（林产化学加工工程专业论文）重组内切纤维素酶酶学性能及其应用研究.pdf

摘要 以往对纤维素酶结构及功能研究的出发点主要致力于提高纤维素酶对生物质的降解 能力，这需要多组分纤维素酶的协同作用。近年来，纤维索酶在植物纤维改性中的应用受 到关注。大量研究结果表明，内切型纤维素酶在植物纤维酶法改性中起着关键作用。由于 天然纤维素酶来源广泛，组分复杂，其分离纯化相当困难，使单一组分酶的应用受到一定 的限制。内切型纤维素酶e g i 是用基因工程方法得到的重组酶，其活性高，纯度高，最 适p h 为7 5 ，加之其制各方便，在植物纤维改性中有很好的应用前景。e g i 最终的高效 应用尚需作进一步的基础研究。 本研究即从构建无纤维素吸附区的内切纤维素酶e g i c d 着手，通过对e g i 和e g i c d 酶对不同性质的底物吸附及水解性能的比较，讨论了e g i 不溶性纤维素在底物上的吸附 性能及其对水解的影响，以及纤维素吸附区( c b d ) 在e g i 对植物纤维水解及改性中的 作用。 研究主要得到了以下结果： 1 利用基因工程方法成功构建了无纤维素吸附区的内切纤维素酶e g i c d ，为研究纤维 索吸附区( c b d ) 对e g i 酶的吸附性能和底物特异性的影响提供了条件。 2 纤维素酶在不溶性纤维素底物上的吸附因底物结构的不同而异。吸附平衡时，e g i 或 e g i c d 对磷酸润胀纤维素、滤纸和微晶纤维素的吸附率分别为6 4 2 、4 3 5 、3 3 6 或3 8 8 、1 4 5 和0 ，因此c b d 的去除影响酶在不溶性纤维素底物上的吸附，并且 底物结晶度高则影响大。这一结果为e g i 酶在基因水平上的改造指出了方向。 3 e g i 对于不溶性纤维素底物的水解能力主要取决于酶在底物上的吸附程度。c b d 的吸 附不仅提供了酶与底物接触的机会，c b d 本身也会使纤维发生变化，尽管这种变化不 会导致底物水解，但对催化域的水解具有促进作用。 4 一定量的内切纤维素酶e g i 在较短的时间内即可水解底物产生还原糖，但随着时间的 延长，其产生的还原糖量趋于稳定，反映了e g i 酶仅作用于纤维表面，具有植物纤维 改性所需要的酶的特性。 5 e g i 酶可明显提高混合办公废纸的油墨脱出率。脱墨前采用n a o h 预处理可使油墨脱 出率达到9 0 以上。靛蓝牛仔织物经e g i 处理后后织物表面雪花点增多、立体感增强、 色光好，并且对强度没有明显的损伤。 关键词：内切纤维素酶重组纤维素吸附区脱墨生物石洗 c h a r a c t e r i z a t i o na n d a p p l i c a t i o n o ft h er e c o m b i n a n tt r u n c a t e d e n d o g l u c a n a s e w i t h o u tc e l l u l o s eb i n d i n gd o m a i n ( c b d ) e x p r e s s e d i np a c h i a p a s t o r i s a b s t r a c t m o s to fp o s tw o r ko nc e l l u l a s es t r u c n l r e sa n di t s f u n c t i o n sw a sf o c u s e do nh o wt o e n h a n c ei t sb i o m a s sl i g n o c e l l u l o s i cd e c o m p o s a b i l i t y , w h i c hn e e d e dm a n yg r o u p so f c e l l u l a s e t os y n e r g i ca c t i o n r e c e n t l yi tw a sp a i dm o r ea t t e n t i o nt ot h ea p p l i c a t i o no fc e l l u l a s eo n m o d i f i c a t i o no f p l a n tf i b r e m a n yr e s u l t ss h o w e d t h a te n d o g l u e a n a s e g ) p l a y e d k e yr o l eo n m o d i f i c a t i o no fp l a n tf i b r e b e c a u s eo fd i v e r s i t yo fn a t u r ec e l l u l a s es o u r c e s ，c o m p l e x i t yo f m u l t i - c o m p o n e n t sa n dd i f f i c u l to fs e p a r a t i o n ，a p p l i c a t i o no fs i n g l ec e l l u l a s ec o m p o n e n t w a s m u c hr e s t r i c t e d e g io n ek i n do fe n d o g l u c a n a s ew a so b t a i n e db yg e n ee n g a n e e r i n ga s r e c o m b i n a n te n z y m e d u et oi t s h i g ha c t i v i t y , h i g hp u r i t y , o p t i m a lp hv a l u e 7 5a n d c o n v e n i e n t p r o d u c t i o n ，e g ih a d b r i l l i a n tf u t u r eo nm o d i f i c a t i o no f p l a n tc e l l u l o s e b u tf i m h e r s t u d y w a ss t i l ln e e d e df o re g if i n a le f f e c t i v ea p p l i c a t i o n i nt h i sp a p e rm a j o rw o r kw a sd o n eo nt h ec o n s t r u c t i o no fe x p r e s s i o nv e c t o rc o n t a i n i n g o fe n d o g l u c a n a s ee g i c da n di t sh e t e r o g e n e o u se x p r e s s i o ni np i c h i ap a s t o r i s 断西t h e c o m p a r i s o no fa d s o r p t i o na n dh y d r o l y s i so f d i f f e r e n ts u b s t r a t e sb ye g ia n de g i - c d ，t h e i n f l u c e n e eo fc b do nt h ea d s o r p t i o na n do ni l s h y d r o s i so fe n z y m eo ns u b s t r a t e sw e r e d i s c u s s e di no r d e rt oi m p r o v ei t sm o r te c o n o m i c a l l ya p p l i c a t i o no fe g io nt h ei n d u s t r i a l c o n d i t i o n 、v i t l l 9 0 0 d m o d i f i c a t i o ne f f i c i e n c y m a j o r r e s u l t sa sf o l l o w i n g ： 1 e g i - c dw a ss u c c e s s f u l l yo b t a i n e db yg e n ee n g i n e e r i n g ，a n du s e da sm a t e r i a lf o rt h e s t u d yo ft h ei n f l u e n c eo f t h ec b do na d s o r p t i o na n ds p e c i f i c i t i e so fe g io nd i f f e r e n t s u b s t r a t e s 2 a d s o r p t i o n o fc e l l u l a s eo ni n s o l u b l ec e l l u l o s ew a sd e p e n d e do nt h es t r u c t u r e so f s u b s t r a t e s t h ei n f l u c e n c eo fc b do na d s o r p t i o no fe g io nc e l l u l o s ew a sp o s i t i v e l y r e l a t i o nt oc r y s t a l l i z a t i o no fc e u u l o s e t h ep e r c e n t a g e sa d s o r p t i o no fe g io re g i c do n s w o l l e nc e l l u l o s e 、f i l t e rp a p e ra n dc r y s t a l l i n ee e l l u l o s ew e r e6 4 2 ，4 3 5 ，3 3 6 o r 3 8 8 ，1 4 5 ，0 ，。r e s p e c t i v e l y t h e r e s u l t si n d i c a t e dd e l e t i o no fc b dd e c r e a s e d a d s o r p t i o nr a t eo f e g io ni n s o l u b l ee e l l u l o s es u b s t r a t e s u c hr e s u l t sp r o v i d e dd i r e c t i o n f o re g ie v o l 砸o n b yg e n ee n g i n e e r i n g 3 h y d r o s i so fi n s o l u b l ec e l l u l o s eb ye g im a i n l yl i e d o nt h ea d s o r p t i o no fe n z y m eo n s u b s l x a t e s t h ea d s o r p t i o no f e g i - c dw i t h o u tc b d o n l yp r o v i d e d t h ec o n t a c to p p o r t u u l t y o fe n z y m ea n ds u b s t r a t e s 。w h i l et h ea d s o r p t i o no fe g lw i t hc b dn o to n l yp r o v i d e dt h e c o n t a c to p p o r t u n i t yo fe n z y m ea n ds u b s t r a t e s ，b u ta l s oc a u s e dt h ec e l l u l o ss t r u c t u r e a l t e r a t i o n a l t h o u g hs u c ha l t e r a t i o nc o u l dn o t r e s u l ti nt h eh y d r o s i so fs u b s t r a t e sd i r e c t l y , i tp r o m o t e dt h eh ) ；d r o s i so f c a t a l y t i cd o m a i n o f e n z y m e 4 e g ic o u l dr e l e a s er e d u c i n gs u g a rf r o mc e l l u l o s ew i t h i ns h o r tt i m e b u tw i t l lt h et i m e i n c r e a s e ，t h eq u a n t i t yo fr e d u c i n gs u g a rt r e n d e ds t a b i l i z a t i o n t h e s er e s u l t ss h o w e de g i j u s ta t t a c k e d o nc e l l u l o s es u r f a c e ，i n d i c a t e de g ih a dt h ec h a r a c t e r i s t i cf o rm o d i f i c a t i o n o f p l a n t c e l l u l o s e 5 e g ic o u l do b v i o u s l yi m p r o v et h ed e i n k i n ge f f i c i e n c yo f m i x e do f f i c ew a s t e ( m o w ) t h e p r e t r e a t m e n to fn a o h b e f o r ed e i n k i n gc o u l dm a k e d e i n k i n ge f f i c i e n c ym o r et h a n9 0 e g it r e a t m e n ti m p r o v e dt h es u r f a c ep r o p e r t i e so fd e n i mf a b r i cw i t hm o r es n o w f l a k e ， m o r et h i r dd i m e n s i o na n db e t t e r c o l o r , b u tn oe f f e c to nt h es t r e n g t ho f d e n i mf a b r i c k e y w o r d s ：e n d o g l u c a n a s e ；r e c o m b i n a n t ； c e l l u l o s e b i n d i n g d o m a i n ；d e i n k i n g ； b i o s t o n e w a s h i n g 本论文中缩写词表 a 0 b p c b d c b h c d n a c d c m c d n s m o w s d s p a g e e g s e m b m g y b m m y t r i s x - g a l y p d d n t p r n a o d p c r k b k d a a l c o h o lo x i d a s eg e n e b a s ep a i r s c e l l u l o s eb i n d i n gd o m a i n c e l l o b i o h y d r o l a s e s c o m p l e m e n t a r yd c o x y r i b o n u c l e i ca c i d c a t a l y t i cd o m a i n c a r b o x y m e t h y l c e l l u l o s e 3 ，5 一d i n i t r o s a l i c y l i ca c i d m 政e do m c ew a s t e s o d i u md o d e e y ls u l f a t e p o l y a r c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h r e s i s e n d o b - l ，4 g l u c a n a s a se c 321 4 s c a ne l e c t r o n i cm i c r o s c o p e b u f f e r e dg l y c e r o l - c o m p l e xm e d i u m b u f f e r e dm e t h a n o l - c o m p l e xm e d i u m t r i s ( h y d r o x y m e t h y la m i n o m e t h a n e ) 5 - b r o m o - 4 一e h l o r o 3 i n d o l y - b d g a l a c t o s i d e y e a s te x 打a c t - p e p l o l l e - d e x 订o s em e d i u m d e o x y n b o n u e l e o t i d c s r i b o n u c l e i ca c i d o p t i c a ld e n s i t y p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n k i l o b a s ep a i r s k i l o d a l t o n s 乙醇氧化酶基因 碱基对 纤维素吸附区 纤维二糖水解酶 互补脱氧核糖核酸 催化域 羧甲基纤维素 3 ，5 一二硝基水杨酸 混合办公废纸 十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 内切葡萄糖苷酶 扫描电子显微镜 缓冲甘油复合培养基 缓冲甲醇复合培养基 羟甲基氨基甲烷 5 一溪_ 4 一氯- 3 吲哚- b - d 半 乳糖苷 酵母汁蛋白胨一甍萄糖培 养基 脱氧核苷三磷酸 核糖核酸 光密度 聚合酶链反应 千碱基对 千道耳顿 致谢 v7 4 9 3 5 1 本论文是在导师李忠正教授和丁少军教授的悉心指导扣亲切关怀下完成 的。导师渊博的学识、高尚的人品和博大的胸怀使作者受益匪浅，在论文进行 过程中，导师不仅给予了研究方向和技术上的指导，还给予精神上的鼓励，帮 助作者克服困难，使论文得以顺利完成。在此作者向两住导师表示最诚挚的谢 意。 在本论文的研究过程中，张晓丽高工、叶汉玲高工、宜勇刚老师、张哲夫 老师、池杏微老师和郁金霞副教授为本论文的实验工作提供了大力支持和细致 周到的服务。论文也得到了木素研究室、制浆教研室的各住老师以及马金霞和 戴红旗老师的大力支持和帮助。另外，0 3 届马玉芹同学和0 4 届郭海英，李科、 黄萍等同学以及0 4 级研究生周蕊同学协助完成了部分实验r - 作。 在论文的研究过程中，南京林业大学电镜室和4 5 x - 院理化中心及南京纤维 纺织研究所协助完成了部分分析工作，本校遗传育种实验室为本论文的部分实 验提供了方便条件。 为此作者谨向所有为本论文的完成给予过关心和支持的各位老师和同学表 示深深的谢意! 最后，感谢先生王翔和爱子王子靖在本人学习和生活中的理解、支持和帮 助，特剐感谢母亲无微不至的关爱，是她无私的母爱支持作者顺利完成了学业! 作者：昊淑芳 2 0 0 5 年6 月 1 课题研究的背景及意义 1 j l 日l 舌 资源和环境问题是2 l 世纪人类面临的最主要挑战。纤维素与木质素、半纤维素及其 它多糖一起构成植物细胞壁的主要成分，是生物圈最丰富的可再生资源和能源物资，是地 球生物圈碳素和能量循环的主要部分。据估计，植物每年大约合成1 0 0 0 亿吨以上的纤维 素【l 】。目前，纤维素材料除少量用于纺织、造纸和建筑外，人们对其开发利用还相当有限。 在当今不可再生资源和能源日益枯竭的今天，大力开发和转化利用木质纤维素这些可再生 资源则十分必要。 纤维索是葡萄糖单元通过p - l ，4 一苷键联结而成的线形高分子聚合物，它不同于其它 的葡萄糖基多糖，具有不可溶性和刚性结构，因此具有天然的抗生物降解性能。不过，一 些可水解纤维素的微生物产生的酶类可协同作用，将纤维素水解成低聚糖并最终转化为葡 萄糖，来满足本身及其它微生物的生长需要口3 】。纤维素酶由于具有将大量的可再生的纤 维素生物质转化为可发酵的糖的潜能而被广泛关注。关于纤维素微生物学的有关研究五十 年前即已开始，并且在很多方面取得了很大成就。然而，由于复杂的物质结构及其与植物 细胞壁其它组分之间的关系，纤维素的水解是极其复杂的多酶过程，纤维素生物降解的很 多情形目前仍不十分清楚。目前对纤维素酶研究不仅仅体现在生物质转化方面，在纺织和 制浆造纸行业也有广泛应用【4 ”j 。因此对纤维素酶特别是那些具有特殊的生物化学性能的 需求将快速增长。而纤维素酶的较高的生产成本是其商业化的主要障碍。 纤维素酶是由作用方式不同的内切型纤维素酶( 简称e g ) 、外切型纤维素酶( 简称 c b h ) 和纤维二糖酶( b g ) 组成的多酶体系，其来源广泛，而研究较多的是真菌中的木 霉属、曲霉属、青霉属和根霉属等【1 4 】。从现有的资料看，不同来源的微生物生产的纤维 素酶，在酶的分子结构和催化特性上都有明显的不同，给纤维素酶的应用研究带来了困难。 随着分子空间结构生物学的发展，人们已经可以通过异源表达的方法获得比较单一的纤维 素酶制剂，为研究纤维素酶各组分的作用及酶的定向应用创造了条件。 v o l v a r i e l l av o l v a c e a ，食用草菇，生长在热带和亚热带，多年前即在中国和其他亚洲国 家中种植，目前在一年生食用菌中产量排名世界第五【1 5 】。关于v v o l v a c e a 产生的木质 纤维降解酶的研究已经开展【l “川。以往的研究显示，矿v o l v a c e a 分泌的胞外酶包括纤维 二糖水解酶、内切葡萄糖苷酶和b 葡萄糖苷酶，但缺乏木素降解酶、木质素过氧化物酶 和锰过氧化物酶。当用稻草作为主要的碳源变化培养时，可测出半纤维素酶及纤维素酶活 性。 由于天然纤维素酶来源广泛，组分复杂，其分离纯化相当困难，草菇天然纤维素酶亦 然。丁少军等分别采用离子交换、凝胶过滤柱层析、疏水交合型色谱以及制备型凝胶电泳 等技术方得到五种内切纤维素酶，这一过程极其复杂。而c a i 等使用d e a e s e p h a r o s e 、 具有m o n o q 、m o n o - s 和m o n o p 的f p l c 柱纯化内切纤维素酶却没有获得成功。可见从 天然酶组分中分离得到单一组分的酶是十分困难的，这也导致了酶应用的困难，尽管纤维 素酶用于废纸脱墨研究的很多，由于大多采用混合酶，因此其用于脱墨的机理目前还不十 分清楚。基因工程方法通过克隆特定酶组分的编码基因并将其表达于受体细胞中，可得到 纯度较高的单一组分的重组酶。本研究所用e g i 酶即通过基因工程手段获得的单一组分 的内切纤维素酶。该酶最大的特点是内切纤维素酶活性高、纯度高，经过两步分离提纯后 即可得到纯化的重组酶蛋白，用传统的纯化方法很难获得。这为单一组分酶的酶学特性及 应用研究创造了条件。另外，e g i 酶的最适p h 值为7 5 ，基本为中性，这也为该酶将来 的工业化应用提供了方便。 目前，国外用于植物纤维改性的纤维素酶已经商品化。n o v o z y m c s ( 诺维信) 、g e n e n c o r ( 杰能科) 和h e n k e l ( 汉高) 等公司的纺织用织物整理荆以及e d t 公司的生物脱墨剂已 在国内市场销售，其售价相当高。在国内尽快研制出能够代替上述产品的工业酶制剂已势 在必行。山东大学微生物实验室对于纤维素酶在纺织和造纸行业的应用已经作了大量的研 究工作。但目前尚无很好的产品代替进口酶制剂。 目前国内对于纤维素酶分子结构和性能研究相对较少。山东大学微生物实验室对拟康 氏术霉、微紫青霉等所产的纤维素酶各结构域的功能及吸附性能作了部分研究。其研究所 用纤维素酶为传统方法制备，经分离纯化后使用。对于e g i 和c b h i 酶结构域的拆分多 采用蛋白有限酶切的方法。关于重组纤维素酶及其它纤维素酶结构和功能的研究尚未见报 道。 2 课题拟解决的问题及研究目的 对纤维素酶的研究已经有五十多年的历史。期间有关纤维索酶的分离纯化、酶的基 因克隆和一级结构测定以及酶分子的结构和功能的研究取得了很大进展。但是，纤维素酶 降解天然纤维素的效率比较低的问题一直没有得到解决。近年来，纤维素酶大量用于废纸 脱墨和纤维改性研究，由于研究多用混合酶。因此其真正的作用机理仍不十分清楚。这些 问题的存在使得纤维索酶的应用及其作用的真正发挥受到一定的限制。本研究拟从构建无 纤维素吸附区的内切纤维素酶着手，通过对有无纤维素酶吸附区的酶的性能的比较研究， 了解了纤维素酶的吸附性能及其吸附对水解的影响，这对于解决纤维素酶降解天然纤维素 效率低的问题具有理论指导意义。 关于纤维素酶的结构与功能目前已经清楚绝大多数纤维紊酶分子都含有一个易于和 纤维素结合的纤维素结合区域( c e l l u l o s eb i n d i n gd o m a i n ，c b d ) 和包含催化水解纤维素 底物的活性位点的催化域( c a t a l y s ed o m a i n ，c d ) ，二者通过一段高度糖基化的肽链 ( 1 i n k e r ) 连接。大量研究认为，c b d 对高效降解不溶性纤维素起着关键作用【l 批1 2 9 1 。但 是，不同来源的纤维素酶对不同的纤维素底物，或者不同来源的纤维素酶对同一纤维素底 物，甚至同一来源的纤维素酶对不同的纤维素底物的水解能力并不完全相同。h u m i c o l a i n s o l e n s 的e g 5 和c e l l u l o m o n a s f i m i 的c e n e g 中并未发现c b d 结构，却仍然具有水解活 性 9 0 l ，可见有些纤维素酶中c b d 结构可能不是水解必须的。纤维素酶的c b d 的具体功 能尚不十分清楚。迸一步搞清楚c b d 的具体功能对于纤维素酶应用中经济上的可行性是 十分必要的。 目前研究纤维素酶c b d 结构与功能主要是通过蛋白有限酶切或基因工程方法删除 或增加c b d ，再比较二者在性能上的差异。其中蛋白有限酶切由于技术上比较成熟而被 2 广泛采用，但是其操作过程比较复杂，且不适合大批量制备。基因工程方法则相对便捷、 快速，并且能够大批量制备，是一种比较先进的方法。目前在纤维素结构与功能的研究中 采用基因工程方法的相对较少。通过聚合物链反应( p c r ) 得到目的基因片段，并通过载 体在受体细胞中高效表达是这一技术的关键。 以往对纤维素酶结构和功能的研究主要致力于纤维素酶对生物质的降解上，这需要 多组分纤维素酶的协同作用。近年来，纤维素酶在植物纤维改性中的应用受到关注，并且 已经有部分研究成果。其中最成功的应用是靛蓝牛仔的生物石洗。此外，纤维素酶用于 l y o c e l l 织物的整理、纸浆二次纤维滤水性能的改善以及废纸酶法脱墨等研究都有突破性 进展，但是有关纤维素酶用于废纸脱墨以及纤维改性的机理目前仍不十分清楚。加之天然 纤维素酶来源广泛，组分复杂，其分离纯化困难，因此以往对纤维素酶用于废纸脱墨的研 究( 尤其是国内) 多采用混合酶，不利于搞清纤维素酶脱墨机理以及酶的各组分在脱墨中 的作用。本文拟通过基因工程手段得到无吸附区的重组内切纤维素酶e g i - c d ，研究e g i 酶的吸附区在酶对不溶性纤维素底物吸附、水解、织物改性及其废纸脱墨中的作用，为 e g i 酶最终能够得到高效应用而在基因水平上的改造提供依据。 3 本论文主要研究内容 利用已经克隆到的e g l 基因，扩增出e g l c d 基因片段，构建无吸附区的内切型纤维素 酶e g i - c d ，进行内切纤维素酶吸附性能、底物特异性及其应用研究。本文主要研究内容： ( 1 ) 无吸附区的内切型纤维素酶e g i - c d 的构建： ( 2 ) 内切型纤维素酶e g i 和e g i - c d 吸附性能以及对不同的纤维素底物水解性能的研 究： ( 3 ) 内切型纤维素酶e g i 在牛仔布生物石洗和混合办公废纸脱墨中的应用研究。 4 本论文的主要创新点 本研究从构建无c b d 的内切纤维素酶着手，通过对有无c b d 的重组内切纤维素酶吸 附性能和底物特异性的比较，讨论了内切型纤维素酶e g i 对不溶性纤维素底物的吸附和 水解特性及其c b d 在吸附和水解中的作用，并提出纤维紊酶在不溶性纤维素底物上的吸 附有两种方式的观点。这在国内尚属首次。 在国内首次用具有较高纯度的单一组分内切型纤维素酶进行办公废纸酶法脱墨和织 物改性的研究，取得了较好的效果，并探讨了办公废纸纤维素酶脱墨中灰分对脱墨效果的 影响。由于所用内切纤维素酶e g i 为转基因重组酶，酶的纯度高，因此研究结果可较好 地说明内切型纤维素酶确实在脱墨和织物改性中起着重要作用。 1 1 纤维素的结构 第一章文献综述 纤维素是发现最早的陆生及海生植物细胞壁的主要组成成分，一些水产动物和细菌也 可产生纤维素阎。纤维素化学结构早在2 0 世纪3 0 年代就已清楚。它是由成千上万个d 吡哺式葡萄糖残基通过1 3 - i ，4 - 葡萄糖苷键连结而成的线性聚合物。其中吡哺式葡萄糖基 的构象为椅式，相邻葡萄糖基在形成糖苷键时相互要旋转1 8 0 0 因此，纤维素亚单元实际 上是纤维二糖( c e l l u b i o s c ) 矧。其结构式如图1 1 所示。 。母。峪。 图1 1 纤维素结构 f i 邑1 1s t 兀l c t u r eo fc e l l u l o s e 纤维素不同于其它的葡萄糖基多糖，有不可溶性和刚性结构，因此具有天然的抗生物 降解性能。这是因为纤维素链具有聚集在一起的倾向，通过分子间力形成稳定的结晶体。 目前已发现，不同的纤维素样品其结晶度不完全相同，且有多种结晶结构和无定型区阱2 5 】。 纤维素纤维的尺寸及结晶区和无定型区的比例取决与其起源。高等植物细胞壁中的纤维素 纤维由半纤维素和木质素包围1 2 6 l 。 关于纤维素是如何构成纤维的，目前比较有代表性的是f e n g e l 提出的模型1 2 7 l ( 图1 2 ) 。 若干纤维素大分子链首先构成直径约3 n m 的原纤丝( e l e m e n t a r yf i b r i l ) ，原纤丝是最基本 的形态结构单元，1 6 根原纤丝组成直径约1 2 n m 的微纤丝( m i c r o f i b r i l ) 。再由这样的微纤 丝组成一根比较大的纤丝，童径约2 5 n m 。在原纤丝之间存在着木聚糖的单分子层，在微 纤丝之间存在着几个分子厚的木聚糖层，而纤丝周围则为木素包围。 不同植物的细胞壁组成及解剖学结构明显不同，相同之处是它们的纤维素成分含量都 很高。典型植物细胞中纤维素含置约占细胞干重的3 5 5 0 1 2 8 - 2 9 ，而棉纤维细胞纤维素约 占9 0 以上，几乎为纯的纤维索。大多数植物细胞的纤维中都嵌入半纤维素和木质素等 其它生物聚合物，这些聚合物随着植物细胞类型和成熟期的不同而有所区别【3 0 1 。这种显 著的结构特征限制了微生物对它们的降解，也限制了人们对它们的利用。 4 图1 2 细胞壁的结构层次及纤维的组成1 2 7 j f i g 1 2s t r u c t u r eo fc e l lw a l la n dc o m p o s i t i o no f c e h u l o s e 迄今为止，已发现固态下存在着五种纤维素结晶变体。天然纤维素也称为纤维素i ， 是所有聚合物科学中研究最多的物质。拉曼光谱、c 1 3 核磁共振和微衍射光谱研究显示， 纤维素i 实际上含有两个截然不同的结晶品格：具有三斜对称性的纤维素i 。也称为“海藻 一细菌”型，具有单斜( 晶系) 的纤维素i - 也称“棉花苎麻”型【3 l 。j 。这两种形态的区别 在于它们分子内氢键的构成m 1 。不同来源的纤维素其纤维索i 。和i ，具有特有的性能。i 。 主要存在于简单的微生物如由线性末端联合体合成的醋酸菌和一些细菌的细胞壁中，其它 藻类和高等植物如c h a r as p p 和棉花的细胞壁富含i 。有被膜的动物纤维素完全是i ，但 也有纤维素i 。【3 5 】。藻类纤维素微衍射研究认为沿着微纤维长度方向i 。和i 。两种形态交替， 但醋酸菌纤维素的研究表明，i 和i 。共存于微纤维的整个交叉区域。纤维素i 。缺乏热力学 稳定性容易转化为纤维素i 。m 】。 微晶纤维素、滤纸或棉花常被用于研究纤维素酶的水解性能或酶对底物的吸附性，这 主要是因为它们具有典型的结晶纤维素i 的结构且比较容易得到。苎麻纤维由于其具有简 单的形态也是一个比较好的选择。醋菌属和有被膜的纤维素也具有简单的形态，是研究纤 维素i 。和i 。不同酶解性能的比较适合的底物【3 2 1 。其它纤维素晶格类型( 、i i i t 、i i i u 、l 和i v l l ) 对于研究酶的作用具有潜在的用途。存在于某些植物中的纤维素i i 、i 也具有 生理学意义【3 7 1 。将棉纤维或微晶纤维素在浓磷酸中润胀可方便地得到无定型纤维素，但 其结构目前还不清楚，有人将其描述为一个低结晶度的纤维素i i 的形式口“。用二甲亚砜- 二氧化硫亚乙基二酰胺溶液得到的无定型纤维素也是一个很好的选择i j ”。 1 2 降解纤维素的微生物 据报道，自然界中具有降解纤维索活性的微生物有近2 0 0 种1 3 9 1 。这些微生物产生并作 用在广泛的由腐朽植物残体组成的厌氧的土壤环境中，并分泌产生以不同方式作用于底物 的多种变化的酶。能够降解纤维素的微生物的种类很多，但只对少数纤维素酶产量较高的 微生物及其纤维素酶进行了较为深入的研究。 1 2 1 细菌 典型的好氧和厌氧细菌都能够降解纤维索。厌氧细菌产生结合紧密的多蛋白的纤维素 酶复合体，称为“c e l l u l o s o m c s ”，它能够广泛有效降解结晶纤维素。瘤胃是厌氧细菌的丰 富的资源。大多数已知的能够水解纤维素的厌氧细菌如下所列【4 0 讲】：c l o s t r i d i u ms p p 如 c c e l l u l o v o r a n s 和c c e l l u l o v o r a n s ，b u t y r i v i b r i of i b r i s o l v e n s ：f i b r o b a c t e rs u c c i n o g e n e s ： r u m i n o c o c c u s s p p 如r f l a v e f a c i e n s 。 大多数好氧细菌产生的纤维素酶称为不完全纤维素酶系，其水解纤维素的能力受到限 制。目前比较清楚的水解纤维素的好氧细菌包括【4 5 啪】：c e l l u l o m o n a s f i m i ：b a c i l l u ss p p 如 b s u b t i l i s ；p s e u d o m o n a ss p p ；a c t i n o m y c e t e s 如s t r e p t o m y c e ss p p 和t h e r m o m o n o s p o r a s p p 。 1 2 2 真菌 白腐菌即能降解木质素又能降解木材中的多糖。这类真菌能够产生完全的纤维索水解 酶系，包括纤维二糖水解酶、内切纤维素酶和b 葡萄糖苷酶。研究较多的自腐菌是 p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m 5 0 】和a g a r i c u s b i s p o r u s 5 ”。 褐腐菌一般为担子菌属，它们能够广泛地降解纤维索和半纤维素，但对木素的作用仅 限于去除甲氧基【5 ”。p o r i a p l a c e n t a 只能产生内切纤维素酶和b 一葡萄糖苷酶。通过这些真 菌降解纤维素的前期是一个非酶的氧化过程【5 3 1 。 软腐菌发现于i m e f f e e t i 和a s e o m y c e t e s 中。它们通常能够降解木材中的多糖而不能降 解木素。软腐菌也能产生完全的纤维素水解酶系。研究较多的软腐真菌有t r i c h o d e r m a s p p 、f u s a r i u ms p p 【5 4 1 、h u m i c o l as p p 【5 5 1 、p e n i c i h i u m 和a s p e r g i l l u ss p p 【鲫。 厌氧真菌也产生多蛋白纤维素酶系，这类似c l o s t r i d i u mt h e r m o c e l l u m 的c e l l u l o s o m e s 。 被广泛研究的厌氧真菌包括n e o c l l i m a s t i xp a t r i c i a r u m 1 、s p h a e r o m o n a sc o m m u n i s 5 8 1 和 p i r o 所d 九甜c o m m 堋d 5 9 1 。 近年来，一些研究者对嗜热好氧菌和中温厌氧真菌的纤维素酶进行了研究。由于嗜热 菌具有所产纤维素酶热稳定性好，对酸、碱等其它不良因素耐受性好，在培养过程中不易 受其它微生物污染等优点而受到关注。嗜极端环境的纤维素酶产生菌的筛选是目前产纤维 素酶菌种筛选的热点。 6 1 3纤维素酶及其研究进展 1 3 1 纤维素酶体系及其协同作用 由于纤维素的结构复杂性，其完全水解需要至少三个不同的酶的作用。即内切1 ，4 - 8 葡萄糖苷酶( e n d o - b l ，4 - g l u e a n a s e s ，e c 3 2 1 4 ) ，简称为内切酶( 来自真菌简称e g ，来自 细菌的简称c e n ) 外切一p 1 ，4 - 葡萄糖苷酶( e x o b 1 ，4 g l u e a n a s e s ，e c 3 2 1 9 1 ) ，简称为外 切酶，又称为纤维二糖水解酶( c e l l o b i o h y d r o l a s e s ，来自真菌的简称c b h ，来自细菌的简 称c e x ) ；b 葡萄糖苷酶( p - 1 ，4 g l u c a n a s e s ，e c 3 2 1 2 t ) ，又称为纤维二糖酶( c c l l o b i a s e ， c b 或b g ) 【6 “。 e g 酶随机进攻和水解纤维素肛1 ，4 糖苷键，产生纤维低聚糖，快速降低聚合度( d p ) ， 但其还原糖的增加却比较缓慢旧。通常，内切纤维素酶的活性仅限于羧甲基纤维素和磷 酸或碱润胀纤维素等无定型纤维素1 6 2 。极少数分离的e g 酶也显示出对结晶纤维素的活性 j 。纤维低聚糖的水解率依赖于聚合度，即长链纤维低聚糖水解率较高，并且此水解率 随着聚合度的增加而增加畔j 。内切纤维素酶与纤维二糖水解酶的差别还表现为进攻发色 体纤维低聚糖4 一甲基伞形植物- p d 一纤维二糖蕾和p 一硝基苯p 纤维二糖的能力。这两种底 物通常可通过纤维二糖水解酶水解，而内切酶不能水解它们【6 ”。大部分真菌能够生产多 种内切纤维素酶，目前6 个产自t , r e e s e i 、5 个产自s p o r o t r i c h u mp u l v e r u l e n t u m 和4 个产 自a s p e r g i l l u sa c u l e a t u s 的重组酶已经得到纯化【6 ”。真菌外泌的内切纤维素酶是具有由 天冬酰胺酸、丝氨酸和苏氨酸连接的糖链的糖蛋白。内切纤维素酶的组成不同，则其作用 模式、吸附于纤维素的程度以及与纤维二糖水解酶协同作用于不溶性纤维素底物的能力也 可能不同【7 1 】。 传统观点认为纤维二糖水解酶从纤维素葡聚糖链的非还原末性端开始水解释放纤维 二糖 7 2 1 。近来的研究显示，t r i c h o d e r m ar e e s e i 的c b hi 和c b h1 1 分别从相反的链末端水 解纤维素。其中c b hi 作用于还原型末端而c b hi i 作用于非还原性末端【7 1 7 5 】。t r i c h o d e r m a r e e s e i 的c b h 的外切作用对酸处理纤维素聚合度的降解速度很慢【7 6 】。同样，f u s a r i u ms o l a n i 和p e n i c 册u m p i n o p h i l u m 也有相似的作用效果1 7 “”j 。其主要产物是纤维二糖，但纤维素水 解过程中也有少量的葡萄糖和低聚糖释放【7 9 j 。纤维二糖水解酶对结晶纤维素和无定型纤 维素具有广泛的特异性，但对羧甲基纤维素等纤维素替代品则无活性。 在一些真菌的培养液中常常含有大量的纤维二糖水解酶蛋白。z r e e s e i 分泌的纤维二 糖水解酶蛋白大概占细胞外蛋白的8 0 【l ，可见其在纤维素水解中具有重要作用。褐腐 真菌只有少量或根本没有纤维二糖水解酶产生，因此它们不能催化水解结晶纤维素【8 “。 来自几个单独的真菌的纤维二糖水解酶蛋白的多个异构重整体已经得到纯化，一般将它们 分成为两个不同的类型c b hi 和c b hi i ，二者具有不同的立体专一性，并且在水解结晶 纤维素时具有协同作用【8 2 1 。一些多c b h