强，其原因 主要是分子量越小，越容易进入细胞壁的空隙结构内，干扰细胞的新陈 代谢，以达到杀死细菌的。 2 1 4 抗肿瘤免疫促进作用 甲壳素、壳聚糖具有抗肿瘤免疫促进的生理活性“”“”，低聚壳 聚糖同样保持有这样的活性，而且活性更高，特别是聚合度为6 8 的壳 聚糖。1 9 8 6 年，s u z u k i 等“”通过对b a i 。b c 白鼠腹腔注射聚合度为4 7 的几丁寡糖发现腹膜渗出液的细胞( p e c ) 数量明显增加，p e c 主要由多形 核白细胞( p m n ) 组成，并认为p m n 表而存在n 一乙酰一d 一葡萄糖胺残基受 体，几丁寡糖和受体结合后激活p m n ，从而激活机体免疫系统，在抗肿 瘤、抗感染等方面显示重要作用。进一步研究发现，几丁寡糖通过激活 花生四烯酸代谢系统促进中性粒细胞对其产生趋化作用，且p g e 2 能加强 中性粒细胞对几丁寡糖的识别”1 1 9 8 5 年，s u z u k i 等“”就几丁六糖和壳六糖的抗肿瘤作用作了报道。 他们在移植了s 1 8 0 的d d y 鼠l i 分别静脉注射几丁六糖和壳六糖，结果七 天后发现产生明显的肿瘤细胞抑制作用：采用l o o m g k g d ，连续3 次， 抑制率分别为8 5 , n9 3 ；而增加至连续5 次时，则能完全抑制肿瘤生 长。同样，向移植了m m 4 6 实体瘤的c 3 h h e 鼠静脉注射几丁六糖和壳六 糖也产生明显肿瘤抑制效果，并发现几丁六糖和壳六糖无直接杀伤肿瘤 浙江人学坝i 学位论史 细胞作用。接着，s u z u k i 等。又做了一系列实验，证明儿丁六糖和壳六 糖对m e t h a 瘤细胞也有明显抑制作川j ，且以l o m g k g 时作用最强。并进 一步阐明作用机理，认为g l c n a c 或g l e n 残基与巨l 噬细胞表面受体结合 后，激活巨噬细胞释放l l 一1 ，同时引起t 细胞表面i l - 2 受体表达，而 这义加速了t 细胞成熟而释放i l - 2 ，j l 一2 与受体结合后，进一步j j l f 速t 细胞分化成熟为细胞毒性t 细胞，从而产生抗刖，瘤作用。1 9 9 0 年， o u c h i t 等研究发现3 个壳寡糖通过六皿甲基空问通道与5 一氟尿嘧啶 ( 5 一f u ) 共轭结合后，其抗肿瘤作用强f5 一f u ；并把该复合物注入p 3 3 8 淋巴细胞白血病小鼠的腥腔中，小鼠的生存时间延长；通过皮下注射应 用于m e t h a 纤维肉瘤或m h l 3 4 盯细胞癌小鼠，发现产生对肿瘤的生长抑 制作用。另外，目前国内也有低分予壳多糖应用于肿瘤放疗患者检测其 对免疫功能影响的报道。王中和等”“1 用低分子壳多糖口服液对临床患者 进行辅助治疗，结果发现自细胞、淋巴细胞的总数保持稳定，t 淋巴细 胞的数量显著上升，说明低分了壳多糖能调整机体免疫机能，减少放疗 对患者免疫功能的影响，有较好的抗肿瘤辅助疗效。而这些免疫指标的 研究再一次表明，其作用机理与细胞免疫密切相关。 2 2 低聚壳聚糖的应用 低聚壳聚糖所特有的各种生理活性和功能性质，使其在保健食品、 生物医药、同用化妆品、医疗诊断和生物生理等方面具有独特的应用价 值。 2 2 1 低聚壳聚糖在保健食晶万l j 的应用 低聚壳聚糖作为一种生物活性的天然商分子化合物，具有低甜度、 低热值、降血脂、降血糖等功效，而且无毒、无副作用。以低聚壳聚糖 为主要原料生产的生物保健品，不仅有利于人体肠内双歧杆菌的增殖， 6 浙江人学坝l j 学他论殳 同时可抑制肠内有毒菌和腐败物质的，e 成，增加人体内纤维素的质和 量、提高年l 体的免疫力。 低聚壳聚糖的保健功能并不限于某些特定的器官，而是可作用于人 体全身。甲壳素的基本单位n 一乙酰丛葡萄糖也是构成人体的重要物质一 透明质酸的组成单元，与人体有很好的亲和性，不会对人体产生排斥作 用。目前，各国以壳聚糖为主要原料的生物保健品已有几十种之多，其 中大多数都是壳聚糖大分子产品。如n 本研制的“救多善”和中国青岛 药物研究所研制的“喜多安”的分子量约为1 0 5 ；上海伟康生物保健品公 司生产的“蛹之宝”的分子量约为1 0 。，而以分子量为1 0 3 、特别是分子 量为1 5 0 0 灰右的低聚壳聚糖来，卜产有特定功效的保健食品则品种较少。 鉴于人体对壳聚糖产品的吸收是通过人体中的生物酶降解后吸收的，低 分子量的壳聚糖产品更有利于人体的快速吸收“。 甲壳低聚糖具有柔和甜味，可作为食品素材加以利用。坂井“”研究 了肠内细菌利用甲壳低聚糖的情况，发现不同菌株对不同甜度的甲壳低 聚糖都有不同程度的吸收，因此f l 壳低聚糖有望作为乳酸菌的增贿促进 剂应用于食品领域。壳寡糖也具有增谩人体免疫力的作用，有希望在改 善食品结构、提高食品保水性能方面有重要应用。目前，同本三荣二r = 业 公司和甲刚化学公司已推 i 甲壳低聚糖、壳寡糖产品，作为保健食品或 食品添加剂售：大连爱宝生物技术有限公司也有低分子水溶性壳聚糖 产品而市。 2 2 2 低聚壳聚糖在生物医药方而的应用 低聚壳聚糖在生物医药方面的重要用途之一是利用低聚壳聚糖的抑 制肿瘤作用来制取抗癌药荆，低聚壳聚糖特别是低聚6 8 糖可通过活化 人体一f 的淋巴细胞、抑制癌细胞的繁殖和扩散来达到抗癌抑痛作用”。 浙 j ：人学坝i 学位沦史 癌细胞的形成伴随大量癌毒素的释放，此毒素会降低人体j f l i | f ir i 的 铁质，使人贫血、食欲减退，i n f 氐聚壳聚糖在人肠内形成的小分子基团 会很容易被肠所吸收，从而抑制癌葱素在体内的释放；同时，壳聚糖作 为一种良好的聚电解质，能很好地吸i f f 在m 管壁细胞的表面，从而i j - 抑 制癌细胞的转移。 低聚壳聚糖可有效地活化人体淋巴细胞，增强人体抵抗病菌的能 力。人体t ”的淋巴细j 胞如n k 、l a k 具有分辨n j 常细j 胞、杀死病菌细胞的 效能，从而使人具有免疫能力。淋i , f l l l 胞的生理活性与其周围环境的p h 值有很大的关系，以p i 值稍显碱性为最佳。通常癌细胞的周围为酸性， 而低聚壳聚糖上的氨基碱性基团i j j 适当调节体内的p | l 值，并通过这利调 节作用改变机体处于病态时的生物化学平衡，_ j j j 强淋巴细胞的生胖活 性，从i 面划癌细胞的繁殖进行抑制”“。 采用适当的降解方法将壳聚糖降解为低聚产品，分离制备以壳聚糖 低聚6 8 糖为主的抗癌口服药剂及注射针剂等是很有应用价值的一项研 究 作，如能尽快实现经济规模t 、l p 化生产，将是广大癌症患者的福 音。 另外，均分子量在1 5 0 0 左右f t j f l 聚壳聚糖对治疗骨病也极有疗效， 其药理活性与它在骨组织中能提岛碱性磷性酶的活性有很大关系”。同 本m i n a m i ”等人也验证了低聚壳聚糖对伤口愈合有显著作用，因此有望 成为未来的医用品。 低聚壳聚糖保持了壳聚糖大分_ 所具有的其他功能性质，包括降胆 固醇、降血压、防治糖尿病、强化盯脏机能、治疗烧、烫伤等”。 2 2 3 低聚壳聚糖在化妆品方面的应用 低聚壳聚糖在化妆品方而的应用主要是利用其优良的保湿增湿性 能。低聚壳聚糖本身具有成膜功能，又具有良好的透气性能，是种强 浙江人学坝i + 学位论文 的吸湿剂与保湿剂，与传统的保混增湿剂相比，低聚壳聚糖的保湿增湿 效果更佳，在沈面奶及各类膏、霜一i 一使用更显其优越性。 护肤化妆品最重要的性能之一是凋湿作用，即化妆品的保湿增湿作 用，通常护肤品的有效性就是依据3 e 调湿能力而苦的。在护肤化妆品中 添加一定量的低聚壳聚糖，既可以防止化妆品配方中水分的逸失，又可 以对表皮水分进行水合，从而起到增湿保湿作用。而且低聚壳聚糖良好 的透气性又不干扰表皮对废物和毒索的排泄，不会造成皮肤粉刺。如含 有适量低聚壳聚糖的面膜弹性好、对皮肤具有明显的滋润及保护作用。 其他添加低聚壳聚糖的护肤产品也有易被皮肤i 吸收、促进血液循环的作 用1 。 因为低聚壳聚糖分子量较小，较之大分子壳聚糖更易于被皮肤所i 吸 收、促进血液循环，以此制成的膏、霜类化妆品可通过毛孔等直接渗入 皮肤内部甚至于细胞内部，起到凋理、保护、滋润皮肤的功能。本开 发了油包水乳剂化妆品，是在乳酸溶液中用壳聚糖酶于3 7 。c 降解壳聚糖 8 h ，制得壳聚糖寡糖，然后用4 8 壳聚糖寡糖与表面活性剂、油、多 元醇或水制得乳剂化妆品。这种用低聚壳聚糖制得的高级化妆品具有良 好的柔软性和保水性”。 低聚壳聚糖特别是壳聚糖寡糖与乳酸、柠檬酸、山梨醇、香料等成 分制成的护肤霜具有抑制皮肤表面黑素生成的良好功效。”1 。壳聚糖与葡 萄糖、二甲胺甲硼烷在甲醇一乙醇介质中反应得到葡萄糖取代的壳聚糖， 可用于制备固发胶o “；配以硬脂酸、单酸甘油酯等可得到对皮肤护理有 特殊疗效的洁面乳”“；配以羊毛脂等可制得雪花膏，产品不发粘。”。 2 2 4 低聚壳聚糖在医疗诊断上的应用 溶菌酶作为消炎剂在医药上应用广泛，食品中用作防腐剂，溶菌酶 存在于人的血、尿中，当有某利一疾病h - j 病人则显示出高于正常值，利用 9 _ ， 浙江人学坝i 学位论义 这一特性，使低聚壳聚糖衍生物应川f 溶菌酶活性的临床渗断或医药、 食品的质量检验部门。有人* u f t j 低聚壳聚糖能被溶菌酶分解的性质，使 儿丁四糖与对硝基酚或4 一甲基一7 一羟基香豆素反应，合成了带有发色 基团的衍生物，将其作为溶菌酶的培养基进行应，1 j 实验”。 2 2 5 低聚壳聚糖在生物生理的应i i j 低聚壳聚糖对植物生长、分化及生物体抗御方面具有信息传达活 性，低聚壳聚糖( g i u n ，) 对植物病原菌有抗菌活性，并能诱导豌豆产生抗 菌物质豌豆素，在瓜茁中，低聚壳聚糖引发甲壳质酶的活性，南瓜产生 乙烯也与低聚壳聚糖对酶活性有诱导作用有关，低聚壳聚糖还能提高 小麦悬浮培养液中胞内外过氧化酶的活性。低聚壳聚糖( g l u n a c 。) 对老鼠 有显著的免疫机能亢进效果和抗癌活性，在家兔静脉内注入低聚壳聚糖可 提高其血浆溶菌酶活性”“。 a s a o 等。研究表明，低分子量的壳聚糖对植物具有生理调节作用， 并制成植物生长调节剂。d o m i n i q u e 等”的研究表明几丁寡糖和壳寡糖 在植物中可作为激活儿丁质酶的诱导物，最小的活性单位为六聚或七聚 d 一葡萄糖。几丁质酶可将感染的真菌或无脊椎动物病原体细胞壁或外骨 骼中的几丁质或壳聚糖降解为至少4 个1 3 一n 一乙酰氨基葡萄糖或脱乙酰 化的残基构成的寡聚糖片段，这些寡糖片段诱发植物防御素，从而起到 对外敌自我防御作用，特别是聚合度较高的寡糖具有阻碍病原菌生长繁 殖的功能。另外，几丁寡糖与壳寡糖还能调节植物基因的关闭与丌放， 促进植物细胞的活化，刺激植物生长”。 胡健等”研究了平均分子量5 0 0 2 0 0 0 的壳寡糖对棉花炭疽病菌 ( m a c r o p h o m i n ap h a s e d i n a ) 和小麦赤霉病菌( f u s a r i u mg r a m i n e a f u m ) 等 植物病原真菌和水稻白叶枯病菌( x a n t h o m o n a so r y z a e ) 、马铃薯环腐病 菌( c l a v i b a c t e rm i c h i g a n e n s i s ) 、棉花角斑病( x a n t h o m o n a s 浙江人学埘+ 学位论殳 c a m p e s t r i s ) 等植物病原细菌生长的影响。结果表明：不同分子量的壳寡 糖对各种植物病原细菌的生长及植物病原真菌孢子萌发形成菌丝体均有 明显的抑制作用，抑制作用的大小因壳寡糖分子量、浓度、植物病原菌 的不同而有差异。 几丁寡糖和壳寡糖是双歧杆菌促生长因子( b j f i d u s f a c t o r ，b f ) 的一 种重要种类，它们调节动物肠道内微生物的代谢活动，改善肠道微生物 区系分布，促进双歧杆菌生长繁殖，从而提高机体免疫力，使肠道内p h 下降，抑制肠道有害菌生长，产li j 族维生素，分解致癌物质，促进肠 蠕动，增进蛋白质吸收。大量实验表明，双歧杆菌通过分泌到细胞外各 种酶来分解利用不同的b f ，并促进其l 长繁殖；而有一些b f 是通过蛋 白质类的粘附素来产生利用的，因为粘附素可使肠道上皮细胞与双岐杆 菌连接在一起。但对于b f 与双歧杆菌的空阳j 作用机理及双歧杆菌优先作 用寡聚糖促进其生长的内在机制报道尚少，还有待进一步研究“。 综上所述，低聚壳聚糖以其独特的各种功能性质，在食品、医药、 化妆品、医疗诊断和生物生理等方而具有广泛的用途，尽管目前的技术 限制还没有使其形成一个舰模产业，但伴随着越来越多的国家和研究机 构在低聚壳聚糖的降解制备及应川方面的大力研究，必将使低聚壳聚糖 产品的丌发与应用得到迅速的发展。 3 低聚壳聚糖制备研究进展 壳聚糖的分子量通常在几十万到 二百万，虽然它能溶于包括醋酸、 稀能酸、氯乙酸等多种稀酸溶液叫i ，但不能溶于水。若在适当的条件 下，对其进行降解反应，则能得到均分子量小于l 万，能够直接溶于水 的水溶性壳聚糖。通过降解反应得到低聚水溶性壳聚糖的制备方法大致 可分为酸降解法、氧化降解法及酶降解法三大类。 浙江人学顾l ：学位论文 3 1 酸降解法 壳聚糖很容易溶于稀酸溶液中，而要用酸剥壳聚糖进行降解反应以 制备低聚水溶性壳聚糖，必须强化其反应条件。早在本世纪5 0 年代就有 人用酸对壳聚糖进行降解，得到了低聚水溶性壳聚糖。目前，已有多种 以酸为主要反应试剂的降解壳聚糖的方法。 3 1 1h c i 降解法 用酸和碱将壳聚糖纯化后，：j i l 入浓盐酸溶液进行降解反应。反应4 8 h 后溶液在真空瓶中冷却，然后， 】乙醇洗涤、浓硫酸真空干燥制得聚合 度小于1 0 的产品壳聚糖盐酸盐( c s i i l o ；n h c i ) 。；若反应时间达到7 2 h ，则可得到其单糖一盐酸豁。刚这种方法得到的低聚水溶性壳聚糖一盐酸 盐的分子量分前i 比较宽”7 ”1 。 3 1 2 酸亚硝酸盐法 壳聚糖溶于乙酸或盐酸稀溶液r i ，然后加入皿硝酸盐( 如n a n 0 2 ) 进 行降解反应：或是先将壳聚栅分散j 二讵硝酸盐的水溶液中，然后在室温 下慢慢将一定浓度的酸加入进行反应。反应2 4h 后，用碱调溶液的 p h 值为5 6 ，经净化分离得到降斛产物。利用该法可制备均分予量为 2 0 0 0 3 0 0 0 、分子量分和相对狭窄的低聚水溶性壳聚糖。 将壳聚糖溶解在5 a c o h 和0 0 5 n a n o z 水溶液中，反应温度控制 在4 c ，反应2 小时，然后用n h 3 h 2 0 中和，并加入n a b h 4 进行处 理，常温搅拌1 2 小时即可制得具有2 ，5 脱水甘露糖醇基团的低聚壳聚 糖”。 3 1 3h 2 s 0 4 一h c l 降解法 将9 5 h 2 s 0 4 和h c i 水溶液混合，加入壳聚糖，搅拌，6 0 。c 反应2 小时，然后通入氯化氢气体，再加入n a o h 反应1 5 小时，由此可制得水 溶性，分子量为5 0 0 0 的低聚壳聚糖”“。 浙江人学i l ! i | i ：学位论义 3 1 4 过醋酸法 用商品过醋酸或以浓硫酸为催化剂，用h 2 0 ：先将醋酸酐( a c 2 0 ) 氧化 成过醋酸( c h 3 c o o o h ) ，加入到壳聚撕的乙酸溶液巾进行降解反应。利 用这种方法制备的低聚水溶性壳聚拼n “品具有可以长期保存的优点，特 别适合于食品及化妆品用低聚水溶性壳聚糖的生产。 3 1 5 h f 降解法 是用无水h f 在2 0 ( 2 降解壳聚糖，反应后冷却冷却到0 。c ，过滤， 再用一7 0 * ( 2 的乙醚洗涤沉淀，可得到聚合度为2 1 0 的低聚壳聚糖，其平均 聚合度依赖于反应的时问和温度”。 酸降解法是壳聚糖降解制备低聚水溶性壳聚糖的一种较好的方法， 利用这种方法可分离得到低至单糖的各种低聚壳聚糖。其降解反应所用 试剂廉价易得，易于实现产业化。但是寡聚糖产量较低，并且由于酸水 解产生大量的d 葡糖胺，使得分离过程非常复杂，而且环境污染严重。 3 2 氧化降解法 氧化降解是目前研究得比较多的一种壳聚糖的降解方法，其中t t 2 0 2 氧化法更是有大量的文献报道，较有代表性的几种氧化降解法如下。 3 2 1h ，o 。氧化法 将壳聚糖溶于1 的乙酸溶液中，在催化剂存在下，加入适量h 2 0 ： 溶液，调节溶液的p h 值为3 5 进行降解反应：也可以在碱性溶液中反 应，调节壳聚糖溶液的p h 值为l 1 5 ，温度7 0 。c 左右，分批加入一定量 3 5 i 筘jh 2 0 ：溶液进行降解反应眦5 ”。 卢风琦等”研究了在酸性条件fh 2 0 ：对壳聚糖的氧化降解反应，结 果表明为制备分子量小于5 0 0 0 0 的壳聚糖，采用h 2 0 。浓度2 ( w v ) ，反应温度6 0 ，时删l 2 h 比较合适；若要制备分子量为 浙江人学硕j ：学位论文 1 0 0 0 0 左右的壳聚糖，可采用h 2 0 ：3 、反应温度8 0 、反应时问2 3 h 的反应条件。 覃彩芹等“7 1 研究表明制备分_ 毓5 j 以上的壳聚糖产品在6 0 7 0 、h 2 0 。用量比小于o 2 5 的中性体系中就可以完成；而制备分予量在 1 5 - - 5 万之i 、日j 的壳聚糖，采朋反应温度7 0 4 c 、h 2 0 ：用量比为o 5 1 5 、 介质为水的条件较适宜；盐酸体系有利于制备分子量7 0 0 0 左右的壳聚 糖；要得到水溶性产物：可以使朋2 醋酸或水两种介质。因此通过选择 反应条件，可制备特定分子量范围的壳聚糖。 3 2 2 h 2 0 ：n a c i o2 法 在o 0 0 4 i o 的n a c i oz 及0 0 1 3 5 0 的h 2 0 。溶液中如j 入适 量盐酸进行降解反应，反应在8 0 。c 进行l h 后，用n a o h 中和，再经 n a b h 处理后可得到均分子量为6 0 0 的低聚水溶性壳聚糖”。 张文清等”研究了n a o c i h 2 0 。胁同氧化制备壳寡糖的适宜工艺条 件，即用0 6 m o l 摩尔配比为0 2 5 的n a o c l h 2 0 ：协同氧化剂氧化降解 6 0 9 壳聚糖，反应p h 为6 ，温度为5 5 。c ，时间8 h ，可使9 8 的壳聚糖 转化为壳寡糖。 除了上面所述的儿种h 2 0 ：氧化法外，其他的氧化法还有n a b o 。 法。该法是将壳聚糖与n a b o 。在水溶液中进行非均相降解反应，得到无 色或略带微黄色的低聚水溶性壳聚糖产品。这种降解方法的最大优点是 降解反应是通过丌裂壳聚糖的b 一( 1 ，4 ) 糖苷键来进行的，反应前后的一n h 。 含量无任何变化。这几种氧化降解方法，从目前研究进展来看，还只能 得到分子量较高的降解产物，其均分子量大约为l 5 万。 3 3 酶降解法 浙江人学坝i 擘位沦史 酶法降解是用专一性酶或非专性酶对壳聚糖进行生物降解而得到 均分子量较低的低聚壳聚糖。酶法降解过程通常优于化学反应降解过 程，这是山1 二酶法降解过程和降解广：物的分子量分靠更容易被控制，从 而可以便利地对降解过程进行监控，得到所需一定分予量范围的低聚壳 聚糖。而且，酶法降解是在较温和的条件下进行的，相对于其他两剃方 法，酶法降解不需要加入大量的反应试剂，对环境污染较少。目前，已 发现有3 0 种左右的专一性或非争一性酶可用于壳聚糖的降解反应，从而 生成各种分子量的低聚壳聚糖。这螳酶包括专一性降解酶如壳聚糖酶： 非专一性降解酶如脂肪酶、溶菌酶、蛋白酶、聚糖酶等。 3 3 1 壳聚糖酶”7 ” 壳聚糖酶( c h i t o s a n a s e ) 主要存在1 二真菌细胞中。若控制一定的条件， 利用壳聚糖酶对壳聚糖大分子进行降解，则可方便地得到低至二至一h 糖 的水溶性壳聚糖，甚至单糖。p e r k i n s 等6 5 i 利用芽孢杆菌属壳聚糖酶对其 降解壳聚糖的水解性能进行了研究，得到了低分子量的降解产物； t a k i g u c h i t “j 使用芽孢杆菌属1 is p 7 一m 株得到的壳聚糖酶进行降解反 应，成功地得到了二至五糖的低聚壳聚糖；i z u m i 等i 引l 用b a c i l l u ss p n o 7 m 产生的壳聚糖酶降解部分乙酰化的壳聚糖，然后用离子交换树脂分 离，获得二至五糖，其中三、四糖含量非常高，收率高达6 0 。由此可 见，壳聚糖酶是降解壳聚糖的很好的方法，特别是在制备聚合度比较小 的低聚壳聚糖时，更显出其优越性。 3 3 2 糖转移法 糖转移法是建立在酶反应的基础上的，糖转移法是利用低聚合度寡 糖在酶参与作用后，延长糖链成为高聚合度的寡糖。单纯的酶反应合成 较商聚合度的低聚糖比较用难，坂井等巧妙地利用某些甲壳质酶所具有 的糖转移性，成功地以较好的收率合成了具有生理活性的n 乙酰基六糖 浙江人学坝1 学位沦史 和n 。乙酰基七糖，即使用来自诺 氏放线菌或木霉属具有高的糖基转移 功能的甲壳质酶，使二糖链发生连接反应，得到六糖的白色沉淀。同 样，以五糖为基质可合成七糖。此法不仅能调节聚合度。还可以通过对 基质的精心设计合成一些特殊结构的低聚糖衍生物。但此法只能用来制 备甲壳质低聚糖，而不能制备壳低聚糖“”。 3 3 3 溶菌酶 溶菌酶( 1 y s o z y m e ) r 泛存在于鸡蛋蛋白及人的唾液中，其中从鸡蛋蛋 白中提取的溶菌酶之转糖苷化能力较强，而从人的唾液中提取的溶菌酶 裂解p ( 1 ，4 ) 糖苷键的能力较强”“。结果表明，溶菌酶在一定条件下可 有效地降解壳聚糖且初始速度很快，反应1 0 r a i n ，v d p ( 粘度降解百分 率) 即可达5 5 。若先对壳聚糖的乙酸溶液进行适当的处理，再出溶菌 酶在3 7 c 进行较长时f n ( 6 天? i 彳i ) 的降解，则经分离可得到较高收率的二 至p q 糖产物“。 溶菌酶存一定条件下对壳聚特的降解为低聚壳聚糖作为口服保健品 提供了有力的保证，人体口腔唾液中所含有的大量溶菌酶，可使壳聚糖 口服液很快发生生物降解，有利于人体的吸收。 3 3 4 脂肪酶 脂肪酶( 1 i p a s e ) 是作用于水有机界而上不溶性物的脂酶。最近几年， 脂肪酶对于壳聚糖的降解反应已引起一些研究者的兴趣。夏文水等”7 ” 使用麦胍脂肪酶对壳聚糖及其衍生物的水解作用进行了研究。麦胍脂肪 酶在微酸性条件下能非常有效地使壳聚糖及其衍生物降解，这种酶能在 几分钟内快速降低壳聚糖粘度，使壳聚糖平均分子量降低，形成无任何 偏向的分子量组分。p a n t a l e o n e 等人刃i 利用来自猪胰腺的脂肪酶( l i p a s e a l e ) 对壳聚糖的非专一性水解作片j 进行了研究。通过对降解产物的粘度 分析可知：在一定的蛋白质与壳聚糖比率下，粘度降解百分率v d p 可达 浙江人学碳j ：学位论文 到1 0 0 。这些研究结果表明，脂肪酶对壳聚糖的降解效率很高，有必要 对其产业化的可能性进行进一步的研究。 3 3 5 其他非专一性水解酶 壳聚糖和纤维素都足山d 葡葡糖经聚合形成的以糖苷键连接起来的 同多糖化合物，由于结构j 二的槲似一陀，它们对于壳聚糖的降解作用应该 也是相似的。p a n t a l e o n e 等”7 1 就纾维素酶和一些其他酶在一定条件下对不 同均分子量壳聚糖溶液的降解作用的研究证明了这点：( 1 ) 对于较低粘度 的壳聚糖溶液，一些聚糖酶( g l y c a n a s e ) 对壳聚糖有显著的降解作用，其中 纤维素酶( c e l l u l a s et v 、c e l l u l a s ea p ) 和i 果胶酶( p e c t i n a s e l 的v d p 可达 9 9 ，半纤维素酶( h e m i c e l l u l a s e ) 的v d p 为9 3 ，淀粉酶( a m y l a s e ) 年l l 葡聚 糖酶( d e x t r a n a s e ) 的v d p 为7 0 8 0 。( 2 ) 对于较高粘度的壳聚糖溶液， 试验所用的3 8 种酶中v d p 在6 0 1 0 0 的有1 7 种，v d p 在2 0 6 0 的有1 2 种，还有9 种酶只有轻微的降解作用或完全没有降解作用 ( v d p 为o 1 5 ) 。其中仍以聚糖酶的降解效率最高，木瓜蛋白酶( p a p a i n ) 和单宁酶( t a n n a s e ) 也显示了较强的降解能力。m u r a k i 等m o 进行的研究得 到了与p a n t a l e o n e 的研究成果相似的结论。y a l p a n i 等人的研究结果表 明：在一定的酶与底物比率下，半纤维素酶具有比甲壳素酶( c h i t i n a s e ) 及 溶菌酶更好的降解能力；各种酶降解所适宜的p h 值是不同的，纤维素 酶为4 5 ，木瓜蛋白酶为3 0 4 0 ，半纤维素酶为3 5 ；各种酶适宜的降 解温度亦有差别，一般为3 0 6 0 。 z h a n g 等”“用纤维素酶、a 淀粉酶和蛋白酶组成的混和酶来降解脱 乙酰度为7 6 的壳聚糖，采用膜分离的技术来分离低聚壳聚糖，可得到 聚合度为3 1 0 的壳聚糖。 总之，酶降解法制备低聚水溶性壳聚糖的研究是非常有意义和有前 途的，特别是由此能得到较高收率的六至八糖更是在食品及医药方面有 浙江人学碳i 学位论文 着广泛的用途。但要以经济成本进行大规模工业化生产，还需要进行更 深入的研究。 3 4 其他降解方法 除了上面介绍的酶解法、氧化降解法以及酸解法外，还有一些方法 也可以用于壳聚糖的降解，如微波法”、超声波法“”1 、y 一射线辐射 法阳”等。超声波法降解壳聚糖，壳聚糖的n h ：含量不随降解时间而变 化，但用超声波处理过的壳聚糖溶液的粘度会随存放时间的增加而减 小。微波降解壳聚糖可以使甲壳素脱乙酰化反应与壳聚糖降解反应同时 进行，这样降低了甲壳素脱乙酰化过程的碱用量，缩短了反应时删，可 有效地降低生产的成本。胡地等采川y 射线辐照分子量为4 5 0 k d 天然壳 聚糖溶液，结果表明：降解产物粘均分子量及还原糖分子量随着辐照强 度及辐照时f 、日j 的增加而减小，并且降解产物分予量的均一程度随着辐照 剂量的提高而提高。 综上所述，利用各种降解方法对壳聚糖进行降解处理，都可以得到 低聚水溶性壳聚糖。酶降解法可特异地、选择性地切断壳聚糖的e ( 1 ，4 ) 糖苷键，降解条件温和，反应过程易于控制，易于得到所需分 子量范围的壳聚糖产品。但在选择合适的酶种以适合工业化大规模生产 上尚存在困难。酸解法是非特异性的降解过程，降解过程较难控制，所 得降解产物的分子量范围很宽。虽然这种方法早已用于工业化生产，各 种分子量范围的壳聚糖产品都能得到，但要得到特定分子量范围且具有 较高收率的壳聚糖产品还是比较困难的；酸解过程引入了强酸，还会造 成一定的环境污染。氧化降解法目l j 发展得比较快，不断有新的氧化降 解方法见诸报道，特别是在f i 本，把这种方法应用于工业化生产，已有 多利，壳聚糖保健食品上市。不过，氧化降解法普遍采用了多种试剂进行 浙江人学坝i j 学位论文 降解反应或降解产物的后处理，这给产品的分离、纯化增添了困难。相 剥j i 苦，氧化降解方法在制各较高分子量范围( 1 万左右) 的壳聚糖产晶时 更为有利。总之，利用降解反应以制备低聚水溶性壳聚糖用于保健食 品、药物、化妆品等方面的生产足- i i ：常有d i 途的一个研究课题。e u ， 大多数的降解方法还只是处于实验室研究阶段，要最终实现产业化大生 产、产生显著的社会经济效益，还必须在其降解机理、降解效率、降解 产