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细胞分裂素和生长素对u v - b 诱导气孔关闭的 效应及其机制研究 韩燕 摘要u v b 辐射增强是目前人们普遍关注的环境问题之一，细胞分裂素( c t k ) 生长素( a u x i n ) 对植物生长发育有重要调控作用，n o 和h 2 0 2 是植物重要信号分子。 研究表明u v b 促进气孔关闭、c t k 和a u x i n 促进气孔开放均与保卫细胞n o 、 h 2 0 2 有关。自然条件下太阳辐射对气孔运动的调控必然涉及u v b 与c r k 、a u x i n 的相互作用，但这种相互作用及其与n o 、h 2 0 2 的关系目前尚未见报道。本文以 蚕_ 豆( h c i af a b al 1 下表皮为材料，借助表皮条分析及激光共聚焦显微镜技术，研 究c t k ( 6 b a 、k t 和z t ) 和a u x i n ( i a a 、n a a 和2 ，4 一d ) 对u v - b 诱导气孔关闭 的效应及其作用机制，旨在为进一步完善保卫细胞信号转导途径和网络，丰富和 发展气孔运动机制理论奠定基础。主要结果如下： 1 前人证明u v - b 提高保卫细胞n o 、h 2 0 2 水平进而诱导气孔关闭。我们的 实验结果表明c t k ( 6 b a 、k t 、z d 、a u x i n ( i a a 、n a a 、2 ，4 - d ) 抑制u v b 诱 导气孔关闭，其效应可被c - p t i o ( n o 清除剂) 、h b ( n o 清除剂) 、l - n a m e ( n o 合成酶n o s 抑制剂) 、a s a ( h 2 0 2 清除剂) 、c a t ( h 2 0 2 酶) 、s h a m ( 细胞壁过 氧化物酶抑制剂) 而非d p i ( n a d p h 氧化酶抑制剂) 模拟，暗示6 b a 、k t 、 z t 和i a a 、n a a 、2 ，4 d 抑制u v b 诱导气孔关闭与降低保卫细胞n o 、h 2 0 2 水平有关，且u v - b 诱导h 2 0 2 生成可能通过细胞壁过氧化物酶途径而非n a d p h 氧化酶途径。 2 借助n o 、h 2 0 2 特异性荧光探针和l s c m 技术发现，与c - p t i o 、工n a m e 相似，6 b a 、k t 、z t 和i a a 、n a a 、2 ，4 d 确实抑制u v - b 诱导蚕豆保卫细胞 n o 水平升高。与a s a 、s h a m 相似，6 b a 、k t 、z t 和i a a 、n a a 、2 ，4 - d 确实抑制u v - b 诱导蚕豆保卫细胞h 2 0 2 水平升高。此与上述激素、清除剂和抑制 剂抑制u v - b 诱导气孔关闭的结果一致，表明6 - b a 、k t 、z t 和i a a 、n a a 、2 ， 4 - d 确实通过降低保卫细胞n o 、h 2 0 2 水平抑制u v - b 诱导气孔关闭。 3 与c p 1 1 0 、a s a 相似，6 b a 、k t 、z t 促进u v - b 诱导下已关闭气孔重新开 放。与n a m e 、s h j m 相似，i a a 、n a a 、2 ，乒d 未促进u v b 诱导下已关闭气 孔重新开放。此结果表明6 b a 、k t 、z t 与n o 、h 2 0 2 清除剂的效应一致，而i a a 、 n a a 、2 ，4 - d 与n o 、h 2 0 2 合成酶抑制剂的效应一致，这种一致暗示6 b a 、k t 、 z t 可能通过清除u v - b 诱导下已生成的n o 、h 2 0 2 促进己关闭气孔重新开放，而 i a a 、n a a 、2 ，4 d 对u v - b 诱导下已生成的n o 、h 2 0 2 无清除效应，因而未使己 关闭气孔重新丌放。 4 借助n o 、h 2 0 2 特异性荧光探针和l s c m 技术，发现u v - b 处理4 h 末保卫细胞 n o 、h 2 0 2 水平较高，此时加入6 b a 、k t 、z t 、c - p t i o ，9 0 0 5 内n o 水平即明显 降低，2 h 时明显低于对照。此时加入6 。b a 、k t 、z t 、a s a ，9 0 0 s 内h 2 0 2 水平亦 明显降低，2 h 时亦明显低于对照。此结果表明，与c p 1 1 0 、a s a 一样，6 - b a 、k t 、 z t 确有清除u v - b 诱导下已生成n o 、h 2 0 2 的效应，这与6 一b a 、k t 、z t 促进u v - b 诱导下已关闭气孔重新开放的结果一致。 5 借助n o 、h 2 0 2 特异性荧光探针和l s c m 技术，发现u v - b 处理4 h 末保卫细 胞n o 、h 2 0 2 水平较高，此时加入i a a 、n a a 、2 ，4 d 、l - n a m e ，9 0 0 s 内n o 水 平无明显降低，2 h 时亦与对照无差异。此时加入i a a 、n a a 、2 ，4 d 、s 矾m ， 9 0 0 s 内h 2 0 2 水平未见变化，2 h 时亦与对照无差异。此结果表明，类似n a m e 和 s h a m ，i a a 、n a a 和2 ，4 d 确无清除u v - b 诱导下已生成的n o 、h 2 0 2 的效应， 这与i a a 、n a a 和2 ，4 d 未能促进u v - b 诱导下已关闭气孔重新开放的结果一致。 综上所述，将6 b a 、k t 、z t 和i a a 、n a a 、2 ，4 d 均抑制u v - b 诱导n o 、 h 2 0 2 水平提高和气孔关闭的结果与6 b a 、k t 、z t 降低u v - b 诱导下已生成的 n o 、h 2 0 2 进而促进气孔开放，i a a 、n a a 、2 ，4 - d 未降低u v - b 诱导下已生成 的n o 、h 2 0 2 亦未促进气孔重新开放的结果联系起来考虑，可以得出6 - b a 、k t 、 z t 通过清除、而i a a 、n a a 、2 ，4 d 通过抑制合成阻止u v - b 诱导n o 、h 2 0 2 水平提高和气孔关闭的结论。 关键词：细胞分裂素；生长素；u v - b ；气孔关闭；一氧化氮；过氧化氢 t h ee f f e c ta n dt h em e c h a n i s mo fc t k , a u x i ni n 、l b i n d u c e ds t o m a t a lc l o s u r e h a n y a n a b s t r a c tt h ee n h a n c e m e n to fu v - br a d i a t i o ni so n eo fe n v i r o n m e n t a lp r o b l e m w h i c hd r a w sg r e a ta t t e n t i o n sr e c e n t l y c y t o k i n i n ( c t k ) a n da u x i n ，a r ei m p o r t a n ti n r e g u l a t i n gp l a n tg r o w t ha n dd e v e l o p m e n t b o t hn o a n dh 2 0 2a r es i g n i f i c a n ts i g n a l i n g m o l e c u l e si np l a n t s r e s e a r c h e sh a v es h o w nt h a tn oa n dh 2 0 2a r ei n v o l v e di nb o t h u v b i n d u c e ds t o m a t a lc l o s u r ea n dc t k , a u x i n - i n d u c e ds t o m a t a lo p e n i n g i nn a t u r e 。 t h er e g u l a t i o no fs t o m a t a lm o v e m e n tb ys o l a rr a d i a t i o ni n e v i t a b l yi n v o l v e st h e i n t e r a c t i o nb e t w e e nu v - ba n dc n ( a u x i n b u tt h i si n t e r a c t i o na n di t sr e l a t i o nt on o a n dh 2 0 2y e th a v en o tb e e nr e p o r t e d i no r d e rt oi n t e g r a t et h ei n t r i c a t en e t w o r ko f s i g n a l i n gp a t h w a y si ng u a r dc e l l s ，e n r i c ha n dd e v e l o p d a t ao nm e c h a n i s m so fs t o m a t a l m o v e m e n t s ，t h ee f f e c t sa n dt h em e c h a n i s mo fc r k , a u x i no nu v - b - i n d u c e ds t o m a t a l c l o s u r ei nv a c i af a b alw e r es t u d i e dh e r eb ye p i d e r m a l s t r i pb i o a s s a y a n d l a s e r - s c a n n i n gc o n f o c a lm i c r o s c o p y t h em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w e d ： 1 f o r m e rr e s e a r c hh a dp r o v e dt h a tu 、，二bc o u l de n h a n c en 0a n dh 2 0 2l e v e l si n g u a r dc e l l s ，t h e r e b yi n d u c et h es t o m a t a lc l o s u r e o u rr e s u l t ss h o w e dc y t o k i n i n ( 6 一b a ， k t , z t ) a n da u x i n ( i a a ，n a a ，2 ，4 - d ) o nr e v e r s i n gu v - b - i n d u c e ds t o m a t a lc l o s u r e c o u l db ei m i t a t e d b yc - p t i o ( n os c a v e n g e r ) ，h b ( n os c a v e n g e o , l - n a m e ( n o s y n t h a s ei n h i b i t o r ) a n da s a ( h 2 0 2s c a v e n g e r ) ，c a t ( c a t a l a s e ) ，s h a m ( c e l lw a l lp o d i n h i b i t o r ) b u tn o td p i ( n a d p ho x i d a s ei n h i b i t o r ) t h i sp r o b a b l ys u g g e s t e dt h a t6 一b a , k t , z ta n d 雌n a a , 2 ，4 - dr e v e r s e du v - b - i n d u c e ds t o m a t a lc l o s u r eb yr e d u c i n g n oo rh 2 0 2i ng u a r dc e l l s f u r t h e r m o r e ，t h eg e n e r a t i o no fe n d o g e n o u sh 2 0 2i sl i k e l y t h r o u g hc e l lw a l lp o dp a t h w a yb u tn o tn a d p h o x i d a s ep a t h w a y 2 u t i l i z i n gs p e c i f i cf l u o r e s c e n ti n d i c a t o rf o rn o o rh 2 0 2a n dl s c mt e c h n i q u e ，i t h a db e e nf o u n dt h a tt h ei n c r e a s eo fn oi ng u a r dc e l l sp r o m o t e db yu v - bc o u l db e p r e v e n t e db y6 - b a , k t , z ta n dn a n a a , 2 ，禾d ，w h i c hw a ss i m i l a rt oc - p 1 1 0o r l - n a m e a n da st h ee f f e c to f a s ao rs h a m ，6 b a , k t , z ta n d 姒n a a , 2 ，t d c o u l dp r e v e n tt h ei n c r e a s eo fh 2 0 2i ng u a r dc e l l sp r o m o t e db yu v - b t h e s er e s u l t s w e r ei na c c o r d a n c ew i t ht h ee p i d e r m a ls t r i pb i o a s s a y a l lt h e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a t t h ep r o h i b i t i v ee f f e ：c t so f6 一b a ，k t , z ta n du 峨n 眠2 ，4 - do nu v - b i n d u c e d s t o m a t a lc l o s u r ew e r ed e f i n i t e l yr e l a t e dt ot h ed e c r e a s i n go fn oo rh e 0 2i ng u a r dc e l l s 3 6 - b a ，k ta n dz t , s i m i l a rt oc - p t i oo ra s a ，c o u l dp r o m o t et h ec l o s e ds t o m a t a i n d u c e db yu v - bt oo p e na g a i n y e t ，i a a ，n a aa n d2 ，4 - d ，j u s tl i k ed p io rl - n a m e ， c o u l dn o tp r o m o t et h ec l o s e ds t o m a t ai n d u c e db yu v - bt oo p e na g a i n i no t h e rw o r d s ， 6 一b a ，k ta n dz th a ss i m i l a re f f e c t so fn oa n dh 2 0 2s c a v e n g e r sw h i l e 呲n a aa n d 2 。4 dh a ss i m i l a re f f e c t so ft h e i rs y n t h e s i si n h i b i t o r s t h ea c c o r d a n c ep e r h a p s i n d i c a t e dt h a t6 - b a ，k ta n dz tp r o m o t e dt h ec l o s e ds t o m a t at oo p e nb ys c a v e n g i n g t h eh i g hl e v e lo fn oo rh 2 0 2i n d u c e db yu v - bd i r e c t l yw h i l ei a a n a aa n d2 ，4 d c o u l dn o tp r o m o t et h ec l o s e ds t o m a t at oo p e nf o rt h e yh a v en os c a v e n g i n ga b i l i t yo n n oo rh 2 0 2i n d u c e db yu v - b 4 u t i l i z i n gs p e c i f i cf l u o r e s c e n ti n d i c a t o rf o rn oo rh 2 0 2a n dl s c mt e c h n i q u e ，i t h a db e e nf o u n dt h a t ，a l t h o u g ht h ef l u o r e s c e n tl e v e lo fn oa n dh 2 0 2i ng u a r dc e l l sw e r e h i g ha f t e rd e a l tw i t hu v - bf o rf o u rh o u r s t h el e v e lo fn o w o u l dd e c r e a s ec l e a r l yi n 9 0 0 sa f t e r6 一b a , k t , z ta n dc - p 1 1 0w e r ea d d e da n dt h ef l u o r e s c e n tl e v e lw a s s i g n i f i c a n t l yw e a k e rt h a nt h eb l a n kc o n t r a s tt w oh o u r sl a t e r s i m i l a r l y , t h el e v e lo f h 2 0 2a l s od e c r e a s e dc l e a r l yi n9 0 0 sa f t e r6 b 八k t , z ta n da s a w e r ea d d e da n dt h e f l u o r e s c e n tl e v e lw a ss i g n i f i c a n t l yw e a k e rt h a nt h eb l a n kc o n t r a s tt w oh o u r sl a t e r t h e s er e s u l t ss u g g e s t e d6 - b aa n dk t , a sc - f t l oo ra s a , c o u l ds c a v e n g et h e g e n e r a t e dn o o rh 2 0 2i ng u a r dc e l l si n d u c e db yu v - b a n dt h e s er e s u l t sw e r ea g r e e w i t ht h ee f f e c t so f6 - b 八k ta n dz tp r o m o t i n gt h eu v - b i n d u c e dc l o s e ds t o m a t at o o p e na g a i n 5 u t i l i z i n gs p e c i f i cf l u o r e s c e n ti n d i c a t o rf o rn oo rh 2 0 2a n dl s c mt e c h n i q u e ，i t h a db e e nf o u n dt h a t ，a d d e di 从，n a a , 2 ，4 一da n dl - n a m ec o u l dn o tc h a n g et h eh i g h l e v e lo fn 0i n d u c e db yf o u rh o u r s u v - br a d i a t i o ni n9 0 0 s ，n e i t h e ri n2h o u r s s i m i l a r l y , 姒，n a a , 2 ，4 - da n ds h a m a l s oc o u l dn o tc h a n g et h eh i g l il e v e lo fh 2 0 2 i n d u c e db yf o n rh o u r s u v - br a d i a t i o ni n9 0 0 s ，n e i t h e ri n2h o u r s t h u s ，i tc o u l db e c o n c l u d e dt h a tl 虬n a aa n d2 ，4 - d ，j u s tl i k el - n a m eo rs h a m ，c o u l d n t s i g n i f i c a n t l yr e d u c eu v - b i n d u c e dh i g hl e v e lo fn o o rh 2 0 2i ng u a r dc e l l s t h e s e r e s u l t sw e r ej u s ti na c c o r dw i t ht h ee p i d e r m a ls t r i pb i o a s s a y t os u mu p ，6 - b a , k t , z ta n d n a & 2 ，4 dc o u l dp r e v e n tu v - b - i n d u c e d i n c r e a s eo fn 0o rh 2 0 2a n dr e v e r s e du v - b i n d u c e ds t o m a t a lc l o s u r e 。6 - b a , k ta n d z td e c r e a s e dt h eh i 【g hl e v e lo fn oa n dh 2 0 2i n d u c e db yf o u rh o u r s u v - br a d i a t i o n i v a n dp r o m o t e dt h ec l o s e ds t o m a t at oo p e na g a i n w h i i e1 a a n a a2 ，4 dc o u l d n t d e c r e a s et h eh i g hl e v e lo fh 2 0 2o rn 0i n d u c e db yf o u rh o u r s u v o br a d i a t i o na n d c o u l d n tp r o m o t et h ec l o s e ds t o m a t at oo p e n s y n t h e t i c a l l y , i tc o u l db ec o n c l u d e dt h a t 6 b a k ta n dz tr e v e l s e du v - b i n d u c e ds t o m a t a lc l o s u r et h r o u g hd i r e c t l y s c a v e _ i g i n gt h en o o rh 2 0 2i n d u c e db yu v b ，w h i l e 认an a aa n d2 ，4 - dr e v e r s e d u v 二b i n d u c e ds t o m a t a lc l o s u r eb yi n h i b i t i n gt h es y n t h e s i so ft h eg e n e r a t i o no fn 0o r h 2 0 2i n d u c e db yu v b k e y w o r d s ：吣a u x i n ；u l t r a v i o l e tb ；s t o m a t a lc l o s u r e ；n i t r i co x i d e ；h y d r o g e n p e r o x i d e v 主要缩略语词汇表 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。尽我所知，除文中已经注明引用的内容外，论文中不包含其他个人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得陕西师范大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均 已在文中作了明确说明并表示谢意。 作者签名：牲 日期：幽! ：2 学位论文使用授权声明 本人同意研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属陕西师范大 学。本人保证毕业离校后，发表本论文或使用本论文成果时署名单位仍为陕西 师范大学。学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其它指定机构送交论文 的电子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进 入学校图书馆、院系资料室被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进 行检索；有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。 作者签名：雄垫日期：盆也2 ：么彳 引言 植物叶表面的气孔是植物体与外界环境进行气体和水分交换的窗口，它能够对 外界生物和非生物刺激包括紫外辐射( u v - b ) 和植物激素作出灵敏的反应。组成气 孔的保卫细胞因其独特的形态结构和生理功能成为研究植物细胞信号转导的模式 系统。 一氧化氮( n o ) 和过氧化氢( h 2 0 2 ) 分别为活性氮和活性氧，它们一直被认为是 生物毒性分子，然而越来越多的证据证明n o 和h 2 0 2 作为信号分子在植物的许多 生理过程如生长发育、防御反应、植物抗逆性、细胞凋亡以及基因表达等发面都 发挥了重要作用。在逆境条件下，n o 和h 2 0 2 作为植物应激反应的早期信号分子， 能够与其它信号分子协同作用，启动植物细胞内一系列反应，保护植物体免受环 境胁迫损伤。 环境污染导致臭氧层减薄，使到达地球表面的u v b 辐射增强，u v b 辐射对 植物生长发育、形态结构、生理生化、基因表达及生态系统等方面均有重要影响。 细胞分裂素( c y t o k i n i n ) 和生长素( a u x i n ) 作为传统植物激素，对植物生长发育及代 谢过程也有重要影响，包括参与植物信号转导过程。 本文主要研究细胞分裂素和生长素对u v - b 诱导气孔关闭的逆转效应及其与 n o 、h 2 0 2 的关系。现将国内外相关研究现状综述如下： 1 文献综述： 1 1 气孔运动和保卫细胞信号转导研究概述 1 1 1 保卫细胞的特点 多数植物叶表面的气孔由一对保卫细胞围成，它控制着植物体与外界环境之 间的气体和水分交换，调节和影响着植物的许多重要生命活动过程，如光合作用、 蒸腾作用、呼吸作用及矿质元素的吸收和运转等【n 。因此，气孔运动机理一直是 重要植物生理学问题之一。近年来，细胞感应与细胞信号转导研究逐渐兴起，构 成气孔的保卫细胞由于其结构和生理功能的特殊性也随之成为该领域研究普遍使 用的模式系统。保卫细胞的主要特点有： ( 1 ) 保卫细胞胞壁厚度不同，内厚外薄，胞壁中的微纤丝是以气孔口为中心，扇形 辐射排列，保卫细胞吸水膨胀时，此结构利于气孔张开； ( 2 ) 许多植物( 尤其是蚕豆和鸭跖草等) 的表皮条较易获得，可方便处理并用于保 卫细胞变化的观察； ( 3 ) 成熟保卫细胞无具生理功能的胞问连丝，即其与周围细胞的联系相对薄弱，此 特征有利于针对单个保卫细胞的研究： ( 4 ) 同一植物材料中保卫细胞体积比普通表皮细胞小，因而只要合成或运入极少量 可溶性物质，即会使其水势明显下降并吸水，从而导致保卫细胞膨压增大，气孔 开度增加； ( 5 ) 保卫细胞能对多种外源刺激如光( 蓝光、红光、紫外线等) 、水分、温度、c 0 2 浓度、渗透胁迫、机械胁迫和植物激素( 如脱落酸、生长素、乙烯) 等作出迅速 反应。 另外，激光扫描共聚焦显微镜、膜片钳等技术的使用，使得胞内离子( 如c a “) 、 自由基( 如n o 、h 2 0 2 ) 等信号成分的测定成为可能，使保卫细胞信号转导研究进 程大大加速。 1 1 2 气孔运动机理 解释气孔运动机理的学说有三种，即淀粉一糖转化学说( s t a r c h s u g a rc o n v e r s i o n t h e o r y ) 、无机离子吸收学说( i n o r g a n i ci o nu p t a k et h e o r y ) 及苹果酸生成学说( m a l a t e p r o d u c t i o nt h e o r y ) 。最近几年来，随着细胞感应和细胞信号转导研究的兴起及各种 技术手段( 包括激光扫描共聚焦显微镜、膜片钳和分子生物学方法等) 的结合应 用，气孔运动机理及保卫细胞信号转导研究也有了长足的进展。 目前的研究已揭示出气孔运动过程中所发生事件的基本轮廓。首先，气孔保 卫细胞质膜上的受体感受外界环境或植物自身信号的刺激。外界信号包括光、水 分、渗透胁迫、温度、c 0 2 、机械胁迫等伫1 ，自身信号则包括活性氧氮( h 2 0 2 、 n o 等) 、植物激素( a b a 、i a a 、乙烯等) 以及一些次生代谢物( j a 、s a 等) 。 这些信号转换为胞内信号第二信使( c a 2 + 、p h i 、i p 3 j d g 双信使、c a d p r 、 c a m p 、c g m p 等) i s 】，并激活质膜上多种离子通道( k + 、c a 2 + 、c i 通道等) 和 与生理生化代谢相关的酶类( 蛋白激酶、蛋白磷酸酶等) 。此时，保卫细胞质膜 上的h + - a t p a s e 被激活，引起h + 外流和质膜超极化，进而促使内向k + 通道开启 和k + 进入细胞，同时a 。经c l 。转运体( c i - o h 或c r h + ) 进入细胞，这些离子和 保卫细胞合成的苹果酸及其它有机化合物共同降低了保卫细胞的渗透势，因而使 保卫细胞吸水膨胀，气孔开放。反之，保卫细胞内、外钙库中c a 2 + 释放到胞质 中，导致胞质c a 2 + 浓度升高，从而活化阴离子通道并使质膜去极化，激活外向 k + 通道和阴离子通道，抑制内向k + 通道活性，促使k + 、a 。等离子外流以及苹果 酸等渗透调节物质水平下降，导致保卫细胞失水，气孔关闭。上述过程可概括为 刺激与感受信号转导反应几个阶段1 4 l 。气孔运动过程包含着复杂的信号 2 转导机制，目前气孑l 运动研究主要集中在胞外刺激、膜转运系统、信号转导、细 胞骨架和液泡等领域1 5 w 。 1 2 n 0 与气孔运动 1 2 1n o 生物学活性的发现 n o 是一种兼具水溶性和脂溶性的气体小分子自由基，半径小，电中性，因 而很容易扩散。低浓度n o 能跨膜扩散穿过若干层细胞，在细胞闻长距离穿梭， 刺激受体细胞做出不同应答1 1 0 1 ：高浓度n o 则与活性氧反应生成强氧化剂o n o o ， 对蛋白质、脂类、d n a 和r n a 产生很强的毒害作用1 1 “，因而一氧化氮( n o ) 长 期被认为是生物毒性分子【1 2 , 1 3 1 。自1 9 8 7 年发现并证明内皮细胞衍生舒张因子 ( e n d o t h e l i u m - d e r i v e dr e l a x i n gf a c t o r , e d r f ) 的本质是n o ，硝酸甘油的扩张血管作用 通过其代谢产物n o 实现，关于n o 的研究才备受关注。1 9 9 2 年，n o 被s c i e n c e 杂志选为明星分子。1 9 9 8 年，美国药理学家f u r c h g o t t 等三人因发现n o 是调节 血压和血流的信号分子被授予诺贝尔生理学和医学奖。短短数十年间，n o 在医 学、生理学、生物学、化学、药学等学科的研究高潮勃然兴起。近年来，n o 在 动物中的各种生物学活性已有很多报道，而植物n o 信号转导研究直到1 9 9 6 年才 逐渐成为一个热点。众多研究结果表明，n o 作为重要信号分子参与植物生长发 育的许多过程，如呼吸作用1 1 4 1 、种子萌发1 1 5 , 1 6 1 、侧根形成1 1 7 1 、根和叶的生长发育 1 8 , 1 9 】、气孔运动l 刎、光合磷酸化1 2 1 1 、光形态建成【1 5 1 、果实等组织的成熟和衰老f 2 2 , 2 3 1 、 病原体防御反应【2 4 i 、细胞凋亡【2 5 , 2 6 1 及植物抗逆反应1 1 9 1 等。 1 2 2 植物n o 产生途径 不同物种、组织、细胞在特定条件下n o 产生的机制不尽相同。概括来说，植 物体内n o 的产生途径包括一氧化氮合酶途径( n i t r i co x i d es y n t h a s e ，n o s ) 、硝酸 还原酶途径( n i t r a t er e d u c t a s e ，n r ) 、黄嘌呤氧化还原酶途径伍a n t h i n e o x i d o r e d u e t a s e ，x o r ) 和非酶促反应途径。 1 2 2 1 一氧化氮合酶( n o s ) 途径 研究证实哺乳动物中精氨酸、n a d p h 和分子氧在一氧化氮合酶( n o s ) 催化 下生成n 0 、n a d p + 和l 瓜氨酸。n o s 的激活需要辅助因子如f a d 、f m n 、血红素、 四氢叶酸、c a 2 + c a m 和2 1 1 2 4 - 等的参与。不少动物n o s 被纯化，基因已被克隆1 2 7 】。 根据活性诱导条件，n o s 可划分为e n o s ( c o n s t i t u t i v en o s ) 和i n o s ( i n d l l e i b l e n o s ) 。根据细胞类型则可分为n n o s ( 结构或神经元中钙调节性n o s ) 、j n o s f 细胞 因子诱导性n o s ) 及e n o s ( 内皮细胞中钙调节性n o s 、i 嚣l 。目前主要是通过检测植 物组织中是否具有n o s 活性、动物n o s 抑制剂能否影响植物的正常生理功能以及 使用哺乳动物n o s 抗体对植物匀浆进行w e s t e r nb l o t t i n g 等探究植物中是否存在 3 n 【) s o 1 9 9 6 年，n i n n e m a n nh 等首次提出高等植物体内存在一氧化氮合酶( n o s ) 活 性。随后，研究者们在烟草花叶病毒( t m 、细菌病原体或激发子处理的烟草、 大豆和拟南芥中发现了n o s 类似酶活性的存在，此种类似酶可以把精氨酸转化 为瓜氨酸【2 9 l 。r i b e i r oea 等运用抗体和酶活性检测方法证明t t , 米中也存在 一氧化氮合酶。w e s t e r n 免疫印迹结果表明，玉米根和幼叶中可溶性蛋白质部分所 含1 6 6 k d a 片断与老鼠i n o s 和兔子n n o s 同源，而且从玉米中提取的酶能将同位素 标记的精氨酸转变为瓜氨酸。动物n o s 的抑制剂( 上n a m e ) 能降低伽蓝菜和红豆杉 叶片薄壁细胞、保卫细胞和表皮细胞中的n o 水平，明显减少伤害诱导的n o 合成 以及n 0 引起的细胞程序性死亡1 2 5 l 。使用抗动物n o s 的单克隆抗体在植物组织中也 发现了专一的免疫反应蛋白1 3 l 】。在蚕豆保卫细胞中，已有报道a b a 诱导的气孔关 闭和n o 合成能被l n a m e 抑制，暗示蚕豆保卫细胞中也存在n o s 活性，且其调节 的n o 合成参与了a b a 诱导的气孑l 关闭1 3 “。最近，g u o 等的实验结果表明拟南芥中 的a t n o s l 基因能够编码一种n o s ，它催化精氨酸向瓜氨酸的转化，其活性能为动 物n o s 抑制剂所抑制，调节着拟南芥的生长和激素信号转导。但这种a t n o s l 基因 与哺乳动物n o s 基因序列不同1 3 3 】，说明植物n o s 与动物n o s 可能有较大区别，植 物中存在n o s 的分子生物学证据仍待探寻。 1 2 。2 2 硝酸还原酶亚硝酸还原酶( n r i n r ) 途径 除n o s 外，植物中依赖n a d ( p ) h 的硝酸盐或亚硝酸盐还原酶也介导n o 产 生。n r 是植物氮代谢中的重要调节酶和限速酶，它包含两个辅基( f a d 和血红素) 及一个钼喋呤中心，可以将电子从n a d ( p ) h 转移到在n 0 3 。，催化n 0 3 还原为 n 0 2 ，n o r 进一步在n i r 催化下还原为n o l 3 4 i 。 1 9 8 1 年，h a r p e rj e 等【3 5 】在分析大豆叶片组织活性时检查到不依赖氧气的n o x ( n o + n 0 2 + n z o ) 产生现象，他们进一步将组成型n r ( c n r ) 纯化进而证实n o x 是c n r 释放的。d e a nj v 和h a r p e rj e 【3 6 l 用大豆硝酸还原酶突变体进行实验，发现其不能 像野生型大豆一样释放n o ，表明n r 可能是催化n o 产生的另一酶源。由于组成型 n a ( c n a ) 是豆科植物特有的酶，n r 途径产生n o 曾一度被认为是豆科植物所特有 的现象【蚓。然而后来的研究表明，在一些非豆科植物中也有通过硝酸还原酶途径 产生n o 的能力。y a m a s a k ih 1 37 l 发现玉米中诱导型硝酸还原酶能够以n a d h 为电 子供体，催化亚硝酸盐的单电子还原合成n o 。r o c k e lp 1 3 s j 等发现，除玉米外，向 日葵的n r 和离体菠菜叶片及其脱盐后的提取液中的n r 在离体和连体情况下都能 催化亚硝酸盐的单电子还原并合成n o ，其中暗处理下n o 的释放量明显高于光照 条件下。太阳花、甘蔗、葡萄、云杉、烟草等非豆科植物在一定条件下也都能通 4 过n r 释放n o 气体1 3 9 l 。此外，r o c k e l l 3 8 l 还发现在无外来病原菌侵染的太阳花和菠 菜叶中，n o 主要来源于n r 催化产生。d e s i k a n ! ”】也指出通过n r 途径产生n o 是 a b a 诱导拟南芥气孔关闭所必需的。 植物中硝酸盐、亚硝酸盐和硝酸还原酶一般存在于胞质中，近来在烟草根质 膜上也检测到n r 活性1 4 0 1 。植物体不同组织或器官中n r 的影响因子不同，例如 叶片中的n r 主要受光调控，而根中的n r 则不存在光暗依赖性。n r 除了受环境 条件( 如光照、p h 、温度、c 0 2 和0 2 等) 的快速调节外，还受外来物质或刺激 ( 如果糖、酚类物质、c a “、蛋白激酶、蛋白磷酸酯酶、盐胁迫等) 的影响【4 1 删。 这些影响涉及到转录、翻译和加工等形式的调控，其机制非常复杂。 1 2 2 3 黄嘌呤氧化还原酶( x o r ) 途径 植物体内除了一氧化氮合酶( n o s ) 、硝酸亚硝酸还原酶( n r i n r ) 夕f ，还存在 着其它酶如黄嘌呤氧化还原酶( x o r ) 。c o q ) a sf j 等在植物过氧化物体中发现了黄 嘌呤氧化酶( x o r ) 活性1 4 4 1 。与硝酸还原酶( n r ) 类似，黄嘌呤氧化还原酶( x o r ) 也 是一个以钼为辅助因子的氧化还原酶，氧气浓度低时x o r 会将亚硝酸转变为n o ， 而氧气浓度高时则会形成超氧化物，后者与n o 反应形成一种非常强的氧化剂过 氧亚硝酸( p e r o x y n i t r i t e ，o n o o 。) ，研究发现一部分n o 对植物的影响可能由o n 0 0 引起。迄今为止，x o r 在植物信号转导中的作用还很少研究，但不能排除x o r 是催化植物n o 合成的另一酶源。 1 2 2 4 非酶促途径( n o n - e n z y m a t i cs y s t e m ) 硝酸盐经非酶促反应途径产生n o 在生物组织中占有重要地位。一氧化氮是 硝化反硝化作用循环过程中n 2 0 氧化的副产品【矧。在n o 形成的非酶促途径中， 酸性条件是最适宜的条件，此条件下硝酸盐最容易歧化为n o 和亚硝酸盐。在酸 性条件下，一些还原性物质如抗坏血酸、n a d p h 、l - 半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、 类胡萝卜素及其它硫醇类物质能将n o r 转变为n o l 2 s 1 。硝酸盐转化为n o 和脱氢 抗坏血酸的反应发生在叶绿体和胞质中p h 较低的区域，这些区域存在着抗坏血 酸【矧。此外大麦糊粉层细胞也能在酸性条件下通过抗坏血酸将硝酸盐转化为 n o t 4 7 i 。 1 2 3 植物n o 信号转导途径 作为信号分子，一氧化氮普遍存在于原生动物、细菌、酵母及动植物体内的。 目前已检测发现的动物n o 信号传递成分均可在植物中发挥作用，暗示植物可能采 用与动物类似的途径传递n 0 信号。