（动物学专业论文）盘基网柄菌kax3细胞和ak127细胞mrna差异显示分析.pdf

盘基网柄菌k a x 3 细胞和a k l 2 7 细胞m r n a 差异显示分析 专业：动物学 导师：侯连生 研究方向：动物细胞与分子生物学 硕士研究生：王一铮 论文摘要 盘基网柄菌( d i c t y o s t e l i u md i s c o i d e u m ) 是一种社会变形虫，在营养丰富的 条件下，以二分裂方式繁殖生长；当食物耗尽时，开始多细胞发育。盘基网柄菌的 多细胞发育过程尽管相对简单，但涉及到一系列信号分子的调控与高等生物十分相 似，在高等生物发育过程中能找到这些信号蛋白的同源体。因此在生命科学研究领 域中，盘基网柄菌经常被用作模式生物来研究多细胞发育、细胞凋亡等过程中的信 号分子调控。 l a g c 基因编码的g p l 5 0 蛋白是一种膜蛋白，在细胞与细胞接触区域特别丰富， 它通过异嗜性相互作用来调节细胞间的紧密黏着。g p l 5 0 蛋白是在盘基网柄菌发育 聚集期开始后才开始表达，当盘基网柄菌发育到1 2 小时的时候，用w e s t e r nb l o t 可以在野生型k a x 一3 细胞中检测出明显的g p l 5 0 蛋白条带；而在突变型a k l 2 7 细胞 中，完全检测不到g p l 5 0 蛋白的表达。g p l 5 0 缺失的细胞株a k l 2 7 不能完成多细胞 发育，发育只能停留在细胞松散聚集阶段。由此推测，g p l 5 0 蛋白在盘基网柄菌发 育过程中起着重要作用，它可能参与介导细胞分化和凋亡的信号转导途径，但具体 的信号通路至今仍未完全清楚。因此，本研究以发育到1 4 小时的盘基网柄菌细胞为 实验材料，试图从寻找野生型细胞株k a x 一3 和突变型细胞株a k l 2 7 差异表达的基因 入手，进一步摸清由g p l 5 0 介导的信号通路及其相关的调控途径。 本研究通过提取盘基网柄菌发育1 4 小时的野生型 t a x 一3 细胞和突变型a k l 2 7 细胞的总r n a ，运用m r n a 差异显示法分离出了两条明显的差异表达片段，其中片段 a 来自野生型k a x - 3 细胞，片段c 来自突变型a k l 2 7 细胞；并通过凝胶回收差异片 段、对差异片段进行再次p c r 、蓝白斑筛选克隆、提取质粒、酶切电泳纯化差异片 段：接着进行n o r t h e r n 杂交的结果表明，片段a 只与野生型k a x 一3 细胞的总r n a 有杂交信号，片段c 只与突变型a k l 2 7 细胞的总r n a 有杂交信号，这就排除了差异 片段假阳性的可能；最后通过测序，搜索n c b ib l a s t 数据库发现：片段a 的小部分 序列与编码组氨酸激酶d h k a 基因中一段序列的相似性高达9 1 ，与编码组氨酸激酶 d h k f 基因中的一段序列相似性高达9 2 ，与编码s t a t e 蛋白基因的一段序列相似性 达9 1 ，以及与编码同源框蛋白的基因中的一段序列相似性达9 7 ，这些基因在盘基 网柄菌细胞分化和细胞比例调控过程中起着相当重要的作用，这些数据进一步说明 了突变细胞不能完成发育的原因。片段c 与盘基网柄菌线粒体d n a 中的一段6 3 5 b p 的序列的相似度达9 9 ，这一段序列包含了基因n a d 3 的大部分序列、编码t r n a - c y s 和t r n a a s n 的全部基因序列。h a d 3 的编码产物是n a d h 脱氢酶亚基3 ，n a d h 是细胞 能量代谢所必需的辅酶，在生物过程中起电子传递作用，是呼吸链中传递氢过程中 的一环，在多数情况下代谢物上脱下的氢先交给n a d + ，使之成为n a d h 和 r ，然后在 n a d h 脱氢酶的作用下，把氢交给黄素腺嘌呤二核苷酸( f a d ) 或黄素单核苷酸( f m n ) ， 再通过呼吸链的传递，最后交给氧，并释放能量，细胞内n a d + n a d h 比率不仅对细 胞内的氧化还原状态具有重要的调节作用，而且常被作为活体内的代谢指标，与细 胞的代谢、节律、衰老、病变、死亡等重大生命过程有着及其紧密的联系。n a d h 脱 氢酶催化由n a d h 转变为n a 们的过程，对n a d + n a d h 比率起调节作用，因此也是调节 细胞代谢、凋亡过程的重要物质。g p l 5 0 蛋白调控的信号途径可能包含了上述基因， 这些基因在盘基网柄菌细胞分化和细胞比例调控过程中起着重要的作用，g p l 5 0 蛋 白可能正是通过影响这些基因的表达来对盘基网柄菌的发育过程进行调控。本论文 的研究为进一步证明这些基因在盘基网柄菌k a x 一3 细胞和a k l 2 7 细胞中差异表达， 构建载体表达这些基因，制备抗体，追踪相关分子在机体中的定位及相关功能的研 究奠定了基础。 关键词；盘基网柄菌；g p l 5 0 ；m r n a 差异显示法；蓝白斑筛选；n o r t h e r n 杂交 m r n ad i f f e r e n t i a ld i s p l a ya n a l y s i so ft h ew i l dc e l l sk a x - 3a n d t h em u t a n tc e l l sa k l 2 7i nd i c t y o s t e l i u md i s c o i d e u m m a j o r ：z o o l o g y t u t o r ：p r o f e s s o rh o u l i a n - s h e n g s p e c i a f i t y ：c e l la n dm o l e c u l a rb i o l o g y m a s t e rc a n d i d a t e ：w a n gy i - z h e n g a b s t r a c t d i c t y o s t e l i u md i s c o i d e u mi sas o c i a la m o e b & t h ei n d i v i d u a lc e l l sg r o wa n d m u l t i p l yb ye q u a lm i t o t i cd i v i s i o nw h e nt h ef o o di se n o u g h e x h a u s t i o no ft h ef o o d s o u r c et r i g g e r sa d e v e l o p m e n tp r o g r a m m e d e s p i t et h em u l t i c e l l u l a rd e v e l o p m e n tp r o c e s s i s r e l a t i v e l ys i m p l e ，t h er e g u l a t o r ys i g n a l i n gp a t h w a y sa r ea sc o m p l e xa st h o s ei n m e t a z o a nd e v e l o p m e n t , t h eh o m o l o g o u ss i g n a lp r o t e i n sc a l la l s ob ef i n d e dd u r i n g m e t a z o a nd e v e l o p m e n t s od i c t y o s t e l i u md i s c o i d e u mh a sb e e n u s e da sam o d e lo r g a n i s m f o rr e s e a r c h i n gr e g u l a t i o no fs i g n a l i n gm o l e c u l e sd u r i n gm u l t i c e l l u l a rd e v e l o p m e n ta n d c e l la p o p t o s i s g p l 5 0i s e n c o d e db y t a g cg e n e ，a n di ti sam e m b r a n eg l y c o p r o t e i n h i g h c o n c e n t r a t i o n so fg p l 5 0a r ep r e s e n ta tc e l l - c e l lc o n t a c t s ，t h e yr e g u l a t ec e l l c e l la d h e s i o n b yh e t e r o p h i l i ci n t e r a c t i o n s g p l 5 0i se x p r e s s e do nc e l l si nt h ee a r l yp o s t - a g g r e g a t i o n s t a g e ，i tc a nb ed e t e c t e di nt h ew i l dt y p ek a x 一3c e l l sb u tn o ti nt h em u t a n tt y p ea k l 2 7 c e l l sb yw e s t e r nb l o t t h em u t a n tt y p es t r a i na k l 2 7 ，鸽ar e s u l to fa b s e n c eo fg p l 5 0 ， c a n tc o m p l e t em u l t i c e l l u l a rd e v e l o p m e n ta n dt h ed e v e l o p m e n ti sa r r e s t e da tt h el o o s e a g g r e g a t es t a g e t h eo b t a i n e dd a t as u g g e s t e dg p l 5 0p r o t e i n sp l a ya ni m p o r t a n tp a r ti n d i c t y o s t e l i u md i s c o i d e u md e v e l o p m e n t , i tm a yt a k ep a r ti nt h es i g n a l i n gp a t h w a yf o r r e g u l a t i n gc e l ld i f f e r e n t i a t i o na n dc e l la p o p t o s i s s of a r , 0 1 1 1 k n o w l e d g eo ft h es i g n a l i n g p a t h w a yi ss t i l lv e r yl i m i t e d s ow e a l et r i e dt of e n dt h ed i f f e r e n t i a ld i s p l a yg e n e sb e t w e e n t h ek a x - 3c e l l sa n da k l 2 7c e l l s ( d e v e l o p e df o r1 4h o u r s ) ，s ot h a tw ec a nk n o wm o r e a b o u tt h es i g n a l i n gp a t hc o n t r o l l e db yg p l 5 0 t o t a lr n a sf r o mk a x - 3c e l l sa n da k l 2 7c e l l s ( d e v e l o p e df o r1 4 mw e l ei s o l a t e d a f t e rt h er e v e r s et r a n s c r i p t i o na n dp c r r e a c t i o n , t w od i s t i n c td i f f e r e n t i a lf r a g m e n t sw e r e a c q u i r e d ，f r a g m e n ta w a sf r o mk a x - 3c e i l sa n df r a g m e n tcw a sf r o ma k l 2 7c e l l s a f t e rr e t r i v i n ga n dr e a m p l i f y i n gt h ed i f f e r e n t i a l l ye x p r e s s e df r a g m e n t s ，w h i t e - b l u ep l a q u e s e l e c t i o n , t h ef r a g m e n t sw e t ep u r i f i e d n o r t h e r nb l o tp r o v e dt h a tf r a g m e n taw a sf r o m k a x - 3c e l l sa n df r a g m e n tcw a sf r o ma k l 2 7c e l l s t h er e s u l t so fs e q u e n c i n ga n d r e s e a r c h i n gf o rn c b id a t a b a s eh a v eb e e ns h o w e d ：p a r ts e q u e n c eo ff r a g m e n ta s h o w s 9 1 s i m i l a r i t yt ot h eg e n ee n c o d i n gd h k a , 9 2 s i m i l a r i t yt ot h eg e n ee n c o d i n gd h k f , 9 1 s i m i l a r i t yt ot h eg e n ee n c o d i n gs t a t e ，9 7 s i m i l a r i t yt ot h eh o m o c o b o xg e n e e n c o d i n gp r o t e i n t h e s eg e n e sp l a yi m p o r t a n tp a r ti nc o n t r o l l i n gc e l ld i f f e r e n t i a t i o na n d c e l lp r o p o r t i o ni nd i c t y o s t e l i u md i s c o i d e u m f r a g m e n tcs h o w s9 9 s i m i l a r i t yt o6 3 5 b p o f d i c t y o s t e l i u md i s c o i d e u mm i t o c h o n d r i o nd n a ，i tc o n t a i n sm o s tp a r to f h a d 3g e n ea n d g e n e se n c o d i n gt r n a c y sa n dt r n a - a s n t h ep r o d u c to f h a d 3i sn a d hd e h y d r o g e n a s e s u b t m i t3 ，n a d hi sac o e n z y m en e e d e df o rc e l l e n e r g ym e t a b o l i s m , t r a n s f e r r i n g e l e c t r o n si nb i o l o g i c a lp r o c e s sa n di ti sa l li m p o r t a n tp a r to fh y d r o g e nt r a n s f e r r i n gi n r e s p i r a t o r yc h a i n m e t a b o l i np a s sh y d r o g e nt on a d + ，a n dt h e nn a d hd e h y d r o g e n a s e p a s sh y d r o g e nt of a do rf m n ，a tl a s t , h y d r o g e ni sc o m b i n e dw i t ho x y g e n , r e l e a s e e n e r g y t h er a t i oo f n a 口澈a d h n o to n l yp l a ya ni m p o r t a n tp a r ti nc o n t r o l l i n gr e d o xi n c e l l s ，b u ta l s oi sc o n s i d e r e da sam e t a b o l i cg u i d e l i n ea n dr e l a t e dw i t hm e t a b o l i s m , r h y t l u n , e a d u e i t y , p a t h o l o g i c a lc h a n g e sa n dd e a t ho fc e l l s n a d hd e h y d r o g e n a s e r e g u l a t e sn a d + n a d h ，a n dt h u si ti si m p o r t a n tf o rc e l lm e t a b o l i s ma n da p o p t o s i s t h e s e g e n e sm a y b ei n v o l v e di nt h es i g n a l i n gp a t h w a yc o n t r o l l e db yg p l 5 0 t h e yp l a yi m p o r t a n t p a r t si nc o n t r o l l i n gc e l ld i f f e r e n t i a t i o na n dp r o p o r t i o n , g p l 5 0m a y e x e r tt h ei n f l u e n c eo n t h ed e v e l o p m e n to f d i c t y o s t e l i u md i s c o i d e u mb ya f f e c t i n gt h ee x p r e s s i o no f t h e s eg e n e s 砌sr e s e a r c hc a np r o v i d es o m ed a t af o rc o n s t r u c t i n gv e c t o r st oe x p r e s st h e s eg e n e s r e s e a r c h i n gt h em o l e c u l e rl o c a t i o ni n t h eo r g a n i s ma n d r e l a t e df u n c t i o n s k e yw o r d s ：d i c t y o s t e l i u md i s c o i d e u m ；g p l 5 0 ：m r n a d i f f e r e n t i a ld i s p l a y ：w h i t e b l u e p l a q u es e l e c t i o n ：n o r t h e r nb l o t 学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取 得的研究成果据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包 含其他个人已经发表或撰写过的研究成果对本文的研究做出重要贡献 的个人和集体，均已在文中作了明确说明并表示谢意。 作者签名：趟日期：2 曼啦 学位论文授权使用声明 本人完全了解华东师范大学有关保留，使用学位论文的规定，学校 有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版 和纸质版。有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入 学校图书馆被查阅有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索 有权将学位论文的标题和摘要汇编出版保密的学位论文在解密后适用 本规定 学位论文作者张互一磊争 日期：迎1 2 1 ：鲨 第一章前言 第一章前言 1 盘基网柄菌细胞分化和细胞比例的调节 盘基网柄菌( d j c t y o s t e y u md i s c o i d e u m ) 是一种社会变形虫，在营养丰 富的条件下，以二分裂方式繁殖生长；当食物耗尽时，开始多细胞发育，整个过 程可分为4 个阶段“1 ：1 ) 细胞聚集( a g g r e g a t i o n ) 阶段，剥夺食物后，饥饿细 胞分泌的化学信号c a l i p 诱导邻近的饥饿细胞向c a m p 来源方向移动，形成细胞流 样结构；2 ) 细胞丘( m o u n d ) 阶段；细胞向聚集中心聚集，形成多细胞组成的丘 状结构；3 ) 蛞蝓体( s l u g ) 阶段，细胞丘垂直向上延伸形成指状突出( t i p ) ， 这一指状结构倒向基质，形成能移动的“蛞蝓”；蛞蝓体在迁移过程中细胞进一 步分化。4 ) 子实体( f r u i t i n gb o d y ) 形成阶段，蛞蝓体迁移到合适的地方后形 成由不同结构组成的子实体。盘基网柄菌的多细胞发育尽管相对简单，但涉及到 一系列信号分子的调控与高等生物十分相似，在高等生物发育过程中能找到这些 信号蛋白的同源体。因此在生命科学研究领域中，盘基网柄菌经常被用作模式生 物来研究多细胞发育、细胞凋亡等过程中的信号分子调控；目前人们还利用盘基 网柄菌作为一些病原体的宿主模型来研究细胞对传染病的敏感性和抗性反应等 脚。研究盘基网柄菌中信号分子对细胞分化和细胞比例的调节过程对了解相应分 子在高等生物生理生化过程中的作用有重要意义。 1 1 盘基网柄菌发育过程中的细胞类型 盘基网柄菌细胞发育至细胞丘阶段时，细胞开始分化。表达前柄细胞特异 基因e c m a 的细胞( f s t a 细胞) 移动到细胞丘的突起部位，而表达前柄细胞特异 基因e c m b 的细胞( p s t b 细胞) 则移动到细胞丘的底部。细胞丘拉长形成了可移 动的蛞蝓体，蛞蝓体有一个明显的前端前柄区，由p s t a 细胞和p s t o 细胞( 从 e c m a 启动子的e c m o 部分表达e c m a 的细胞) 组成：后端还有一个较大的前孢子 区以及一个由p s t b 细胞组成的后卫细胞区。除了以上所述区域外，拔顶期开始 之前，在细胞丘的前端前柄区还检测到一个明显的由p s t h b 细胞( 表达e c m a 和 e c m b 的细胞) 组成的区域。在拔顶期，p s t a 细胞先分化形成p s t a b 细胞，继之 形成柄细胞，构成细长的支持柄。前孢子细胞开始沿着中空的柄向上攀升，逐渐 丧失阿米巴细胞的特征变成孢子细胞。1 。在这整个迁移和拔顶的过程中，各种类 型细胞的比例都严格地维持在一定的水平( 图1 ) 第一章前言 图1 盘基网柄菌发育过程中的细胞类型 饥饿的盘基网柄菌生长细胞朝c a m p 信号方向聚集形成由前孢子细胞和前柄细胞组成的细胞聚集体 ( 详见前文) ( a ) 细胞丘j ( b ) 蛞蝓体；( c ) 子实体 m g 1c e l lt y p e sd u r i n gd i c t y s t e l i m nd i s c o i d e u md e v e l o p m e n t w h e ng r o w i n gd i c t y o s t e l i u mc e l l sa i es t a r v e d , t h e ym o v ec h e m o t a c t i c a l l yt o w a r d sc a m p s i g m l sa n df o r ma l la g g r e g a t ew i t hw h i c hd i f f e r e n t i a t i o ni n t op r e s t a l kc e l l sa n dp r e s p o r ec e l l s ( a ) m o u n d ；( ”s l u g ；( c ) f r u i t 1 2 调控细胞分化的信号分子 1 2 1 细胞外形态发生素 形态发生素参与了细胞类型决定的最初过程和细胞类型比例的调控。其中 一个很重要的分子是分化诱导因子一1 ( d i f f e r e n t i a t i o ni n d u c i n gf a c t o r 一1 ， d i f - i ) ，它能诱发前柄细胞特异基因e c m d 和e c m b 的表达和柄细胞的形成，同时 也抑制前孢子细胞的形成“1 。在细胞丘时期，d i f 引起细胞质中c a 2 + 浓度的持续 上升，结果引起了p c 柑基因的表达。d i f 引发e 锄4 的表达则可分为两个阶段： 第一个阶段与c a 2 + 浓度无关，第二个阶段则受到 c a 2 + 的调节“1 。但目前还不清 楚d i f 是如何影响 c a ” 水平以及c a 2 + 是如何响应的。剔除生物合成d i f 一1 的关 键步骤的酶甲基转移酶的基因的突变种尽管能产生p s t a 并最终分化柄细 胞，但突变种不能产生p s t o 细胞”1 ，说明d i f - 1 在p s t o 形成过程中起着重要作 用，同时也表明细胞聚集体中还存在另一种能诱导柄细胞形成的分子机制来代替 了d i f 一1 的功能。 那为什么处在基本相同d i f 一1 浓度环境中的前孢子细胞对d i f - l 没有反应 呢? 研究发现前孢子细胞存在一种综合药物耐受转运蛋白 ( m u l t i d r u g r e s i s t a n tt r a n s p o r t e r ，m d r t ) ”1 ，m d r t 功能是将d i f _ 1 转运出 细胞外。在细胞聚集体中，在细胞类型特异基因开始表达之前一部分细胞就捉失 了m d r t 的活性，细胞不能将d i f 一1 转运出细胞外，积累在细胞内的d i f l 就诱 第一章前言 导这些细胞分化成前柄细胞；而保持着彻r t 的活性另一部分细胞，则不断地将 d i f l 转运出细胞外，阻止了d i f - 1 在细胞内的积累，这些细胞不能分化成前柄 细胞，而是分化成前孢子细胞。 孢子分化诱导因子( s p o r ed i f f e r e n t i a t i o ni n d u c i n gf a c t o r ) s d f 一1 和 s d f - 2 都是由前柄细胞分泌的活性磷酸肽，体外细胞试验结果表明，s d f 一2 能促 进孢子细胞形成，抑制柄细胞的分化。研究表明，分泌到胞外的s d f - 2 分子与孢 子细胞膜表面受体d h l ( a 结合，结果抑制了磷酸二酯酶r e g a 的活性，r e g a 是一 种带有磷酸二酯酶( p d e ) 位点和组氨酰磷酸盐转运效应调控位点的蛋白质。磷 酸二酯酶活性的抑制使得细胞内c a m p 浓度上升，激活了蛋白质激酶a ( p r o t e i n k i n a s ea ，p k a ) 。使前孢子细胞向孢子细胞转化，最终形成子实体。1 。转录因子 s t k a 是s d f - 2 调控途径中不可或缺的重要因子，s t k a 基因缺失导致柄细胞表达 增加及孢子细胞表达减少。在s t k a 缺失的细胞中，即使p k a 组成型表达也不能 纠正孢子形成的缺陷，说明s t k a 位于p k a 的下游。组氨酸激酶d h k c 通过激活组 氨酰磷酸盐转移酶r d e a 来活化r e g a ，从而抑制孢子的形成，所以组成型表达d h k c 的细胞不会出现拔顶现象，而编码d h k c ，r d e a 和r e g a 的基因缺失的细胞都表现 出发育加速啪。因此前孢子细胞分化的诱导涉及到好几条信号传递途径。 s d f 一1 形成早于s d f 一2 ，它们既能促进孢子细胞的形成，也能促进前柄细胞 特异基因的表达。它们的分泌与前柄细胞的特异跨膜蛋白t a g b 有关”，t a g b 缺 失的细胞聚集体前柄细胞特异基因e c m a 的表达减少，也不能形成孢子细胞。如 果把t a g b 突变细胞与野生型细胞混合在一起发育时，形成的嵌合体没有上述的 表型缺陷，这提示柄细胞分化是孢子细胞分化的前提，野生型柄细胞能够分泌出 s d f 一1 来诱导前孢子基因的表达，由此形成孢子细胞。 2 2 2g s k - 3 分子和c a m p 受体在细胞类型决定中的作用 g s k - 3 ( g l y c o g e ns y n t h e t a s ek i n a s e - 3 ) 是细胞类型决定过程中的重要调 节分子。在g s k 3 缺失的细胞聚集体中，c a m p 对前柄细胞特异基因e c m b 表达的 抑制被解除，使得e c m b 表达增加，前孢子细胞基因表达减少，最终形成的子实 体孢子囊较小，柄很短，却有一个大的基盘“。胞外c a m p 与c a m p 受体3 ( 有4 种c a m p 受体，c a r l 4 “”) 结合后，先活化酪氨酸激酶z a k i ，经z a k i 激活g s k 一3 ； z a k i 的酪氨酸激酶区域调节了g s k - 3 的功能，并且后者的活性的强弱与前者的 磷酸化程度有关，所以z a k l 突变g s k 一3 的活性就降低，因此这两种分子突变的 细胞的发育表型是相似的“”。剔除c a r 2 或c a r 4 基因，前柄细胞特异基因表达减 少，而前孢子细胞特异基因表达增加，这与剔除g s k 3 的结果正好相反。在缺失 c a r 4 的细胞聚集体中，g s k 一3 的活性和其酪氨酸磷酸化的程度都增强。如果用 l i c l ( 一种g s k 一3 的特异抑制剂) 处理c a r 4 缺失细胞聚集体后，前柄和前孢子 第一章前言 细胞基因的表达都恢复到野生型水平，说明g s k - 3 功能的丧失所引起的基因表达 的缺陷正好与c a r 4 缺失所引起的结果相反。因此经由c a r 2 和c a r 4 发出的信号 对g s k _ 3 起负调控作用。尽管c a r 2 和c a r 4 主要在前柄细胞中表达，而c a r 3 主 要在前孢子细胞中表达，但这三种c a m p 受体在两种细胞类型中都有重要的调节 功能n 3 1 。 1 2 3r z i p 对细胞类型决定的调控 r z i p ( r i n g - l e u c i n ez i p p e rp r o t e i n ) 是一种多区接头蛋白，它含有一个 环状锌结合区，一个亮氨酸拉链结构，一段谷氨酸重复序列，一个s h 3 结合区和 一个m a p 激酶磷酸化位点“”。其中环状锌结合区和亮氨酸拉链结构在r z i p 同源 二聚化过程中起作用“”。在营养生长细胞中r z i p 表达受到抑制，但在多细胞发 育期，绝大多数细胞都表达r z i p 。r z p a 缺失将导致细胞聚集方式改变，蛞蝓体 移动速度减弱，前柄和前孢子细胞发育异常：前孢子细胞特异基因大量表达，前 柄细胞特异基因表达减少。r z i p 超表达则e c m b 提前表达并抑制前孢子特异基因 表达m 1 。形态发生素的浓度梯度在空间上调控前孢子特异基因的表达，而r z i p 正是通过对前者的调控来调节前孢子特异基因的表达。m a p 激酶e r k 2 在细胞聚 集过程中主要起着活化腺苷酸环化酶的作用，并对前孢子特异基因的持续表达也 有影响。在细胞聚集期，c a m p 通过细胞表面受体c a r l 活化e r k 2 ，e r k 2 通过磷 酸化r z i p 来调节多蛋白复合体之间的相互作用。在盘基网柄菌中，r z p a 缺失和 c a r 4 缺失的突变株具有相似的表型，说明r z i p 可能存在于c a r 4 调节细胞类型 的信号途径中“。对r z i p 的深入研究以及弄清它与g s k ，e r k 2 和c a m p 受体之间 的相互关系，将有利于更好地了解调控细胞命运的信号网络。 1 3 调节细胞比例的信号分子 1 3 1d d s t a t a d d - s t a t a 在结构和功能上都和后生动物的s t a t ( s i g n a lt r a n s d u c e ra n d a c t i v a t o ro ft r a n s c r i p t i o n ) 同源，它在拔顶期发生的p s t a 转变成p s t a b 过程 中起着重要调控作用。d d - s t a t a 包括d n a 结合区，一个s h 2 区和c 末端的酪氨 酸磷酸化调节位点“”。在c a m p 的调控下，磷酸化的d d - s t a t a 转移到细胞核，核 中富集d d - s t a t a 的现象主要出现在蛞蝓体顶端的p s t a 细胞中“”。敲除编码 d d s t a t a 的基因，在蛞蝓体的整个前柄细胞区域都可以观察到e c m b 的表达“”， 表明d d s t a t a 是e c m b 表达的负调节剂，因此它也是从p s t a 到p s t a b 转变的抑 制子。在p s t a 细胞特异基因e c , z 叫的启动子区存在t t g a 序列；而在e c m b 基因的 启动子区则是反向的t t g a 序列。在胞外c a m p 信号的调节下，单体s t a t a 的c 末端酪氨酸受g s k - 3 磷酸化后，两个s h 2 区相互交叉，形成双体转移到核内，与 第一章前言 1 v r g a 序列结合，激活启动子，促进e c a z 4 的表达；与t t g a 反向序列结合，抑制 了p s t b 细胞的表达“。然而，d d s t a t a 在什么情况下与t t g a 序列结合，在什 么情况下与反向t t g a 序列结合，这些细节都值得深入研究。 1 3 2 同源框基因的作用 从果蝇到人类，有许多同源框基因参与身体前后轴的形成，这些基因编码 的转录因子起着调节身体前后极和细胞类型分化的作用。同样在盘基网柄菌中也 发现两种同源框基因，d d h b x - l ( 又称作w a r i a z 9 和d d h b x - # ”1 ，都具有发育调控 的功能，在细胞丘时期开始表达。在w a r i a i 缺失的细胞聚集体中，p s t o 区至少 扩大两倍，前孢子区呈现出相应的缩小，p s t a 和p s t a b 区则没什么明显的变化， 因此w a r i m 与p s t o 区的大小调节关系密切。单独剔除d d h b x - 2 , 多细胞体的表 型没有明显缺陷，但若同时剔除，则w a r i m 突变细胞表现出的表型缺陷更加明 显，表明1 ) d h b x - 2 有增强w a r i m 功能的作用，但其细节还需深入研究。令人感 兴趣的是p s t o 细胞不表达w a r i a i ，即使在p s t o 特异启动子区构建w a r j m 基因， 其表达出的蛋白也不能弥补w a r i a i 缺失引起的表型缺陷，说明w a r i a i 调节p s t o 区的大小可能是细胞非自主性的。w a r i a i 编码的因子调节了与细胞分化有关的 信号分子表达，d i f 按一定的梯度分布在蛞蝓体中，这种梯度由位于蛞蝓体顶部 的d i f 脱氯酶( d i f 降解酶) 来调控。w a r i a j 就是通过控制脱氯酶的表达水平来 影响d i f 的梯度及影响细胞对d i f 的敏感性，从而调节前孢子细胞和p s t o 细胞 的比例乜砌。 1 3 3m e k 激酶m e k k a m e k 激酶m e k ka 在调节细胞类型模式发育和形态发生过程中起着多重作用 乜1 】。首先，脏l ( i ( a 维持着多细胞机体中细胞的比例，剔除编码m e k k a 的基因m e k k a t j 行引起的发育缺陷与w a r i a i 缺失的细胞株类似。其次，m e k kd 也控制着p s t o 和前孢子这两种细胞区之间的界线。在m e k k a 缺失和超表达的菌株中，各细胞 区之问的界线变得模糊，各种细胞混合在一起；其原因可能是模式发育的信号如 c a m p 、d i f 等受到干扰破坏，使得细胞失去空间判断力；或者是细胞丧失了感应 这些信号的能力。缺失m e k k a 还会加速发育进程，可能这些细胞中含有组成型 活化的p k a ；超表达m e k k 盯则会使细胞聚集体发育速度减缓，甚至停滞在细胞丘 时期。p k a 在前孢子分化、拔项、孢子形成过程中起重要作用，因此我们推测 m e k k 口参与了p i ( a 调节的信号途径。盘基网柄菌以遍在蛋白化去遍在蛋白化的 方式在时间和空间上调控m e k ka 的稳定性：m e k kq 含有f 盒和w d 4 0 重复序列， f 盒是调控遍在蛋白结合的功能区域，w d 4 0 重复序列则将m e k ka 靶定在细胞质 膜区。在盘基网柄菌中发现有两种与遍在蛋白化有关的蛋白质，u b p b 和u b c b 。 u b p b 移走m e k k 上的遍在蛋白，使得m e k k d 不易被蛋白酶体降解。u b c b 是一种 第一章前言 遍在蛋白缀合酶，它将遍在蛋白共价结合在m e k k n 上，使得m e i ( i ( a 容易被蛋白 酶体降解o “。所以控制前孢子和前柄细胞空阃模式发育的是一个复杂的信号网， 我们所讨论m e k ka 信号途径只是其中的一部分，因为她l ( 1 【也受到c a r l 3 的活 化，相应地对c a r 4 和r z i p 调节的途径起拮抗作用，或许u b p b 和u b c b 也受到其 他分子的调控。 虽然目前对盘基网柄菌细胞类型决定、细胞类型比例、末期细胞分化过程 中的信号分子的分析已有显著的进步，但是我们对其中很多具体的作用机制的理 解还有所欠缺；许多其它重要信号分子笔者也没有提到。由于盘基网柄菌在发育 过程中调控细胞命运和空阃模式的许多信号途径都与高等生物类似，所以深入研 究这些信号分子及其途径无疑有助于理解在生命过程中涉及到的信号分子及其 途径的作用。 2 盘基网柄菌发育过程中细胞粘着的调节 细胞粘附分子( c e l la d h e s i o nm o l e c u l e s ，c a m s ) 在许多真核生物的发育过 程中都起着重要作用，它们参与形态发生过程中一系列复杂的细胞相互作用。 c a m s 与细胞间的粘附作用有着直接的关系，一些c a m s 还与形成专门维持多细 胞结构的复合连接体有关，它们是动态的细胞发育过程和病理过程中不可缺少的 一部分。近年来，盘基网柄菌一直被用作研究细胞间粘附作用的模式生物。盘 基网柄菌具有相对简单并且固定的生活周期，因此比较适合用生物化学、遗传学 和细胞生物学方法来对其多细胞发育动态过程进行研究。用细菌喂养的盘基网柄 菌是以单细胞变形虫形式生长，多细胞发育是由饥饿引起的。盘基网柄菌的多细 胞发育过程可分为聚集期和聚集后期，每个时期大约延续1 2 个小时。聚集期开 始时，细胞向着c a m p 来源的中心作趋化性运动，c a m p 信号波由聚集中心传播 开来，引导细胞的方向性运动，并诱导相关基因的表达。细胞粘附分子的表达使 得细胞间的联系和细胞流得以形成，导致松散细胞丘结构的产生。一直到这个时 期，细胞群中的细胞都是相对相似的，发育都是同步的。松散细胞丘的形成是聚 集后期开始的标志，松散细胞丘分泌出细胞外基质包住整个机体，形成致密细胞 丘。此时，细胞分化形成前柄细胞( 约占细胞丘细胞总数的2 0 ) 和前孢子细胞 ( 约占细胞丘细胞总数的8 0 ) ，前柄细胞向上移动到顶端区，前孢子细胞移动 到致密细胞丘的基部。细胞继续运动形成指状突起，接着形成可以移动的蛞蝓体， 在蛞蝓体中前柄细胞位于前端，前孢子细胞位于后端。拔顶开始的时候，蛞蝓体 抬起它的后端，前柄细胞沿着一个管状结构向下移动形成柄，最后形成由丝状柄 支撑着孢囊的子实体。盘基网柄菌的多细胞发育中，有一些细胞粘跗系统表达。 目前的研究发现有四种细胞粘附系统：d d c a d 1 调节的依赖于c a “的粘附系统 第一章前言 在发育刚开始的时候就开始表达；几个小时后，依赖于m 9 2 + 的粘附系统开始表 达；在聚集期开始的时候细胞需要一种由g p 8 0 调节的非依赖于c a 2 年gm 9 2 + 的粘 附系统；在聚集后期刚开始时，细胞表达一种由g p l s o 调节的非依赖于c a 2 + 和 m 9 2 + 的粘附系统。 2 1 细胞粘附分子表达的对空调控 形态学和生物化学研究表明，盘基网柄菌粘附分子在发育过程中表现出明 显的时空表达模式。c a m s 在发育的不同时期表现出不同的功能，它们独特的表 达方式可能正是发育调控以及它们功能协调的结果。 2 1 1 时间调控 在聚集前期，细胞表达两种e d t 敏感的细胞结合位点。e d t a e d g a 敏感位 点是在发育刚开始的时候产生的，受到依赖于c a “的细胞粘附分子d d c a d - 1 或 g p 2 4 的调节；几个小时后，对e d t a 敏感、对e g t a 有抗性的依赖于m 9 2 细胞结 合位点开始表达嘲1 。然而，目前还没