（生物医学工程专业论文）硅微通道阵列红细胞变形性测量系统图像处理分析方法研究与实现.pdf

重庆大学硕士学位论文 英文摘要 a b s t r a c t t h ed e f o r m a b i l i t yo fr e db l o o dc e l l ( r a 0i so n eo fi m p o r t a n tb l o o dr h c o l o g y i n d e x e s t h e r e f o r e , t h es t u d yo fr b cd e f o r m a b i l i t yh a sp l a y e da l li m p o r t a n tr o l ei n p r e v e n t i n ga n dc u r i n gs o m e c e r t a i nd i s e a s e sr e f e rt or b c m o r p h o l o g i c a lf e a t u r e s a b o v ea l l ，t h i sd i s s e r t a t i o ns h o w sak i n do fc e l ld e f o r m a b i l i t ya n a l y s i ss y s t e m d e v e l o p e db yo u r s e l v e sw h i c hi s b a s e do nm e m sa n dm i c r o f l u i d i ct e c h n o l o g y c o m p a r e dw i t hn o r m a ld n c o l o g i c a ld e t e c t i o nt e c h n o l o g y , t h i sm e t h o di sb e n e f i c i a lo n m a n yw a y s ，s u c ha sm u l t i i n f o r m a t i o n , f l e x i b l ea n dc o n t r o l l a b l es t r u c t u r e , e a s yt o h a n d l ea n dl o wp r i c e t h ee m p h a s i so fm yd i s s e r t a t i o ni si m a g ea c q u i s i t i o na n da n a l y s i sf o rt h er b c d e f o r m a b i l i t yt e s t i n gs y s t e mb a s e do ns i l i c o nm i c r o c h a n n d o nt h eo n eh a n d , c o l l e c t i n g t h ev o l t a g es i g n a l sf r o mt h ep h o t o d i o d e sf o rf t l r n l e ra n a l y s i s ，i n c l u d i n gp r o t r a c tt h ef l u x - f i l t r a t ev o l u m eg u r v eo fr b cs u s p e n s i o na n dc a l c u l a t et h et w op a r a m e t e r si nt h er b c d e f o r m a b i l i t yt h e o r e t i c a lm o d e la u t o m a t i c a l l yb yc o m p u t e r o nt h eo t h e rh a n d , w eu s e t h eh i g hs p e e di m a g i n gs y s t e mt oc a p t u r ei m a g e sw h e nt h er b cs u s p e n s i o ng e t p o s s t h em i c r o c h a n n d s f o rt h em o t i v ei m a g e so fr b c s ，ic a l c u l a t et h ev e l o c i t ya n d a c c e l e r a t i o nw h e nt h er b cs t m p e n s i o ng e ta c r o s st h em i e r o c h a n n e l si no r d e rt oa n a l y z e t h ee n t r a n c ee f f e c t , e n dt h e nc o m p a r et h er b cd e f o r m a b i l i t y f o rt h es t i l li m a g e , i p r e s e n t e dai m p r o v e dm e t h o do f c o n t o u re x t r a c t i o na c c u r a t e l yf o rr b ci m a g e , a n dt h e n a n a l y z e t h e r b c d e f o r m a b i l i t y b y t h e w a y o f c a l c u l a t i n g t h e p e r i m e t e r a n d l a n d m e a s u r e o f t h er b c t h ep r o g r a mc o m p i l i n gt o o lo f m yd i s s e r t a t i o na r ev i s u a lc _ 件a n dm a t l a b i nt h ep r e s e n td i s s e r t a t i o n , an e - q rs e m i - a u t o m a t i cd a t a i m a g ep r o c e s s i n ga n d a n a l y s i sm e t h o df o rr b cd e f o r m a b i l i t yt e s t i n gh a sb e e nd e v e l o p e d a n dt h i sa p p r o a c h i sa ne c o n o m i c a l ，o b j e c t i v e ，p r e c i s ea n dc a np r o v i d ev a l u a b l er e f e r e n c ef o rt h ea u x i l i a r y d i a g n o s i so f r e l a t i v ed i s e a s e s a sw e l la so t h e ra p p l i c a t i o n si nt h ef i e l d so f b i o m e d i c i n e a n db i o m e d i c a le n g i n e e r i n g , t h es t u d ya l s om a k e st h ef o u n d a t i o ni nt h ef i e l do f h e m o r h c o l o g yf o rt h ef u r t h e rd e v e l o p m e n t o f t h i sn e wm e t h o d k e y w o r d s ：r b cd e f o r m a b i l i t y , m e m s ，e n w a n c ee f f e c t , c e l li m a g ep r o c e s s i n g , c o n t o u re x t r a c t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得重麽太堂 或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本 研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：翁钯签字日期：z 印7 年占月罗日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解重废太堂有关保留、使用学位论文的 规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。本人授权重废太堂可以将学位论文的全部或部 分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段 保存、汇编学位论文。 保密() ，在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密( ) 。 ( 请只在上述一个括号内打“”) 学位论文作者签名：采越 签字日期：翮7 年月7 日 导师签名： 签字日期：卿年歹月7j 日 重庆大学硕士学位论文1 绪论 1 绪论 1 1 前言 红细胞变形性是指红细胞在流动过程中利用自身的变形通过狭窄的血管通道 的能力【1 1 。红细胞变形性是血液流变学的重要指标之一。红细胞变形能力主要有红 细胞膜的力学性质、红细胞内液的粘度和红细胞的几何形状等因素决定。外在因 素如血管内径、红细胞浓度、血浆粘度、p h 值、渗透压等也可影响红细胞的变形 能力。红细胞变形能力异常主要见于诸如镰状红细胞贫血、地中海贫血、球形红 细胞增多症、椭圆形红细胞增多症等血液病和心肌梗塞、高脂血症、雷诺综合征、 冠心病、糖尿病等疾病。因此对红细胞变形能力的研究，对于相关疾病的预防与 诊治有着重要的意义。 红细胞变形性测量方法从原理上可分二类，一类是将血样置入较大几何尺度 的测定系统中经受切应力的作用，判断群体红细胞在流动中的平均可变形性质， 如粘度测定计算法和激光衍射法；另一类是利用狭窄的通道系统使红细胞逐个通 过，如微吸管法和微孔滤过法【2 圳。这些检测方法都有各自的优点，但也存在着许 多的不足。 鉴于此，本论文在细胞流变学和m e m s 技术基础上建立了硅微通道阵列红细 胞变形性检测系统，利用微通道阵列模拟毛细赢管，改进流路及驱动方式，结合 增强型高速图像成像采集系统，静、动态图像处理及分析技术探索出新的实验方 法，研究和开发相应的基于细胞形态特征和变化的红细胞变形性应用分析软件系 统。 1 2 课题来源 本课题部分资金支持来源于国家自然科学基金项目( 3 0 2 7 0 4 0 7 ，己于2 0 0 6 年3 月结题) “微型血液流变特性分析系统”。在实验室课题组的研究基础上，针对原装 置，完善系统软件应用分析功能。 1 3 课题研究目的和意义 临床研究表明，许多疾病能使决定红细胞变形能力的3 个内部因素，即红细 胞的几何形状；红细胞膜的粘弹性；红细胞内液粘度中的任何一个发生异常，从 而引起红细胞变形性的变化。因此，测定红细胞变形性对于许多疾病的预防与诊 断有重要意义【5 1 。 硅微通道技术利用仿生学原理，结合微机械加工技术和微观测量技术，对于 重庆大学硕士学位论文1 绪论 红细胞变形性和血液流变特性的微观条件下的观测提出了一种新的思路，而且相 对于已有的一些常规方法具有一定优势：如结构设计灵活，可以根据不同目的设 计不同形式和结构的微晶片；可以直接通过显微镜对微通道及微结构进行观测， 对研究提供了丰富的图像方面的信息等等。对本系统结构的优化和测量的标准化， 如针对红细胞变形性测量的不同侧重，采用什么样的管径或结构，测量的参数以 及分析软件等等都要进行进一步探讨。再者，要规范和简化测量过程，使这项技 术趋于成熟化。 1 4 国内外研究现状 1 4 1 红细胞变形性测量方法概述 激光衍射法1 6 1 激光衍射法是b e s s i s 与m p h a n d a s 于1 9 7 5 年设计发明的，它是将粘性测定装 置和激光衍射测量相结合，将红细胞悬浮液置入一个同心圆柱体粘度计中承受一 定的剪切应力，进而获得不同状态下的红细胞衍射图，从衍射图纵轴和横轴方向 的大小变化表示红细胞的变形性，即长轴短轴比值越大，则红细胞变形性越好。 所获得的衍射图，是红细胞群体衍射的叠加，所反映的也是红细胞的平均变形性。 这种方法用血量少，且测定重复性好，可以分析细胞变形性与剪切应力的关 系，也可分析渗透压对变形性的影响。其缺点是仪器昂贵，且只能得到红细胞群 体的变形情况，无法了解单个红细胞的流变特性。 微管吮吸澍6 】 微管吮吸法由r o n d 和b u r t o n 首先应用于红细胞变形性的研究，它采用内径小于 红细胞直径的微吸管，一端接一定的负压，另一端接触红细胞，测量在一定负压下红 细胞被吸入管内部分的长度，或红细胞被吸入吸管中达一定标准高度时所需负压大 小，或单个红细胞被全部吸入个较粗微管时所需要的负压大小，并以此来度量红细 胞变形性的大小，即红细胞越易被吸入，表示变形性越好。 由于微吸管制作复杂，技术要求高，而且只能反映单个红细胞变形性，不能 在短时间内估计群体红细胞的变形性，故此法主要用于实验研究，不适合临床应 用。 微孔滤膜法啪 微孔滤膜法是利用滤膜、金属筛等具有过滤作用的器具来测定红细胞的变形 性。目前较常用的滤膜为核孔滤膜，其孔径有3 p m 和5 岫等尺寸，3 l u n 为正常红 细胞所能通过的临界尺寸，而5 1 u n 较适宜于变形性明显降低的红细胞。最常用的 方法为等压差法，该法的测定结果可由下述两项指标表达： 1 ) 红细胞变形指数毋 2 重庆大学硕士学位论文1 绪论 即用一定数量红细胞通过核孔滤膜的时间或每分钟滤过的红细胞悬浮液体积 来表示： 1 9 1 ：蔓p c v 1 0 0式( 1 1 ) 式中岛为悬浮介质滤过时间，t b 为悬浮液滤过时间，p c v 为悬浮液红细胞比积。 d i 值越大，表示红细胞变形性越好，反之则变形性越差。 2 ) 红细胞滤过指数( i n d e xo f f i l t r a t i o n ，1 伊：生玉p c v 式( 1 2 ) t | 当红细胞变形性下降时t b 延长，伊因之增大，表明红细胞可滤过性差。 核孔滤膜法是目前广为采用的评价红细胞变形性的方法，该法简单、经济， 能反映红细胞亚群的变形性，如能结合扫描电镜观察，则可以更好了解红细胞通 过微孔时的变形过程。但该法易受很多因素的影响，如白细胞、血小板聚集性、 红细胞平均比积以及温度、压力、抗凝剂、p h 值等，应引起注意。 底部附着法【8 1 1 9 1 底部附着法由h o c h m u t h 等人于上世纪7 0 年代提出，到9 0 年代，国内外学者 还在不断的使用和改进。这一方法的具体操作过程是，将红细胞悬浮液引入两平 行平板玻璃构成的流动渠道，静止1 5 3 0 分钟后，红细胞沉降到底部，并附着在底 部平板上。然后用负压吸引，将悬浮液从管道中匀速抽出，在渠道中形成切变流 场，通过显微测量系统可测量附着于底部的红细胞随切变率的改变而引起的形态 改变。 粘性测量法【习 粘性测量法是利用红细胞悬浮液的表观粘度随剪切率的增高而降低的原理， 从粘度上的差异来估测红细胞变形性，在较高剪切率情况下，表观粘度降低越明 显，红细胞的变形能力越好。基于上述原理现一般采用较高剪切率( 8 0 2 0 0 s 4 ) 来 测定粘度，其测量仪器可采用毛细管粘度计或旋转粘度计，以后者较为理想，因 其具有确切的剪切率，且被测样品内剪切流动状态相对一致。 粘性测量法操作方法简单，设备亦不复杂，检测的是红细胞群体的平均变形 性，较适用于临床研究，但由于其不能分辨单个红细胞的变形能力，故不适宜于 基础研究。 电导法f 5 】【1 0 】 电导法利用的是红细胞在流场中不同p h 值可发生定向排列从而引起细胞悬 浮液电导率的改变，因而用电导率表征出红细胞的变形性。 电导法能较好地反映红细胞的变形性，且其测量简便，易重复，测速快，而 且与微管吮吸法、激光衍射法所得结论一致。 重庆大学硕士学位论文1 绪论 凝胶过滤法【“j 凝胶过滤法是由r o h n e r 宅e 1 9 9 0 年提出，选用性质稳定、无离子交换性和亲和性 的四种凝胶。他们采用一系列血样分析与分离不同变形性红细胞，表明正常红细 胞的凝胶过滤呈现可重复的洗脱现象，从而证实该法为分析红细胞变形性的可靠 方法。 此外，还有基于微通道的红细胞变形性检测法，本系统检测方法可归属为这 一类检测技术，下面对这一方法的原理和发展做进一步的介绍。 1 4 2 基于微通道的红细胞变形性测量技术概述 微通道技术指以微流控技术为基础，由微结构在芯片上形成网络，并以可控流 体贯穿整个系统的技术，是芯片实验室的主流。微通道的制作主要是利用光刻、 湿腐蚀等技术在玻璃、硅片、高分子材料上刻蚀出一定形状的空间结构。 微通道技术已广泛应用于生物医学、新药物的合成与筛选、以及食品检验、 环境监测等分析领域，其中生物分析是热点，用于血液流变分析检测也很具潜力。 k i k u c h i 等人f 1 2 】设计的系统是硅微通道技术的一种完整实现。他的研究采用了 两种不同的硅基片结构，首先实验的是一种等边三角形沟道结构，在后来的研究 中又改进为一种等边梯形槽结构，并在沟道出入口处分别加入了一段血流进出的 平台结构。梯形槽相比于三角形沟道更真实的模拟了血管形态，而由k i k u c h i 的推 导和实验，他也证明了他的平台结构在流路系统和测量观察上的有益作用。k i k u c h i 系统比较了微通道结构与核孔滤膜的差异，说明了微通道技术完全可以替代核孔 滤膜法的功能，并且具有很多自己的优点。该系统从类比核孔滤膜技术开始，利 用流量时间关系研究红细胞悬浮液通过的流速，表征了红细胞的变形特性，并开 始把影像系统引入直接观察红细胞的变形现象，作为测量的辅助。之后，他还研 究了红细胞变形性和氧传输等生理现象的关系【”】，并把该技术的应用范围扩大到 研究血小板流变特性的方面【1 4 1 。 图1 1 流路系统示意图 f i g ! 1m a po f t h em a c r o f l u i d i es y s t e m 4 重庆大学硕士学位论文1 绪论 j p b r o d y 等人l l 习则设计了一种栅格网状结构，采用了一定组数等长等深但 通道宽度渐变的矩形沟道阵列作为微通道网络，其尺寸结构为：沟道宽度沿一个 方向渐变，从2 5 肛m 到4 t i m , 步长o 5 t t m , 沟道深4 t t m , 长1 2 i j t m , 每组间间隔1 3 t i m 。 在他的实验中着重研究了生理生化因素在红细胞变形性现象中的应用，提出了一 种活动骨架理论并认为钙离子活动在其中产生了重要的作用，他使用了一种附着 钙离子的荧光染色剂来标定钙离子浓度并采用影像设备观测红细胞通过情况，证 实了一种红细胞变形现象的生理生化性原因的理论。他的研究提出了一种添加甚 至附着特定物质而不单单是用药物对试样预处理的思路，从而很大程度丰富了它 的实验手段并扩展了应用范围。 t r a c e y l ”j 、s u t t o n ”j 等人的实验和研究里又对硅微通道技术在实验系统和实验 方案等方面作了各自的努力。t r a c e y 等在实验中改进了图像处理系统和数据处理 系统。s u t t o n 等设计了一个有完整控制和处理系统的硅微通道实验仪器，在流路控 制系统中加入了精确的负压调节装置，如图1 1 所示，而在硅基晶片方面采用了另 一种形态，如图1 2 所示。通道采用宽3 4 t t m 、变化间隔0 2 t t m 、长1 0 0 1 l m 的矩 形槽。 图1 2 微通道芯片结构示意图 f i g 1 2s l r u c t m a po f m i c r o c h a n n e l 1 9 9 8 年，t o m o y a 【1 8 1 等人利用晶体材料来制作成并列的两两相对的微通道，微 通道长1 3 0 微米，深9 1 微米，总共有5 0 个通道，透过透明的盖玻片可以直接观 察到通道里红细胞流过的全过程，通过显微镜对目标区域放大，再用处理速度能 达到1 0 0 0 帧秒的高速摄像头采集图像，处理后能从图像上直观地观察到红细胞通 过时产生的形变情况。微通道结构示意图如图1 3 所示。 5 重庆大学硕士学位论文1 绪论 图1 3 微通道示意图 f i g 1 3s m l c t u r eo f m i e r o c h a u a e l s 2 0 0 1 年，勋g u k 9 】口田在t c 忉o y a 等人的基础上，运用该微通道设计，改进整个 微通道红细胞变形性检测系统的外置驱动等设备，结合高速摄像系统采集到红细 胞过通道的过程，并提出可使用红细胞变形性指数d i 来检测红细胞变形性。检测 系统的总体结构示意图如图1 4 所示。图1 5 是k o s u k 礴采集到的红细胞过微通道的 图像。 图1 4 检测系统总结构图 f i g 1 4s l n l c cm a po f t o t a lt e s t i n ga y s t a u 6 重庆大学硕士学位论文1 绪论 图1 5 不同速度红细胞过通道示意图 f i g 1 5 l o w - a n d h i g h - m a g n i f i c a t i o n i m a g e s o f f l o w i n g r b c $ t h ev e l o c i d e * i n ( b ) a n d ( c ) a 2 1 3m i d1 0 7 m m sr e s p e c t i v e l y k o s u k e 使用红细胞变形性指数d i 来比较和描述红细胞的变形性。他们定义的 d i 为： 一 ， d i = l d 式( 1 3 ) 其中1 ，d 如图1 6 所示 图1 6 变形指数d i 的计算 f i g 1 6d e f o r m a t i o ni n d e xc a l c u l a t i n g 在国内，结合m e m s 技术，利用微通道系统测量血液流变性的研究还比较少但 运用计算机图像处理技术研究红细胞形态结构等性质的研究却屡见不鲜。 郝葆青1 2 l 】瞄】等人依据红细胞形状因子的计算机数字图像处理技术，通过编写 相应的软件，实现了红细胞形态的识别、测量和相关统计，方法快速可靠。并且 利用该方法对正常( 形态分布曲线为单峰) 与溶血性贫血症红细胞形态分布( 双峰) 情 况定量描述的结果表明溶血性贫血病症的红细胞形态形状因子分布与正常红细胞 形态的情况有显著性的差异。该方法不仅可用于红细胞形态相关的研究与疾病的 7 重庆大学硕士学位论文1 绪论 辅助诊断，还可以应用于医学其它领域。不过，细胞和组织形态变化的复杂性， 仅用面积、周长、等效半径、形状因子等指标是不够的。 阮萍【2 3 】等人以显微图像分析技术，在无扰、在位、实时的情况下，定量测定 了温度和p h 值的变化对人血红细胞形态结构、功能及胞膜力学参量的影响，并进 行了初步讨论揭示了它们的相关关系及随各种生理条件而相互变化的情况。通 过摄像系统拍摄所需红细胞静态图像，进行截面积、周长、主轴长、短轴长、形 状规划因子( r e f ) 等分析，同时，他们还运用动态图像分析技术，分析6 0 0 帧图像 中红细胞边缘的涨落变化，计算胞膜的弯曲模量k c ，以确定红细胞膜流动性与变 形能力。弯曲模量k c 的测量是基于红细胞的f h c k e r 现象进行的，f l i c k e r 现象是由于 胞膜的起伏波动造成散射和反射光方向和强度的涨落而引起的视觉闪烁，因此它 携带着膜的力学性质。 张诚【2 4 】等利用红细胞的似圆特性，采用一个可交半径的圆环，对红细胞轮廓 从两个方向同时进行跟踪，并结合计算机图形学的技术，对单个红细胞的搜索以 及整幅图像红细胞的搜索过程进行了优化，提高运算速度，从而实现了对红细胞 轮廓的精确提取。 1 4 3 微流控芯片技术及其应用 芯片实验室【2 5 】是指把生物和化学等领域中所涉及的样品制备，生物与化学反 应，分离、检测等基本操作单元集成或基本集成到一块几平方厘米的芯片上，用 以完成不同的生物或化学反应过程，并对其产物进行分析的一种技术。芯片实验 室分为两大类，一类以微流控技术为基础，由微通道在芯片上形成网络，以可控 流体贯穿整个系统，通常被称之为微流控芯片实验室，是芯片实验室的主流；另 一类是以静态亲和杂交技术为核心的阵列微孔板芯片，没有流通网络，没有分离， 因为比较专一的适用于d n a 和蛋白质，通常被国内的媒体称之为“生物芯片”。微 流控芯片实验室常被简称为芯片实验室或微流控芯片，当它的功能集中于分析领 域时，也被称之为微全分析系统( m - t a s ) 。微流控芯片实验室的早期形式是芯片 毛细管电泳，芯片毛细管电泳至今仍是芯片实验室中分离部分的主体。 微流控芯片【2 5 l 是以微管道网络为结构特征，以生命科学为主要应用对象的。 微流控芯片材料的选择，通道的设计是微流控分析芯片的关键问题之一。最初的 微流控芯片是利用光刻、湿腐蚀技术在玻璃、石英、硅片上刻蚀出微通道，之后 还发展了电感耦合等离子体刻蚀技术，l i g a 技术等。但是以玻璃、石英、硅片为 基质来制作微流控芯片技术工艺复杂、冗长、步骤烦琐、成本高。近年来，高分 子材料以其加工容易，成本低等优点成为微流控芯片新的发展方向。高分子材料 为基质的微流控芯片通常采用压模，注塑，x 光刻蚀或激光刻蚀等方法制作。 微流控芯片可以用于各个分析领域 2 6 - 2 引，如生物医学、新药物的合成与筛选、 以及食品和商品检验、环境监测、刑事科学、军事科学和航天科学等其他重要应 重庆大学硕士学位论文1 绪论 用领域，其中生物分析是热点。目前其应用主要集中在核酸分离和定量、d n a 测序、 基因突变和基因差异表达分析等。另外，蛋白质的筛分在微流控芯片中也已有报道 【圳。针对病原微生物基因组的特征性片段、染色体d n a 的序列多态型、基因变 异的位点及特征等，设计和选择合适的核酸探针，经p c r 扩增后检测，就能获得病原 微生物种属、亚型、毒力、抗药、致病、同源性、多态型、变异和表达等信息，为 疾病的诊断和治疗提供一个很好的切入点。 微型芯片的主要特点【2 5 】是高通量、微型化和自动化，是在传统生物技术和疾病 诊断等方面的创新和飞跃。微流控芯片的发展极大地扩宽了生物芯片的内涵，是当 前微全分析系统发展的重点，它有很多优点。微流控芯片主要以分析化学和分析生 物化学为基础，以微机电加工技术为依托，以微管道网络为结构特征，各工作单元既 能独立完成单一反应或单元操作，也能与其他单元合作完成较复杂的工作，使整个 芯片成为一个动态的反应系统。探针和靶分子的作用是主动式的，因而大大增强敏 感性，提高反应速率。微流控芯片把整个实验室的功能，包括样品处理、化学反应、 分离和检测等集成在芯片上，且可多次使用，因此具有更广泛的适用性。每个芯片可 用于多个病人而不是一个病人一块芯片。每块芯片至少可重复使用2 0 次，因此比微 阵列芯片更为经济耐用。 1 5 本论文主要研究工作 本论文对以m e m s 技术为基础的硅微通道阵列红细胞变形性测量系统进行信 号采集和处理，以测量红细胞变形性。主要涉及流速信号采集和处理，静、动态 图像处理及红细胞变形性参数分析等方面。 第一章论述了课题的研究目的和意义，综述了相关领域的研究情况。 第二章综述了硅微通道阵列红细胞变形性测量系统理论基础和整体设计。 第三章介绍了运用本系统基于本课题组提出的红细胞变形性测量理论模型建 立的单个红细胞变形性测量子系统，主要包括光电管阵列的信号采集，以及根据 理论模型对数据进行处理分析以测量红细胞变形性。 第四章介绍了基于该系统的动态图像红细胞变形性定性分析子系统，包括应 用高速摄像系统对硅微通道内红细胞流动动态图像的采集和处理，主要是对红细 胞过通道，特别是进入通道和通道内的流速、加速度的测定及相关血液流变性的 分析方法。 第五章介绍基于该系统的静态图像红细胞变形性定量分析子系统，主要涉及 红细胞图像预处理，图像分割和轮廓特征提取实现红细胞形态特征分析，继而测 量红细胞变形性。 第六章简单介绍本论文开发平台及整个系统的人机交互界面。 最后，第七章对论文所做的主要工作做了总结与展望。 9 重庆大学硕士学位论文2 硅微通道阵列红细胞变形性测量系统概述 2 硅微通道阵列红细胞变形性测量系统概述 2 1 系统总论 2 皿3 习 硅微通道阵列红细胞变形性测量系统的设计包括：芯片设计以及芯片的封装、 流路设计、数据接口电路以及检测电路设计和软件设计。 整个系统有以下几部分组成： m e m s 芯片子系统；流路控制测量子系统； 数据采集子系统；数据处理和分析子系统。系统结构原理图和实物图如图2 1 和 图2 2 所示。 图2 1 系统结构原理图 f i 9 2 1 s t r u c t u r e m a p o f s y s t e m 2 2 硅微通道芯片设计3 3 3 4 】 图2 2 整体系统实物图 f i 9 2 2 t h ew h o ms y s t e mm a p 结合人体毛细血管长度范围，参照i c s h 对微孔滤膜和微孔长度的建议值，本 论文研究确定通道长度为3 0 t m ，截面积为5 x 5 2 9 i n ( 等效直径为6 1 m a 的毛细血管) 。 对比标准核孔滤膜的孔密度，确定通道排列密度为9 0 条m m 左右，实验中取8 0 条m m ，确定正方形边长为8 4 m m ，每边总通道数8 0 0 条。这样，微通道的整体形 状也就确定为一正方形硅片( 这种排列方式的另一好处是，划片方位与晶体解理 面一致，可减少划片时硅片破碎的概率) 。此外，在微通道的入口和出口处设计成 较小的转角( 图2 3 ) ，这样更加有力的保证了红细胞能顺利地进入微通道而不会 被划破，也使细胞不容易在入口处堵塞，最大限度的减小通道的出入口效应。为 了能在反射光下较清楚地观察到细胞进出通道的情况，在通道的入口及出口设计 了一段与通道底同水平面的台阶，我们将台阶部分流阻设计为通道部分每1 0 j m 长 的阻力，进而可确定入、出口处的水平台阶长度各为6 0 p m ，这个长度既能减少出 入口效应的影响，又能防止因台阶部分过长，附加阻力太大的问题。 此外，设计的关键还在于如何实现密封的微通道，对红细胞变形性测量而言，要 1 0 重庆大学硕士学位论文2 硅微通道阵列红细胞变形性测晕系统概述 求硅片和玻璃片的结合面不平度应小于l 岬，因此我们采用了硅一玻璃表面键合的 封装方式。 与一般血流变检测方法( 如电导法，衍射法) 相比，本微通道芯片具有可直接 观察细胞变形情况，并结合图像资料可分析单个和群体细胞流变特性，另外m e m s 加工的微通道尺寸控制精确，还可根据具体要求灵活设计通道形状和尺寸。 在芯片制作之前，为了解微流体在微通道中的流动情况及红细胞悬浮液在硅 微通道中的流体性质，课题组运用c o v e n t o r w a r e 软件对我们设计的微通道：占片和 微流体流过通道情况进行了仿真分析。仿真结果表明，我们设计的芯片在结构和 尺寸上对于红细胞变形性测量方面有着良好的流体性质，符合实际应用的要求。 本论文实验所用的硅微通道阵列芯片均在在信息部电子2 4 所制作完成，芯片三 维仿真图和实物图如图2 4 和图2 5 所示。 图2 3 显微镜下微通道阵列实物图 f i 9 2 3m i c r o c h a n n c l sa r r a ym a pu n d e rm i c r o s c o p e 图2 4 芯片三维图 f i g 2 43 dm o d e lo f t h ec h i p 图2 5 芯片实物图 f i g 2 5 p h o t oo f t h ec h i p 2 3 流路测控系统设计 流路测控系统主要实现压力控制、试样驱动、数据采集等功能。试样池、外 管路、压力计，芯片基座和几个阀门组成了一个完整的流路，其中外管路使用玻 璃制作，试样池和芯片基座均由有机玻璃制作，整个系统全部由a b 胶粘接在一起， 为一个密闭的流路，压力驱动采用真空泵驱动。流路系统示意图如图2 6 所示。 重庆大学硕士学位论文 2 硅微通道阵列红细胞变形性测量系统概述 图2 6 流路系统示意图 f i 9 2 6m a p o f f l o ws y s t e m 2 4 软件设计 系统软件设计是本论文的主要完成工作，包括基于理论模型的单个红细胞流 变性测量模块，高速图像采集模块和红细胞动、静态图像处理模块。 基于理论模型的单个红细胞流变性测量模块软件系统设计为论文前期主要工 作，主要功能包括对并行口的控制，通过u s b 7 3 1 0 模块控制外设并采集数据，然 后对采集的数据进行处理，并自动计算基于理论模型的红细胞变形性参数。同时 进行视频采集，并在电脑屏幕上实时显示。该模块软件设计原理框图如图2 7 所示： 图2 7 基于理论模型的单个红细胞流变性测量软件系统原理图 f i g 2 7 s k e t c hm a po f t h es o f t w a r e 重庆大学硕士学位论文 2 硅微通道阵列红细胞变形性测量系统概述 论文后期主要运用了高速摄像系统采集红细胞悬浮液过微通道的静、动态图 像。我们使用的是x c i t e x 公司的m i d a s2 0 软件模块进行。 红细胞图像处理模块主要完成对单个红细胞变形性的测量。对静态红细胞图 像部分主要有滤波、增强，边缘检测，红细胞特征参数提取等功能；此外，对红 细胞动态图像中红细胞过通道的速度、加速度等信息进行测量，并考虑到入口效 应的影响研究红细胞流变性。红细胞图像处理模块流程图如图2 8 所示。 图2 8 红细胞图像处理分析系统流程图 f i g 2 8 s t r u c t u r em a po f r b ci m a g ep r o c e s s i n g 由于本系统涉及较多的对硬件的操作，要求实现外设控制，数据采集，图像 处理等功能，因此，本论文选用v i s u a lc + + 和m a t l a b 作为软件开发工具。 图像采集部分是直接调用视频采集卡的有关函数来实现，在此就不赘述了。 2 5 本章小结 本章介绍了整个硅微通道阵列红细胞变形性测量系统的原理图，主要包括芯 片设计以及芯片的封装、流路设计、数据接口电路以及检测电路设计、软件设计 等部分。其中重点介绍了信号处理各子系统的方法和原理图。值得提出的是，微 芯片的设计，由于现有加工工艺的限制，生产出来的芯片在平整度、清洁度，特 别是通道壁陡峭程度上都达不到理论上的要求，因此也会对采集到的图像的质量 效果以及后期图像处理的效果产生一定影响。 重庆大学硕士学位论文 3 基于理论模型的红细胞变形性测量 3 基于理论模型的红细胞变形性测量 3 1 测量方法概述 红细胞变形性是微观特性，而实验中测量的是宏观结果，要想由宏观测量结 果获得具体到单个红细胞这一微观级别的定量的变形性信息，必须依赖理论模型。 而对于同样的实验结果，采用不同的理论模型进行数据处理可以导出不同的参数 来描述红细胞变形性。现有的这些参数之间彼此不一致，难以相互比较实验结果， 很多也没有具体到单个红细胞这一微观级别；而且有些参数是人为定义的，并没 有明确的微观物理含义，甚至有的参数其理论推导本身就存在错误：1 4 1 。 这部分研究是基于郑小林教授等人【2 9 删提出的硅微通道红细胞滤过试验新理 论模型，完成软件的设计和功能实现。该理论模型通过红细胞悬浮液宏观特性， 推导出了直接反映单个细胞通过微通道阻力的b 参数和反映单个细胞堵塞微通道 的比率( 概率) 的参数的计算公式，见式( 3 1 ) 和式( 3 2 ) 。 声参数：反映单个细胞通过微通道的阻力。卢越大，变形性越差。 f1 2 尝棚言+ 1 式( 3 1 ) 气 爿 式( 3 1 ) ：土障一1 ) + 1 日、q 7 式中，q 6 为纯缓冲液的流量，q o 为红细胞悬浮液在t = 0 时的初始流量。h 为红细 胞压积。 参数：反映单个细胞堵塞微通道的比率( 概率) 。s 越大，表明红细胞堵 塞越严重。 占：丝堕式( 3 2 ) a vh a p 式中，q r 为红细胞悬浮液滤过体积，a v 为红细胞悬浮液滤过体积，助为红 细胞体积，r 0 为缓冲液通过单个通道所受的阻力，可由式( 3 3 ) 求得，4 p 为通道 两端的压差。a q , 可由红细胞悬浮液的流量比滤过体积曲线9 矿曲线求得。 a 矿 r = 垒c l = 垩f f a + 粤a = 等 柏3 船 式中将通道视为半径为a ，长为l 的圆柱形通道，缓冲液的粘度为，缓冲液 在4 p 作用下通过单个通道的流量为q ，l e = l + 3 x a 8 ，为微通道的有效长度。 重庆大学硕士学位论文3 基于理论模型的红细胞变形性测量 这两个反映红细胞变形性双参数指标直观、具体、微观物理意义明确，适于 在等压法中表达红细胞变形性。 正如国际血液学标准化委员会血液流变学专家组所指出在微循环中，少数异 常红细胞难以通过毛细血管的入口、分支等关键部位。这种红细胞对体内循环有 不成比例的作用，它们在体外孔道过滤实验中可能对结果有决定性的影响3 卯。事实 上，与平均变形性相比，堵塞现象反映了红细胞变形性的个体差异，在许多情况下更 具有临床诊断意义曙们。以往的理论模型没有考虑这一重要现象，而郑小林教授等人 提出的硅微通道红细胞滤过试验理论模型在不增加实验量的情况下方便地提取了 堵孔比率这一明确的定量信息，克服了以往b l a c k s h e a r 模型、j o n e s 模型和 k o u t s o u r i s 模型【4 】的不足。相信这一理论模型将有助于过滤法测量红细胞变形性的 检测方法在血液流变学临床和基础研究上的进一步应用。但是，此理论模型仍存 在不完善之处，如采用的阻力系数口不能区分入孔阻力、通道中移动的阻力和出 孔阻力等 4 3 5 1 1 3 7 3 扪。 这部分检测方法的系统框图如图3 1 所示。 图3 1 系统组成框图 f i g 3 1s l l u , y m r em a po f s y s t e m 3 2 方案实现 3 2 1 图像采集 。 图像采集系统的硬件由显微镜、摄像头和视频采集卡组成。 由于硅片是不透可见光的，故采用奥林巴斯b x s l m 型显微镜透过覆盖在硅微 通道上方的玻璃片来观察红细胞悬浮液在微通道中的流动情况。微通道尺寸在微 米级，为获得较好的放大图像，采取以下测量参数： 高倍率放大图像的获取 为了便于观察、分析细胞形状变化，需要将细胞从p a n 级放大到接近c m 量级， 因此放大倍率应在1 0 3 1 0 4 量级。我们将摄像头是直接接在显微镜的目镜上的那 么总的放大倍数为物镜放大倍数目镜放大倍数。 重庆大学硕士学位论文3 基于理论模型的红细胞变形性测量 则当物镜选5 0 x ，目镜1 0 x 时，总放大倍数为 5 0 1 0 = 5 0 0 ( 倍)式( 3 4 ) 分辨率由物镜的放大倍数决定，即与物镜的放大倍数成正比。我们采用的日 本奥林巴斯b x s l m 型金相显微镜，参照其产品说明书，在使用1 0 倍m p l a n 物镜 时，其数值孔径n a 为o 2 5 ，分辨率r 为1 3 4 1 u n ，工作距离为1 0 6 m m ；使用5 0 倍l m p l a n f i 物镜时，其数值孔径n 丸为0 5 0 ，分辨率r 为0 6 7 啦n ，工作距离为 1 0 6 m m 。 放大倍数与景深 因为我们设计的微通道深为5 p m 左右，为了看清通道内情况，应选择景深在 2 s p a n 量级。显微镜的景深与放大倍数和n a 成反比： 景深d y = 夏刁n x 面2 + 而五i n i 西 式( 3 5 ) 式中m 为显微镜总放大倍数，n 为物镜与物体间媒质的折射率，对选用的显 微镜，选用l o 倍、5 0 倍物镜及1 0 倍目镜时的景深为1 8 4 1 t m 和2 5 岬。同时，我 们选用了长工作距离物镜，以避免发生由于镜头和标本之间距离太近而影响采光， 使图像景深缩短，对比度下降的情况。 论文前期做红细胞变形性检测时使用的是图像摄取采用c c d ( c h a r g e - c o u p l e d d e v i c e s ) 摄像头( 后期改用了高速摄像系统，在第四章详细论述) 。c c d 的分辨 率由c c d 感光元件数决定，并用调制传递函数m a y ( 0 表示。为获得高的空间分辨 率，应选截止频率高的c c d ，并在频响范围内使m r f ( f ) 愈高愈好。这里我们选用 的是松下的c c d 摄像头。 我们使用a v e rm e d i a 的a v c a p 视频采集卡，该卡提供对s 端子、兼容制 式端子的支持；提供p a l 、n t s c 等几种制式支持；该卡可以基本支持2 4 帧秒的 实时采集并且提供了较好的软件二次开发的能力。 3 2 2 红细胞变形性双参数指标测量 由3 1 节可知，为测得我们理论模型中的红细胞变形性双指数参数b 和8 ，需 要计算红细胞悬浮液的流量比滤过体积曲线的斜率，因此，我们在硬件上运用红 外光电管对阵列及其接口电路和u s b 7 3 1 0 模入数据采集模块来间接测量红细胞悬 浮液流量信息。而后，通过软件实时读取u s b 7 3 1 0 模入数据采集模块的数据，即 实时检测红外光电管对阵列的电压变化，再转化为时间信息自动描绘红细胞悬浮 液流量比滤过体积曲线，并计算红细胞变形性双指数参数p 和8 。 这里简单介绍一下u s b 7 3 1 0 模入接口模块。该模块适用于提供了u s b 接口 的p c 系列微机，具有热插拔、即插即用( p n p ) 功能。其操作系统可选用w i n d o