抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性测定方法.doc

抗氧化酶（sod、pod、cat）活性测定方法一、 超氧化物歧化酶（sod）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）1、试剂的配制（1）0.05mol/l磷酸缓冲液(pbs，ph7.8)：a母液：0.2mol/l磷酸氢二钠溶液: 取na2hpo412h2o（分子量358.14）71.7g；b母液：0.2mol/l磷酸二氢钠溶液：取nah2po42h2o（分子量156.01）31.2g。分别用蒸馏水定容到1000ml。0.05mol/l pbs（ph7.8）的配制：分别取a母液(na2hpo4) 228.75ml，b母液(nah2po4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267268。（2）14.5mm甲硫氨酸溶液：取2.1637g met用磷酸缓冲液（ph7.8）定容至1000ml。（3）30m edta-na2溶液：取0.001gedta-na2用磷酸缓冲液定容至100ml。（4）60m核黄素溶液：取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存。（5）2.25mm 氮蓝四唑(nbt)溶液：取0.1840g nbt用pbs定容至100ml，避光保存。酶液制备：取0.2g（可视情况调整）样品（新鲜叶片或根系）洗净后置于预冷的研钵中，加入1.6ml 50mmol/l预冷的磷酸缓冲液（ph7.8）在冰浴上研磨成匀浆，转入离心管中在4、12000g下离心20min，上清液即为酶液。2、酶活性测定（1）反应混合液配制(以60个样为准)：分别取met溶液162ml，edta-na2溶液0.6ml，磷酸缓冲液5.4ml，nbt溶液6ml，核黄素溶液6ml,混合后摇匀；（2）分别取3ml反应混合液和30l酶液于试管中（3）将试管置于光照培养箱中在4000 lux光照下反应20min；同时做两支对照管，其中1支试管取3ml反应混合液加入30l pbs（不加酶液）照光后测定作为最大光还原管，另1支只加缓冲液置于暗中测定时用于调零。（4）以不照光的对照管（只有缓冲液并置于暗处）调零后，避光测od560(出现颜色即可测定)。（5）酶活性计算：sod活性单位以抑制nbt光化还原50所需酶量（测的样品值要在最大管的一半左右才合适，否则要调整酶量）为1个酶活单位（u）。sod总活性 ( ack-ae )v/（1/2ackwvt）sod比活力sod总活性/蛋白质含量sod总活性以鲜重酶单位每克表示（u/g fw）；比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示；ack为照光对照管的吸光度；ae为样品管的吸光度；v为样品液总体积（ml,1.6ml，加入pbs的体积)；vt为测定时的酶液用量（ml，30ul）；w为样品鲜重（g，测定时应换算为叶绿体的质量mg）；蛋白质含量单位为mg/g。二、pod、cat酶活性的测定粗酶液制备同sod。1、 过氧化物酶（pod）活性测定（愈创木酚法）（1）试剂配制：0.2mol/l磷酸缓冲液(ph6.0)：分别取a母液(na2hpo4 ) 123ml和b母液(nah2po4 ) 877ml混匀即为1000ml pbs(0.2m，ph6.0)；（2）反应混合液配制（以60个样为准）：取200ml pbs(0.2m，ph6.0)，加入0.076ml液体（原液）愈创木酚（2-甲氧基酚）加热搅拌溶解，冷却后加入0.112ml 30的h2o2，混匀后保存于冰箱中备用。（3）样品测定：取3ml反应液并加入30l酶液，以pbs为对照调零，而后测定od470值（测定40秒）。（边加样边测定，测定前等待5秒，动作要快，如果慢的话，要保证每个样品从加好样到开始记时的时间相差不大）（4）酶活性计算：以每min od值变化（升高）0.01为1个酶活性单位（u）。pod=（a470vt）/（wvs0.01t） (u/g min)a470：为反应时间内吸光度的变化；w为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；vt为提取酶液总体积（ml，(1.6ml）；vs为测定时取用酶液体积（ml，30ul）。2、 过氧化氢酶（cat）活性测定（1）试剂配制：0.15mol/l磷酸缓冲液（ph7.0）：取a母液(na2hpo4) 457.5 ml 和b母液(nah2po4) 292.5 ml混合后用蒸馏水定容至1000ml。（2）反应液配制：取200ml pbs（0.15m，ph7.0），加入0.3092ml 30%的h2o2（原液）摇匀即可。（3）样品测定：取3ml反应液加入0.1ml（可视情况调整）酶液，以pbs为对照调零，测定od240（紫外）（测定40s）。（4）酶活性计算：以每min od值减少0.01为1个酶活性单位（u）。cat=a240vt /（wvs0.01t） (u/g min)a240：为反应时间内吸光度的变化；w为样品鲜重(g)；t为反应时间(min)；vt为提取酶液总体积（ml， 1.6ml）；vs为测定时取用酶液体积（ml, 0.1ml）。四、超氧阴离子自由基（o2.-）产生速率的测定（羟胺氧化法）1、试剂的配制（1）1mm盐酸羟胺溶液：称取0.02085g盐酸羟胺用蒸馏水定容至300ml；（2）17mm对氨基苯磺酸溶液：称取1.1776g对氨基苯磺酸用少量冰醋酸水溶液（冰醋酸：水=1：3配制）加热溶解后定容至400ml；（3）7mm-萘胺溶液：称取0.4008g-萘胺用冰醋酸水溶液（冰醋酸：水=3：1配制）定容至400ml。2、o2.-含量的测定（1）样品液提取方法同sod测定；（2）取0.5ml提取液（酶液）（可视情况调整用量）中加入0.5ml pbs（0.05m，ph7.8），1ml 1mm盐酸羟胺溶液后摇匀。（3）在25下保温1小时；（4）依次先加入1ml 17mm对氨基苯磺酸，再加入1ml 7mm -萘胺，混合后快速摇匀；（5）在25下保温20min后在3000g下离心3min后马上进行测定（或置于冰箱待测）；（6）以对照管调零（用水调零），取粉红色水相液测定od530值（测定）；（7）o2.-含量的计算：由测得的od530，查no2-标准曲线得到no2-；根据羟胺与o2.-的反应式：nh2oh2o2.-h+ no2-h2o2 h2o 计算o2.-，即no2-2=o2.-；再根据样品与羟胺反应的时间和样品中的蛋白质含量，求得o2.-产生速率（以nmol min-1mg-1蛋白表示，也可以nmol min-1g-1鲜重表示）。o2.-产生速率=（cv）/（tw） （nmol min-1g-1鲜重）c为标准曲线上查得的浓度(umol/l)；v为测定时所取提取液用量(叶绿体稀释后的体积)；t为反应时间(60min)；w为样品鲜重(叶绿体实际质量g)参考文献：王爱国，罗广华植物生理学通讯，1990，（6）：5557五、丙二醛含量的测定1、试剂配制：10%tca：100g 三氯乙酸 1l0.67%tba：3.35g硫代巴比妥酸 500ml 10%tca （避光）2、测定步骤:0.2 样品+1.6ml 10%tca 研磨12000g 离心 10min 上清1.5ml +1.5 0.67% tba 沸水煮30min 冷却，离心上清od450，od532，od6003、计算组织中mda含量：mda浓度c (umol/l)=6.45(od532-od600)-0.56od450mda含量(umol/g fw)=cv/w式中v为提取液体积(1.6ml)，w为样品鲜重(0.2g)。六、植物细胞质膜透性的测定（电导仪法）（1）取新鲜叶片或根系（不能萎蔫）0.3g，用自来水冲洗表面污渍，再用去离子水冲洗几遍后用吸水纸吸干水分；（2）样品剪碎（也可打孔取样）放入试管（或15ml大离心管）中，加10ml去离子水，在室温下放置3h使叶片充分吸水后测定溶液电导率(r1)；（3）再放入恒温水浴锅中在100沸水浴中煮20min以杀死叶片组织，用冷水冷却到室温后测定溶液电导率(r2)；（4）用公式计算质膜相对透性（用相对电导率表示）：相对电导率（%）=r1/r2100%还可以计算植株伤害程度： 伤害率=（处理电导率对照电导率）/（煮沸电导率对照电导率）100%七、可溶性蛋白含量的测定（考马斯亮蓝染色法）1、试剂的配制（1）考马斯亮蓝溶液配制：称取100 mg考马斯亮蓝，溶于50 ml 90乙醇中，加入100 ml 85（w/v）的磷酸，再用蒸馏水定容到1。在过夜后过滤并贮于棕色瓶中，常温下可在暗中保存一个月。（2）100g/ml牛血清蛋白（bsa）标准溶液：称取25mg bsa加水溶解后定容至100 ml，再从中吸取40ml用蒸馏水定容至100 ml（也可取10mg bsa定容至100ml即为100g/ml标准bsa溶液）。2、样品可溶性蛋白含量的测定（1）样品可溶性蛋白含量测定：取20l提取液（酶液）加入80l，0.05