（应用化学专业论文）动态皂化萃取、结晶与柱层析法结合提取茄尼醇的研究.pdf

摘要 摘要 本文综述了国内外有关提取茄尼醇的各种方法。在前人研究的基础上，进一 步探讨和研究茄尼醇的提纯方法，制定了合适的实验方案，提出了采用动念皂化 萃取一结晶一柱层析相结合的方法提取茄尼醇。 在课题组前期实验工作的基础上，改进实验方案，使皂化和萃取反应同时进 行，减少了实验步骤，提高了实验效率，详细研究了石油醚用量、皂化萃取时间 和温度对实验过程的影响，采用最小二乘法对实验数据进行关联和比较。实验结 果表明，5 o g 粗品茄尼醇在4 5 时加入5 0 r a l 乙醇、2 5 9 氢氧化钠和5 0 r a l 石油 醚，搅拌反应2 h ，调节溶液的p h 值为7 ，得到了5 8 茄尼醇。 设计了球形央套式萃取结晶装置，针对得到的5 8 茄尼醇，选择以甲醇作为 结晶剂，采用深冷结晶法提取更高纯度的茄尼醇。考察了结晶剂的用量、结晶温 度、结晶时间和抽滤时间对结晶过程的影响，采用最小二乘法关联，设计了正交 试验进行优化。实验结果表明，在结晶溶剂比为6 0 、结晶温度为3 、结晶时间 为4 h 、抽滤时间为2 0 m i n 的条件下进行深冷结晶，可将茄尼醇含量提高到8 0 9 6 以上。 设计了连续中压柱层析分离装置，对于得到的8 0 茄尼醇，选择以硅胶作为 固定相，一定比例的石油醚和乙酸乙酯作为流动相，采用硅胶柱层析法来提取茄 尼醇产品。考察了流动相的比例、硅胶目数及用量等因素对实验过程的影响，采 用最小二乘法对实验数据进行关联和比较。实验结果表明，在固定相为2 0 0 3 0 0 目的硅胶、流动相为石油醚：乙酸乙酯= 9 ：l 的条件下，0 6 9 的层析原料，通过 装柱量为1 2 0 9 的硅胶柱，最后再通过重结晶，得到了含量为9 5 的茄尼醇产品。 本文所采用的分离方法简单，提取过程能耗低，9 5 的茄尼醇产品为进一步 制备其它生物产品提供了原料。 关键词：茄尼醇，皂化萃取，结晶，硅胶柱层析 a b s t r a c t a b s t r a c t t h er e c e n tm e t h o d so fs e p a r a t i n gs o l a n e s o lw e r er e v i e w e di nt h i sp a p e r s o m e n e wr e s e a r c ha n dd i s c u s s i o no fp u r i f y i n gs o l a n e s o lw e r ec a r r i e do u to nt h eb a s i so f p r e v i o u sr e s e a r c h a c c o r d i n gt ot h ee x p e r i m e n t a lp l a nw em a d e ，a l la d v a n c e dm e t h o d o fd y n a m i cs a p o n i f i c a t i o na n de x t r a c t i o n , c r y s t a l l i z a t i o nc o m b i n e dw i t hc o l u m n c h r o m a t o g r a p h yt oe x t r a c ts o l a n e s o lf r o m i t sr o u g hm a t e r i a lw a sp u tf o r w a r d o nt h eb a s i so fp r e v i o u sr e s e a r c h ，e x p e r i m e n t a lp r o j e c tw a si m p r o v e d t h e n s a p o n i f i c a t i o na n de x t r a c t i o nr e a c t i o nc o u l db ec a r r i e do u ta tt h es a m et i m e t h i s m e t h o dn o to n l yr e d u c e de x p e r i m e n t a ls t e p sb u ta l s oi n c r e a s e de f f i c i e n c yo ft h e e x p e r i m e n t d i f f e r e n ti n f l u e n c i n gf a c t o r s o nt h ee x p e r i m e n t a le f f e c ts u c h嬲 s a p o n i f i c a t i o na n de x t r a c t i o nt i m e , t e m p e r a t u r ea n da m o u n to fp e t r o l e u me t h e re t c 。 w e r es t u d i e di nd e t a i l t h ee x p e r i m e n t a ld a t aw a sc o r r e l a t e db yl e a s ts q u a r em e t h o d t h e e x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a tt h ep r o d u c to f5 8 s o l a n e s o lw a sg a i n e dw h i l e p u t t i n g5 0m le t h a n o l ，2 5 9s o d i u mh y d r a t ea n d5 0m lp e t r o l e u me t h e ri n t o5 0 9 c r u d es o l a n e s o la tt h et e m p e r a t u r eo f4 5 a f t e rs t i r r i n gf o r2h o u r sa n da d j u s t i n gp h t 07 r o u n d j a c k e t e de x t r a c t i o na n dc r y s t a l l i z a t i o na p p a r a t u sh a db e e nd e s i g n e d t h e p r o c e s so fc r y s t a l l i z a t i o nu s i n gm e t h a n o la sc r y s t a l l i z i n ga g e n tw a ss e l e c t e dt oi s o l a t e s o l a n e s 0 1 t h e i n f l u e n c i n g f a c t o r ss u c h 嬲a m o u n to f c r y s t a l l i z i n ga g e n t ， c r y s t a l l i z a t i o nt e m p e r a t u r e ，c r y s t a l l i z a t i o nt i m ea n ds p i n - f i l t r a t i o nt i m ew e r es t u d i e d i nd e t a i l n ee x p e r i m e n t a ld a t aw a sc o r r e l a t e db yt h el e a s t s q u a r em e t h o d o r t h o g o n a lt e s t sw e r ed e s i g n e dt oo p t i m i z et h er e s u l t s t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t s s h o w e dt h a to v e r8 0 s o l a n e s o lw a so b t a i n e dw h e nt h ep r o d u c tc r y s t a l l i z e da tt h e t e m p e r a t u r eo f - 3 c ，a tt h er a t i oo fs o l v e n to f6 0 ，r e a c t e df o r4h o u r sa n df i l t r a t e d 2 0 m i n c o n t i n u o u sm i d i u mp r e s s u r ec o l u m nc h r o m a t o g r a p h ys e p a r a t i o na p p a r a t u sh a d a l s ob e e nd e s i g n e d t h ep r o c e s so fc o l u m nc h r o m a t o g r a p h yu s i n gs i l i c ag e la s i m m o b i l ep h a s e ，p e t r o l e u me t h e r - e t h y la c e t a t em i x e dw i t hac e r t a i np r o p o r t i o n 嬲 m o b i l ep h a s ew a ss e l e c t e dt op u r i f yp r o d u c t so fs o l a n e s 0 1 d i f f e r e n ti n f l u e n c i n g f a c t o r so nt h es i l i c ac o l u m nc h r o m a t o g r a p h ys u c ha st h ep r o p o r t i o no fm o b i l ep h a s e , t h em e s ho fs i l i c ag e la n dt h ew e i g h to fs i l i c ag e le c t w e r es t u d i e d t h ee x p e r i m e n t a l d a t aw a sa l s oc o r r e l a t e db yt h el e a s ts q u a r em e t h o d t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e d t h a to v e r9 5 s o l a n e s o lw a so b t a i n e da f t e rs i l i c ac o l u m nc h r o m a t o g r a p h ya n d a b s t r a c t r e c r y s t a l l i z a t i o n o 6 9s a m p l ed i s s o l v e di n e l u e n te m p l o y i n gp e t r o l e u me t h e r - e t h y l a c e t a t e ( 9 0 ：10 ，v v ) w a sl o a d e do n12 0 92 0 0 - 3 0 0m e s hs i l i c ag e la n dp l a c e do nt h e c o l u m n i nt h i sp a p e r , t h em e t h o do fs e p a r a t i n gs o l a n e s o lw a ss i m p l ea n dt h ee n e r g y c o n s u m p t i o no ft h er e f i n i n gp r o c e s sw a sl o w t h ep r o d u c to f9 5 s o l a n e s o lh a s p r o v i d e dr a wm a t e r i a l sf o rp r e p a r i n go t h e rb i o l o g i c a lp r o d u c t s k e yw o r d s ：s o l a n c s o l ，s a p o n i f i c a t i o na n de x t r a c t i o n , c r y s t a l l i z a t i o n ，s i l i c ag e l c o l u m nc h r o m a t o g r a p h y 第一章绪论 1 1 前言 第一章绪论 烟草中含有数百种化学成分，其中有许多是宝贵的成分，如烟碱、茄尼醇、纤维 素、果胶、色素、烟草烟蛋白等，可以用一系列的化学方法，对这些有用的化学成分 进行提取、精制或加工，从而应用于农业、医药、化工、造纸、食品等行业，其中茄 尼醇由于其广泛的医学用途而备受关注。 现在种植最多的烟草类型主要有：烤烟、白肋烟、马兰烟和香料烟，主要用 于生产卷烟。通过考察h a r l a n 和m o s e l e y 介绍的主要卷烟用烟草类型的代表性分析 ( 见表1 。1 ) ，我们可以对这些烟草化学成分的差异有一个大概的了解【l j a 从表1 1 可以看出，茄尼醇是烟叶的重要组成成分之一，其中烤烟作为提取茄尼 醇的原料较好。 1 2 茄尼醇的性质 茄尼醇，英文名称为s o l a n e s o l ，是一种不饱和的聚异戊二烯醇，属四倍半萜醇， 具有特殊的全反式链式结构【2 】经红外光谱( i r ) 、元素分析和衍生物制备化学方法 对茄尼醇的结构进行鉴定，认为它的分子式3 0 c 4 5 h 7 4 0 ，分子量6 3 0 ，结构式为【3 】： c h 2 y = 誓 纯的茄尼醇为白色针晶，熔点在4 1 5 4 2 5 1 2 之问，易溶于乙醚、丙酮、烃类 等有机溶剂，不溶于水，无光学活性，在强光下易分解，避光保存。广泛存在于 高等植物、哺乳动物和微生物体内，烟叶、马铃薯叶和桑叶中含量突出，尤其是 烟叶中茄尼醇含量高达0 3 3 【4 - 7 1 。 佩口 h 一 玛 飓 吗 啦 7liil圳ij h 既 h c h 一 鸭 凰 a c 第一章绪论 表i - i烟草的化学组成：卷烟烟叶的代表性分析( 陈化叶片，按干质量计) 1 3 茄尼醇的用途 1 3 1 构成茄尼醇的复合物 茄尼醇有较强的抗癌生物活性，能够抗菌消炎，对于治疗充血性心脏病所致 浮肿、肺充血、心绞痛，治疗急慢性肝炎、亚急性肝坏死，治疗坏血病、十二指 肠溃疡、胃溃疡、坏死性牙周炎，凝血、止血等有良好作用，近期还发现它对艾 滋病还有显著的辅助疗效。由茄尼醇和药食同源成分的高度不饱和脂肪酸( 天然 2 第一章绪论 甘油酯型鱼油) 复合可以构成一种复合物【8 】，其中天然甘油酯型鱼油：茄尼醇( 纯 度7 5 以上) ：维生素e = l ：0 0 1 - - 0 0 5 ：0 0 3 ( 重量比) 。天然甘油酯型鱼油有 调节血脂，抗血栓，抗炎症等作用。天然甘油酯型鱼油是茄尼醇的载体，二者性 状接近，都具有非常强的脱氢反应，有降解人体低密度脂蛋白，激活细胞活性， 预防心血管疾病及动脉硬化的价值，前者还能对后者进行包和，有效的克服茄尼 醇极易氧化的致命缺陷，天然甘油酯型鱼油复合物中维生素e 作为抗氧化剂。 1 3 2 合成辅酶q l o 维生素k 2 等药用中间体 茄尼醇同时也是用于合成辅酶q i o 、维生素k 2 、高效杀虫剂和p 胡萝卜素等产 品等的药用中间体原料2 1 。其衍生物辅酶q l o 是人体内不可缺少的参与代谢的重 要活性物质，它作为细胞电子和质子的传递者，参与蛋白质和脂肪代谢，是细胞 呼吸和代谢为人体细胞产生能量的激活剂，能激活细胞呼吸，加速产生三磷腺苷 ( a t p ) ，并起到解毒急救作用可以改变细胞和组织的缺氧状态，对肝脏、脑、心 脏及神经系统具有较好的保护和改善作用它还能提高吞噬细胞的吞噬率，增加抗 体的产生，改善细胞功能，增强体内的非特异性免疫力。同时，辅酶q i o 还是细胞 自身产生的天然抗氧化剂，能抑制线粒体的过氧化，保护生物膜结构的完整性。 因此辅酶q l o 在医药、保健和化妆品领域中应用十分广泛，如在医药领域中用于治疗 心脑血管疾病、病毒性肝炎、十二指肠溃疡和癌症病人减轻化疗副作用等；在保 健品领域，辅酶q i o 用于预防多种疾病和减缓衰老等，是欧洲、美国、开本等国非常 流行的一种保健品，大多数发达国家的保健品商店中均可看到辅酶q l o 的胶囊或片 剂；在化妆品领域，辅酶q 1 0 用于祛斑除皱、防止肌肤老化等，是高档化妆品的原料， 如欧莱雅( l o r e a l ) 、妮维雅( n i v e a ) 等品牌的化妆品中有很多品种都含有辅酶 q 。o 。此外，辅酶q i o 近来还被发现有更多的用途，如治疗老年痴呆、先天障碍性贫 血等。维生素k 2 具有促进凝血、改善动脉硬化的作用，维生素k 与骨骼的新陈代谢 有关，其中维生素k 2 作用最显著。1 9 9 5 年同本首次将维生素k 2 作为治疗骨质疏松 药物应用。我国已进入老龄化社会，骨质疏松患者发病率较高。维生素k 2 既可作 为一种营养物，又可以作为骨代谢调整物质应用于生活和医疗保健中。 1 3 2 1d a n i e ld a v i dw e s t 提出合成辅酶q i o 的方法 以茄尼醇和对甲基苯酚通过多步反应合成辅酶q l o 【】。 h o 泊。h 旦h o 沸b ，篇h n a 0 h _ ：矿 h z c - - c h m g b r 3 第一章绪论 o o 1 3 2 2b r u c eh l i p s h u t z 等人1 1 4 i 提出的合成路线 ：凄h 滞：取o t s 叶l i c l 7 d m f 6 - 1 u t i d i n e r l c e o b 飘帆c 麟 h 警c ，儿嚣、岩簪 删5 1 9 2 1 3 2 3b r u c eh l i p s h u t z 的改进方法 利用了不同的原料进行合成目的产物辅酶q l o ，合成过程分两步进行，其中合 成步骤一中三次用到氧化反应，可以提高产率；合成步骤二缩短合成路线【1 5 】。 合成步骤一： n a b h l m e o 1 矿m e o m e o m e o o 9 0 4 兰q ! ! ! - m e o m e o h o 第一章绪论 m e o m e o m e o 。- 订丫一：三兰繇o h o h o h6 e o m e o m e 0 o 0 3 m e o m e o 忖i 儿文尹詈： 合成步骤二： 撤h 。詈卫 m e o m e o h o - m e o - m e o o c h o 1 3 2 4 毛进等提出以下合成路线 国内毛进等【1 6 】提出辅酶q l o 的合成方法： m em e h 飞入矿研+ h 姒，胃o h o m e 0 m e o o m e o + 怜p h m e o o o 且m m e o o m e 一h 飞办韶h o 1 3 3 合成抗癌增效剂s b d 乙二胺 n 茄尼基n ，n - - ( 3 ，4 二甲氧基苄基) 乙二胺( 简称s b d 乙二胺) f 】具有优先 作用于多种抗药性肿瘤的直接的细胞毒性，对几乎所有类型临床抗肿瘤药物具有 增效作用，其中对抗生素类和生物碱类抗癌药物的增效尤为显著，如对其中的博 莱霉素( 争光霉素) 、呱来霉素、磅霉素等，每毫升注射液含有3 1 0i lg 的s b d 乙 二胺，药效分别能提高4 7 和1 3 0 倍，对新制癌菌素( n e o c a r z i n o s t a t i n ) 也能提高2 倍 以上【i8 1 。与其他增效剂相比，s b d 乙二胺的增效作用具有定向细胞毒性，而本身 完全没有细胞毒性，安全性好，可以连续使用，可减少抗癌剂的剂量，减轻毒副 作用 1 9 2 0 。因此，研究丌发抗癌药物增效剂是茄尼醇的重要作用之一。合成路线 5 第一章绪论 如下： o c h ：i o c h ：i 1 厂 一c 剐吼一 2 0 c i i ：l h 十啪i 一2 + b r 佣：l 4 1 4 茄尼醇国内外市场现状与前景 由于高纯度茄尼醇是合成辅酶o l o 的重要原料，因此辅酶o l o 的市场直接决定于 茄尼醇的市场情况。辅酶q l o 在医药、保健和化妆品领域中应用十分广泛，欧美诸国 和同本等发达国家，已把人体内辅酶q i o 含量的高低作为衡量身体健康与否的重要指 标。美国f d a ( f o o da n dd r u g a d m i n i s t r a t i o n ) 于2 0 0 4 年3 月将辅酶q l o 的建议用量 提高了4 倍，使得本来就供不应求的辅酶q l o 市场更加紧俏，目前国际市场价格已从 20 0 0 美元k g 上涨到30 0 0 美元k g 。一般来说，每生产lk g 辅酶q o ，至少需要2k g 质量分数为9 0 以上的茄尼醇。2 0 0 4 年国际辅酶q l o 总产量约为9 0 0t ，其中半合成 法生产的约为7 2 0t ，直接需要消耗高纯度茄尼醇近20 0 0t 。纯度为9 0 的茄尼醇的 国际市场价格在2 0 0 5 年下半年已涨到4 8 0 美元l 【9 2 。同本、美国、德国、韩国分别 为采购高纯度茄尼醇量最大的4 个国家。而我国从2 0 世纪9 0 年代初才丌始茄尼醇的 工业化丌发，建立了若干茄尼醇粗品厂( 质量分数在1 7 以下) 由于工艺落后，消耗 烟叶和有机溶剂的量十分庞大。近1 0 年来，国内茄尼醇粗品生产企业大多数将产品 销售给同本，由r 本企业精制高纯度茄尼醇用于辅酶q l o 的合成。而由于茄尼醇黏度 很大、熔点低，无法用传统的分离纯化方法纯化，而日本在茄尼醇精制工艺方面严格 6 第一章绪论 保密，因此我国长期以来无法生产高纯度茄尼醇。近一两年来，我国科研工作者采用 非常规方法突破了茄尼醇低成本精制技术，但全国仅有两家生产的产品能够符合其 合成辅酶q i o 的要求。 随着国际市场上辅酶q - o 建议用量的提高和需求量的同益增大，国际市场对茄尼 醇的需求量也与r 俱增。中国是全球最大的烟草生产国，发展茄尼醇产业有着得天独 厚的优势，但由于高纯度茄尼醇的生产工艺技术长期被r 本所垄断，因此目前我国的 高纯度茄尼醇几乎完全依赖进口。由此可见，茄尼醇的市场规模很大，且供不应求的局 面将维持相当长的时间。特别要指出的是，我国研究辅酶q l o 的科研单位很多，掘报道 已完成实验室合成的单位有数家，但至今尚没有工业化投产的消息，究其原因是因为 高纯度的茄尼醇所制约。国内从烟叶中提纯出茄尼醇大多在2 0 左右，这些低纯度茄 尼醇不能用于合成辅酶q 1 0 。由低含量茄尼醇提纯到高纯度，按传统方法不可能实现， 必须采用某些特殊工艺，纯度和收率才均能适合。因此组织工业化生产高纯度的茄尼 醇，不仅有国外市场，而且国内市场可观，经济效益显著。 1 5 国内外提取茄尼醇的主要方法 1 5 1c 0 2 超临界萃取方法 针对有机溶剂萃取烟叶中茄尼醇的工艺路线长，溶剂消耗量大且会造成环境 污染等缺点，杨群力，吴建华提出用超临界c 0 2 萃取法【2 2 】从烟叶中提取茄尼醇。基 本原理：负载溶质( 粉碎烟叶) 的超临界c 0 2 流体进入分离器后，c 0 2 流体溶解度 降低，使萃取物得以分离，产品从分离器下方出口放出，c 0 2 流体循环使用。 工艺流程图如图1 1 所示： 产品 粉 烟 2 图l 一1c 0 2 超临界萃取法的j 1 ：艺流程幽 7 c 0 2 第一章绪论 分离过程包括将粉碎烟叶装入萃取器4 中，储罐1 中的二氧化碳液体加压后 送到换热器6 中加热，将加热后的二氧化碳液体送入萃取器4 中完成萃取过程； 负载溶质的二氧化碳流体进入分离器5 中，分离器中压力和温度均小于储罐中的 压力和温度，在分离器5 中二氧化碳流体溶解度降低，伎萃取物得以分离，分离 萃取物后，二氧化碳流体再经换热器6 液化后，回到储罐l 中循环使用，产品从 分离器5 下方放出。 c 0 2 超临界萃取方法虽然流程短、溶剂用量少、无污染、萃取率较高，但需要 购置昂贵的分子蒸馏仪，而且在蒸馏过程中不仅茄尼醇蒸出，其他沸点相近的成分 也会同时蒸出【2 3 1 。 1 5 2 大孔树脂法 大孔树脂法是将含茄尼醇8 o 的废次烟叶浸膏溶于石油醚后先经皂化、抽滤 和减压蒸馏后得到茄尼醇粗品( h p l c 含量为2 8 3 ) ，再经无水乙醇超声溶解离 心后除去不溶物质，在层析柱中，用大孔吸附树脂作为层析介质，先后以蒸馏水、 4 0 乙醇、6 0 乙醇洗去极性大的杂质，再用8 0 乙醇洗脱，收集8 0 乙醇沈脱部 分，h p l c 含量为9 1 3 ；最后将9 1 3 的茄尼醇浆状物溶于乙腈丙酮( v ：v = 3 ：2 ) 中，于1 5 下静置过夜，低温( 0 ) 抽滤，用冷乙腈( 一l o c ) 洗涤晶体，低温冷冻干 燥，得茄尼醇白色粉末，h p l c 含量为9 7 3 【2 4 】。大孔吸附树脂具有吸附容量大、 解吸快、洗脱率高，可重复利用等优点，但整个操作过程比较繁琐，工业化比较困难。 1 5 3 柱层析法 柱层析方法是将流动相连续通入层析柱内，待分离混合物间歇地以阶跃的形式注 懒t 2 5 , 2 6 。在层析柱内，组分经历不断被吸附、沈脱的过程，从而根据各自与固 定相和流动相相互作用的不同而达到有效分离。待分离的混合物一次送入层析柱，随 后以设定的条件通入洗脱剂，使混合物得以分离。 薛华欣等人【2 7 】提出以含量不低于7 0 的茄尼醇粗品为原料使用高效液相制备 色谱柱或中压硅胶填充柱以无毒的饱和烷烃( , - e 戊烷、环己烷、j 下己烷或正辛烷 任一种) 和乙酸酯( 乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸丙酯任一种) 的混合液为淋沈液。 淋洗后的馏分分段收集，经旋转蒸发回收溶剂，溶解浓缩后的分段产物真空干燥 处理，得到的茄尼醇的纯度9 8 5 。 马震【2 8 】报道了用含量1 7 2 的茄尼醇在甲醇、乙醇、石油醚单独或混合溶剂 下进行皂化，温度控制在4 0 - 8 0 ，反应时间1 5 4 h 。反应后再加入有机溶剂甲醇、 乙醇、或混合溶剂提取0 5 h ，加入脱色剂，在2 0 6 0 降温沉淀、离心分离，提取 液在2 5 o 结晶，分离得到的结晶体再用上述溶剂溶解，再结晶，得到了含量在 5 0 7 5 的茄尼醇，再用有机溶剂溶解除杂( 可用萃取、常压过滤，也可采用膜过滤 第一章绪论 或澄清过滤，澄清过滤的有效手段是加硅藻土助滤或g q 型管式澄清离心过滤) 。 滤液浓缩到一定体积后进行柱层析分离。层析液经浓缩结晶得到纯度8 0 9 0 的 茄尼醇产品，再经过重结晶可得到9 0 以上的茄尼醇产品，再经过一次层析分离 结晶，即可达到i 9 6 0 的高纯茄尼醇产品，经h p l c 检测含量达到9 6 2 。 胥克亮【2 9 】用纯度不低于7 0 的茄尼醇提取物，用正己烷溶解后以f 己烷、l ， 2 二氯乙烷和丙酮的混配液为洗脱剂，以丙酮为返洗剂，采用吸附色谱法，去掉与茄 尼醇极性不同的杂质后，再以j 下己烷为溶剂和洗脱剂，采用凝胶渗透色谱法，去掉与 茄尼醇分子量不同的杂质，浓缩、冷却后即得到纯度为9 5 以上的茄尼醇精品。 夏薇掣3 0 】报道了将废次烟叶浸膏溶于苯中加入对苯二酚搅拌，再经氢氧化钾的甲 醇溶液进行皂化后用柱色谱进行分离，最后用丙酮在1 5 下结晶，得到茄尼醇晶体， 纯度9 3 4 ，总收率5 8 8 。 1 5 4 聚合态共沉淀法 王非等【3 l 】报道了一种新的精制茄尼醇的方法聚合态共沉淀法，该法采用有靶 向性的高分子基团与茄尼醇分子形成聚合态，在适宜的条件下形成共沉淀后洗脱，得 到高纯度( 质量分数9 5 ) 的茄尼醇。这种方法在理论和实际上都是可行的。但是， 偶联是在一定条件下进行的，在偶联、解离过程中，茄尼醇也必须纯化到一定程度， 这期间采用的仍然是传统的提取、皂化等方法。 1 5 5 动态轴向压缩色谱法 阎家蒯3 2 】曾指出，目前同本采用的工业化生产高纯度茄尼醇的方法动态轴向 压缩色谱( d a c ) 法。设备为一直径2 0c n l ，柱床高2 5c n l 的动态轴向压缩色谱柱，上 样量0 5k g ，一轮提纯的时间只有4 0 r a i n 。粗品( 纯度1 7 ) 茄尼醇经一次动态轴向 压缩色谱纯化，产品纯度 1 9 6 ，收率1 9 7 。这是目前生产高纯度茄尼醇最简便、 成本最低的方法。动态轴向压缩色谱技术解决- f $ j j 备技术的放大问题。对于粒径为5 l am 填料的色谱柱，其有效塔板数为8 0 0 0 0 m 以上，折合板高为2 1 ( 实际板高与填 料颗粒直径的比值) ，峰的对称性值为0 9 1 3 ，柱效与分析柱的柱效一样高。实际 上，动念轴向压缩色谱就是放大到制备型也可按h p l c 色谱条件直接进行放大，节约 了时间和成本。目前世界上的动态轴向压缩色谱柱直径已达1 6m ，满足了装填出稳 定、高效的大直径柱以用于大规模生产的需求。 动态轴向压缩柱在分离、操作原理上与常规柱层析相同，操作是不连续的或者说 仍是批处理色谱，批处理色谱所具有的不足还都保留，克服了批处理色谱不足的色谱 是模拟移动床色谱。 9 第一章绪论 1 5 6 模拟移动床动态轴向压缩色谱法 模拟移动床色谱( s m b c ) 是连续色谱分离工艺中的一种，它是模拟移动床技术和 色谱技术的结合，是以模拟移动床的运转方式来实现色谱分离过程的一种连续色谱方 法【3 3 】。模拟移动床色谱系统通过使用电磁阀来控制进口与出1 3 的位置沿流动相流动的 方向有次序地移动，有效地模拟了固定相与流动相的相对逆流流动。 由于模拟移动床色谱系统是通过进口与出口位置的移动来模拟固定相的移动，从 而实现相对逆流，使色谱的高分离率、低能耗、低物耗、常温运行等诸多优点继续保 留而移动床的优点也能体现；由于模拟移动床技术与色谱结合，使色谱分离从间歇变 为连续；由于模拟了逆流，硬得固定相和流动相能反复利用，从而大大提高了效率，降 低了成本：由于模拟移动床色谱是在谱带首尾切取馏分，从而使提纯过程更易控制； 由于引进了精馏、回流机制，使分离能力增加，产品收率提高；同时由于引进了连续机 制，从而提高了产率，克服了移动床和层析色谱的不足。 模拟移动床的分离单元仍是层析色谱柱。将高性能的动态轴向压缩柱替换常规的 层析色谱柱，就得到了模拟移动床动念轴向压缩色谱。它兼具模拟移动床色谱与动态 轴向压缩柱色谱的优点，而克服了彼此的不足。 1 5 7 分子蒸馏法 分子蒸馏就是在高真空状态下，使蒸发面( 加热面) 和冷凝面的间距小于或等于 轻组分物料的蒸汽分子的平均自由程，即使蒸发面逸出的分子可以毫无阻碍地奔喷射 并凝集到冷凝面上。根据分子运动理论分子蒸馏具体过程如下：液体混合物的分子受 热后运动会加剧，当分子获得足够能量时，就会从液面逸出而成为气相分子。随着液 面上方气相分子的增加，有一部分气体就会返回液体。在外界条件保持恒定的情况下， 最终会达到分子运动的动态平衡，从宏观上看，液体系统达到了平衡。在一定温度下， 压力越低，气体分子的平均自由程越大。但由于不同分子的分子量不同，导致轻分子 的平均自由程大，重分子的平均自由程小。此时若在离液面小于轻分子的平均自由程 而大于重分子的平均自由程处设置一捕集器，使得轻分子不断被捕集，从而破坏了轻 分子的动态平衡而使混合液中的轻分子不断逸出，而重分子因达不到捕集器很快趋于 动态平衡，不再从混合液中逸出，这样，便达到了混合物分离的目的。 由于烟草成分比较复杂，含有的有机物质种类比较多，孔宁川等人提出【3 4 】采用分 子蒸馏暨短径蒸馏技术以烟草浸膏为原料制烟草净油及茄尼醇。将烟草浸膏送入分子 蒸馏的蒸发器中，通过真空度和蒸发温度的控制，对烟草浸膏进行分段蒸馏，得到烟 草净油前段，将分离出净油前段的剩余物处理成高真空烟草净油后段，分子蒸馏残渣 为黑色的茄尼醇富集段，再采用传统的分离方法分离出高含量茄尼醇。分离流程图 1 - 2 所示。 l o 第一章绪论 茄尼醇 分离方 图1 2 分子蒸馏法流程幽 富集茄尼醇段 传统 陵 r 高含量茄尼醇 1 5 8 微波辅助萃取法 微波辅助萃取法【3 5 3 6 1 是利用微波能加热与固态样品接触的溶剂，使所需要的化合 物从样品中分配到溶剂里的提取过程。提取在密闭或敞丌的微波透明容器中进行，提 取溶剂和样品混合在里面，可同样接受到微波能。 此法是目前正研究丌发的一种新的萃耿技术【3 7 1 ，具有选择性高、操作时间短、 溶剂用量少的特点。工艺流程：原料烟叶加溶剂溶解，微波辅助萃取，冷却，过 滤，结晶得产品。 1 5 9 溶剂提纯法 溶剂提纯法是植物提取常用方法，我国中草药有效成分提取均使用这类方法， 只要选择好溶剂，一般可以从植物中将所需化合物分离出来。由于这种方法操作 步骤多，溶剂消耗量大，反复循环过程中有效化合物损失较多，只适用于茄尼醇 粗品的生产，无法应用于精品制备。但傅强，蒋才良，马世学提出一种可连续操 作，通过喷淋法萃取烟草中茄尼醇的方法【3 8 1 。萃取液先用蒸汽间接加热，再用热 水间接加热后自然蒸发得到的产品中茄尼醇的含量为6 0 ，将得到的产品再问接加 热，负压蒸发，茄尼醇的含量可以达到9 5 。主要流程：烟草预处理，加溶剂( j 下 己烷或溶剂油) 萃取( 萃取率9 0 ) ，萃取液净化和浓缩。所用的设备如图1 3 。 第一章绪论 图1 3 萃取罐的整体示意图 l 苹取罐罐体2 原料入口3 溶剂入口4 湿烟渣山1 2 15 萃取液出口 6 物料容器7 物料容器的底网的支撑板8 链条9 链条齿轮l o 电机 此过程包括将烟草预处理，用溶剂萃取茄尼醇，然后将萃取液净化和浓缩， 其中萃取过程是在萃取罐中进行，将烟草加到物料格上，烟草随物料格水平转动， 同时将溶剂喷到物料上，溶剂流经物料层从物料格底网渗出，用泵将该渗出的萃 取液送至其他物料格上，喷淋该物料格内的物料，将进行多次喷淋后的萃取液取 出，并将经多次喷淋后的物料从萃取罐中取走，连续操作。 1 5 1 0 国内外提取茄尼醇各种方法的比较 从以上提取茄尼醇的各种分离方法可以看出，超临界c 0 2 萃取法要购置昂贵 的分子蒸馏仪，而且在蒸馏过程中不仅茄尼醇蒸出，其他沸点相近的成分也会同 时蒸出，因此操作比较困难。大孔树脂法虽能将茄尼醇提到较高的纯度，但整个操 作过程比较繁琐，工业化比较困难。柱层析法能达到高纯的茄尼醇，但对原料要求很 高，茄尼醇含量需达到7 0 左右。聚合态共沉淀法虽然在理论和实际上都是可行的， 但在偶联、解离过程中，茄尼醇也必须纯化到一定程度，而且这期间采用的仍然是传 统的提取、皂化等方法。动态轴向压缩色谱法在分离、操作原理上与常规柱层析相同， 操作是不连续的或者说仍是批处理色谱，批处理色谱所具有的不足还都保留，模拟移 动床动念轴向压缩色谱法对设备的要求比比较严格，鉴于实际情况实验室中不适合 采用。分子蒸馏法整个工艺流程也比较复杂，其中也用到传统的茄尼醇分离方法。 微波辅助萃取法也很难实现工业化，溶剂提纯法对溶剂的消耗比较大，生产成本比 较高。 1 6 分析检测方法的确定 一 1 6 1 薄层色谱法 2 第一章绪论 薄层色谱法( t h i n - l a y e rc h r o m a t o g r a p h y ) 是一种物理化学的分离分析方法。操 作时将吸附剂均匀地涂于玻璃板或塑料板上使之形成薄层( 固定相) ，将样品滴于薄 层的底端，待溶剂挥散后置入盛有一定溶剂( 展丌剂) 的密闭容器内。吸附剂对不同 物质的吸附力的大小不同，它对极性大的物质吸附力强，对极性小的物质吸附力较弱。 在检测过程中溶剂流过时，不同物质在吸附剂和溶剂之间会不断地发生吸附解吸附 再吸附再解吸附，易被吸附的物质，相对移动得慢一些，而较难被吸附的物质则相 对移动得快一些。经过一段时间毛细管作用的移动( 展丌) ，不同的物质彼此实现分 离。 薄层色谱法一般用作定性检测分析，特别是对于某些需要避免杂质干扰的检测方 法，薄层色谱法是很好的预分离手段。姚文等人用硅胶g 板，以1 ，2 二氯乙烷 苯丙酮( 9 ：9 ：1 ，v v ) 为展开剂，1 2 5 磷铝酸乙醇液为显色剂，在1 1 0 ( 2 下显 色5 m i n ，茄尼醇的r f 值为o 5 2 。李烈等m 】采用硅胶g 高效薄层板( 1 0 0 m m x 2 0 0 m m ) ， 用正己烷乙酸乙酯乙酸( 4 ：1 ：o 5 ) 为展开剂，香草醛浓硫酸溶液为显色剂，对 不同产地烟叶中茄尼醇的含量进行了测定。 薄层层析法是常用的物质定性分析方法，采用薄层层析检测茄尼醇，可以为茄尼 醇的定量分析节省时间。该方法不需要昂贵的仪器，可为烟叶中茄尼醇的质量分析和 控制提供依据。 1 6 2 库仑分析法 库仑分析法( c o u l o m b sa n a l y s i sm e t h o d ) 是在电解分析法基础上发展起来的一种 分析方法。它通过测量被测物质在电解过程中所消耗的电量来求得物质的含量。库仑 分析中，电流效率必须1 0 0 ，没有其它的副反应和次级反应存在。 茄尼醇是不饱和醇，能与溴等发生加成反应，因而可以采用库仑分析法检测提取 物中茄尼醇的含量。其中滴定介质的选择是一重要研究内容。刘快之等用冰醋酸为 电解介质，对皂化处理后的茄尼醇提取物，采用库仑滴定法对茄尼醇的含量进行了测 定。郑奎玲【4 2 】用薄层分离库仑滴定法对茄尼醇浸膏纯化并进行了含量的测定，确定 了层析板为硅胶板，乙酸乙醋：甲醇= 3 ：1 的混合溶剂为展开剂，碘显色的分离体系， 得到最适合的滴定介质为冰醋酸( 7 2 ) ：甲醇( 8 ) ：水( 2 0 ) ，在2 0 - , 3 0 范 围内测定茄尼醇较准确。 茄尼醇提取纯化过程中有许多样品需快速测定而不需精确定量的，库仑滴定法方 法简单，精密度较高，可以满足其要求，该方法不需要标准溶剂，不需要昂贵的仪器， 容易实现。 1 6 3 高效液相色谱法 高效液相色谱法( h i g hp e r f o r m a n c el i g u i dc h r o m a t o g r a p h y ，h p l c ) 是以经典液 1 3 第一章绪论 相色谱法为基础，引入了气相色谱的理论与实验方法，发展而成的分离分析方法。具 有分离性能高、分析速度快、检测灵敏度高、流动相选择范围广和应用范围广等特点。 高效液相色谱特别适合分析高沸点、大分子、强极性、热不稳定化合物和各种离子型 化合物。因此被广泛应用于生物碱、黄酮、有机酸、萜类化合物、维生素、农药等的 分离和分析。h p l c 仪器由高压输送系统、进样系统、分离系统以及检测和记录数系 统四大部分组成，此外，可根据特殊要求，配备一些附属装置，如梯度洗脱、自动进 样、馏分收集等装置。图1 4 为h p l c 的流程：贮液槽中的流动相经高压泵输送至色 谱柱入口，样品由进样器进入输液系统，流经色谱柱进行分离，分离后的各组分由检 测器检测，输出信号由记录仪记录，即得液相色谱图。 圆悃 图l - 4i - i p l c 的流科 赵瑾等【4 3 】选用z o r b a x s i l ( 2 5 0 m m x 4 6 m m i d ) 色谱柱，以f 己烷：异丙醚： 乙酸乙醋( 6 ：3 ：1 ) 混合溶剂作流动相，用示差折光检测器测定了烟叶提取物中茄 尼醇的含量，结果表明所用方法具有良好的分离效果和回收率，可用于烟叶或茄尼醇 产品中茄尼醇含量的测定。张明时等1 采用正相硅胶色谱柱，以正己烷：异丙醇( 体 积比为9 8 ：2 ) 混合液为流动相，在波长2 1 5 n m 处对烟叶中茄尼醇的含量进行了测定。 本课题拟采用高效液相色谱法，以甲醇乙醇为流动相，对茄尼醇进行分析检测。 1 7 本课题技术关键 目前，世界各国对烟草及其废弃物综合利用的研究丌发方兴未艾，而且正在不断 的深入，我国在该领域的研究相对较为落后。值得重视的是，我国既是烟草生产大国 又是烟草的消费大国，烟草既对人类有药用等多种实用价值，也存在“吸烟危害人类 健康和污染环境的隐患。由于烟草业税收丰盈己成为国家财政收入的国情，加强对 烟草有利人类方面的综合开发利用研究，同时重视对烟草制品进行再研究，提高品质， 降低有害物质的含量，体现其有益的功效，既满足吸烟人群的需求又达到最大限度保 护健康和减少环境污染的目的，扬长避短，让烟草充分发挥对人类的贡献。 鉴于以上认识和思考，本课题以烟草及其废弃物所提取的烟叶浸膏为研究对象， 在前人研究工作的基础上，充分应用现代高新技术和方法手段，从茄尼醇浸膏中提取 1 4 第一章绪论 9 5 茄尼醇产品方面展开工作。通过实验研究，建立提取分离茄尼醇的方法，为综合 丌发利用烟草及其废弃物提供一定的科学依据和一些实用方法。 针对茄尼醇本身的化学结构，以及其具有极性小，熔点低等特点，且浸膏中与其 相邻近的几种杂质很可能是一系列同系物，分离纯化困难的问题，本文提出采用动态 皂化萃取、结晶与柱层析法结合来提取9 5 茄尼醇产品，申请了实用新型专利超低温 结晶离心装置【4 5 】和连续中压柱层析分离装置m 】，简化了实验步骤和不必要的损失， 提高了实验效率。通过查阅国内外大量文献和实验找到了分离效果较好并且易得的有 机溶剂，此溶剂不仅有较高的茄尼醇提取率和较高的溶剂回收率，更为重要的是它的 价格比较低，在工业化生产中，可使整个生产过程的成本降低，利用组分间的溶解性 不同将组分得以分