（应用化学专业论文）纳米硒的生物利用和毒性研究.pdf

中田科学技术大学博士学位论文文摘 文摘 硒是人体必需的微量元素，有预防癌症的作用。硒的特点是有益剂量和毒 性剂量之间范围狭窄，高于有益需求的水平就具有毒性。预防癌症和合并化疗 药治愈癌症需要超营养水平或超大剂量水平的硒，这些剂量接近或进入了硒的 毒性范围。狭窄的安全范围限制了硒在癌症治疗和预防方面的应用。 零价态元素硒被公认为既没有活性也没有毒性的硒形式。即属生物惰性的 硒形式。以牛血清白蛋白为分散剂，亚硒酸钠与谷胱甘肽反应生成的元素硒能 聚集在纳米尺寸( 纳米硒，n a n o s e ) 。依据蛋白质控制纳米硒的形成和尺寸大小 的原理，制备了一系列不同尺寸纳米硒。通过i 种尺寸的纳米硒( 5 1 5 n m ， 2 0 - - 6 0 n m 和8 0 - - 2 0 0 r i m ) 对含硒酶活力影响来比较不同尺寸纳米硒的生物利用。 结果显示：三神尺寸纳米硒在细胞水平和动物水平上对含硒酶活力和组织硒积 累有相同的上调作用，这说明在一定尺寸范围内( 鱼 蛋 肉 油料 豆类 粮食 蔬菜 水果。另外有些植物如黄芪属 紫云英，大蒜和圆葱等对土壤硒有很强的富集作用，也是富含硒的食物之一。 1 2 2 食物中硒的化学形式 食物中硒化合物包括硒代胱氨酸l e n o c y s t e i n e ，s e c y s ) ，硒蛋氨酸 ( s e l e n o m e t h i o n i n e ，s e m c t ) ，硒酸盐( s e l e n a t c ) ，亚硒酸盐( s e l e n i 哟，甲基硒半胱氨 酸( s e - m e t h y l s e l e n o c y s t e i n e ，s e m s c ) 等等f l 】。小麦，玉米大米和大豆中硒的主 要形式是硒蛋氨酸 2 - 5 ，占其总硒量的8 1 8 2 6 1 。因此，饮食中硒的主要化学 形式为硒蛋氨酸。谷类或饲料作物主要将吸收的硒转化为硒蛋氨酸，硒蛋氨酸 可无选择地替换机体蛋白质中的蛋氨酸。植物，海藻和酒酵母合成硒蛋氨酸的 主要途径见图1 - l 阴。富硒酵母中硒的主要化学形式也是硒蛋氨酸【8 l l 】，其占 总硒量的9 0 0 , 6 【7 ，1 2 ，而硒代胱氨酸占总硒量的o 5 胱硒醚占o 5 ，甲基硒 代半胱氨酸占0 5 ，谷氨基硒甲基硒代半胱氨酸占o 5 硒腺营硒高胱氨 酸占2 - 5 7 1 。然而在黄芪属紫云英和富硒大蒜【9 ，i l 一1 5 1 富硒圆葱【l1 , 1 3 ，富 硒西兰花【1 3 】，富硒谷苗f 1 6 j 和富硒野生韭葱1 1 7 中硒的主要化学形式是甲基硒 半胱氨酸。通过检测2 0 种蔬菜中硒的形式发现1 5 0 的硒以硒酸盐的形式存在 中国科学技术大学博士学位论文 第一章 f i s 。西兰花菜花，西兰花菜时。黄瓜，甜菜叶，甘蓝，西红柿中硒酸盐所占比 例分别达总硒量的4 4 ，3 8 ，4 0 ，5 0 0 ，4 0 和3 9 【i8 1 鱼类组织中硒 酸盐约占总硒量的1 5 3 6 1 9 动物摄入硒蛋氨酸或亚硒酸盐后，组织中硒的 主要化学形式是硒代半胱氨酸f 2 0 - 2 2 。例如大鼠注射亚硒酸盐，组织中6 4 7 0 的硒以硒代半胱氨酸的形式存在 2 0 2 2 】；大鼠注射硒蛋氨酸5 天后组织中 4 6 5 7 的硒以硒代半胱氨酸的形式存在 2 1 ，2 2 。 图1 - i 植物。海藻和酒酵母合成硒蛋氨酸示意图f 7 】。 1 3 硒在体内的代谢 不同的有机硒和无杌硒化合物都可以作为硒源，提示这些硒化合物都可以 转化成同一中间体，然后用于含硒酶的合成【2 3 - 2 5 。硒化氢( h 2 s c ，h y d r o g e n s e l e n i d e ) 或它的等价物被假定为可以用于含硒酶合成的硒化合物的代谢中间体。 1 3 1 无机硒的转化 无机硒化合物，硒酸盐和亚硒酸盐，都可以简单地还原为硒化氢。亚硒酸 中田科学技术大学博士学位论文第一章 根离子通过结合蛋白3 而被红细胞吸收【2 6 】，被红细胞吸收的硒酸根将被还原为 硒化氢，并进入血液与血清蛋白结合，然后以血清蛋自结合的形式进入肝脏【2 7 】。 硒酸根离子不是被红细胞吸收，而是通过磷酸转化系统被肝细胞直接吸收，并 且部分硒可通过尿液排出体外【2 8 】。因此源自亚硒酸根和硒酸根的硒化氢以不同 形式被肝脏吸收并用于含硒酶的合成，可能的代谢如图1 - 2 所示。 圈i - 2 硒的代谢途径 1 3 2 有机硒化合物的转化 与无机硒化合物不同，有机硒化合物通过更为曲折的途径进行转化，其可 能的代谢途径如图1 2 所示。有机硒营养源大部分是硒氨基酸类化合物，其c s e 键可以被裂解酶还原切断 2 9 - 3 3 。硒半胱氨酸( s e c y s ) 通过b - 裂解酶直接还原为 硒化氢，此b 裂解反应被认为是硒氨基酸类化合物还原为硒化氢的主要转化路 中国科学技术大学博士学位论文第章 径。硒蛋氨酸通过转硒途径先转化为硒半胱氨酸，其途径为 ( s e m e t - - , s e - a d e n o s y l s e m e t - - , s e a d e n o s y l s e l e n o h o m o c y s t e i n e - - s e l e n o h o m o c y s t e i n e - - * s e l e n o c y s t a t h i o n i n e - - - , s e c y s ) ，这与蛋氨酸的转硫途径相似 ( m e t - * a d e n o s y l s e m e t - - a d e n o s y l s e l e n o h o m o e y s t e i n e - - - h o m o e y s t e i n e - * c y s t a t h i o n i n e - , c y s ) ，转化的硒半胱氨酸将通过b - 裂解酶还原为硒化氢；当摄入过量的硒蛋 氨酸时，其 r 位的c s e 键可以被丫- 裂解酶还原切断【3 4 】，p 裂解酶反应生成的活性 硒中间体为甲基硒醇( c h 3 s e l l ) ；硒蛋氨酸也可以无选择地替换机体蛋白质中的 蛋氨酸1 3 5 。3 6 ，其插入到普通蛋白质中的数量依赖于食物中硒蛋氨酸和蛋氨酸 的比例【3 7 】；以硒蛋氨酸的形式储存在蛋白中的硒可通过蛋白降解将其从蛋白中 释放出来，并通过转硒途径或者通过p 裂解反应用于含硒酶的合成。甲基硒半 胱氨酸( s e m s c ) 通过b 裂解酶反应生成甲基硒醇。硒蛋氨酸和甲基硒半胱氨酸生 成甲基硒醇被认为是它们抗癌的可能机制之- 1 3 8 4 2 1 。 1 3 3 硒的排泄 机体吸收的硒在体内经过阶段性的甲基化反应后，通过尿液和呼吸排出体 9 i 4 3 - 4 5 。通过尿液排泄的硒主要是单甲基化硒和三甲基化硒；通过呼吸排出 体外的硒主要是二甲基化硒【4 3 】。起初认为尿液中的单甲基化硒是甲基硒醇 【4 6 】，但最终确定为硒糖( s e l e n o s u g a r ) 4 7 。肝脏中已经确证了两种硒糖，即硒糖 a 和b 。硒糖a 是硒糖b 的前体，硒糖b 和尿液中硒糖结构完全相同1 4 7 ，4 8 。摄入 微量元素硒后，机体合成含硒酶，然后细胞中的含硒酶降解，产生硒糖a 和b ， 硒糖进入血液，然后排出体外。单甲基化硒和三甲基化硒是两种主要硒排泄物， 其排泄的比例依据摄入的硒剂量。例如，在低剂量下，硒主要以单甲基化硒的 形式排泄；在高剂量下，主要以单甲基化硒和三甲基化硒形式排出( 三甲基化硒 的量随硒剂量的增加而增1 f 1 ) 4 6 ，4 9 ，5 0 。然而最新的实验数据显示【5 l 】：年轻大 鼠摄入硒剂量为营养水平时，尿液中主要代谢物为硒糖，而摄入毒性剂量时， 排泄的主要是三甲基化硒；而老龄大鼠摄入两种剂量的硒，代谢产物都主要是 硒糖。因此尿液中硒代谢物的形式无法判断饮食摄入的硒为营养剂量还是毒性 剂量。 中国科学技术大学博士学位论文 第一章 1 4 含硒酶 微量元素硒的生物功能主要通过含硒酶来实现。硒是以硒代半胱胺酸( s e e ) 的形式插入到蛋白中，被人们称作第2 1 种氨基酸【5 2 】。s e e 是由终止密码子u g a 编码，其在原核和真核生物中的表达略有不同，但是它们的表达都依赖于m r n a 中特殊的二级结构f 5 3 】。谷胱甘肽过氧化物酶( g l u t a t h i o n ep e r o x i d a s e , g p x ) 是哺乳 动物体内发现的第一个含硒酶， t - 1 9 5 7 年就被m i l l s 首先发现【5 4 】，但直到1 9 7 3 年f l o h e 和r o t r u c k 才确立了g p ，【与硒的联系 5 5 1 。随后又相继发现了其它4 种g p x 同工酶。硒与甲状腺素代谢也密切相关，1 9 9 0 年b e h n e 等发现了细胞膜上另一种 含硒酶即i 型碘甲状腺素5 脱碘酶0 t 4 5 o ) ，此后又发现了另两种类型的甲状腺素 脱碘酶。1 9 9 6 年，t a m u r a 和s t a d t m a n 5 6 因怀疑一种出现无义突变的细胞色素 i 4 5 0 基因( c y p 2 8 7 ) 可能解码含s e e 的硒蛋白，于是，以含该基因的人肺腺癌细 胞( n c l h 4 4 1 ) 为材料进行研究，他们虽然未能找到预期含硒的细胞色素p 4 5 0 ， 却意外地分离得到另一种7 s s e 标记的分子量为5 7 i d 的同二聚体蛋白质，即硫氧 还蛋白还原酶( t h i o r e d o x i nr e x l u e t a s e ，t r y ) ，至今人们已发现3 种t r x r 同功酶。此 外，还有硒蛋白p 和硒蛋白w 等两类，但到目前为止这二者的生物功能尚不明确。 1 4 1 谷胱甘肽过氧化物酶( g p x ) 1 4 1 1g p ) 的结构 g p x 是生物体内重要的含硒酶，硒是该酶活性中心的构成成分m i l l s 在1 9 5 7 年报道g p x 能保护红细胞溶解【5 4 】。g p x 主要功能是还原过氧化氢和一些有机氢 过氧化物，包括胆固醇和长链脂肪酸 5 7 1 。虽然g p x 可以和很广泛的氧化底物作 用，但是它的还原底物却具有专一性，只利用谷胱甘肽进行还原反应。g p x 分 子量为2 2 - 2 3k d ，由4 个相同亚基组成的4 聚体蛋白，每个亚基结构中都含有一 个s c c ( 图1 3 ) 。牛组织g p x 的三维结构显示它有四个球形亚基。在球形表面凹处 包含s e e 5 8 ，而s e e 是g p x 催化氧化还原反应的活性中心用半胱氨酸取代g p x 结构中s e e ，结果g p x 活力显著下降，这证明s e e 是g p x 的活性中心。 中田科学技术大学博士学位论文第一章 图1 - 3g p x 结构图 1 4 1 2g p x 的几种同功酶 迄今为止，人们已经发现五种g p x s 亚型，即细胞质谷胱甘肽过氧化物酶 ( c y t o s o l i cg l u t a t h i o n ep e r o x i d a s e 。c g p x ) 、胃肠谷胱甘肽过氧化物酶( s t o m a c h i n t e s t i n eg l u t a t h i o n ep e r o x i d a s e , g 1 - o p x ) ，血浆谷胱甘肽过氧化物酶( p l a s m a g l u t a t h i o n ep e r o x i d a s e ，p g p x ) 和磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶( p h o s p h o l i p i d h y 出o p e r o x i d eg | m a t h i o n ep e r o x i d a s e ，p h g p x ) 、精核谷胱甘肽过氧化物酶( s p e r m n u c l e u sg l u t a t h i o n ep e r o x i d a s e ，s n g p x ) i ) 细胞质谷胱甘肽过氧化物酶( c g v x ) c g p x 是第一个被发现的哺乳动物硒蛋白，它分布广泛。在肝脏和红细胞中 e g p x 活力比较高，而在肌肉和脑等其它组织中活力比较低【5 9 】。它的结构中包 含四个s e c ，主要功能是还原可溶性的过氧化氢和一些有机氢过氧化物，起重要 的抗氧化作用。研究显示，敲除小鼠的c g p x 的基因，其体内缺少c g p x ，小鼠可 以正常生存和正常繁殖，但是对氧化应激更加敏感 6 0 ，6 q 。b e c k 等通过敲除小 鼠的c g p x 基因的研究也显示，c g p x 在小鼠抵抗r n a 病毒基因组造成的氧化应 中国科学技术大学博士学位硷文第一章 激方面起重要作用【6 2 】。在缺硒动物中c g p x 活力降低，动物对氧化应激也更加 敏感【6 3 。 2 ) 胃肠谷胱甘肽过氧化物酶( g i g p x ) g i g p x 与c g p x 相似，在酶结构中含有四个s e c ，可以还原各种过氧化物【6 4 】。 与c g p x 不同，g l g p x 在小鼠体内仅限于在胃肠道内表达，而在人体中，除了胃 肠道中，肝脏中也有表达，这种特殊的分布提示它可能作为抵制过氧化物吸收 的第一道防线【6 5 】和预防结肠癌发生的抗氧化酶【6 6 】。 3 ) 血浆谷胱甘肽过氧化物酶( p g p x ) p g p x 的酶结构中含有四个s e c 。与c g p x 和g i g p x 不同，p g p x 是糖蛋白，存 在于很多组织的细胞外液中1 6 7 。在肾脏中p g p xm r n a 分布最集中，这也是 p g p x 的主要合成场所【6 8 1 。在体外实验中p g p x 以谷胱甘肽为底物可以还原过氧 化氢和各种有机过氧化物 6 9 1 虽然p g p x 在十几年前就被发现，但是它的生物 学意义仍旧不清楚，这可能归因于血浆中谷胱甘肽浓度过低以至于p g p x 没有足 够的还原底物而发挥作用。 钔磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶( p h g p x ) p h g p x 主要存在于细胞膜中 7 0 1 。与其它四聚体谷胱甘肽过氧化物酶不同， p h g p x 可以直接还原磷脂和胆固醇脂质氢过氧化物，这被认为是机体防御系统 中保护生物膜氧化损伤的主要酶，具有抗炎和抗凋亡的作用 7 1 ，7 2 1 。敲除p h g p x 基因将造成早期胚胎死亡 7 3 1 。 5 ) 精核谷胱甘肽过氧化物酶( s n g p x ) s n g p x 仅存在于睾丸和精子中 7 4 1 。它在青春期开始后出现在精子细胞核中 【7 6 】。它的生物学功能至今仍不清楚，可能在精子成熟和生育能力方面有重要作 用。 1 4 1 3g p x 的生物学活性 g p x 在机体内起着重要的抗氧化作用。敲除小鼠的e g p x 的基因，小鼠可以 正常生存和繁殖，但是对各种氧化应激更加敏感 6 0 6 2 1 。敲除p h g p x 甚至造成 早期胚胎死亡f 7 3 】。g p x 能够及时将h 2 0 2 转化成h 2 0 ，防止它对细胞的危害。在 中国科学技术大学博士学位论文 第一章 g p x 作用下，脂质过氧化物转化为较为稳定的羟基化合物( r o h ) ，阻断脂质过氧 化物自由基链式反应。g p ) 利用两分子谷胱甘肽将h 2 0 2 还原为水，并将谷胱甘 肽氧化为氧化型谷胱甘肽，氧化型谷胱甘肽通过n a d p h 和谷胱甘肽还原酶还原 成谷胱甘肽。在此过程e e g p x 实现了清除过氧化物功能( 1 9i - 4 ) 。 g s s g n a d p h + h + r 2 g s h n a d p - 图1 - 4g p ，【的催化作用 许多实验表明g p x 活力升高可以保护细胞遭受活性氧自由基( r e a c t i v e o x y g e ns p e c i e s ，r o s ) 的伤害，例如，过氧化氢、有机过氧化物，抑制百草枯( 除 草剂) 等物质造成的伤害 7 5 ，7 6 。g p x 活力升高能够抑制过氧化氢诱导产生的细 胞凋亡【7 7 】。在人类t 4 7 d 细胞转染子中，g p x 活力升高可以减少过氧化氢，抑 制核转录因子n f r b 的激活，从而增强细胞抵抗损伤的能力【7 8 】。 1 4 1 4g p ) 【的调节 硒是g p x 的活性中心，可调节机体g p x 的活力，但g p x 的几种同功酶受 影响的程度不同。缺硒小鼠肝脏c g p x 活力降低到足硒小鼠的1 7 9 ，8 0 ，8 1 。而 p h g p x 的活力只降低到足硒小鼠的4 0 8 3 。在细胞和动物体中施与营养剂量 的硒能使g p x 活力上升 8 3 。8 4 。当摄入硒的剂量为营养剂量时，g p x 活力随剂 量的增加而增加；而当摄入硒的剂量为超营养时，g p x 活力升高到一定程度后 就不再升高，维持在一个高水平的平台上， 即g p x 的活力达到饱和【8 3 】。g p x 的m r n a 水平也受硒态的影响。在硒摄入量很低的时候g p ) 【的m r n a 的表达 很不稳定 8 5 ，8 6 。e g p x 的m r n a 在缺硒小鼠组织中的水平不到足硒小鼠的 1 0 ，而p h g p x 受硒态的影响小。硒调节m r n a 的稳定性需要m r n a 中特殊 的二级结构，即s e e 插入序列( s e l e n o c y s t e i n ei n s e r t i o ns e q u e n c e , s e c i s ) 【8 7 ，8 8 。 1 4 2 硫氧还蛋白还原酶( t r x r ) l e w i n 等【8 9 】在人内皮细胞系e a h y 9 2 6 中研究不同硒态与叔丁基氢过氧化 中田科学技术大学博士学位论文 第章 物( t e = r tb u o o h ) 、氧化型低密度脂蛋白( l d l o x ) i 秀导氧化损伤之间的关系，在缺 硒培养基中，t o tb u o o h 与l d l o x 使细胞死亡，如果加入4 0n m o l l 亚硒酸钠， 则细胞中t r x r 上升3 1 倍。无明显细胞死亡。敲除小鼠t r x r 基因造成胚胎死 亡【9 0 】。因此1 h r 在机体内起着重要的作用。 1 4 2 1t r x r 的结构 图! - 5 哺乳动物硫氧还蛋白还原酶二聚体结构 t r x r 为同型二聚体酶，分子量为5 7 k d ，每个单体中含有1 个黄素腺嘌呤 二核苷酸( f l a v i n e ，a d e n i n ed i n u c l e o t i d e ，f a d ) 和1 个s e x ，属于吡啶核苷酸二硫化 物氧化还原酶家族( 图1 5 ) 。在t r x r 的n 末端存在- c y s v a l a s n g l y c y s 一氧化 还原催化位点，在c 末端存在c y s s e c g l y 氧化还原活性位点【9 1 自1 9 7 7 年t r x r 第一次从牛组织中分离纯化被描述以来【9 2 】，研究发现t r x r 可以催化 许多非专一性反应和专一性反应，这说明t r x r 具有广泛的底物，但箕主要功能 中国科学技术大学博士学位论文第一章 是将小分子蛋白质硫氧还蛋白( t h i o r e d o x i n ，t r x ) i - 的s 2 还原成( s h ) 2 1 9 1 ，即维 持t r x 处于还原型，后者在机体氧化还原调节和抗氧化防御中起重要作用 f 9 3 ，9 4 。1 9 9 6 年，从人类肺艨癌细胞和细胞中纯化得到t r x r ，发现其结构中 含有s e e 【9 5 ，9 6 1 。这个发现使研究者对哺乳动物硫氧还蛋白系统产生了深入研 究的兴趣。目前研究发现所有哺乳动物t r x r 酶系中都含有s e e 。s e e 与半胱氨 酸非常类似，但远比半胱氨酸活泼，被认为是由基因编码的第2 1 种氨基酸 【5 2 ，9 7 】。在n 咀蛋白中，s e e 位于c 一末端，以c y s - s e e g l y 保守序列存在于各 种t r x r 同功酶中 9 5 , 9 8 - 1 0 l 】。t r x r 蛋白中s e c 是发挥酶活性的重要元件 f 9 8 ，1 0 2 - 1 0 4 1 。在缺硒动物体内或细胞中t r x r 活力明显下降 1 0 s ，1 0 6 1 ，补硒后 使t r x r 活力增加 1 0 7 1 ，说明微量元素硒对t r x r 活力有重要影响。 l a 2 2t r x r 的几种同功酶 至今人们已发现3 种t r x r 同功酶( t r x r l 、t r x r 2 、t r x r 3 ) 。目前研究比较 清楚的是m r l 和t r x r 2 。t r x r l 和t r x r 2 基因具有高度同源性，都含有f a d 以及与n a d p h 结合区域。t r x r l 主要存在于细胞浆中，t r x r 2 主要存在于线粒 体中。t r x r 2n 末端有一个3 3 个氨基酸组成的延伸部分，其中富含碱性残基， 该区域是线粒体引导序列。t r x r 3 主要存在于精子细胞中，也含有n 末端延伸 部分，但比较短。t r x r 3 与t r x r l ，t r x r 2 有5 2 5 3 同源。1 h r l 和t r x r 2 在许多组织均有表达，尤其在肝脏中表达更为丰富，而t r x r 3 仅在睾丸中高表 达 9 1 1 。 1 4 2 3t r x r 的生物学活性 t r x r 最显著特征是具有广泛的底物，包括t r x ，小分子量的含二硫键的化 合物和不含二硫键的化合物。这种广泛的底物特点主要归因于t r x r 蛋白中含有 容易接近的含s e e 的氧化还原活性中，g , 0 0 s t r x r 最典型的底物是1 ，t r x 是一类分布广泛的小分子多功能蛋白，它们 在进化上相当保守，一般都具有一个相同的有氧化还原活性的c y s g l y p r o - c y s 氨基酸序列。在其保守的活化区域内含有具备氧化还原活性的二硫醇，使t r x 在细胞内发挥还原作用