（营养与食品卫生学专业论文）喹乙醇多克隆抗体制备的研究.pdf

摘要 喹乙醇是一种化学台成的具有广谱抗菌作用的药物，主要用于预防和治疗细菌感染性疾 病，也常用作为饲料添加剂促进动物生长。然而，喹乙醇具有中等至明显的蓄积毒性、遗传 毒性和诱变性，不合理的使用会造成在动物性食品中残留，可能对人类的健康造成潜在危害。 为了建立快速灵敏的检测喹乙醇残留免疫分析方法，本研究制各了喹乙醇多克隆抗体，主要 研究内容和结果包括以下方面： 通过琥珀酸酐法合成了具有喹乙醇分子结构特征的半抗原；分别采用活化酯法将半抗原 与牛血清白蛋白( b s a ) ，混合酸酐法将半抗原与卵清蛋白( o v a ) 进行偶联，分别制备了 免疫原和包被抗原。免疫原免疫4 只新西兰大白兔，获得喹乙醇的抗血清，e l i s a 法测得其 效价分别为1 ：6 4 0 0 ；1 ：1 6 0 0 ；1 ：1 2 8 0 0 ：1 ：6 4 0 0 。间接e u s a 法喹乙醇的抑制中浓度i c 5 。 为7 4 3 3 n g m l ，最低检测限i c ”为5 7 l n g m l 。抗血清与喹乙醇结构类似物卡巴氧、痢菌净 的交叉反应均小于0 叭，无交叉反应。分别用饱和硫酸铵法和离子交换层析对抗血清进行 纯化，纯化后得到了纯度较高的抗体。 本研究表明，制备的喹乙醇多克隆抗体可为进一步单克隆抗体的制备，试剂盒的开发工 作打下基础。 关键 司：喹乙醇，多克隆抗体，酶联免疫吸附分析，抗体纯化 a b s t r a c t o l a q u i n d o xi sas y n t h e t i cv e t e r i n a r ym e d i c i n e sw i t hb r o a da n t i - b a c t e r i a la c t i v i t y i ti sa p p l i e di nt h e t r e a t m e n ta n dp r o p h y l a x i so fb a c t e r i a li n f e c t i o n s ，a l s oc o m m o n l yu s e da sg r o w t hp r o m o t e ri na n i m a l s t h ef e e da d d i t i v e 。h o w e v e r , i so b v i o u s l ym u t a g e n i ca n dg e n o t o x i cf o rr o d e n t s n eu n c o n s c i o n a b l eu s e o fo l a q d i n d o xi nf o o da n i m a l sw o u l dc ： t u s ed r u gr e s i d u e s i tp r e s e n t sar i s kt oc o n s u m e l s t oo p e r a t o r s a n dt ot h em e d i c a t e da n i m a l s o u rr e s e a r c ha i m e dt of i n dar a p i da n ds e n s i t i v em e a n st od e t e c t t h eo l a q u i n d o xr e s i d u ei uf o o d o l a q u i n d o xp o l y c l o n a la n t i b o d yw a sp r e p a r e d t h em a i nr e s e a r c ha n dr e s u l t sc o n t a i nt h ef o l l o w i n g p a r t s t h eo l a q u i n d o xh a p t e nw a ss y n t h e s i z e db ys u c c i n i ca n h y d r i d em e t h o d t h e nt h en h se s t e r i f i c a t i o n w a se m p l o y e dt oc o n j u g a t eh a p t e nt ol a r g ec a r r i e rp r o t e i n - b s ao ro v a , i m m u n o g e na n dc o a t i n g c o n j u g a t eh a v eb e e ns y n t h e s i z e d t h ei m m u n o g e nw a si n j e c t e di n t of o u rn e wz e a l a n dw h i t er a b b i t s ， a n t i - s c r n m h a d b e e ns y n t h e s i z e d t h e t i t e r o f t h e s e a n t i s e r u ma 1 ：6 4 0 0 ；1 ：】6 0 0 ；1 ：1 2 8 0 0 ：】： 6 4 0 0s e p a r a t e l y , d e t e r m i n e d b yi n d i r e c te l i s a f o ri n d i r e c te l i s a ，t h ei c 5 0o fo l a q u i n d o xi s 7 4 3 ，3 0 9 m la n dt h ed e t e c t i o nl i m i t ( i c 曲i s5 7 1 n g m l t h ec r o s sr e a e t i v i t i e so fp c a b sw i t hc a r h a d o x a n dm e q u i n d o xa l e 0 0 1 w eo b t a i n e dm o r ep u r e l ya n t i b o d ya f t e rn e a t e d b ys a l t i n go u ta n d i o n - e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y t h i sd i s q u i s i t i o ni n d i c a t e st h a tt h eo l a q u i n d o xp o l y c l o n a la n t i b o d yc a nb et h ep r e p a r a t i v ef o r p r e p a r i n gt h eo l a q u i n d o xm o n o d o n a la n t i b o d ya n de x p l o i m r i n gt h ee l i s a t e s tk i t k e yw o r d s ：o l a q u i n d o x ，p o l y c l o n a la n t i b o d y , e l i s a , a n t i b o d yp u r i f i c a t i o n 1 i 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 研究生签名：乍采金至莳间：细苦年z 月2 2 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复 制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、 传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名：豫金王 导师签名： 1 百叶l 习 时间：聊z 年占月z z 同 时间：枷g 年6 月z 2 日 1兽药残留现状及其危害 第一章文献综述 动物性食晶安全已经成为国际食品进出口贸易中一个关注热点和控制点，在其所涉及的诸如 畜产品安全、加工安全、储藏安全、运输安全、销售安全等方面，动物产品安全为其源头，而其 中最重要的即是兽药残留问题。近年来兽药残留引起食物中毒和影响畜禽产品山口的报道越来越 多。兽药残留可能对人类健康和生态环境产生诸多影响：毒理作用；诱导耐药菌株，干扰人 肠道内的正常菌群；部分药物还可引起变态反应：对生态环境产生有害作用。另外，兽药残 留还影响我国养殖业的发展及走向国际市场。因此必须采取有效措施，减少和控制兽药残留的发 生。 1 1 兽药残留的现状 虽然抗菌药物、维生紊、动物激素等的使用，为我国畜牧业生产和畜产品数量的增长发挥了 一定作用，但同时也给动物性食品安全带来了隐患。由于科学知识的缺乏和经济利益的驱动，养 殖业中滥用药物的现象普遍存在。滥用药物的首要直接后果是导致兽药在动物性食品的残留，摄 入人体后，影响人类的健康。我国虽已制定“动物性食品中兽药残留最高限量”标准，但滥用和 超标使用兽药尤其是抗菌药物造成的餐桌污染和引发的中毒事件时有发生。据报道广州市1 9 9 9 年- 初对待宰生猪进行抽检，盐酸克伦特罗残留阳性率高达5 9 4 【1 j 。 根据美国对兽药残留的调查，产生残留超标的原因：7 6 是不遵守休药期规定，1 8 是饲料 污染及不正确使用药物，6 为其他原因。而我国动物性食品兽药残留超标的主要原因是：非法使 用违禁药物，超量使用抗菌药物和药物添加剂，不遵守休药期的规定。自t l a 世界贸易组织( w t 0 1 后一般认为我国动物性产品出口创汇有一定的优势，然而事实并非如此，国外技术壁垒、绿色 肇垒正在削减这种优势。由于我国出口的动物性产品中“抗生素”超标，2 0 0 2 年1 月2 5 日，欧盟 停止进口我国包括蜂蜜在内的动物源性产品，导致我国大批相关产品滞留或被遣返。受其影响， 2 0 0 2 年1 5 月，我国畜产品累计出口1 0 9 亿美元，同比下降1 2 ，对欧盟水、海产品出口大幅下 降，f 降幅度达i 1 j 6 6 。动物源食品中的药物残留问题不仅给人民健康带来极人的危害，而且严 重影响了我国畜产品的出口，造成了巨大的经济损失，损害了我国畜产品在国际上的地位和声誉。 兽药残留很多，残留毒理学意义较大的兽药按照其用途分类主要包括：抗生素类、合成抗菌 素类、抗寄生虫类药、生k 促进剂和杀虫剂等。抗生素和抗菌素统称抗微生物类药是主要的作 为添加剂而生产的兽药残留，占药物添加剂的6 0 。各类常见兽药见表： 中国农业人学硕士学位论文第一章文献综述 裹1 - 1 常见鲁菊分类 t a b1 - 1t h ec l a s s i f yo f v e t e r i n a r ym e d i c i n e s 兽药种类代表性药物 抗生素类 合成抗菌素类 抗寄生虫和杀虫剂类 生艮促进剂 且_ 内酰胺类、四环素、氯霉素、链霉素、金王f = 素等 磺胺类、喹诺酮类、卡巴氧、喹乙醇等 阿维菌素类、苯并眯唑类、咪唑并噻唑类等 己烯雌酚、雌二醇、b 激动剂、生长激素等 1 2 危害 1 ，2 1 毒性作用 一般急、慢性毒性。兽药残留一般浓度很低，加上人们食用的数量有限，大多数药物并不能 由于残留引起急性毒性。但由于某些药物毒性大或药理作用强或残留比较严重，也有少数人由于 吃了含有药物残留的组织而发生急性中毒的报道。如2 0 0 2 年1 月8 日和1 0 日，浙江省两地分别发生 大量市民食物中毒事件，中毒原冈为市民所吃猪肉中含有盐酸克伦特罗。法国、西班牙也出现因 食用克伦特罗超标的牛肝而出现中毒及死亡的事件。许多兽药添加剂都有一定的毒性，如常用的 氯霉素可引起再生障碍性贫血，氨基糖甙类有较强的肾毒性等，如果长期吃入含有这些药物的动 物性食品就可能产生慢性毒性作用。 特殊毒性。现已发现许多普药具有致畸、致突变或致癌作用( 简称“三致”作用) ，如硝基昧 唑及硝基呋哺类药物可能引起人体基因、细胞染色体突变和致畸胎作用；其抑制细胞性的作用使 其具有潜在的致突变性和致畸性：克伦特罗等兴奁剂能引起人心跳加速、神经过敏等症状。雌激 素、喹噫类的卡巴氧、砷制剂等都已被证明具有致癌作用，许多国家己禁止这些药物用于食品动 物。 1 2 2 激素样作用 2 0 世纪7 0 年代以前，许多国家均将雌激素或同化激素用作畜、禽的促生长剂，后来发现雌激 素具有致癌作用，已先后禁止使用。但目前我国仍有非法用于畜禽、水产养殖的情况，如果食入 含有这类药物的食品，则可能干扰人体的激素功能。 2 1 2 3 过敏反应与变态反应 少数抗菌药物能够致敏易感个体，如青霉索、磺胺类、四环素类等。当这些抗菌药物残留于 肉食品中进入人体后，就使部分敏感人群致敏，产生抗体。当这些被致敏的个体再接触这些抗生 素或用这些抗生素治疗时，这些抗生素就会与抗体结合生成抗原抗体复合物，发生过敏反应。英 国一对青霉素高度敏感的病人，食用约含i o i u m l 青霉索的商品牛奶后，发生了变态反应口1 。在 近几十年中，有关牛奶中青霉素类和磺胺类药物残留引起人过敏反应的病例时有发生，轻者皮肤 痛瘁和患荨麻疹。重者引起急性血管性水肿和休克，严重过敏病人甚至出现死亡。这些过敏反应 尤其以食用牛奶的婴儿屡见不鲜。 1 2 4 对人类肠道微生物的影响 近年来国外众多研究认为，有抗菌药残留的动物源食品，可以对人类肠道的正常菌群产生不 良影响，部分敏感菌受到抑制或被杀死，致使菌群的生态平衡受到破坏。某些条件性致病菌可能 会大量繁殖，损害人类的健康。m o k h t a r 报道，对感染血吸虫的2 7 位病人用吡喹酮治疗前后的结 肠菌群进行了评价，结果在治疗后4 8 h ，需氧菌和类大肠杆菌计数有显著增加。这种变化被认为 是由于药物对肠道的主要厌氧菌丛起抑制作用，导致对药物不敏感的需氧菌大量繁殖的结果。这 种菌丛的扰乱可能使免疫机能己遭到损害的血吸虫病人进步产生并发症。 i 2 5 对角原蓖耐药性的影响 食品动物使用低剂量抗生素和抗菌剂作促生长剂时容易产生耐药性。另一方面，抗菌药物在 动物性食品中的残留可能使人类的病原菌长期接触这些低浓度的药物，从而产生耐药性，使人类 上使用的同种或同类抗菌药的抗菌活性火为降低；并且近年来的研究证明耐药基因限质粒1 可以 在人群中细菌、动物群中细菌和生态系统中细菌问互相传递，例如氟喹诺酮类药物的耐药性现已 非常严重，产生耐药性的速度也很快。由此可导致人体患感染性疾病时，人类上目前常用的抗菌 药效果变差甚至无效，给临床上感染性疾病的治疗造成困难。 1 26 兽药在环境中的生态毒理 动物应用药物后排出的原药或代谢产物由于仍然具有生物效应，将含有兽药残留的废弃物随 意放置、丢弃，将对周围环境构成潜在威胁。随着世界各国环保意识的增强，人们越来越关注兽 药在环境中的蓄积、转移、转化和对人体健康的影响，并在国际上形成了一个新的研究热点。 绝大多数兽药排进环境后仍然具有活性，会对土壤微生物、水生生物及昆虫等造成影响。 3 中国农业大学硕士学位论文第一章文献综述 s t r o n gl 等”报道有几种兽药( 阿维霉素、伊维霉素等) 能在粪便中保持8 周活性，对草原中及 堆肥周围的多种昆虫都有强大的抑制或杀灭作用。兽药进入环境厉，在多种环境闽子的作用下， 可产生转移、转化或在动物中蓄积；s t u m p f m 等“曾对生活废水灌溉植物后的流出液检测，发现 其中有多种药物残留，残留的药物平均浓度范围多在0 1 l m g l 之间，当药水随废水通过这些 植物后，其浓度下降了1 2 9 0 ，然后残留的药物继续进入河流，在对河流造成污染，此时河水 中药物的平均浓度范围在0 2 0 0 4 m g l ，最大浓度可达0 5 m g l 。另外，c o a t sjr d 等”1 通过模 拟生态系统对几种药物进行研究，发现己烯雌酚能通过食物链高度富集；粪中的氯羟毗啶在环境 中降解很慢，磺胺二甲嘧啶降解也较慢。作为饲料添加剂的矿物质元素经排泄物进入环境会造成 在养殖场周围土壤或水中的含量增加。w o l l e n b e r g e r 等1 6 l 报道畜禽常用抗菌药甲硝唑、喹乙醇、 土霉素等六种药物对甲壳细水蚤的作_ e l j 。发现喹乙醇对甲壳细水蚤的急性毒性最强，对水环境有 潜在的不良作用。 随着人f j 对动物源性食品需求量的增加，动物性食品中的兽药残留越来越成为全社会共同关 注的公共卫生问题。兽药残留因存在的环境和健康隐患，不利于养殖业的健康发展和走向国际市 场。在畜牧生产实践中，除了规范用药，必须同时建立药物残留监控体系，制定有关违规处罚手 段，才能有效控制药物的残留。各国政府，尤其是西方发达国家出台了关于兽药添加斋u 使用的更 严格的限制措施，美国及欧盟各国成员已经开始实施国家残留计划监控( t h en a t i o n a lr e s i d u e p r o g r a m ) ，定期向社会公布市场检测结果。我国兽药残留的研究工作起步较晚，但有关部门日益 开始重视动物性食品中的兽药残留问题，制定各种监控兽药残留的规范，修订了动物性食品兽 药残留最高限量标准，并开始建立全国范围的兽药残留监控体系，改进了残留分析方法和技术， 发展了快速、准确和灵敏度高的质量检测手段。而后者是本研究的主旨和主要内容。 2 兽药残留常用分析方法 按照分离或检测原理，兽药残留常用分析方法分为三大类：1 ) 理化分析方法，包括波谱法、 色谱法及其联用技术，如高效液相色谱( h p l c ) 、质谱( g c ) ，薄层色谱法( t l c ) 、毛细管 电浊( c e ) 等；2 ) 免疫分析法，如放射免疫；9 1 4 定法( r i a ) ，酶联免疫测定法( e i a ，e l i s a ) 、 荧光免捩测定法( h a ) 等：3 ) 生物测定法，如微生物学测定法( m i c r o b i o l o g i c a la s s a y ) 儆感 菌抑制法) 、放射受体测定( r e d i o r e c e p t o ra s s a y s ) 等。 由于残留样品的特点，一些分离色谱与检测波谱联用的分析技术，女f l h p l c 、g c 、t l c 在残 留分析中显示较大的优势，遂成为主流的残留分析方法。理化分析方法对药物分离好、特异性强、 灵敏度高，同时可检测多种药物。但缺点是样品的提取净化等前处理步骤繁琐，检测的成本高， 对操作人员的要求也较高，不适宜大批量样品的筛选检测。免疫分析是以免疫结合反应为原理分 析，在简化分析过程、提高速度和降低成本方面具有特殊意义。微生物学测定法原理和操作简单， 虽然耗时长、精度不高，但目前在抗微生物药物残留的分析中仍然发挥作用【”。 4 中国农业大学硕士学位论文 第一章文献综述 3 喹乙醇概述 3 1睦乙醇的理化性质 颐一 窭删2 c h 2 d h t 。 o 0 喹叫嚷 3 2 瞳乙醇的作用 3 2 1 广谱抗蕾 哇乙醇 圈i - ! 睦叨矗、睦乙醇的化学结构 f 崦i - i t h e $ t r a c t u r e o f q u l a d o x l n - d d o i a q u i n d o x 喹乙醇对革兰氏阴性菌，例如巴氏杆菌、大肠杆菌、志贺氏菌及变形特另敏感：对革兰氏阳 性菌，例如链球菌和葡萄球菌也有效，最小抑菌浓度为5 0 1 0 0 g m l ，作用优于金霉菌；对抗生 素耐药的细菌仍然敏感，与四环索、氯霉素、氨卞青霉素不产生交叉耐药性，它选择抑制肠道致 病性溶血大肠杆菌但不影响有益大肠杆菌和其它革兰氏阳性菌。故能有效的控制小猪腹泻和禽 巴氏杆菌病。据报道，用3 0 m 毋g 体重的喹乙醇一次投服治疗人丁感染的禽巴氏杆菌病有很好的 疗效，保护率为9 8 。一些临床治疗报告也表明，喹乙醇是治疗禽巴氏杆菌病的理想药物。由于 喹乙醇有良好的抑菌作用，已广泛地应用于各种动物疾病预防与治疗中。目前研究认为，喹乙醇 的抗菌活性是促生长作用的基础，抗菌机理是抑锖 j d n a 的合成。 5 中国农业大学硕十学位论文 第一章文献综述 3 2 2 提高饲料转化率、促进动物生长 有关喹乙醇促进动物生长的机理尚无定论。目前，主要有以v i i , 种观点：普遍认为喹乙醇能 影响机体的代谢，特别是影响内分泌系统，促进合成，促进氮的沉积，从而导致蛋白质、细胞形 成和组成增多，进而达到增加动物体重促进生产的目的1 9 1 ”，也有文章认为喹乙醇改善饲料利用、 促进生长的主要原因在于其发挥抗菌药物的作用，抑制有害菌群，增强消化酶的活性，提高饲料 的消化吸收率。这在家备的研究中也得到证实”“。c o r p e t ( 2 0 0 0 ) 1 1 3 1 也认为喹乙醇促生长的作用 在于其改善了动物肠道中菌群的数量与组成。 德国学者报道，喹乙醇对仔猪促生长增重平均提高4 4 2 1 8 ，瘦肉率提高4 5 ，饲料报 酬提高6 - 1 5 。发病率降低3 7 5 0 。北京市营养源研究所用消化能为1 3 m j k g ，粗蛋白 1 6 0 9 的饲料水平，添加喹乙醇5 0 x1 0 6 饲料浓度，对断乳仔猪饲喂6 2 天，日增重前3 0 天为2 9 1 ， 后3 0 天为9 1 ，全期平均日增重提高1 6 3 ，饲料报酬提高9 。 3 2 3 喹乙醇对动物的体型和蕾养组成的影响 喹乙醇在促进生长的同时，也能降低粗脂肪的含量，增加动物的瘦肉率【1 4 1 。叶金云等在 对一龄草鱼的研究中发现，喹乙醇对草鱼的肥满度指标无显著影响，而对提高肌肉蛋白质含量和 灰分含量、降低脂肪含量有一定的作用。文良印等1 1 0 l 的实验中也得出相似的结果。 3 3 喹乙醇的毒理学 3 3 1 致突变性 曹随忠等【l ”对喹嗯琳1 ，4 二氧化物类抗菌促生长剂特殊毒理学研究进展做了综述，阐明喹乙 醇在微生物和哺乳动物测试系统中有一定的诱变性。y o s h i m u r a 1 7 1 等用鼠伤寒沙i j 氏菌为材料的 微生物回复突变试验表明，喹乙醇在2 5 、5 、1 0 、 s g e g m l 齐j 量下不论加或不 j n s 9 f 谢活化系统 对t a 9 8 和t a l 0 0 都有诱变性，其中t a l 0 0 更敏感，回复突变率高，而且在加有s 9 活化系统时t a 9 8 和t a l 0 0 回复突变率显著降低。大量资料显示 i s , 1 9 ，喹嗯啉1 ，4 二氧化物类的诱变性与它们的n = o 基团存在有密切关系，随着氧的脱去诱变性也随之消失，脱去氧的速度越快，则诱变性丧失越快。 另外，有学者报道【1 ”，喹乙醇在猪体内或一些肠道细菌作用下能逐渐丧失诱变性但为了消费者 的安全，使用时必须严格控制以确保它们在猪体内无残留。在d n a 当复试验中，喹乙醇对枯草杆 菌( r e c + 和l e c - ) 修复试验为阳性l l ”，喹乙醇对肺炎杆菌、大肠杆菌k 1 2 和酿酒酵母都有诱变性【“。 有些研究证明喹乙醇对哺乳动物细胞有致突变能力。s c h e u t w i n k e l r e i c h 等【2 l 】用喹乙醇处理中 国仓鼠细胞、r 7 9 ，姐妹染色单体互换( s c e ) 频率增加，且存在剂量反应关系。王树槐f 捌报道，喹乙 醇在大丁6 6 , u g m l 剂量时不论加与不；n s 9 代谢活化系统对c h 脚胞染色体都产生畸变作用，并存 6 中国农业大学硕士学位论文第一章文献综述 在剂量反应关系。 在骨髓细胞染色体畸变试验、微核试验、精子畸形试验及小鼠显性致死突变试验等哺乳动物 体内诱变试验中；喹乙醇除在显性致死突变试验中表现阴性外，其余均表现阳性。c i h a k 等例在i c r 小鼠处死前2 4 h 灌胃给予喹乙醇，结果发现喹乙醇8 0 0 m 蚺小鼠骨髓细胞染色体断裂。微核试 验中，c i h a k - - , 等- 僻l 给w i s t a r 大鼠分别于处死前3 0 h 和6 h 腹腔内注射喹乙醇( 3 0 、6 0 、9 0 、1 2 0 和 2 4 0 m g k g ) 一次，处死后取骨髓细胞涂片染色后计数嗜多染红细胞( p c e ) 微核( m n ) 出现率， 结果表明喹乙醇2 x 6 0 m g k g 以上剂量组p c e 微核率与阴性对照比较著异均极显著( p 9 6 1 ) 牛血清白蛋白0 3 s a ) ( 第五组分，9 8 ) 卵清白蛋白( o ) 羧甲基纤维素钠( 分析纯) 薄层层析硅胶g ( 化学纯) 丁二酸酐( 化学纯) 吡啶( 分析纯) 三正丁胺( 化学纯) 氯甲酸异丁酯( 纯度，9 8 腑) n - 羟基琥珀酰亚胺( n h s ) ( f l u k a ) n ，n - 二二环己基碳酰亚胺( d c c ) ( 化学纯) n ，n - 二甲基甲酰胺m f ) ( 分析纯) 乙二胺四己酸二钠( e d t a n a 2 ) ( 纯度9 9 0 ) t r i s ( 超级纯) 溴酚蓝 甘油( 纯度 9 9 o ) 1 2 明天饲料厂分装 s i g m a 公司 s i g m a 公司 s i g m a 公司 天津市津科精细化工研究所 青岛海洋化工有限公司 中国医药集团上海化学试剂公司 广东汕头市西陇化工厂 北京益利精细化工品有限公司 a l f a a e s a r 进口原装 s i g m a 公司 国药集团化学试剂有限公司 北京化丁厂 a m l c s c o 公司 a l n r e s c o 公司 m n r e s c o 公司 a m r e g c o 公司 中国农业大学硕上学位论文 第二章喹乙醇人丁：抗原的合成 过硫酸铵( 纯度9 8 0 ) a l d r i c h 公司 四甲基乙_ 二胺( r i e m e d ) ( 纯度9 9 o )a l d r i c h 公司 甘氨酸( 纯度 9 9 o ) n o v o n 公司 十二烷基硫酸钠( s d s l ( 纯度：9 5 0 ) s i g m a 公司 b 巯基乙醇a m r e s c o 公司 丙烯酰胺( 电泳级，纯度9 9 0 )a m r e s o o 公司 甲叉丙烯酰胺a l r t r e s c o 公司 标准m a r k e r ( 2 0 1 9 9 4 k i ) )a m c r s h a m 公司 1 2 主要仪器设备 h h $ 2 1 6 电恒热温水浴锅 f a l 0 0 4 上皿电子天平 j b 系列磁力搅拌器 r e - 5 2 旋转蒸发器 z f - c 三用紫外分析仪 b r u k e rd p x 3 0 0 型核磁共振谱仪 红外光谱仪( n e ) ( u s _ 4 7 0 f 1 1 r ) u v - 2 4 5 0 可见紫外分光光度计 s z 9 7 自动三重纯水蒸馏器 l g j 1 0 冷冻干燥机 透析袋份子量1 2 0 0 0 d ) x - 4 数字显示显微熔点测定仪 a e - 6 4 5 0 电泳槽 a e 8 1 5 0 电泳电压装置 1 3 溶液系统 1 3 1 电泳用溶液 北京长安科学仪器厂 北京东南仪诚实验室设备有限公司 上海雷磁新泾仪器有限公司 上海亚荣生化仪器厂 上海强运科技有限公司 芬兰 n i c o l e t 岛津分析仪器 上海亚荣生化仪器厂 北京四环科学仪器厂 北京拜尔迪有限公司 北京泰克仪器有限公司 a t i d 公司 a i t o 公司 1 3 1 1 储备液 ( 1 ) 2 m t r i s - h c i ( p h 8 8 1 ，l o o m l 称取2 4 2 9 t r i s 碱，加入适量蒸馏水，缓慢的加入浓盐酸调p h 8 8 ，溶液冷却至室温后，加蒸 馏水定容至1 0 0 m l 。 中国农业大学硕士学位论文第二章睡乙醇人工抗原的合成 ( 2 ) 1 m t r i s h c l ( p h 6 8 1 ，1 0 0 m l 称取1 2 1 9 t r i s 碱，加入适量蒸馏水，缓慢的加入浓盐酸调p h 6 8 ，溶液冷却至室温后，加蒸 馏水定容至1 0 0 m l 。 ( 3 ) 1 0 ( w v ) s d s ，1 0 0 m l ，室温保存 称取1 0 9 的s d s ，加蒸馏水定容至1 0 0 m l 。 ( 4 ) 5 0 ( v v ) 甘油，1 0 0 m l 称取5 0 m 1 1 0 0 的甘油，加蒸馏水定容至1 0 0 m l 。 ( 5 ) 1 ( w v ) 溴酚蓝，1 0 m l 称取1 0 0 r a g 溴酚蓝，加蒸馏水定容至1 0 m l ，搅拌至完全溶解，过滤除去未聚合的染料。 ( 6 ) 考马斯亮蓝染液，2 0 0 m l 称取2 0 0 m g 考马斯亮蓝r - 2 5 0 ，加入9 0 m l 甲醇，2 0 m l 冰醋酸，9 0 蚰蒸馏水。用普通滤纸过 滤后使用。 ( 7 ) 考马斯亮蓝脱色液，2 5 0 m l 2 5 r n l 甲醇2 5 i r d 冰醋酸，2 0 0 m l 蒸馏水。 1 3 1 ，2 工作液 ( 1 ) a 液：丙烯酰胺存储存液，1 0 0 m l 3 0 ( w v ) 丙烯酰胺，0 8 ( w v ) 甲叉丙烯酰胺 称取2 9 砧丙烯酰胺。o 8 9 甲叉丙烯酰胺，加蒸馏水定容至1 0 0 m l ( 2 ) b 液：4 分离胶缓冲液，1 0 0 m l 7 5 m l2 mt r i s - h c l ( p r t 8 8 、 4 m l1 0 s d s 2 i m l 蒸馏永 可在4 c 存放数月 ( 3 ) c 液：4 浓缩胶缓冲液，1 0 0 m l 5 0 m l1 m t r i s - h c l ( p h 6 8 、 4 r n l1 0 s d s 4 6 m l 蒸馏水 可在4 。c 存放数月 ( 4 ) 1 0 过硫酸铵( a p ) ，5 m l 0 5 9 a p 5 m l 蒸馏水 可在密闭的管内，4 4 c 存放数月。 ( 5 ) 电泳缓冲液，l l 3 9 t r i s 碱 4 9 甘氢酸 l g s d s 加蒸馏水至1 l ( 6 ) 5 x 样品缓冲液，1 0 m l 中国农业大学硕士学位论文 第二章喹乙醇人工抗原的合成 0 6 m l1 mt h s - h c l0 ，h 6 8 ) 5 m 5 0 的甘油 2 n f l1 0 的s d s 0 5 m l2 - 巯基乙醇 1 m l1 溴酚监 0 9 m l 的蒸馏水 可在4 存放数周 1 3 1 3 工作液的用量 ( 1 ) 分离胶( 1 0 ) a 液：6 6 6 m 1 b 渡：5 0 m l 蒸馏水：8 3 4 m l 四甲基乙二胺( t e m e d ) ；2 0 p l 1 0 a p ：5 0 z l ( 2 ) 浓缩胶( 4 ) a 液：0 6 6 m b 液：1 2 5 i l l l 蒸馏水：3 r r d 四甲基乙二胺( t e m e d ) ：5 , l 1 0 a p ：2 5 u l 2 试验方法 2 1 喹乙醇一半琥珀酸酯的合成( 琥珀酸酐法) 2 1 1 合成路线“ o c o n h c h 2 c h 2 0 h f l 十 c h 3 f 型c ( 1l j o 0 圈2 - 1 半抗原合成路线 啦2 - 1t h es y n t h e t i cr o u t e st ot h eh a p t e n 1 5 o f 中国农业大学硕上学位论文 第二章喹乙醇人工抗原的合成 2 1 2 实验步骤 称取2 1 0 6 9 喹乙醇( o l a ) 和1 6 9 琥珀酸酐置于三口圆底烧瓶中，加入8 0 m l 吡啶作为溶 剂，加热回流反应4 h 。反应过程中采用薄层色谱( t l c ) 监测反应进程。减压蒸馏除去毗啶， 在剩余混合物中加入冰蒸馏水6 0 m l ，用2 m o l l h c l 调p h 至2 0 3 0 ，放入4 冰箱中，过 夜。减压抽滤，并用冰蒸馏水洗涤后抽干，得粗产品( 命名为o l a - s h ) ，计算回收率。称取1 2 5 9 o l a - s h ，用蒸馏水进行重结晶，重复三次，干燥得白色结晶状粉末，计算重结晶率。用显微熔 点仪测定o l a s h 的熔点。 合成产物经核磁共振，红外光谱，质谱进行结构鉴定。 2 2 喹乙醇人工抗原的合成 2 2 1 瞳乙醇人工免疫原的合成 2 2 1 1 合成路线 本研究采用活化酯法，参考x ud u n - m i n g ( 2 0 0 5 ) p 8 1 合成鬼臼毒素人t 抗原的路线略加修改 合成喹乙醇人t 免疫原。该合成方案的原理是通过喹乙醇半抗原的羧基官能团与载体蛋白b s a 上的游离氨基之间的缩合反应进行的。方法原理见下反应式： d c c 0 n h c h 2 c h 2 0 c c h 2 c h 2 c o o h 8+o o o 1 6 o | | 厂吣 l c 如 oh一=o n 一 0 一0 8hch = o 0h 乒 hch b s a rl，(器o?hch2ch2吨ch2ch2c。n。bsa 2 2 1 2 免疫原的合成 准确称取5 4 4 8 m g 半抗原溶丁- 3 m i d m f 中，加入3 0 9 4 8 m gd c c 和和1 7 2 6 2 m gn h s ，在室 温磁力搅拌下反应1 0 h 。反应液离心( 2 0 0 0 r p m ，1 0 m i n ) ，弃去沉淀，上清液为反应液a 。 称取5 0 1 7 m gb s a 溶于5 m l 磷酸缓冲液中，此为反应液b 。 将反应液b 置于磁力搅拌器上，4 c 下将反应液a 缓慢滴加到反应液b 中，搅拌反应过夜。 次日将反应液置于处理过的透析袋内。 2 2 1 3 透析袋的预处理【5 q 将透析袋裁剪成适当长度( 1 0 2 0 c m ) 的小段，在含有2 ( w v ) n a i - i c 0 3 的im m o l le d t a ( p h 8 o ) 溶液中将透析袋煮沸l o m i n ，取出透析袋后用蒸馏水彻底清洗干净。 然后在含有1m m o l l e d t a ( p n 8 o ) 的溶液中将透析袋继续煮沸1 0 r a i n ，冷却后存放于4 c 。 临用前将透析袋装满蒸馏水然后排出，并清洗干净。 2 2 1 4 人工免疫原的初步纯化 待上述交联反应完成后，将反应终产物全部转移至经预处理的透析袋内，于4 c 冰箱中先用 三重蒸馏水4 0 透析2 次，再用0 9 生理盐水透析，共透析7 2 h ，每8 h 换液1 次。透析后冷冻干燥， 分装所得的固体，贮于加备用。交联产物命名为o l a b s a 。 2 2 2 噻乙醇人工包被原的合成 2 2 2 1 合成路线 本研究采用氯甲酸异丁酯法( 又称混合酸酐法) ，参照s e r g e 等( 2 0 0 2 ) 推荐的合成路线 合成喹乙醇人工包被原。该台成方案的原理是通过喹乙醇半抗原的羧基官能团与