（食品科学专业论文）酶法及美拉德反应改进大米蛋白功能性质的研究.pdf

摘要 学科、专业：工科、食品科学 硕士研究生姓名：纪崴 指导教师：麻建国教授 摘要 入学时间：2 0 0 7 年9 月1r 答辩时间：2 0 0 9 年1 2 月9 同 授予学位时间： 大米蛋白具有独特的营养特性。但由于其8 0 以上为碱溶性谷蛋白，溶解性较差， 产量相对较低，因此限制了关于大米蛋白的研究和应用。本研究以大米蛋白为原料，利 用酶法和美拉德反应合成大米蛋白糖复合产物，旨在探讨通过大米蛋白及其水解产物 与糖之间的接枝反应改善大米蛋白的功能性质，为植物蛋白的改性提供理论参考。 首先，采用酶法对大米蛋白进行改性，探讨蛋白酶催化反应动力学特性及大米蛋白 改性后功能性质，确立酶法改善大米蛋白功能特性的技术参数。以水解产物的乳化性和 溶解性为指标，确定水解大米蛋白的最佳蛋白酶，得到酶法改性大米蛋白的最佳工艺条 件：采用碱性蛋白酶p r o t e a s en ，控锖i j e s 为0 0 1 2 0 ，水解温度5 0 ，控制水解度为5 。 此时水解产物的乳化性及溶解性最佳，其溶解性在p h 8 0 提高了3 4 4 倍，其乳化活性分别 为相同条件下蛋白对照样的2 2 2 倍，同时起泡性和持水性也分别提高了2 8 8 、4 7 6 倍。 在酶法改性的基础上，进一步尝试采用蛋白糖湿法接枝改性来改善大米蛋白的功 能性质。主要以产物的溶解性、乳化性及乳化稳定性作为指标，同时结合产物接枝程度、 褐变程度及体系p h 变化，研究有限水解的大米蛋白与不同相对分子量的多糖发生美拉 德反应后功能特性的变化。同时研究了不同反应温度、质比、p h 及离子强度对复合产 物功能性质的影响。结果表明，反应温度越高，反应速度也越快；质比对复合产物的性 质影响不大，蛋白与葡聚糖l ：l 时为最优；大米蛋白经改性后，在不同p h 及离子强度 下功能性质均得到改善，溶解性、乳化性及乳化稳定性变化趋势与原料大米蛋白相似。 通过对复合产物功能性质的研究，确定了以葡聚糖做为与大米蛋白发生美拉德反应的糖 基供体，最佳工艺条件为：水解度为5 ，p h 值为1 l ，反应温度1 0 0 ，反应时间2 0 m i n 。 在最佳反应条件下制备得到的复合产物，其功能性质均有了不同程度的改善。复产合物 溶解性、乳化活性、乳化稳定性分别为蛋白对照的3 8 3 倍、5 2 8 倍、6 5 7 倍。 对复合物的理化性质及产物结构进行了分析。由荧光分析结果可知，复合物在激发 波长3 4 7a m ，发射波长4 2 2a m 处有最大荧光强度，符合美拉德反应产物的荧光特征， 从而确定美拉德反应的发生。采用h p l c 分析可知，随反应的进行，分子聚集体不断发 生解聚，分子量减小，同时产生分子量相对较小的峰，这可能是在美拉德反应过程中形 成的一些次级产物，随着反应进入到后期，生成的中间产物进一步经历不同途径的反应， 降解生成更小分子量物质。由氨基酸成分分析结果表明，赖氨酸、脯氨酸均与葡聚糖发 生了接枝反应。另外，随着接枝反应的进行，复合物表面疏水性呈现不断下降的趋势。 傅立叶红外( f t 瓜) 证明了复合产物以共价键的结合形式接入了糖分子。扫描电镜( s e m ) 摘要 研究发现大米蛋白改性前后有明显不同，后者为薄且分散的聚集体。粒径实验表明，复 合产物所形成的乳状液与原蛋白相比粒径更小且更加稳定。 将最佳工艺条件下制备的大米蛋白葡聚糖复合产物应用于焙烤食品中，并与空白 组及商用乳化剂( 单甘酯，蔗糖酯) 相比较。结果表明，随着复合产物添加量增大，蛋 糕面糊的弹性模量和粘性模量逐渐减小。成品与空白组相比各项性质指标有明显提高， 其中某些性质甚至优于单甘酯和蔗糖酯组样品，综合考虑理化指标及成本，当复合产物 添加量2 时为最优。 关键词：大米蛋白；酶水解；糖；美拉德反应；功能性质 a b s t r a c t s u b j e c ta n ds p c i a l i t y ：f o o ds c i e n c e ， m a s t e rg r a d u a t es t u d e n t ：j iw e i f a c u l t ya d v i s e r ：m a ，p r o a b s t r a c t t i m eo fe n r o l l m e n t ：o1 0 9 2 0 0 7 t i m eo fd e f e n s e ：0 9 12 2 0 0 9 t i m eo fc o n f e r r i n gd e g r e e ： r i c ep r o t e i n ( i 冲) p o s s e s s e su n i q u en u t r i t i o n a lp r o p e r t i e s o v e r8 0 o fr i c ep r o t e i na r e g l u t e l i n s ，w h i c hh a v el o ws o l u b i l i t ya tn e u t r a lp h s ot h eu s ea n dr e s e a r c ho fr i c ep r o t e i na s a ni n g r e d i e n ti nf o o d si sl i m i t e d i nt h i s s t u d y , t h er pi su s e da st h em a i nm a t e r i a l s ，a n d r p s a c c h a r i d eg r a f t sw e r es y n t h e s i z e db yt h ew a yo fe n z y m a t i ch y d r o l y s i sa n dm a i l l a r d r e a c t i o n t h ep u r p o s eo ft h i sp a p e rw a st os t u d yt h em a i l l a r dr e a c t i o nb e t w e e nr pa n ds u g a r , a n dt oi m p r o v et h ef u n c t i o n a lp r o p e r t i e so ft h ep r o t e i nb yt h er e a c t i o na n ds u p p l yt h e t e c h n i c a lf o u d a t i o nf o rt h em o d i f i c a t i o no fv e g e t a b l ep r o t e i n f i r s t ，r i c ep r o t e i nw a se n z y m a t i c a l l yh y d r o l y z e db ys e v e r a lc o m m e r c i a l l ya v a i l a b l e p r o t e a s e s t h ea i mo ft h i si n v e s t i g a t i o nw a s t of i n dt h eo p t i m u mc o n d i t i o n st h a tc a no b t a i nt h e h y d r o l y s a t e s w i t he x c e l l e n t e m u l s i f y i n gp r o p e r t i e sa n ds o l u b i l i t y b yc o m p a r i n gf i v e e n z y m a t i cd y n a m i cr e a c t i o no ft h em o d i f i e dr i c ep r o t e i na n dt h ef u n c t i o n a lp r o p e r t i e so fr i c e p r o t e i n ，t h eo p t i m a lr e a c t i o nc o n d i t i o n sw e r eo b a i n e d a sf o l l o w s ：t h ed e g r e eo f h y d r o l y s i s o f r i c ep r o t e i nu s i n gw a s5 p r o t e a s en a n dt h et e m p e r a t u r ew a sc o n t r o l l e da t5 0 t h e s o l u b i l i t ya tp h 8 0 ，e a ，f o a m i n gp r o p e r t i e s ，a n dw a t e r - h o l d i n gc a p a c i t yo fr i c ep r o t e i nw a s i n c r e a s e d3 4 4 、2 2 2 、2 8 8 ，a n d4 7 6t i m e s ，r e s p e c t i v e l y o nt h eb a s eo fe n z y m a t i ch y d r o l y s i s ，t h i ss t u d ya i m e dt oi m p r o v et h ef u n c t i o n a lp r o p e r t i e s o fr pb yw e t h e a t e dm a i l l a r dr e a c t i o n s e v e r a l p a r a m e t e r s w e r e i n v e s t i g a t e d ：t h e i m p r o v e m e n to ff u n c t i o n a lp r o p e r t i e s ，t h e 黟a rd e g r e e ，b r o w n i n g ，a n dp hv a l u ec h a n g e so n t h es y s t e mw h i c hl i m i t e dh y d r o l y s e dr i c ep r o t e i nr e a c t e dw i t hs u g a ro fd i f f e r e n tm o l e c u l a r w e i g h t t h eo p t i m a lr e a c t i o nc o n d i t i o n sw e r eo b t a i n e da sf o l l o w s ：t h ed e g r e eo fr i c ep r o t e i n h y d r o l y s i sb yp r o t e a s en w a s5 t h e nt h eh y d r o l y z e dr i c ep r o t e i nw a sr e a c t e dw i t hd e x t r a n a t10 0 ，a n dt h er e a c t i o nt i m ew a sa r o u n d2 0 m i n t h ef u n c t i o n a lp r o p e r t i e so fc o n j u g a t e s s y n t h e s i z e da tt h i sc o n d i t i o n sw e r ei n c r e a s e do b v i o u s l y t h ee f f e c t so fr e a c t i o nt e m p e r a t u r e ，p h ，i o n i cs t r e n g t ho nt h ef u n c t i o n a lp r o p e r t i e so fr i c e p r o t e i n d a x t r a nc o n j u g a t e sw e r ea l s oi n v e s t i g a t e d t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h eh i g h e rr e a c t i o n t e m p e r a t u r e ，t h ef a s t e rt h er e a c t i o np r o c e s s e d ；t h ep r o p e r t i e so fc o n j u g a t e sh a st h es a m et r e n d 船c o m p a r e dr pc o n t r o la td i f f e r e e n tp ha n di o n i cs t r e n g t h t h es t r u c t u r ea n dp h y s i c o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i co ft h ep r - dc o n j u g a t e sw e r ea s t i m a t e d b yh y d r o p h o b i c i t y , f l u o r e s c e n c ea n a l y s i s ，h p l c ，a m i n oa c i da n a l y s i s ，f t i ra n ds e m t h e p r - dc o n j u g a t e sh a v et h es t r o n g e s tf l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yw h e ne m i s s i o nw a s3 4 7 n ma n dt h e e x c i t a t i o nw a s4 2 2 n m a n df l u o r e s c e n c ei n t e n s i t ys h a r p l yi n c r e a s e dw i t h i nt h ef i r s t10 m i n ， t h e ni n c r e a s e ds l o w l yw i mi n c r e a s i n gt i m e t h er e s u l tc o m f i r m e dt h a tt h em a i l l a r dr e a c t i o n w a so c c u r e d h p l cw a su s e dt om e a s u r et h em o l e c u l a rw e i g h to ft h ec o n j u g a t e s t h er e s u t s s h o w e dt h a tt h ea g g r a g a t i o n so fr pw e r ee h a n g e db ym a i l l a r dr e a c t i o n h o w e v e r , w h e nt h e i i i a b s t r a c t r e a c t i o no c c u r r e d ，t h em o l e c u l a rw e i g h to ft h ep r o t e i nb e c a m es m a l l e rt h a nt h er pa tt h e b e g i n n i n gr e a c t i o ns t a g e t h es o l u b i l i t yo ft h ep r o t e i ni n c r e s e da n ds od i dt h eo t h e rp r o p e r t i e s t h r o u g hm a i l l a r dr e a c t i o n t h ei n f o r m a t i o no fi n t e r m e d i a t e sf r o mm a i l l a r dr e a c t i o nc o u l db e f o u n db yh p l c t h er e s u l to fa m i n oa c i da n a l y s i ss h o w e dt h a tt h ec o n t e n to fc y s t e i n e ，l y s i n e a n dp r o l i n ew a sd e c r e a s e db y 百y c a t i o n i na d d i t i o n ，t h es u r f a c eh y d r o p h o b i c i t yd e c r e a s e d w i t hi n c r e a s i n go fr e a c t i o nt i m e i tw a sp r o v e db yf t i rt h a tt h er pm o l e c u l ew a sg r a f t e dw i t ht h es a c c h a r i d eb yt h e c o v a l e n tb o n d i na d d i t i o n ，i tw a so b s e r v e dw i t hs e mt h a tt h es u r f a c es t r u c t u r eo ft h e c o n j u g a t e sw a sd i f f e r e n tf r o mr pc o n t r o l ，w h o s ea g 伊e g m e sw e r ed i s p e r s e d ，e s p e c i a l l yf o rt h e h y d r o l y s a t e sa n dc o n j u g a t e s m o r e o v e r , t h er e s u l to fd i s t r i b u t i o no fp a r t i c l es i z ei nt h e e m u s i o no fr pc o n t r o la n dc o n j u g a t e sa n a l y s i ss h o w e dt h a tt h es t o r a g es t a b i l i t yo fp r - d c o n j u g a t e sh a sd r a m t i c l l yi m p r o v e di nc o m p a r i s i o nw i t hr pc o n t r 0 1 t h ec o n j u g a t e sp r o d u c e du n d e rt h eb e s tp r o c e s s i n gc o n d i t i o n sw e r ea p p l i e di nt h eb a k i n g p r o d u c t s t h ep r o p e r t i e so ft h ef i n a lp r o d u c t sw e r ec o m p a r e dw i t ht h o s em a d eo fp r o t e i n c o n t r o la n dc o m m e r c i a le m u l s i f i e r s ( m o n o g l y c e r i d e se s t e ro rs u c r o s ee s t e o w i t ht h ei n c r e a s e a m o u n to fc o n j u g a t e s ，t h eg a n dg ”o ft h ep a s t ed e c r e a s e d a l lt h ep r o p e r t i e so ft h ep r o d u c t s m a d eb yt h ec o n j u g a t e sw e r es i g n i f i c a n t l yi m p r o v e da sc o m p a r e dt ot h ec o n t r o la n ds o m eo f t h e mw e r ee v e nb e t t e rt h a nt h eo n e sp r o d u c e db yc o m m e r c i a le m u l s i f i e r s k e y w o r d s ：r i c ep r o t e i n ，e n z y m a t i ch y d r o l y s i s ，s u g a r , m a i l l a r dr e a c t i o n ，f u n c t i o n a l p r o p e r t y i v 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是拳人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名：日 期： 3 趔拿! f 羔：! 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名：导师签名： 日 期： 绪论 1 绪论 稻谷是世界上重要的粮食作物之一，同时也是人类粮食消费中重要的蛋白质来源， 尽管它蛋白含量相对较低，但由于全球的生产量极大，这部分蛋白值得关注。亚洲国家 的居民多以大米为主食【i 】。近年来，全球每年大米产量在6 1 亿吨左右，其中一半以上产 自于亚洲，例如中国，印度，印度尼西亚，孟加拉国，越南以及泰国【2 j 。2 0 0 4 年，中国 的稻谷总产量达到1 8 5 亿吨，占据其中的3 7 ，居世界首位口】。根据我国粮食生产、消费 大，解决我国蛋白质不足的方法之一，应当是以发展植物蛋白为主，同时适当发展动物 蛋白，而淀粉和蛋白质是大米的主要成分，分别占6 7 - - 一8 3 和7 4 2 - - 一7 7 6 嘣引，对其 蛋白质的研究应受到更大的关注。我国大米加工水平较低，产品附加值不高，在技术上 与发达国家有很大的差距。因此，大米深加工技术的研究是提高大米附加值的必然途径。 当考虑到一些例如碎米，白垩米等低商业价值的大米产品也适于食品加工时更是应如此 岭j 。因此这是适合我国国情的一种发展模式。 1 1 大米蛋白的营养特性及其在国内外应用 大米蛋白具有独特的营养特性，大米蛋白的氨基酸配比合理，生物价为7 7 ，不但在 各种粮食中居第一位( 包括大豆) ，而且可以与鱼( 生物价7 6 ) 、虾及牛肉相媲美【6 7 j 。大米 蛋白必需氨基酸组成同小麦蛋白、玉米蛋白必需氨基酸组成相比与w h o 推荐蛋白质氨 基酸最佳模式更加接近【8 】，这是其它植物蛋白所无法比拟的。大米蛋白的另一特点是具 有低过敏性、无色素干扰等特性，味道柔和而不刺激，含钠量低，易于消化吸收【9 】，相 对其他谷物来说，大米赖氨酸含量较高，其中的谷蛋白氨基酸结构比起小麦中的醇溶性 谷蛋白更合理，弥补了赖氨酸和色氨酸的不足【l o 】。比酪蛋白与大豆蛋白更适合2 5 岁儿 童食用【1 l 】。 据文献资料介绍【1 2 - 1 7 1 ，米渣蛋白可制成酱油、高蛋白粉、蛋白饮料、蛋白胨和蛋白发 泡粉，保健饮料、调味品、可食用膜、化妆品及洗涤剂等。此外大米蛋白还具有重要的 保健功能。近年来的研究表吲1 8 , 1 9 ，大米蛋白对癌变、高血压、高血脂、脂肪肝、肾结 石和心脏病等都有一定的预防作用。国外已有多种大米蛋白制品出售，如有机米蛋白、 纽崔来及n u t r i b i o t e c 等，消费量较大，但价格不菲。国内关于此方面的研究甚少，主要 是由于其功能性质较差，大多用于动物饲料，浪费情况严重。 1 2 大米蛋白的结构组成及功能性质 糙米主要有皮层( b r a n ) 、胚乳( e n d o s p e r m ) 、胚( g e r m ) 三部分组成。糙米的主要 部分是胚乳，其质量约占整谷质量的7 0 。大米胚乳的内部结构紧密，淀粉颗粒细小， 并几乎全部以复粒形式紧紧包含在蛋白质网络中，蛋白质与淀粉颗粒两者之间的结合力 非常紧密，并且大米蛋白中谷蛋白含量高达8 0 以上。蛋白分子间通过二硫键和疏水基 团进行交联而凝聚【2 0 l 。 按o s b o m e 分类方法 2 1 】，大米蛋白可粗分为四类：清蛋白( a l b u m i n s ) ，可溶解于水 江南大学硕士学位论文 的蛋白质，占总量2 一5 ；球蛋i 兰t ( g l o b u l i n s ) ，溶于0 5 m o l l 的n a c i 溶液，占总量2 一1 0 ；谷蛋i 刍( g l u t e l i n ) ，溶于稀酸或稀碱蛋白质，占总量8 0 以上；醇溶蛋i 圭t ( p r o l a m i n s ) ， 溶于7 0 8 0 乙醇溶液，占总量l 一5 。其中，大米谷蛋白分子量约为6 1 0 5 6 1 0 6 ，由二硫键连接的多个亚基构成，而大米球蛋白分子量约为1 2 - - 3 1 0 3 ，以蛋白体 的形式集中存在。用常规s d s a p g e 电泳技术分离可看到四个颜色较深的谱带【2 2 2 3 1 ， 它们依次是1 3 k d a 的醇溶蛋白，2 2 k d a 、3 7 3 9 k d a 、5 7 k d a 的谷蛋白。一般认为谷蛋白刚 合成时是5 7 k d a 的大分子，其后从核糖体转运到液泡并形成蛋白体的过程中，该前体被 水解成伐、p 两个亚基，其中0 t 为酸性亚基，相对分子质量为3 7 k d a 一3 9 k d a ，b 为碱性亚 基，相对分子质量2 2 k d a 。研究表明 2 4 , 2 5 , 2 6 ，在稻米生长发育期间，这四类蛋白会在植 物体内形成蛋白质聚集体，小分子蛋白质分子通过二硫键与其它蛋白质分子结合，形成 分子量大小不一的蛋白质聚集体。由于二硫键的存在，赋予了大米蛋白分子的多样性及 其性质的多样性。 在国内，由于大米蛋白物化功能性特差，溶解度较低，这也制约了蛋白的其他性质 如乳化性、乳化稳定性、起泡性等，限制其研发和应用，相关报道也较少，提取的大米 蛋白无法真正得以利用。同时我国大米种植范围广，产量大，而目前碎米或早籼米生产 糖产生的米渣主要用于动物饲料，未能将这一宝贵的蛋白资源进行更充分的利用。为了 有效地改善下脚料米渣的综合利用情况，研制出功能特性极好的专用大米蛋白粉，与国 外市场接轨，我们应重视中大米蛋白研究。 1 3 大米蛋白的改性研究现状 大米蛋白功能性差主要原因是含有一定数量的谷蛋白肽。大米蛋白中谷蛋白含有两 条多肽链，一条为q 链，一条为d 链，a 链的等电点是6 6 _ - 7 5 ，b 链的等电点为9 4 1o 3 ，在p h 值4 _ 1 0 时溶解性差【2 7 2 8 1 ，因此非蛋白酶水解获得的大米蛋白的溶解性 小，进而导致其稳定性、乳化性、发泡性等性能不佳，影响了大米在溶液体系中的应用， 因此有必要对大米蛋白进行改性研究。 国内外对于食品蛋白质的改性方法主要集中在酶法【2 9 1 、化学法、物理法和基因工程 法。其中化学法主要有酸作用、磷酸化、脂化【3 0 1 、琥珀酰化和糖基化等作用。 ( 1 ) 酸法水解【3 1 , 3 2 】具有生产周期短、操作简易、产品风味好等优点。但对设备要求较 高，必须耐腐防蚀，且用盐酸水解时，其会与类蛋白上所连的残余脂物反应形成氯丙醇， 对人体有害； ( 2 ) 酰化作用【3 3 】就是蛋白分子的亲核基团( 如氨基和羟基) 与酰化试剂中的亲电基团 相互反应。酰化后的蛋白质分子表面负电荷增多，多肽链伸展和空间结构改变，导致分 子柔性( 表示蛋白质分子结构发生变化的参数) 提高，从而增加了蛋白质的溶解性、乳 化性、发泡性； ( 3 ) 磷酸化改性【3 4 , 3 5 】是有选择的利用蛋白质侧链的活性基团接上一个磷酸基。但是， 磷酸化需在弱碱的条件下，易引发一些副反应，包括赖氨酰丙氨酸的生成； ( 4 ) 脱酰胺改性【3 6 , 3 7 是通过羰基中的。和h + 发生质子化作用，导致氨释放( 又称脱氨 2 绪论 作用) 。酸法脱酰胺是酸提供h + 将n h 2 键打断，脱去n h 2 。 1 3 1 酶法改性 酶促水解就是利用蛋白水解酶在一定条件下对蛋白质分子进行催化水解，主要是通 过控制水解度，使蛋白质大分子降解成不同链长的小分子来达到蛋白功能性质的改善。 蛋白质经酶水解以后形成的较少的、弱亲水的和较易溶剂化的小肽单位能够提高蛋白质 的溶解度，从而使乳化性、起泡性也得到了改进，除了其功能性质明显改变以外，由于 水解生成的肽类更容易被人体吸收、消化，对人体没有副作用，因此水解蛋白质适宜于病 人、儿童食用p 引。 目前，国内外大米蛋白的改性工作主要采用蛋白酶水解，一般采用风味酶、木瓜蛋 白酶、胃蛋白酶、复合蛋白酶等对大米蛋白进行改性研究，k r z y s z t o f s u r o w k a ”】等人 利用风味蛋白酶和中性蛋白酶对大豆蛋白进行限制性水解，所得的产物在溶解性，起泡 性，持水性上都有很大提高。反应产物不仅保持原料蛋白的一些典型性质，同时也拥有 水解蛋白的功能特性，很适合作为改良剂添加到食品体系中。k h i c h as i n h a t 4 0 l 等人利用 真菌发酵蛋白酶和木瓜蛋白酶对乳清蛋白水解改性，并对2 0 ，4 0 ，6 0 m i n 水解产物的功 能性质和成分进行分析比较。结果表明，水解产物的持水性和起泡性都有明显提高；体 外蛋白消化实验表明，消化吸收率要比原蛋白提高3 倍左右。利用水解产物制成新型功 能性蛋白饮料，改饮料在p e t 材质容器中储存性良好。有人利用葡萄糖氧化酶【4 l 】( g o ) 改善米粉中的大米蛋白的功能性质，在得到各项性质均有所提高的大米面包的同时，也 减少了羟丙基甲基纤维素( h p m c ) 的添加，因此改性大米蛋白更可以作为某些合成添加 剂的代替品。 人为地将交联键引入食品中，可以改善蛋白质的功能特性。转谷酰胺酶【4 2 ( t g a s e ) 是 一种催化酰基转移反应的转移酶，它可催化蛋白质以及肽键中谷氨酰胺残基的c 2 羧酰 胺基和赖氨酸残基的e 2 氨基相连，形成e 2 ( c 2 谷氨酰基) 赖氨酸共价键，从而改变蛋白 质的结构和功能性质，赋予食品蛋白质特有的流变特性和1 2 1 感【4 3 】。h a r d e e ps i n g h g u j r a l 删等人利用转谷酰胺酶( t g a s e ) x i 大米粉进行改性。实验表明，经t g 处理后米粉的 流变学特性发生很大改善，粘性模量g ”和弹性模g 量都有所增加。由于t g 反应，大米 蛋白发生聚集，形成较好的网络结构，在发酵过程中可以更好的保持气体，更适于焙烤 行业的应用。 1 3 2 接枝改性 蛋白质一般对热，水解作用很不稳定，但对碳水化合物或生物多聚物的交联能变得稳 定，也被赋予一些新的特性。蛋白质糖的接枝反应主要是基于蛋白质分子中氨基酸侧 链的自由氨基q 或e 氨基和糖分子还原末端的羰基之间的羰氨反应【4 5 1 ，著名的美拉德 反应( m a i l l a r dr e a c t i o n ) 就是一个简单的例子，仍属于蛋白质化学改性的范畴。通过共 价键相连的蛋白质与多糖聚合物能适应很广泛的溶液条件，意即当溶液的p h 值、离子强 度等条件发生较大变化时，聚合物仍能保持聚集状态和良好的溶解性。复合物的蛋白质部 分可以有效地吸附在油水界面上降低界面张力，同时，共价结合的多糖分子链在吸附膜 3 江南大学硕士学位论文 的周围形成立体网状结构增加了膜的厚度和机械强度【4 6 1 。经美拉德反应所得到的蛋白质 一多糖的共价复合物既由于蛋白质能在油水或气液界面上形成吸附层降低界面张力而 具有较好的乳化性，也由于多糖其良好的增稠和持水特性而具有较好的稳定性。除乳化 特性 4 7 , 4 8 】有明显改善外，蛋白质一多糖的共价复合物也由于其溶解性、热稳定性、抗菌 性、抗氧化性的不同程度的提高而备受关注【4 9 , 5 0 , 5 1 , 5 2 】。 1 3 2 1 美拉德反应基本原理 美拉德反应是由法国生物化学家l o u i sc a m i l l em a i l l a r d ( 1 8 7 8 1 9 3 6 ) 于1 9 1 2 年发现。美 国化学家h o d g e 5 3 】于1 9 5 2 年首先提出了美拉德反应的网络系统分类图解，对该反应机理 做了系统的论述。美拉德反应一般可以分为二个反应阶段，三条反应路线。随着研究的 不断深入，许多科学家认为美拉德反应【5 4 5 5 】可分成3 个反应阶段，即初期( t h ee a r l y s t a g e ) 、中期( t h ea d v a n c e ds t a g e ) 和末期( t h ef i n a ls t a g e ) 。在早期阶段，还原糖与氨基酸 或蛋白质中的氨基缩合，形成s c h i f f s 碱，经过a m a d o r i 重排形成a m a d o r i 产物。在这一阶 段，蛋白质与多糖的共价结合已经完成；在进展阶段，a m a d o r i 产物降解形成大量裂解 产物；在最终阶段，前面的裂解产物继续反应，生成褐色色素一类黑精，同时发生蛋白 质交联反应。生成的色素无特定构成单位。在食品加工特别是热处理工艺中，形成的类 黑素不仅直接影响着食品的风味、色泽和质地，同时可通过断开分子链清除体系中的氧和 螯合金属离子，具有较强的抗氧化作用并延长食品的货架期。类黑素本身有较高的安全 性，不存在细胞毒素效应。 1 3 2 2 干法美拉德反应接枝改性研究进展 目前国耐】上许多学者对鱼肉蛋白、卵清蛋白、d 哥l 球蛋白、牛血清蛋白、鱼精蛋 白、谷蛋白等蛋白质与糖基化合物经过美拉德等化学合成新的糖蛋白已经行了研究，结 果表明，新合成的糖蛋白在乳化性、溶解性、热稳定性、抗菌性、抗氧化性等功能性质 方面都有不同程度的提高，对一些蛋白质如p 乳球蛋白的过敏反应特性也有较好的抑制 作用。 自1 9 8 8 年日本的k a t o ，7 】等报导了乳清蛋白葡聚糖复合物的功能性得到极大改善以 来，研究人员开始用其他一些蛋白与多糖进行共价复合，结果反应产物也在诸如乳化性、 溶解性、抗氧化性和抗菌活性等功能性质上得到了极大的改善。周家华，刘刹5 8 】利用大 豆蛋白与淀粉及其水解物在6 0 0 c ，相对湿度7 5 的条件下通过美拉德反应进行改性，反 应在1 9 5 d x 时内可以完成。大豆蛋白改性后，在广泛的p h 范围内，都有较高的溶解度， 在p h 6 时，其热稳定性、乳化性、泡沫性能和水化能力都有较大的提高。k i k a 5 9 1 等人 在6 0o c 条件下使乳清浓缩蛋白和c m c 发生美拉德反应，反应产物在乳化性和乳化稳定 性上有明显改善。齐军茹等人采用红外光谱唧】探讨了该蛋白与多糖发生m a i l l a r d 反应机 理：蛋白一多糖之间的干热反应属于固相反应中的一类低热固相反应；对于在保持一定 相对湿度条件的蛋白与多糖混合物，起始时为蛋白与多糖分子的扩散接触，此时的扩散 过程中当多糖分子中的还原性醛基有机会与蛋白质中伯氨基接触时就会发生化学作用， 得到具有优越功能性质的糖一蛋白复合物。但是从以上研究也可知道，美拉德干法反应 通常是在一定相对湿度下进行，对环境要求较高，并且固相反应物问的实际接触面积较 4 绪论 小，反应物之间接触不均匀、不充分，反应受到限制，产物性能比较不稳定。同时反应 时间为一周甚至几个月不等，反应较为缓慢，这也极大制约工业生产。 1 3 2 3 湿法美拉德反应接枝改性研究进展 国内外对于蛋白一糖的美拉德反应主要对干热变性反应方面的研究较多，对湿热反 应的报道很少。为了克服干法中对环境要求高、反应缓慢等缺陷，湿法美拉德反应也越 来越受到食品科学家的重视。两种方法的理论基础基本相似，但在液相体系中，蛋白与 多糖之间接触的几率更大，在相对较短反应时间下，反应的程度更高。 b r a n d s 6 1 】等人以酪蛋白一二糖为实验对象，在p h 6 8 ，1 2 0o c 条件下，研究该模拟 体系的动力学过程，并建立了其动力学模型。在这个体系中，主要有2 个反应路线：( 1 ) 糖的异构化及降解；( 2 ) 糖及其断裂产物与蛋白质上赖氨酸的一氨基反应。实验结果显 示，美拉德反应是由很多连续或同时进行的反应组成，对于控制美拉德反应的进程，动力 学数据非常重要。与干热改性过程中，蛋白功能性质( 起泡性，乳化性等) 的改善是由 于蛋白表面亲水亲油平衡的改变不同，在液相体系中【6 2 1 ，是通过连接糖链来加强蛋白 在气一水界面上的相互作用，而不是通过增加蛋白的亲水性来影响蛋白在气一水界面的 行为。同时，蛋白本身的变性状态以及在蛋白一蛋白接触面上的结构改变似乎对蛋白在 气水界面上的吸附和重组起到至关重要的作用。热变性以及通过美拉德反应连接糖链， 这两者共同作用的结果强烈影响蛋白的界面性质。 c h e v a l i e r t 6 3 j 等人利用p 乳球蛋白与不同分子量糖，包括阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、 乳糖、鼠李唐等，在6 0 0 c ，p h 6 5 溶液条件下进行美拉德反应，反应时间为3 天；所得的 复合产物不仅在乳化性、溶解性上有很大提高，在起泡性及热稳定性方面也有明显改善。 w i t t a y a c h a il e r t i t t i k u l e 叫等人在1 0 0 0 c 对不同p h 下猪血浆蛋白葡萄糖体系美拉德产物的 抗氧化性进行研究。结果表明体系p h 对产物功能性质有显著影响，体系p h 值越高，产 物的抗氧化性越高。同时反应伴随褐变指数增大，自由氨基数目减少等现象，均符合美 拉德反应特征，并得出结论，体系p h 会影响反应过程中蛋白质交联的发生，从而导致产 物特性的不同。h j i n g 6 5 】等人研究酪蛋白与葡萄糖，果糖，核糖，在5 5o c ，p h 7 0 液相体 系中进行美拉德反应2 8 天，实验发现，在反应过程中，反应体系褐变指数荧光吸收均有 增加，羟基和自由基清除能力明显提高，并且无毒无害。国内，刘娟6 j 等利用美拉德反 应对酪蛋白进行湿法糖基化改性研究。结果表明，乳化性随着接枝度的增大，乳化性逐 渐增大，当接枝度为35 时，酪蛋白的乳化性提高了约1 5 倍，并通过sds pa ge 证实酪蛋白经湿法改性生成了接枝共聚物。齐军茹【67 j 等对液相体系制备得到大豆酸 沉蛋白一葡聚糖共价物的反应机制及功能性质的改善进行了研究，发现湿法改性所得产 物的功能性质大部分与干热反应的产物的功能性质相当。通过紫外光谱和红外光谱以及 g p c 分析液相体系产物性质分析，与干法制备相比，两者产物具有相同的紫外吸收和红 外吸收特征，且数均分子量和重均分子量非常相近。 以上实验结果指出了蛋白质一多糖的共价复合物是一种性质优良的多功能食品添加 剂。另一方面，它们是由蛋白质和多糖两种天然生物大分子在没有任何化学试剂参与下 经由美拉德反应制得，是一种“绿色 食品添加剂，符合现代社会对天然食品与日俱 5 江南大学硕十学位论文 增的要求，因而有着广泛的应用前景。 1 4 立题背景及意义 据全国营养调查，目前我国国民平均蛋白质摄取量达6 克人同，还未达到标准7 0 克， 据合理的营养需要还有相当大的距离，尤其是动物蛋白所占的比重还不到1 0 ，由此可 见，我国人民营养水平还比较低，严重地影响我国人民身体健康；另一方面，利用早籼 稻或碎米为原料生产淀粉糖或发酵生产谷氨酸、柠檬酸、乳酸以及生化药品时，米粉液 化或者是糖化后的副产品米渣的综合利用【6 8 】一直是困扰企业的一个难题。制糖后米 渣中的蛋白质含量高达5 0 ( 干基) ，是大米中蛋白质含量的5 - 8 倍，且高于大豆中蛋白 的含量【6 9 1 ，但在我国却未得到良好地开发利用，造成了蛋白质资源的极大浪费。为此， 在我国合理开发利用这些下脚料生产食品级的大米蛋白，开发功能性食品蛋白资源，提 高人民群众的蛋白摄取量是当前一项十分紧迫的任务。基于这个目的，加大对大米蛋白 的开发，将会造福于人类，有着十分显著的经济效益和社会效益。 1 5 课题研究内容 1 根据建立的相关性，确立适宜于大米蛋白改性的蛋白酶种类或酶组合，并以此为依 据研究不同改性目标下达到蛋白质溶解性与功能特性之间平衡的蛋白酶控制水解技术 方案； 2 在控制水解度条件下，采用湿法对大米蛋白进行糖基化改性，探讨通过美拉德反应对 大米蛋白功能性质产生的影响。并对美拉德反应的影响因素( 水解度，糖的种类) 进行 了研究，测定共价物的溶解性，乳化性等，以确定最佳的工艺条件； 3 通过最优工艺条件制备得到大米蛋白一葡聚糖复合物，研究不同p h 条件、不同反应 温度、蛋白糖的配比不对复合物溶解性、乳化性及乳化稳定性的影响； 4 通过荧光分析、h p l c 、氨基酸分析及、表面疏水性测定、傅立叶红外、扫描电镜等 手段研究蛋白一葡聚糖复合物的理化性质及产物结构，对美拉德反应机理进行初步分 析。 6 实验材料与方法 2 实验材料与方法 2 1 实验材料