不同生长条件下黄连主要生物碱的积累动态研究优秀毕业论文 参考文献 可复制黏贴.pdf

分类号 华中农业大学硕士学位论文 密级 不同生长条件下黄连主要生物碱的积累动态研究 a n a l y s i so ft h em a i n a l k a l o i d sa c c u m u l a t i o no fc o p t i su n d e r d i f f e r e n tgr o w t hc o n d i t i o n s 研究生：李沛 指导教师：王学奎副教授 指导小组：王沫 李再云 刘焰 姚明镜 专业：植物生理学 获得学位名称：理学硕士 教授 教授 副教授 副教授 研究方向：药用植物生理 获得学位时间：2 0 11 年6 月 华中农业大学植物科学与技术学院 二。一一年六月 “ l 。i 独创性声明及使用授权书 不同生长条件下黄连主要生物碱的动态积累研究 目录 摘要i a b s t r a c t i 1 前言1 1 1 黄连概述1 1 2 黄连药用研究l 1 3 黄连栽培研究进展3 1 4 高速逆流色谱分离黄连中的生物碱5 1 4 1 生物碱的概述5 1 4 2 生物碱分离方法与技术5 1 4 3 高速逆流色谱的概述6 1 4 4 黄连中有效成分的分离与鉴定7 1 5 研究目的及意义8 1 6 研究内容和范围8 2 研究方法8 2 1 试验区概况8 2 2 试验材料9 2 3 试验设计及施肥方法9 2 3 1 试验设计9 2 3 2 施肥方法1 0 2 4 样品采集与处理1 1 2 4 1 样品的采集1 1 2 4 2 样品的处理1 1 2 5 测定项目与方法1 1 2 5 1 黄连根茎中有效成分的分离与鉴定1 1 2 5 2 可溶性糖含量的测定1 2 2 5 3 全氮含量的测定1 2 2 5 4 酪氨酸含量测定12 华中农业大学2 0 11 届硕士研究生学位论文 2 5 5 黄连总生物碱含量的测定13 2 5 6 黄连生物碱四种主要生物碱含量测定1 3 2 6 数据处理一1 4 3 结果与分析1 4 3 1 黄连生物碱的分离与纯化鉴定1 4 3 1 1 黄连生物碱的分离1 4 3 1 2 生物碱组分的薄层色谱鉴定。1 5 3 1 3 生物碱组分的h p l c 鉴定1 5 3 2 不同施肥水平对黄连主要生理生化指标的影响1 7 3 2 1 不同施肥水平对黄连植株可溶性糖含量的影响1 7 3 2 2 不同施肥水平对黄连植株全氮含量的影响2 2 3 2 4 不同施肥水平对黄连植株碳氮比的影响2 6 3 2 5 不同施肥水平对黄连植株酪氨酸含量的影响2 9 3 2 6 不同施肥水平对黄连植株总生物碱含量的影响- _ 3 3 3 3 不同施肥水平对黄连植株生物碱组分含量的影响一3 8 3 3 1 不同施肥水平对黄连植株小檗碱含量的影响：3 8 3 3 2 不同施肥水平对黄连植株巴马汀含量的影响4 2 3 3 3 不同施肥水平对黄连植株表小檗碱含量的影响4 5 3 3 4 不同施肥水平对黄连植株黄连碱含量的影响4 7 4 小结与讨论5 0 4 1 不同施肥水平对黄连主要生理生化指标的影响。5 0 4 2 不同施肥水平对黄连植株总生物碱含量的影响5 2 4 3 不同施肥水平对黄连植株生物碱组分的影响5 2 参考文献5 5 附录6 2 致 射。7 3 不同生长条件下黄连主要生物碱的动态积累研究 摘要 黄连( c o p t i sc h i n e n s i s f r a n c h ) ，为毛茛科( r a n u n e u l a e e a e ) 多年生阴性常绿草本植物。 分布于北半球温带，大约有1 8 种，且多数分布于亚洲东部。因其根如连珠而色黄， 故名。黄连是以干燥的根茎入药，是最常见的中药之一。黄连制剂用途广泛，主要 具有清热燥湿、泻火解毒之功效。黄连主要产于重庆，湖北，四川等地。近年主要 产于湖北利川、重庆石柱，两地有“黄连之乡之称。多年来对黄连的研究主要在 药用植物化学，药理学，资源学，临床等方面，对黄连栽培技术的研究较少。 长久以来，黄连的栽培都是以林下为主，近年来逐渐发展起来的旱地栽培所体 现出来的增产效益很显著。目前湖：l l ，禾1 ) 1 1 药农对黄连进行大规模种植但栽培管理比 较粗放。本试验在湖北利川箭竹溪分别选取水稻田、生荒地、旱地栽培黄连，采用 3 1 1 4 设计进行分别施肥处理。分析不同处理下黄连生物总碱及其各分碱动态积累的 规律，探讨不同田块条件下黄连高产优质栽培模式及配方施肥技术，为今瓞孽的1 ；o 奄_ ； 优质栽培提供技术参考。 。 本研究对黄连主要生物碱：表小檗碱、黄连碱、巴马汀、小檗碱，进行分离、- 、激拿，- 提取。以及在不同田块，不同施肥水平下，黄连地上部和地下部主要生物碱的动态 一_ 。一。： 积累，及其主要生理指标：可溶性糖含量、全氮含量、c n 比、酪氨酸含量进行测 。 定。结果如下： 一 ，t 一 1 栽培于水稻田的黄连地上部和生荒地黄连地上部、地下部在9 月份至1 1 月 份再到次年3 月份之间其可溶性糖含量先升后降。栽培于水稻田地下部和旱地黄连 地下部在此时期内可溶性糖含量持续下降。 2 栽培于3 种不同田块一水稻田、生荒地、早地的黄连在6 月份至次年3 月份 之间且在1 1 月份之前其地上部、地下部的全氮含量呈下降趋势，3 月份的全氮含量 上升。 3 栽培于3 种不同田块一水稻田、生荒地、早地的黄连的地上部、地下部不同 施肥水平c n 比在1 1 月份之前呈上升趋势，1 1 月份至次年3 月份之间呈下降趋势。 4 3 种不同田块栽培的黄连地上部、地下部在6 月份至次年3 月份之间，其酪 氨酸含量呈持续上升趋势。 5 稻地黄连地上部、地下部的总生物碱含量在1 1 月份之前呈上升趋势，在1 1 月份之后呈下降趋势。生荒地、旱地地上部、地下部在9 月至次年3 月份期间其总 华中农业大学2 0 11 届硕士研究生学位论文 生物碱含量整体呈下降趋势。 6 栽培于水稻田、生荒地黄连植株的小檗碱含量在9 月份至次年3 月份期间呈 下降趋势；稻地黄连、荒地黄连地上部巴马汀含量此期间先降后升，其地下部的先 升后降；稻地黄连、荒地黄连地上部的表小檗碱含量在9 月份至次年3 月份之间呈 上升趋势而其地下部的在此时期内各施肥处理下均值呈下降趋势；稻地黄连、荒地 黄连于9 月份、1 1 月份、3 月份3 次取样的黄连碱含量均呈下降趋势，而稻地黄连 地上部、地下部在6 月份至9 月份其所含黄连碱含量呈上升趋势。 关键词：黄连；黄连生物碱；不同田块；施肥水平 i i 不同生长条件下黄连主要生物碱的动态积累研究 a b s t r a c t c o p t 豇c h i n e n s i si sa h e r b a c e o u ss h a d ep l a n to ft h eb u t t e r c u pf a m i l y a b o u t18s p e c i e s h a v eb e e nf o u n da tp r e s e n t , w h i c hd i s t r i b u t e di nt h en o r t h e r nh e m i s p h e r et e m p e r a t e r e g i o n s ，a n dm o s to ft h e md i s t r i b u t e di ne a s ta s i a 1 1 1 es h a p eo fc o p t 西r h i z o m ei sl i k e y e l l o ws t r u n gb e a d s ，s oi t sc a l l e dh u a n g l i a n t h ed r i e dr h i z o m eo fc o p t i sc h i n e n s i si s o n eo fm o s t l yu s e dc h i n e s et r a d i t i o n a lm e d i c i n a lh e r b s n l ep r e p a r a t i o n sf r o mc o p t i s r h i z o m e sw e r ew i d e l yu s e df o rc l e a r i n ga w a yh e a t , r e s o l v i n gd a m p n e s s ，p u r g i n gf i r ea n d d e t o x i f i c a t i o ne ta 1 c o p t & c h i n e n s 括b a s i c a l l yo r i g i n a t e di nc h o n g q q i n g ，h u b e i ，s i c h u a n , e t c i nr e c e n ty e a r s ，i t sm a i n l yc u l t i v a t e di nl i c h u a no fh u b e ia n ds h i z h uo fc h o n g q i n g ， b o t ho ft h e mw e r ef a m o u sf o r t h eh o m e t o w no fc o p t i sc h i n e n s i s ”f o rm a n yy e a r s ，t h e r e s e a r c ho fc o p t 括c h i n e n s i sw a sm a i n l yf o c u s e do nt h em e d i c i n a l c h e m i s t r y , p h a r m a c o l o g y , r e s o u r c e sa n dc l i n i c a la p p l i c a t i o ne t c 1 1 h ec u l t i v a t i o no fc o p t 8c h i n e n s 括 h a dal o n gh i s t o r y , b u tt h ew o r ko nc u l t i v a t i o no fc o p t i sf o rh i g hy i e l da n dq u a l i t yi sv e r y l i t t l e i nal o n gt i m e ，t h ec o p t i sc h i n e n s i sw a sm a i n l yc u l t i v a t e du n d e rt h ef o r e s tl a n d n e r e s e a r c ho fc o p t 括c h i n e n s i sc u l t i v a t e du n d e rd r yl a n dg o ts u c c e s si nr e c e n ty e a r sa n d m a d ean o t a b l ee c o l o g i c a le c o n o m i cb e n e f i t l i c h u a no fh u b e ii st h eb i g g e s ta r e af o r c o p t 西c u l t i v a t i o n , b u tt h em a n a g e m e n t ，e s p e c i a l l yi nf e r t i l i z a t i o n ，i sc o m p a r a t i v e l y e x t e n s i v e s ow es e l e c t e dt h r e ek i n d so fl a n ds u c ha sr i c ef i e l d ，u n c u l t i v a t e dl a n da n dd r y l a n dt oc u l t i v a t ec o p t 括c h i n e n s 捃i nj i a n z h u x io fl i c h u a n ，c o m b i n e d 谢mt h ef o r m u l a f e r t i l i z a t i o n sb a s e do nt h e 3 414 e x p e r i m e n t a ld e s i g nt os t u d yt h ed y n a m i ca c c u m u l a t i o n o ft h et o t a la l k a l o i d sa n dt h em a i nc o m p o n e n t s ，i no r d e rt og i v es u g g e s t i o n sf o rh i g h q u a l i t yo fc o p t 括c h i n e n s i sc u l t i v a t i o na n df e r t i l i z a t i o nu n d e rd i f f e r e n tk i n d so ff i e l di n t h e f u t u r e t h ee x t r a c t i o no ft h et o t a la l k a l o i d sa n ds e p a r a t i o no ft h em a i nc o m p o n e n t so fc o p t 括 c h i n e n s i sf r a n c ha n dt h ea c c u m u l a t i o nc h a r a c t e r i s t i c so ft h em a i nc o m p o n e n t ss u c ha s e p i b e r b e r i n e ，b e r b e r i n e ，p a l m a t i n ea n dc o p t i s i n ei nt h ea b o v e g r o u n da n du n d e r g r o u n d p a r t so fc o p t 西c u l t i v a t e di nd i f f e r e n tt y p eo ff i e l d sa n dd i f f e r e n tf e r t i l i z a t i o n ，t h em a i n p h y s i o l o g i c a li n d e x e ss u c ha st h ec o n t e n t so fs o l u b l es u g a r , t o t a ln i t r o g e n , c nr a t i o ， t y r o s i n ea n dt h em a i nc o m p o n e n t sh a v eb e e nd o n ei nt h i sp a p e r t h em a i nr e s u l t sa r ea s f o l l o w s ： 1 1 1 1 ec h a n g eo fs o l u b l es u g a ro ft h ea b o v e g r o u n do fc o p t 捃c u l t i v a t e di nr i c ef i e l d ， a n db o t t lo ft h ea b o v e - a n du n d e r - g r o u n dp a r t so fc o p t 括c u l t i v a t e di nu n c u l t i v a t e dl a n d i i i 华中农业大学2 0 1 1 届硕士研究生学位论文 s h o w e d 距i n v e r t e d “v ”s h a p ec u r v ed u r i n gt h ep e r i o df r o ms e p ，2 0 10t om 弛2 011 b u t t h es o l u b l es u g a ro ft h eu n d e r g r o u n dp a r t so fc o p t 括c u l t i v a t e di nr i c ef i e l da n dd r yl a n d d e c r e a s e dd u r i n gt h i sp e r i o d 2 t h ec o n t e n t so ft o t a ln i t r o g e no fc o p t & c u l t i v a t e di nr i c ef i e l d ，u n c u l t i v a t e dl a n d a n dd r yl a n ds h o w e dat r e n dt od e c r e a s ef r o mj u n ，t on o v , 2 010 ，a n da ni n c r e a s i n gt r e n d w a sf o u n df r o m n o v , 2 0 1 0t om a r ，2 0 1 1 3 2 t h ec nr a t i oo fc o p t 西c u l t i v a t e di na n yo n eo ft h et h r e et y p e so ff i e l d s i n c r e a s e df r o mj u i l ，t on o v , 2 0 1 0 ，a n dd e c r e a s e df r o mn o v , 2 0 1 0t om 甄2 0 11 4 t h ec o n t e n t so ft y r o s i n eo fc o p t 括c u l t i v a t e di na n yo n eo ft h et h r e et y p e so ff i e l d s i n c r e a s e df r o mj u n ，2 0 10 t om 鸸2 0 11 5 t h ec o n t e n t so ft o t a la l k a l o i d si na b o v e - o ru n d e r - g r o u n dp a r t so fc o p t & c u l t i v a t e d i nr i c ef i e l dr i s e df r o mj u n ，t on o v , 2 0 1 0 ，a n dd e c r e a s e df r o mn o v , 2 0 1 0t om 瓯2 0 1 1 t h et o t a la l k a l o i d si na b o v e o ru n d e r - g r o u n dp a r t so fc o p t 括c u l t i v a t e di nu n c u l t i v a t e d a n dd r yl a n dd e c r e a s e do v e r l yf r o ms e p ，2 0 1 0t om 2 0 1 1 6 t h ec o n t e n t so fb e r b e r i n es h o w e dat r e n do fd e c l i n ed u r i n gt h ep e r i o df r o ms e p ， 2 010t om 瓯2 011 t h ec o n t e n t so fp a l m m i n eo fa b o v e g r o u n dp a r t so fc o p t 括c u l t i v a t e d i nr i c ef i e l da n du n c u l t i v a t e dl a n dd e c r e a s e da tt h ee a r l ys t a g ea n di n c r e a s e dl a t e rd u r i n g t h i ss a m e p e r i o d ，a n dt h ec o n t r a r yt r e n dw a sf o u n d i nt h ev a r i a t i o no f p a l m a t i n ec o n t e n ti n t h eu n d e r g r o u n dp a r t s t h ec o n t e n t so fe p i b e r b e r i n eo ft h ea b o v e g r o u n dp a r t so fc o p t i s c u l t i v a t e di nr i c ef i e l da n du n c u l t i v a t e dl a n ds h o w e dat r e n do fi n c r e a s ed u r i n gt h ep e r i o d f r o ms e p ，2 010t om a r , 2 011 ，t h ec o n t e n t so fe p i b e r b e r i n eo ft h eu n d e r g r o u n dp a r t s d e c r e a s e dd u r i n gt h i sp e r i o d ，t h ec o n t e n t so fc o p t i s i n eo ft h ea b o v e o ru n d e r - g r o u n d p a r t so fc o p t i sc u l t i v a t e di nr i c ef i e l da n du n c u l t i v a t e dl a n ds h o w e dat r e n do fd e c r e a s e d u r i n gt h ep e r i o df r o ms e p ，2 0 10t om 2 011 ，a n dt h ec o n t e n t so fc o p t i s i n eo fc o p t 西 c u l t i v a t e di nr i c ef i e l di n c r e a s e dd u r i n gt h ep e r i o df r o mj u n ，2 010t os e p ，2 011 k e y w o r d s ：c o p t i sc h i n e n s i sf r a n c h ；a l k a l o i d so fc o p t 括；d i f f e r e n tf i e l d s ；f e r t i l i z a t i o n i v 不同生长条件下黄连主要生物碱的动态积累研究 1 月i j 舌 1 1 黄连概述 黄连为毛茛科多年生阴性常绿草本植物。分布于北半球温带，大约有1 8 种，且 多数分布于亚洲东部。因其根如连珠而色黄，故得名。株高1 5 - - 2 5 c m 。根茎常分枝， 密生多数须根。常分枝成簇生状，形如鸡爪，节多而密，生多数须根，单枝根茎长 3 - 6 c m ，直径长0 3 0 8 c m 。表面黄褐色或黄灰色，粗糙，且有不规则节状隆起、须 根及与须根残基复叶基生，有的节间表面平滑如茎秆，习称“过桥”。上部多残留褐 色鳞片，顶端常带有残余茎或叶柄。质硬且断面不整齐，皮部橙红色或暗棕色，木 部呈鲜黄色或橙黄色，呈放射状排列，髓部有的中空。叶片卵状三角形，3 5 全裂， 裂片再作羽状深裂。春季开黄绿色花，2 歧或多歧聚伞花序，花3 8 朵。每年春末 夏初结果。种子为褐色，长椭圆形。 据史书记载，黄连最早出现在东汉的神农本草经，且被列为上等品，据统计一一一 1 部宋代之前古代方书之中有3 2 万多方剂，含“黄连的方剂有1 7 6 0 种，即约 。_ 5 的方剂之中有黄连。本草纲目记载：今虽吴、蜀皆有，惟以雅州、眉州者为。槲一1 、。4 毫a _ - ”! = 良。药物之兴废不同如此。大抵有二种，一种根粗有珠，如鹰鸡爪形而坚实，色深 。 ：1 黄；一种无珠多毛而中虚，黄色稍淡，各有所宜。即今“味连、“雅连 。我国黄连 ，_ _ k i _ ；一 主要有三个品种，分别是毛莨科植物黄连、三角叶黄连、云南黄连。分布于湖北、 四川、云南、陕西、甘肃、湖南、贵州等地。其中以四川栽培面积最大，为我国西 南部地道药材，约占全国总产量的7 0 一8 0 ，销全国各地，且有出口。黄连是我国 保护植物。近年主要产于湖北利川、四川石柱，两地素有“黄连之乡 之称。 1 2 黄连药用研究 黄连是以“苦”而著称的中药材，性寒且味苦。从古至今都是我国百姓治病祛 火的良药。李时珍认为：“黄连入手少阴心经，为治火之主药：治本脏之火，则生用 之；治肝胆之实火，则以猪胆汁浸炒；治肝胆之虚火，则以醋浸；治上焦之火，则 以酒炒；治中焦之火，则以姜汁炒；治下焦之火，则以盐水或朴硝炒；治气分湿热 之火，则以茱萸汤浸炒；治血分块中伏火，则以干漆水炒；治食积之火，则以黄土 炒。”( 李经纬，2 0 0 1 ) 金张元素云：“其用有六：泻心脏火，一也；去中焦湿热， 二也；诸疮必用，三也；去风湿，四也；治赤眼暴发，五也；止中部见血。”名医 华中农业大学2 0 1l 届硕士研究生学位论文 别录谓黄连：“主五脏冷热，久下泄游脓血。”本经谓其主“肠游腹痛下痢 等， 均说明黄连有较好的止痢之效。是历代医家倍受青睐的中药之一。 黄连是一种古老抗菌药。根据全国中成药品种目录的统计，以黄连为原料 的中成药就有1 0 0 多种。现代研究表明黄连的药用成分主要是小檗碱( b e r b e r i n e ) ，含 量达1 0 左右，以盐酸盐形式存在。因最早发现它具有抗菌、抗病毒功效，传统上 一直作为清热解毒与抗感染药物，主要用于治疗肠道细菌感染性疾病。近几年来， 随着临床药理学不断深入研究，陆续发现其还有抗心律失常、改善充血性心力衰竭、 扩张冠状动脉、降血糖、降血脂、抗血小板凝集、利胆、抗肿瘤等功效，从而被广 泛地应用于心律失常、心力衰竭、糖尿病、高脂血症、高血压、抗血栓形成、治疗 慢性胆囊炎、神经衰弱、防治癌症等的治疗( 席国萍等，2 0 0 9 ) 。 黄连中的药用成分为生物碱，其种类达十种左右，但不同类型的黄连药用成分 种类存在较大差异。黄连根茎含小檗碱( b e r b e r i n e ) 、表小檗碱( e p i b e r b e r i n e ) 、黄连碱 ( c o p t i s i n e ) 、甲基黄连碱( w o r e n i n e ) 、小檗红碱( b e r b e r r u b i n e ) 、掌叶防己碱( p a l m a t i n e ) 、 非洲防己碱( c o l u m b a m i n e ) 、药根碱( g a t r o r r h i z i n e ) 、木兰花碱( m a g n o f l o f i n e ) 、阿魏酸 ( f e r u l i ca c i d ) 、黄柏酮( o b a k u n o n e ) 、黄柏内酯( o b a k u l a c t o n e ) 。三角叶黄连根茎含小 檗碱、表小檗碱、黄连碱、甲基小檗碱、药根碱、木兰花碱。云南黄连根茎含小檗 碱、掌叶防己碱、药根碱、黄连碱、甲基黄连碱、木兰花碱( 崔学军，2 0 0 6 ) 。其主 要的有五种生物碱，包括小檗碱、药根碱、黄连碱、表小檗碱和巴马汀。其中小檗 碱含量最高，药根碱最低。其含量一般表现为：小檗碱 黄连碱 巴马亭 表小檗 碱 药根碱。 不同品种与产地也是影响中药黄连生物碱组分的重要原因，不同种黄连属植物 在主要组分上有一定差异。黄连中表小檗碱及黄连碱含量较高，而云南黄连、峨眉 黄连不含表小檗碱。非洲防己碱为黄连、三角叶黄连、峨眉黄连所共有，而云南黄 连不含。几种黄连根茎小檗碱含量范围为：黄连3 6 0 1 1 4 9 ，三角叶黄连为 3 0 2 7 0 3 ，云南黄连为5 4 0 8 7 7 ，峨眉黄连为3 9 2 7 3 6 。就其平均含量 来看，云南黄连最高，黄连最低( 张莉等，2 0 0 6 ) 。 随着应用黄连的热潮，上个世纪8 0 年代，我国与日本学者对黄连的研究逐渐深 入，且与发展黄连生产密切相关的栽培技术、野生资源的保护、药材的质量等方面 也取得了一定进展。随着国际上天然药物的广泛应用，尤其是日本对黄连解毒汤的 2 不同生长条件下黄连主要生物碱的动态积累研究 深入研究与大量应用，更增加了我国黄连出口量。近年来，黄连及复方的药理不断 深入，药理机制陆续被发现，新药理与新试剂在临床中得到广泛应用，人们开始关 注中药黄连及黄连属植物。有研究表明，黄连叶片、花薹以及须根中也含有小檗碱， 只是低于根茎的小檗碱含量。一般黄连茎叶中含小檗碱约0 3 ，且在老叶中的含量 较高；须根中的小檗碱含量为1 0 7 ；种子内小檗碱含量为o 2 3 ( 方忻平等，1 9 8 9 ) 。 中国药典( 2 0 1 0 版) 指出黄连的质量指标是其盐酸小檗碱的量不少于5 5 ，由 于黄连根茎以外副产物中的小檗碱含量相对较低且入药困难，但可以作为提取其它 生物碱( 如巴马汀、药根碱等) 的原料或用于兽药而加以利用，其地上部茎叶中的 天然色素还可作为日用化工原料，与此同时也可避免带有病原菌的黄连植株由于自 然返田而产生对后茬作物的危害。 1 3 黄连栽培研究进展 黄连栽培历史已有3 0 0 余年，自清代之后，栽培规模逐步扩大，其主要栽培品 种为：黄连、三角叶黄连、云连分别习惯称为“味连”、“雅连 、“云连”。味连， 由于其栽培技术成熟，产量高且适应性广，目前约占全国黄连市场的9 8 以上，成一_ 嚣 为黄连中药市场的主流品种。作为中草药的黄连及制剂的广泛使用，很多学者深入。懒只? 研究了黄连属植物的分类、形态、生药鉴定、药理以及化学成分以后，开始发展对 。f 黄连栽培技术的研究，且在该方面取得了长足的发展。 + 帅舢辅 黄连属植物仅仅分布于秦岭以南各省区，而且对环境条件要求较高。黄连生长 于海拔5 0 0 至2 0 0 0 m 处的山林地下或山谷阴处；三角叶黄连生长于海拔1 6 0 0 至 2 2 0 0 m 处山坡林下，野生植株现在已不多见；云南黄连生于海拔2 0 0 0 至3 0 0 0 m 的 林下，由于生长缓慢，且采挖过度，现已危及其种源；峨嵋黄连是我国特有植物， 仅分布于四川局部的地区，生长于海拔1 0 0 0 至1 7 0 0 m 荫蔽悬岩陡壁上的植株同益 减少处于绝灭的边缘；短萼黄连常生长于海拔6 0 0 至1 6 0 0 m 沟谷林下阴湿地或溪涧 岩隙间，资源日趋的减少( 杨俊宝等，2 0 0 5 ) 。在野生资源逐渐减少的情况下，一些 地区开展了黄连属植物的引种栽培。据统计，黄连主产区渝东、鄂西两地，栽培面 积达3 3 万k m z 以上，年产量1 5 0 多万k g 。有研究对短萼黄连进行了人- r 三j 1 种栽培 的试验，对其生活习性、形态特征、生物学特点等进行了研究，并对引种栽培的目 的与意义进行了探讨。指出人工引种栽培短萼黄连，不但能为中医药持续提供药材， 而且还能够保护短萼黄连野生资源不致绝灭( 吴发旺等，1 9 9 8 ) 。 华中农业人学2 0 1 1 届硕士研究生学位论文 黄连喜凉爽但不耐高温，3 2 以上的高温可以抑制黄连的生长从而产生夏季休 眠。在低海拔的南京引种黄连实验表明：成苗在8 5 郁闭度下，能经受3 2 3 5 c 的 持续高温和4 1 以上的短暂高温( 陈震，2 0 0 2 ；潘清平，2 0 0 1 ) 。 黄连生于高寒山地阴湿处。土壤多为富含腐殖质的黄壤、山地红壤、棕壤、暗 棕壤等。黄连属植物性喜温凉、湿润、陡坡环境，适宜种植在荫蔽凉爽、湿润、肥 沃、透气和排水好的腐殖土中，应及时除草，以防杂草生长，忌高温、干旱和强光 直晒。 西南地区是我国利用野生植物提取黄连素的主要产区。目前主要用三棵针的根、 茎、叶片作为提取原料，但含量低，因国内外对黄连的巨大需求，以及人工栽培品 种的药效未得到人们全部的肯定，从而进一步加大了对野生资源的需求。人为的过 度采挖及旅游开发等，使其自然生境遭到了破坏，目前黄连属植物野生资源已经极 其少，加之植株生长缓慢，长期只挖不栽，处于濒临灭绝的边缘。因此，国内黄连 属植物6 种1 变种除分布于台湾的五叶黄连外其它已全部列入重点保护植物名录。 近年对不同产地和品种黄连的生物碱进行了测定( 刘岱等，1 9 9 7 ) ，结果表明： 异地( 保山、峨眉) 引种的黄连小檗碱含量不及北岸味连( 开县) 的一半，故小檗 碱含量可作为评价味连质量的标准，且黄连不同产地药材中小檗碱含量差异大于种 间的含量差异。不同品种与产地的药材，其巴马汀和药根碱的含量差异不大，故在 药材道地性评价时含量指标需要作多种生物碱比较和选择。研究表明，不同生态环 境、不同生育状态、不同品种均对生物碱的含量有显著影响( 庄平等，1 9 9 4 ) 。对生 物碱含量高的种类除应加强对其种质资源的研究和保护外，亦可作为黄连引种栽培、 种质选育基因库的优良资源。要保证药材质量的可靠性与可控性，必须选择优良种 质并进行规范化栽培，判定药材种质的首要指标为其有效成分的含量。 在药材引种栽培过程中，适当施用无机化肥，在增加产量的同时，还可以提高 药物药用成分的含量。利用山地风化砂研究黄连的氮、磷、钾营养状况及其对产量 和药用成分的影响。证明氮、磷、钾等缺乏都大大影响黄连植株的正常生长，叶片 硝酸还原酶的活性和根茎小檗碱的含量都很低。尤其是缺氮植株生长最差，死苗也 多；缺磷、缺钾植株长新叶少而小，缺钾植株新根生长少且易衰老( 张丽萍等，1 9 9 8 ) 。 同时还研究了不同氮素营养水平对黄连生长的影响，证实黄连根茎形成最高有效成 分时所需的供氮水平较黄连植株旺盛生长所需求的氮水平低( 杨俊宝等，2 0 0 5 ) 。 4 不同生长条件下黄连主要生物碱的动态积累研究 恩施利川土家族地区早在上世纪中期就有种植黄连的习惯，一度成为高山地区 ( 建南、团堡、汪营、凉雾等乡镇) 农村经济的重要收入来源。黄连喜高山冷凉、荫 湿的气候环境，忌强烈直射光，尤其幼苗期最怕强光直射。因而人工栽培必须搭棚 遮荫，要求透光度为1 5 左右，而且对光的需求随栽培年限的增加而增长。与传统 毁林种植黄连相比，黄连的人工搭棚种植杜绝森林破坏，减少水土流失，涵养了水 源，保护了生态环境。人工栽培管理精细，单产与品质大大提高，促进了黄连栽培 效益的提高，增加了药农收入。种植模式的创新与推广，增加了黄连种植面积，加 快了地道中药材板块基地建设步伐( 胡波等，2 0 0 9 ) 。近几年来，通过推广大田全覆 盖栽培，利川箭竹溪高山地区黄连种植面积逐年增加。 1 4 高速逆流色谱分离黄连中的生物碱 1 4 1 生物碱的概述 生物碱( a l k a l o i d s ) 是存在于自然界中的一类天然含氮的碱性有机化合物，有类 似碱的性质，因此过去称为赝碱。生物碱是人类最早研究的动、植物有效成分，分；， 。 o 鱼觑， 布广泛于植物中。较常用的4 0 0 多味来源于植物，至少有4 0 多味中药含有生物碱， 和# i 而且多是主要的活性成分。自1 8 0 6 年德国学者f w s e r t u r n e r 从鸦片中分出吗啡碱 i t t 以来，迄今已从自然界分出1 0 0 0 0 多种生物碱。其中大多数有复杂环状结构，氮素 。“也磁 大多包含在环内，有明显的生物活性。生物碱具有光学活性。有些源于植物而不含 碱性的含氮有机化合物，有显著的生物活性，故仍属于生物碱。主要分布于1 0 0 多科植物中，以双子叶植物最多，且较集中分布于防己科、罂粟科、夹竹桃科、毛 莨科、豆科，马钱科、茄科等植物中；在单子叶植物中分布少。主要分布在兰科， 百合科、石蒜科，禾本科等中；动物中也发现有生物碱的存在。生物碱而有些来源 于天然的含氮有机化合物，如某些维生素、氨基酸、肽类，习惯上又不属于“生 物碱”。生物碱广泛分布在植物界，其中许多重要的植物如黄连，益母草、贝母、 黄柏、麻黄、鸦片、乌头、秋水仙、延胡索、洋金花、苦参、长春花，三尖杉等都 含有生物碱成分。 1 4 2 生物碱分离方法与技术 一般用于纯化的方法其可析出生物碱的结晶用重结晶法；生物碱的挥发性可用 水蒸气蒸馏法；容易升华生物碱用升华法提取得到单体。由不同沸点组而成的液体 华中农业大学2 0 11 届硕士研究生学位论文 总生物碱，可通过常压或者减压分馏进行分离。很多生物碱的盐比游离碱更易于结 晶。因而，可利用其溶解度在各种溶剂中的差异进行分离，然后再转变成游离碱。 色谱法：色谱法是利用混合物组分在固定相中吸附与分配系数的细微区别，达 到分离各组分的目的。其优点在于分离效率高，能分离各种性质极相似的组分，之 后分别进行定量，因此是一类常用、发展最快且重要的分离手段，该方法在一些用 传统分离方法难以分离的物质及热敏性物质具有明显的优越性。对于极性较大的生 物碱和苷类生物碱，也可用葡聚糖凝胶与反相色谱进行分离。 树脂吸附分离技术：一种有效分离有效成分的技术方法即为树脂吸附。大孔吸 附树脂是一类有机高聚物吸附剂，具有多孔网状结构与较好吸附性能。使用大孔吸 附树脂对中药材或中药复方制剂中的药用成分进行定量、定性检测时，可有效除去 某些干扰物质，而取得很好的效果。在提取中草药药用成分而用大孔吸附树脂其优 势明显。 超滤法：超滤法是一种以超滤膜为分离介质的膜分离技术方法。有分离不同分 子量分子的功能。操作方便简单且不消耗任何溶剂为超滤法优点所在。总生物碱纯 度虽然较低，但超滤液能直接结合阴离子交换树脂从而对生物碱进行进一步分离纯 化，减少了分离纯化过程中许多中间的步骤，而且总生物碱纯度高，树脂污染小。 超临界萃取技术：超临界流体萃取技术即基于超临界流体的优良特性发展起来 而被列为中药药效最佳提取分离技术，具有精馏与液一液萃取特点，操作参数极易 于控制且溶剂可循环的使用，尤其适合分离热敏性物质。 层析法也广泛用于生物碱分离与纯化。大多数采用的是吸附层析，且应用分配 层析的例子很多。高速逆流色谱仪的出现，更开拓了在这方面的应用。吸附剂大多 采用氧化铝、纤维素、硅、聚酰胺等。其中，硅胶应用的最为广泛。对于极性较大 的生物碱和苷类生物碱，可运用反相层析材料或葡聚糖凝胶进行分离。高速液相色 谱( 1 l i 曲p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g a p h y ，h p l c ) 虽然有快速、高效的特点，但用于 大量制备性分离仍有困难。在实际工作当中，常用低压或中压柱层析、制备薄板层 析分离。 1 4 3 高速逆流色谱的概述 高速逆流色谱咖曲s p e e dc o u n t e r c u r r e n tc h r o m a t o g r a p h y ，简称h s c c c ) ，是2 0 世纪8 0 年代由美国国立卫生院的y o i c h i r o i t o 博士在行星式运动模式与螺旋