（动物遗传育种与繁殖专业论文）鸡肌肉硫胺素相关候选基因遗传多样性及其与硫胺素含量相关性研究.pdf

孟春玲：鸡肉硫胺素含量相关候选基因遗传多样性与硫胺素含量相关性研究 5 7 孟春玲：鸡肉硫胺素含量相关候选基因遗传多样性与硫胺素含量相关性研究6 l 扬州大学学位论文原创性声明和版权使用授权书 学位论文原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下独立进行研究工作所取得的研 究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含其他个人或集体已经发表 的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：盘茜磋 签字日期：如矿年f 月阳日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借 阅。本人授权扬州大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国 科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过 网络向社会公众提供信息服务。 学位论文作者签名：盂者竣 导师 签字日期：p t 髫年6 月f ( ) 日 签字日期：上旷峰舌月廿日 重查兰! 塑旦堕堕茎塑差堡垄兰里望堡兰壁丝垦苎兰堕堕壅宣里塑墨壁堡塑 三 鸡肌肉硫胺素相关候选基因遗传多样性及其与 硫胺素含量相关性研究 研究生：孟春玲 导师：陈国宏教授 专业：动物遗传育种与繁殖 ( 扬州大学动物科学与技术学院，扬州2 2 5 0 0 9 ) 中文摘要 硫胺素是影响肉品风味的重要物质基础之一，硫胺素在体内的合成和代谢过 程十分复杂。本研究以文昌鸡、如皋鸡为材料探讨肌肉硫胺素含量的变化规律及 同品种不同家系间硫胺素含量的差异；同时以鸡的硫胺焦磷酸激酶( 丁| p 削) 基因 为候选基因，在如皋鸡、泰和乌骨鸡、萧山鸡、白耳鸡等4 个地方鸡种以及1 个 外来鸡种隐性白羽鸡群体中对鸡的硫胺焦磷酸激酶( 删j ) 基因进行单核苷酸 多态性( s n p ) 扫描，并分析其与地方鸡种肌肉硫胺素含量之间的关系，主要结果 如下： 1 在相同的饲养管理条件下，4 1 2 周龄的文昌鸡肌肉中硫胺素含量随周龄 增加而逐渐减少。同品种不同家系1 2 周龄的如皋鸡肌肉硫胺素含量差异显著( p o 0 5 ) ，母鸡的胸肌硫胺素含量稍高于公鸡，但两者之间的差异不显著。体重与胸 肌硫胺素含量显著负相关( p 0 0 5 ，r = 0 2 0 0 ) ，进一步证实了鸡肌肉硫胺素含量 受遗传因素的影响显著，这为进一步从分子水平探讨我国地方鸡种特异香味机理 的研究奠定了基础，对于从育种角度开发利用地方鸡种资源也具有重要意义。 2 首次以鸡硫胺素合成代谢过程中的硫胺焦磷酸激酶( ”削) 基因为候选基 因，采用p c r - s s c p 结合序列测定的方法，对如皋鸡、泰和乌骨鸡、萧山鸡、 白耳鸡和隐性白羽鸡群体中对该基因的所有外显子与3 调控区域进行s n p 扫 描，共发现2 个s s c p 多态位点，分别为3 ，- 调控区和外显子7 。3 调控区多态 !扬州大学硕士学位论文 位点，纯合子a a 型与b b 型相比有一个c 2 1 3 2 t 的单碱基突变，c c 型与b b 型相比有一个c 2 1 3 2 a 的单碱基突变，如皋鸡在此位点并未检测到a c 和c c 基 因型；外显子7 中多个个体测序发现一个a 8 0 9 g 。2 个s n p 分别命名为t p k l a 和t p k l b ，t p k l b 只在如皋鸡中检测到。统计分析发现，这2 个多态位点的 基因型分布在鸡不同品种间差异显著，在同一品种不同家系间基因型分布也具有 显著差异。进一步方差分析结果表明，只有t p k l a 位点与胸肌硫胺素含量之间 存在关联；其a a 型( 突变型) 个体的硫胺素含量极显著高于b b 型和a b 型个 体( p 0 0 1 ) ，研究初步认为该位点可以作为肌肉硫胺素含量的辅助选择标记。 关键词：硫胺素；硫胺焦磷酸激酶；单核苷酸多态性；相关性 孟眷玲；蹬盟囱堕堕童塑差堡垄茎圈遗传多样壁垦苎量堕堕鲞鱼望塑薹壁堕塞 三 s t u d i e so ng e n e t i cd i v e r s i 够o ft h i a m i n er e l a t e dc a n d i d a t e g e n ea n di t sc o r r e l a t i o nw i t l lt h i a m i n ec o n t e n t si nc h i c k e n m u s c l e c a n d i d a t e ：m e n gc h u n - l i n g a d v i s o r ：p r o c h e ng u o h o n g a b s t r a c t t h i 锄i m ( v b l ) i so n eo f t h ek e yc o m p o n e n t sf o rm e a tn a v o la n d t h ep r o c e s so f s y l l t h e s i sa i l d m e t a b o l i s m f o r t h i a m i n e i s v e r yc o m p i | c d t e d t p k ( t h i a m i n ep y r o p h o s p h o k i n 鹳e ) i s i m p o n a n t f o r t h ef o 丌n a t i o no f ac o e n 纠m er e q u i r e df o rc e n l r a im 啦b o i i cf h n c n o n s ht h ef i r s tp a r to f t h i ss t l l d y ， c h 锄g eo fm u s c l et h i 跚i n ec o n t e n t si n 、n c h a n gc h i c k e n sf 0 眦4t o1 2w e e k sa n dd i 彘r c n c e so f m u s c l et i l i a m i n e n t c n t si nd i f f 色r e n tg e n e a l 哩了si nr u g c h i c k e ma tt 1 1 ea g eo f1 2w e e j 【sw e r e s t u d k d i n 山es e c o n dp a n ，珊jg e n ew 舔s t u d i e d 拈ac 锄d i d a t eg e n ef o rt h i 哪i 眦n t e n t si n c h i c k e n t o e x p l o r e t k 毗l t i o n s h i p s b 咖n 丁嘲g e n e w i 血也妇n 士c n t si i l c h i c k e n s i n 西e s t m n dc o n f o m a t i o np o l y r n o r p h i s m ( s s c p ) 锄dg 印es c q u e n c i n gw e p e 响m i e dt os c r e e ns i n g l e n u c l e o t i d ep o i y m o r p h i s m ( s n p ) i nf o u rc h i n e i n d i g e n o 惜c h i c k e nb r e e d s ，r i l g a oc h i c k e n r 0 ) t a h es i l k i 鹤( t s ) x i a o s h a l lc h i c k e n x s kb a 漪c h c k e n s ( b e ) ，a n da ne x o t i cb r d ，r e c e s s v e w h n eb r o i l e r s ( r w ) t h em a i nr e s u i t sw e 陀鹞f 瑚l o w s 1 i i lt i l es a m ec o n d i t i o no fm 鲫日g e m e m ，i n c r e 船i n g ，t h e l 胁i n ec o n t e n t so fm 啦c i ew e r c d e c 瀚s i n gc o n t i n u o u s l yi nw e n c h 硼gc h i c k e n sf r o m4 t o1 2w e e k so fa g e s i g l l 矗c a n td 撼嘲c e s o ft h j 锄i n ec o n t e n tw e r ef o u n da m o n gg e n c a l o 科sa tt h ea g eo f1 2w e e l 【s mt h er u g a oc h i c l c e n t h ef e l 撕。惦h i pb e m e b o d yw e i g h i 锄dm u 虻l e st l l i a m i c o n c e m si nb r e a s tw a ss i 印访c 锄n y m g a t ( p o 0 5 ，r i s o 2 0 0 ) w h i c hc o i l f i m st h ef a c tn 眦鲫e t i cm a yp l a yak e yr o l eo n m i 咖i n ec o n t e n to f c h i c k e n a n dt l l i sm a ys e 仕l eaf o u n d a t i o nf o rr e s e a r c h i n gm em e c h a n i s m o fn a v o ri nc h i n e i n d i g e n o u sb r e e d si nm em o l e c u l a rl e v e l 锄db e o fs i g i l i f i c a 工l c cf o r ! 扬州大学硕士学位论文 f o u rb r e e d i n gp r a c t i c ec h i c k e nb r c e d so f c h i c k e ns - 2 a 1 l7e x o n s 淅t hn a n k i n gi n t r o n i cs e q u 锄c e sa n d3 ，- r e g i o no f 印足jg e n ew e r e a n a l y z e db yt h em e t l l o do fp c r s s c pa i l “y s i s ，c o l b i n e dw 油g e n es e q u e n c i n gi 1 1t h c f i v ec h i c k e nb r e e d sm e m i o n e da b o v e w 毫f o u n d2s n p si nt o t a l ，o n es n pw e r ed e t e c t e d i n3 u t ra n dt h es e q u e n c 堍r e s u l l 【si n d i c a t e d 血a ib bg e n o t y p e sh a do n l yo n eb a s e d i 髓r e n c ew i t ha ag e n o t y p e ( c 2 1 3 2 t ) ，w h i i ec cg e n o t y p eh a do n l yo n eb a s e d i 娲r e n c e 埘t hb bg e n o t y p e ( c 2 1 3 2 a ) ；a n o t h e rs n pw 够f o u n di ne x o n7w i 血a a 8 0 9 g t h e s et w op o l y m o r p h j cs i t e sw e r e 肿m i n a t e d 鹞t p k l a ，t p k lbr e s p e c 咖e ly _ t p k l bw e r cd e t e c t e do n l yi nt h cr u g a 0c h i c k e n t h eg e n o t y p e sd i s t r i b u t i o n 锄o n g d i f f e r e n tc h i c k e nb r e e d si ss i g i l 湎c a n t l yd i f f e r e n c e ，a i l dg e n o t y p e sd i s t r i b u t i o n 锄o n g d i f f e r e n tc h i c k e ng c n e a l o g y si sa l s os i g l l i f i c 咖l yd i f f e r e n t 0 n l yt h ct p k l a1 0 c u ss h o w as i g n m c a n ir e l a t i o n s h i p 、i t hm i a m i n ec o n t e n ti nb r e a s tm u s c l e a c r o s sm eb r e e d s ， t h i a m mc o n t e mo fi n d i v i d u a l s 谢血a ag e n o t y p e 、a ss i g n i n c a l l t l yl l i 曲e rt h a nm a to f w i t ha ba n db bg e n o 啪e 妒( o 0 1 ) r c s u l ti n d i c a f e dm a tm i sl o c u sm a yb ea c a n d i d a t ea s s i s t a n “n a r k e rf o rs e l e c t i o n 血i 啦i n ec o n t e m s k e y w o r d s ：t h i 锄i n e ；，r h i m i n e p y p h o s p h o k i n m ；s i n g l em l c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ( s n p ) ：r e l a t i o n s i 重量堕! 墨坠塑堕堕墨塑墨堡垒堇里垦堡墨壁丝丝基墨堕堕塞鱼量塑差堡婴曼 ! 第一章文献综述帚一早义j 瓠琢尬 近2 0 年来，我国的畜牧业飞速发展。畜牧业能将大量的人类不能直接利用 的植物产品转化为对人类十分有益的脂肪、蛋白等营养物质和优质的衣着材料。 肉产量从1 9 9 0 年的2 8 6 7 万吨增加到2 0 0 6 年的8 0 5 l 万吨，增长量是1 9 9 0 年的3 倍。同时，畜产品的品种结构也随之向低脂肪、高蛋白的品种调整与改善。 猪肉比重由1 9 9 0 年的7 9 8 下降到6 4 7 ；牛羊肉比重由1 9 9 0 年的8 1 提 高到1 4 8 ，禽肉比重由1 9 9 0 年的1 2 提高到了2 0 5 ，是肉类中增长最快 的品种【lj 。 从国际比较看，中国是仅次于美国的第二大禽肉生产国，也是禽肉出口大国， 在国际市场上的主要竞争对手是美国、巴西和泰国，出口主要以鸡肉为主。2 0 0 5 年，中国鸡肉产量为l o l 4 8 7 万吨，占禽肉总产量的6 9 1 5 ；仅香港地区，2 0 0 6 年3 月份统计显示，鸡肉的纯进口量比去年同期下降了3 0 以上，第一季度的 出口增加了1 1 7 ，达到5 3 5 4 6 吨。出口的几乎全是冷冻切割鸡肉f 2 】。 在国内，随着经济的发展和生活水平的提高，人们对鸡肉的需求正在由以满足 数量为主向注重质量风味的方向转变。快大型白羽鸡的生产和消费渐趋饱和，而 肉质鲜美适合华人烹调习惯的优质黄羽肉鸡生产则呈明显上升趋势。肌肉品质的 改善和提高已经成为当今肉鸡育种的主导方向之一。肌肉品质是对肉品质特性的 一种综和评价，包括质地、营养价值、安全性、风味等。肌肉的品质除了感官品 质( 如肉色) 外，更重要的是它的食用品质，如鲜味、香味和营养成分等。在我国， 人们对鸡肉风味的关注程度远胜于欧美等国，肉品风味己经成为消费者评价肉品 优良与否的一个重要标准【3 】。 1 研究素材介绍 如皋鸡：如皋鸡是江苏省畜禽品种志的优质黄鸡，具有三黄特征( 黄羽、黄 喙、黄脚) ，加上肉质细嫩，味道鲜美，体重小，是深受消费者欢迎的“一席鸡”。 但因其生长速度慢，料重比达4 ：l 以上，年产蛋率低，严重影响其生存与发展。 扬州大学硕士学位论文 为了使如皋鸡的生产性能能适应市场经济的需求，开发利用地方品种资源，从 1 9 8 2 年开始对如皋鸡提纯复壮，杂交利用的工作。经过多年精心选育，于2 0 0 5 年1 月1 0 日通过了江苏省畜禽品种委员会审定，定名为“如皋鸡”。2 0 0 5 年1 月 3 1 日，省农林厅公告正式批准“如皋鸡”为省级畜禽新品种( 配套系) ，并颁发 了畜禽新品种证书，该品种的认定将极大地推迸如皋下畜禽生产结构调整，预 计2 0 0 5 年如皋黄鸡的年饲养量将达到1 8 0 0 万羽【4 ，5 1 。 隐性白羽鸡：隐性白羽鸡是蛋肉兼用型快大型品种，羽毛纯白，单冠，冠5 6 个，肉垂与耳叶均为红色，喙和脚、皮肤均黄色，胸宽体圆，羽色纯白，单冠， 体形外貌良好，无芦花基因，与纯黄土鸡种杂交，其f 1 代雏黄羽率达9 5 一9 9 ， 2 5 周龄达5 产蛋率，开产体重为2 6 5 0g ，高峰产蛋率为8 3 ，6 8 周龄入舍 产蛋枚数1 8 5 枚，产健雏数1 5 6 羽，平均受精率9 3 ，平均孵蛋率8 4 5 【6 ”。 隐性白羽鸡因其特别的羽性遗传基础，良好的体型外貌及产肉性能而成为优质高 产商品鸡生产不可缺少的素材，且体重具有较高的遗产力，可根据表型进行选种， 以保证目标性状的世代进展嗍。 泰和乌骨鸡：乌骨鸡是我国畜禽基因库中具有特殊经济价值的珍禽，具有许 多国外鸡种所不及的优良特性，兼备药用、肉用、观赏价值，是我国古老的鸡种 之一，闻名中外的药用家禽，1 9 7 4 年被列为国际承认的标准品种【9 1 。乌骨鸡在我 国已有1 3 0 0 多年的饲养及药用历史，最早的史裁见于明正德1 3 年李时珍本 草纲目。据历史记载，由雏形初步形成品种，有遗传不稳定到遗传性状的相对统 一，大约经过了1 6 6 2 4 0 年的自然选择和人工选择。而品种的相对固定，又经过 了2 3 2 年的选育过程。产地以江西省的泰和、万安、吉安等地和福建省的莆田、 晋江、永春等沿海一带尤为集中，体形特征因产地的不同而有所差异【l 叭，如位于 我国江西省泰和县的丝毛乌骨鸡，其体形结构细致紧凑，体躯小而短矮，头小， 颈短，眼乌，体态轻盈，外貌奇特，皮肉俱黑而羽毛银丝雪白或全黑，头顶凤冠， 放有“白凤”之称。有人称之为“十全”禽，所谓“十全”是指桑椹冠、缨头、 绿耳、胡须、五爪、丝毛、乌皮、乌骨、乌肉【l “。 乌骨鸡不仅外形奇特美观，而且具备性情温顺，不善飞跃，就巢性好，生长 盂春玲：鸡肌肉硫胺索相关候选基因遗传多样性及其与硫胺素含量相关性研究 发育前快后慢等特点，同时集药用、营养和观赏价值于一身，特别是药用价值最 为明显。中国的许多学者都认为黑色素是乌骨鸡具有良好的药用价值的秘密所在， 李华等【1 2 】( 2 0 0 0 ) 认为乌骨鸡黑色素对微量元素( c u 、f e 、z n 、m n 、c o 、m o ， n i ) 有富集作用，其中c u 、f e 、z n 、m n 4 种元素可直接参与人体的细胞免疫功 能；徐幸莲等【1 3 】( 1 9 9 9 ) 研究证明乌骨鸡黑色素能清除氧超阴离子，具有类似超 氧化物歧化酶的功能，具有延缓衰老的作用。 萧山鸡：又名越鸡，为蛋肉兼用型品种，产于浙江萧山，分布于瓜沥、义蓬、 坎山、城北等地。1 9 8 1 年的饲养量为1 5 0 万只。外貌特性：萧山鸡体型较大， 外形近似方而浑圆，公鸡羽毛紧凑，头昂尾翘。红色单冠、直立。全身羽毛有红、 黄两种，母鸡全身羽毛基本黄色，尾羽多呈黑色。单冠红色，冠齿大小不一。喙、 胫黄色。初生重为3 8 5g 。成年体重公鸡为2 7 5 9g ，母鸡为1 9 4 0g 。屠宰测定； 1 5 0 日龄公鸡半净膛为8 4 7 ，全净膛为7 6 5 ；母鸡半净膛为8 5 6 ，全净膛 为6 6 o 。开产日龄1 8 5 天左右，年平均产蛋1 3 2 5 枚，平均蛋重为5 6 9 ，蛋 壳褐色，蛋形指数1 3 9 。蛋壳厚度o 3 l 姗。萧山鸡营养丰富，对人体具有补益 五脏、治脾胃虚弱的功效。民间以仔鸡与黄芪炖服，对慢性肝炎、腰肌酸痛、神 经衰弱、气虚盗汗、肾阳不足等症有较好的疗效。早在春秋时代，民间土种鸡被 择优选入越王宫中，供观赏玩乐之用，逐渐形成性状良好的鸡种，名为“越鸡”。 后来由宫中传至民间，再经精心培育成为今日的萧山鸡，故其饲养历史已达2 0 0 0 余年【1 4 1 。 白耳鸡：又名白耳银鸡、江山白耳鸡、上饶地区白耳鸡，为我国稀有的蛋用 早熟鸡品种，以其全身披黄色羽毛、耳叶白色而故名，主产于江西上饶地区广丰、 上饶、玉山三县和浙江的江山市。1 9 8 0 年产区共有8 0 多万羽。外貌特性：白耳 黄鸡以“三黄一白”的外貌特征为标准，即黄羽、黄喙、黄脚，白耳，耳叶大， 呈银白色，似白桃花瓣，虹彩金黄色，喙略弯，呈黄色或灰黄色，全身羽毛呈黄 色，单冠直立，公母鸡的皮肤和胫部呈黄色，无胫羽。初生雏绒羽以黄色为主。 初生重平均为3 7g ，开产日龄平均为1 5 0 天，年产蛋1 8 0 枚，蛋重为5 4g ，蛋 壳深褐色，壳厚o 3 4 o 3 8 岫，蛋形指数1 3 5 1 3 8 。雏鸡羽毛生长较快，通常 8 扬州大学硕士学位论文 4 2 日龄全身羽毛可长齐，换羽也较快，适应性强。成年鸡的屠宰率较高，屠体较 丰满【1 5 l 。 2 风味物质 风味是一个复杂的概念，是人的嗅觉、味觉和三叉神经等对食品的刺激所产 生的一种综合感觉【1 6 1 。食品的总风味是各种风味物的生成并相互平衡的结果。肉 品风味包括滋味( s a v o r ) 和香味( a r o m a ) 。肉的香味是由肉受热过程中产生的挥发性 物质对嗅觉的刺激而产生，已被鉴定的熟肉中的挥发性化合物的种类超过l 0 0 0 种【1 7 】，其中可能与肉品风味有关的有4 0 0 余种，这些化合物可分为两大类，一 类是烃、醇、醛酮等化合物，另一类是含氧、硫、氮原子的杂环化合物，如呋喃 及其衍生物等【l 剐。能产生风味的挥发性前体物很多，碳水化合物、蛋白质、脂肪 及核酸等物质经过水解、氧化、还原等化学反应，都可以产生香味物质，其中氨 基酸和还原糖的m a l i l d a r 反应、脂质的氧化和硫胺素的降解反应，对香味的贡献 最大【1 9 】。m a l i l a r d 反应产物中与香味有关的至少有4 0 余种，包括呋喃、噻吩、 噻唑等多种含硫化合物口n2 ”。硫胺素受热时可产生以含硫化合物为主的多种挥发 性香味物【2 2 1 ，己鉴定的6 8 种硫胺素分解产物中含硫化合物占5 0 以上，这些 化合物在肉受热过程中产生浓郁的香味。不饱和脂肪酸在加热过程中氧化产生的 挥发性物质是形成肉香味的另一个重要来源2 3 1 ，其中影响风味的主要是磷脂。鸡 胸肉中磷脂占总脂的比例分别是皮下脂肪和腹脂的2 4 和5 3 倍，腿肉分别是 1 0 5 倍和2 3 倍。从牛肉中去掉甘油三酯，牛肉风味不受明显影响，但去掉磷脂 后，加热产生的挥发性脂肪醇和脂肪醛浓度大大降低，牛肉风味发生明显改变【2 4 1 。 3 硫胺素作为风味物质研究进展 3 1 硫胺素的风味特性 硫胺素( t h i 锄i n e ) 是一种由嘧啶环和噻唑环结和而成的一种b 族维生素， 为白色结晶体，溶于水，在酸性溶液中对温度和氧稳定，在碱性溶液中不稳定， 易被氧化和受热破坏【2 5 j 。但加热至熔点( 2 4 9 ) 即分解，通常也称维生素b l ，是 参与体内糖及能量代谢的重要维生素，对维持人体健康显得尤为重要，是人体为 重童丝! 苎些塑堕堕鲞塑差堡垄苎里望生墨壁笪墨基兰堕壁耋宣里塑差堡! 塞 ! 了维持正常生理功能而必须从外界摄入的天然有机物，维生素b - 本身不具有生物 活性，必须在肝脏转化为焦磷酸硫胺素( t p p ) 后才具有生物活性。t p p 的主要功 能是作为糖分解代谢途径的中间产物a 酮酸氧化脱羧酶系的辅酶。维生素b l 缺 乏，a 酮酸氧化脱羧障碍，导致糖分解氧化产能障碍，影响神经系统能量供给，引 起多发性神经炎【2 6 1 。临床表现为四肢麻木、肌肉萎缩、心力衰竭、下肢水肿等症 状。t p p 的另一功能是抑制胆碱酯酶活性，当维生素b i 缺乏时，胆碱酯酶活性增 高，乙酰胆碱分解过多，影响神经传导，临床表现为消化液分泌减少、胃肠蠕动 减慢、食欲不振、消化不良等。维生素b i 缺乏症较常见，我国广西南宁等地方曾 大规模发生过维生素b l 缺乏症【2 7 1 。 硫胺素( t i l i 锄i n e ) 也是重要的香味前体物质。当受热时可产生多种含硫和舍氮 挥发性香味物质。d v v i v e d i 等( 1 9 7 3 ) 报道硫胺素热降解可产生硫化氢、3 乙酰3 巯基丙醇、3 巯基丙醇、4 甲基5 乙烯基噻唑及呋喃、噻吩。加热硫胺素水溶液 可产生碳酰化合物、呋喃、噻吩、噻唑、二恶茂及其它含硫化合物。已鉴定的硫 胺素分解产物有6 8 种，其中一半以上是含硫化合物，包括脂肪链硫醇、含硫碳酰 化合物、硫取代呋喃、噻吩、噻唑、双环化合物和脂环化合物，它们多数具有煮 肉的诱入香味。硫胺素先与含硫多肽和烷酮反应，再加入二乙酰化合物和己醛， 可产生鸡肉特有的风味口8 ，2 9 1 。 3 2 影响肌肉硫胺素含量的因素 3 2 1 遗传因素 大量研究表明在同样的日粮和饲养管理条件下，不同品种、不同性别、不同 部位肌肉中硫胺素的含量有较大的差别，这些在同样环境下产生的差异表明硫胺 素与遗传因素有关。 陈国宏等口川( 1 9 9 8 ) 对我国1 2 周龄萧山鸡、自耳鸡、狼山鸡、乌骨鸡、油 鸡、白耳鸡( 6 ) 萧山鸡( 早) 、萧山鸡( 6 ) 白耳鸡( 早) 等7 个地方鸡种肌肉中硫 胺素含量进行了比较分析，发现肌肉中硫胺素含量由高到低依次为白耳鸡、萧山 鸡( 6 ) 自耳鸡( 早) 、萧山鸡、白耳鸡( 6 ) 萧山鸡( 早) 、乌骨鸡、狼山鸡、油鸡， 扬州大学硕士学位论文 其中白耳鸡肌肉硫胺素含量显著高于乌骨鸡、狼山鸡和油鸡( p 0 0 5 ) ，说明此阶段性别的不同没有对公、母鸡肌肉硫胺素含量带来较大的影响。 此外，对所分析的7 个地方鸡种肌肉硫胺素含量与体重相关分析表明，肉硫 胺素含量与体重呈负相关，其中乌骨鸡、油鸡相关系数达到极显著水平( 尸 0 0 1 ) 。 3 2 2 饲养方式和饲喂水平 不同的饲养方式对鸡肉中硫胺素含量的影响不同。韩剑众等d 1 1 的研究表明， 放养肉鸡肌肉中肌苷酸和硫胺素的含量均明显高于圈养鸡。肌肉中中间型肌纤维 含量的变化，放养肉鸡腿部含量明显下降，而胸部则显著上升，而一定量的肌肉 脂肪是改善肌肉烹制后的适口性所必需，肌肉脂肪还可使结缔组织松散，从而提 高肌肉的多汁性和嫩度。 3 2 3 饲料添加齐0 在饲料中添加不同的物质可显著改善肌肉的肉质。大蒜素能增加肌肉的香味 成分，使肉更鲜。郑诚等( 1 9 9 8 ) 研究结果表明在肉鸡的饲料中添加2 5 0 卧的 效果最好，脚胫皮肤着色较黄，并且显著改善了鸡肉的风味。据泰国报道，大蒜 素改善鸡肉风味是由于其中含有c 3 h 5 s o 集团。 3 3 硫胺素的合成代谢。” 硫胺素的体内合成代谢十分复杂，其硫胺素分解产物有6 8 种，其中一半以 上是含硫化合物，它们多数具有煮肉的诱入香味，同时在合成过程中的很多产物 也具有产生香味的功能。 硫胺素的体内合成开始于嘌呤，代谢的最终产物是硫胺乙酸，三磷酸硫胺和 异硫胺。图1 1 给出了硫胺素的合成代 身f 路径，共涉及到2 2 步反应，其中测定 出明确产物的反应共有1 4 步，催化各步反应的酶分别是：( 1 ) 羟甲基嘧啶激酶 堇童堡：堕坚塑堕堕垂塑薹堡堡量堕望堡受蠖丝墨茎兰堕堕耋笪墨塑差堡堕塞卫 ( h y d r o x y m e t h y l p y r i m i d i n e 虹n a s e ，e c ：2 7 1 4 9 ) ( 2 ) 磷酸甲基嘧啶激酶 ( p h o s p h o m e t h y l p 州m i d i n eh n a s e t e c ：2 7 4 7 ) ，( 3 ) 羟乙基噻唑激酶 ( h y d m x y e t h y l “a z o l ek i n a s e ，e c ：2 7 1 5 0 ) ， ( 4 ) 正磷酸硫胺磷酸化酶 ( t i l i a n l i n e - p h o s p h a t ed i p h o s p h o r y l 猫e ，e c ：2 ，5 1 3 ) ，( 5 ) 正磷酸硫胺激酶 ( “a r n i n e p h o s p h a t ek i n a s e ，盟；2 ：2 ：生! 亟) ，( 6 ) 二磷酸硫胺激酶( m i a l l l i n e p h o s p h a t e l 【i n a s e ，墼；2 ：2 ：垒：! ) ，( 7 ) 硫胺三磷酸酶( t l l i 锄i n e - t r i p h o s p h a t a s e ，盟；3 ：鱼! ：2 8 ) ， ( 8 ) 硫胺焦磷酸激酶( t h i a m i n ep ”o p h o s p h o k i n 鹤el ，e c ：2 7 6 2 ) ，( 9 ) 三磷 酸核苷酯酶( n u c i e o s i d e - t r i p h o s p h a t a s e ，鳗；3 ：! ：1 5 ) ，( 1 0 ) 硫胺氧化酶( t h i 锄i n e o x i d a s e ，盟；l ：! ：3 ：2 ) ，( 1 1 ) 硫胺激酶( t l l i 衄i n e k i f l a s e ，盟；2 ：z ：! ：婴) ，( 1 2 ) 硫胺水解酶( t h i a m i n h y d r o l 鹤e ，盟；2 ：5 ：! ：2 ) ，( 1 3 ) 硫胺酶( t h i a m i n a s e ，盟墨51 塑：2 ) ， 墼；3 ：! ：3 ：还没有明确的名称。反应所有的酶郡存在于胞液内。 合成途径开始于嘌呤的代谢，在酶的催化作用下生成1 ( 5 - 磷酸核糖基) - 5 - 氨基酮( a i r ) ，经过中间的三步反应生成4 氨基5 羟甲基2 一甲基嘧啶，经由羟 甲基嘧啶激酶催化合成4 氨基- 2 甲基5 羟甲基磷酸嘧啶，此反应中一个磷酸集 团转移到嘧啶环上，形成磷酸嘧啶，在第4 步反应中，4 氨基一2 甲基5 羟甲基 磷酸噎啶在磷酸甲基嘧啶激酶的催化作用下合成2 甲基4 氨基5 - 羟甲基磷酸嘧 啶二磷酸。第5 步反应是丙酮酸与三羧酸循环的产物催化产生5 - ( 2 羟甲基) - 4 甲基噻唑，在经由羟乙基噻唑激酶催化合成4 一甲基5 ( 2 磷酸基) 噻唑，磷酸基 取代了羟甲基的位置。第7 步反应是4 甲基一5 一( 2 磷酸基) 一噻唑与第4 步的反 应产物2 甲基4 氨基5 羟甲基磷酸嘧啶二磷酸由正磷酸硫胺磷酸化酶催化合成 正磷酸硫胺，正磷酸硫胺脱去磷酸，成为硫胺素。硫胺正磷酸盐磷酸化为二磷酸 硫胺和三磷酸硫胺，瑰睦素在硫胺焦磷酸激酶的激活下同样磷酸化为二磷酸硫胺 和三磷酸硫胺，在硫胺激酶的作用下磷酸化为正磷酸硫胺。硫胺素被硫胺氧化酶 氧化生成硫胺乙醛，进一步氧化为硫胺乙酸。在硫胺酶得作用下分解为5 - ( 2 一羟 甲基) 4 一早基噻唑。 1 2 扬州大学硕士学位论文 3 4 硫胺素合成代谢酶系基因的研究概况 3 4 1 硫胺氧化酶基因 硫胺氧化酶是硫胺素代谢的关键酶之一，催化4 个极其微小的氧化反应，硫 胺素通过中间产物硫胺乙醛的过渡最终被氧化为硫胺乙酸。g o m e z - m o r e n oc 【3 4 】 等( 1 9 8 5 ) 报道硫胺氧化酶的催化机制，发现中间产物硫胺乙醛的的最大吸收波 长是3 7 0 砌，整个研究的关键是p h 值和酶作用底物的浓度。 图1 1 硫胺素合成代谢图( h n p ： w ，、v k e g g c o m ) 3 4 2 硫胺焦磷酸激酶基因 硫胺素( 1 1 1 i 砌i n e ) 在体内的合成代谢过程十分复杂，合成代谢涉及十几种 关键酶，硫胺焦磷酸激酶是硫胺素代谢过程中的关键酶之一，催化两个重要的反 应：( 1 ) 由硫胺素生成二磷酸硫胺素的反应；( 2 ) 由二磷酸硫胺素生成三磷酸硫 胺素的反应，这两个反应对于最终的肌肉硫胺素含量具有重要的影响。国内外对 此酶的研究主要集中在q t l 定位。n i e m a n w c 等口5 岍究发现曲霉菌的乃j 定 位于7 号染色体，日本水稻的贮朋定位于1 号染色体【3 6 】，狗”臣，定位于1 6 号染色体【3 7 】，由2 0 8 个氨基酸组成，黑猩猩z p 斛定位于7 号染色体【38 】，由2 4 3 重量堕：璺坚堕堕壁茎塑差堡垄墨堕垫堡墨堡堡墨茎皇堕堕耋鱼苎塑苎丝型塞旦 个氨基酸组成，人卯k 定位于7 q 3 4 - q 3 s 【3 9 】，由1 9 4 个氨基酸组成。鸡的卯k j 基因被定位于2 号染色体i 帅1 ，包含7 个外显子及3 。调控区。 3 4 3 硫胺激酶基因 硫胺激酶基因是体内合成代谢的关键酶之，催化硫胺素的磷酸化，对最终 硫胺素的含量具有重要的影响。经人们研究发现，埃希氏大肠杆菌、沙门氏菌、 志贺氏菌虽然在染色体图谱中的位置有所差异h 3 1 ，但这三种菌均由2 7 4 个氨 基酸构成，耶氏菌由2 9 5 个氨基酸构成【州，耶尔森氏菌由2 8 8 个氨基酸构成m 。 国内外对此酶的研究主要集中在q t l 定位，并没有关于其功能的明确报道。 4 侯选基因法在畜禽遗传育种中的应用 畜禽肉品的风味通常属数量性状，受多个基因的控制，基因表达与调控方式 和机理极其复杂。候选基因法( c a n d i d a t eg e n ea p p r o a c h ) 和连锁分析法( 1 i f l k a g e r n a p p i n g ) 是鉴定数量性状基因位点的两种基本方法，它们分别用候选基因或遗传 标记与表型性状进行连锁分析来鉴定或定位数量性状基因位点。连锁分析法至今 引人注目，在欧美等国几年前就已开展了研究h 5 ，4 6 1 ，但因该方法需要建立参考家 系，耗资巨大，目前在我国尚难以开展研究；而候选基因法具有统计决策效率高、 应用范围广( 可用于任何群体且只需要一个世代的资料) 、费用低和操作简便等优 点，适合在我国现阶段开展研究。 作为某个性状的候选基因通常是一些己知其生物学功能和核酸序列的基因， 它们参与性状的生长发育过程。这些基因可能是结构基因、调节基因或是在生化 代谢途径中影响性状表达的基因【4 7 】。 4 1 候选基因与表型性状间的连锁分析 候选基因法鉴定q t l 适用于任何可取得基因型和表型数据的群体，是在商 品种群中鉴定q t l 的理想方法。根据候选基因一个多态位点还是根据候选基因 的单元型来进行连锁分析【4 引，是连锁分析中首先要作出的决定。用候选基因单元 型进行分析将增加测定基因型的费用，但也许可提供较强的特异性及统计的可靠 性。在整个群体中候选基因的效应使用混合线性模型来分析，其中候选基因的等 1 4 扬州大学硕士学位论文 位基因和基因型效应作为固定效应来处理。当在某群体中分析多个候选基因对某 一性状的作用时，可采用多重回归方法。候选基因与表型性状间的连锁分析也可 通过比较具有不同性状值品种群的等位基因频率差异来进行，及可采用观察大群 体中分布二侧或不同选择系之间的等位基因频率的差异来进行分析。 4 2 连锁关系的验证 候选基因与数量性状的连锁关系通常在某一群体的特定世代中发现，所以该 效应可能是仅仅存在于该群体中，甚至于在该世代中。例如，在某群体中所研究 的候选基因与影响某性状的q t l 可能处在暂时的连锁不平衡状态，而该q t l 与它相隔一定距离或甚至在另一条染色体上，这仅仅可由机遇产生，或者某公畜 携带着候选基因的某个等位基因，使得该等位基因在研究世代中出现的比例不平 衡，并恰巧与研究性状育种值的高低相对应。鉴于连锁不平衡产生的候选基因效 应是因为与它紧密连锁的基因仅仅存在于该群体中，或者候选基因效应的产生是 因为其等位基因与研究群体中的特殊遗传背景有交互作用，所以在某一群体中得 到的候选基因效应需要在该群体中经过一个或多个后续世代的验证，或在同品种 不同群体以及不同品种中进行验证。 4 3 候选基因法用于鸡肉品质性状的研究 目前，对鸡肉品质的研究主要见于肌肉肌内脂肪含量和脂肪代谢候选基因 的研究，候选基因包括：细胞外脂肪酸结和蛋白基因、生长激素基因的s n p 与 鸡脂肪性状的候选基因、肌肉生长抑制素基因( m y o s 协t i n ，m s t n ) 、p p a r - a 基 因、鸡瘦蛋白受体基因、解偶联蛋白基因作为研究肉鸡体脂代谢的候选基因。 王启贵等删( 2 0 0 2 ) 以鸡细胞外脂肪酸结和蛋白基因为影响鸡脂肪性状的候选 基因。颜炳学掣5 0 】( 2 0 0 3 ) 等分析了生长激素基因的s n p 与鸡脂肪性状的候选 基因。顾志良等【5 l 】( 2 0 0 3 ) 等以肌肉生长抑制素基因( m y o s t “i n ，m s t n ) 为 影响鸡腹脂性状的候选基因。孟和等5 习( 2 0 0 2 ) 以鸡p p a r - d 基因作为影响鸡 脂肪性状的候选基因，采用p c r - s s c p 法分析了该基因编码区大约1 _ 2k b 的单 核苷酸位点在a a 肉鸡、石岐杂、北京油鸡、白耳鸡突变，发现b b 基因型与 重量堕! 堕些堕堕堕童塑叁堡垄垩璺望垡墨壁堡星基兰堕堕垂笪墨塑差堡塑塑 坚 a b 和a a 基因型相比有较高的腹脂重和腹脂率，多重比较结果b b 型同a a 型 间差异显著( p o 0 5 ) 。王颖掣耶】( 2 0 0 4 ) 以东北农业大学高低脂双向选择系的 第6 世代肉鸡为材料，分析了鸡瘦蛋白受体基因内含子8 的序列与鸡7 周龄 腹脂重性状的关系。建立适合的统计模型对多态性位点产生的基因型与生长和 体组成性状进行相关分析。经最小二乘分析，3 种基因型在腹脂重和腹脂率上 差异显著( p o 0 5 ) ，b b 型个体腹脂重和腹脂率显著高于a b 型( p o 0 5 ) ，极显 著地高于a a 型个体( p o 0 1 ) 。赵建国掣5 4 】( 2 0 0 2 ) 以解偶联蛋白基因作为研 究肉鸡体脂代谢的候选基因。以肉鸡和3 个地方品种( 北京油鸡、石岐杂、白耳 鸡) 以及海兰褐蛋鸡为研究材料，用2 对引物对解偶联蛋白基因( u c p ) 的37 非 翻译区进行s n p 检测，b b 基因型个体的腹脂重和腹脂率显著低于a b 、a a 基 因型的个体。 对于构成肌肉鲜味和香味的主要成分之一的肌苷酸( i n o s i n i cm o n o p h o s p h a t e 舵i d ，i m p ) 含量相关候选基因的研究已经有报道。柴丽娟( 2 0 0 3 ) 、陈继兰( 2 0 0 4 ) 【5 5 ，5 6 】以腺苷单磷酸脱氨酶1 ( 址但d 1 ) 基因为肌苷酸含量的候选基因，分析了 其在北京油鸡等5 个肉鸡品种中的基因型分布。束婧婷等嗣以a d s l 基因为肌 苷酸含量的候选基因，分析了其在泰和乌骨鸡、白耳鸡等5 个肉鸡品种中基因 型分布与肌苷酸含量的关系。 5 利用分子标记评估群体遗传结构及遗传分化 遗传结构是指基因或基因型在空间和时间上的非随机分布，群体的遗传结构 包括群体内的遗传变异和群体间的遗传分化。对遗传结构及其影响因子的研究是 探讨生物适应意义、物种形成过程及其进化机制的基础，也是保护生物学的核心 之一。一个物种的遗传结构是长期进化的产物，许多物种独特的遗传结构反映了 进化历史上的一些特殊事件。生物多样性保护的关键之一是保护物种，更具体地 说就是保护物种的遗传多样性或进化潜力，制定有效的保护策略和措施必须建立 在对遗传结构充分了解的基础上【5 8 】。 利用标记进行群体遗传结构的研究具有悠久的历史。传统的标记形式有形态 标记( m o r p h o l o g i c a lm 牡k e r s ) 、细胞遗传标记( c ”o l o g i c a lg e n e t i cm a k e r s ) 、生化遗 1 6 扬州大学硕士学位论文 传标记( b i o c h e m i c a lg e n e t i cm a l ( e r s ) 、免疫遗传标记( i m m u n eg e n e t i cm a k e r s ) 等，这 些标记数量有限，在实践中的应用和产生的效果也有限。随着分子生物学技术迅 速发展，对基因结构和功能的研究更加深入，在分子水平上以d n a 多态性为记进 行遗传分析，识别个体基因型差异成为可能，从而诞生了分子遗传标记( m 0 1 e c u l a r g e n e t i cm a k e r s ) 。特别是近1 0 年来，在畜禽基因组研究计划相继开展，子标记的 研究与应用得到了迅速的发展，为准确地评价畜禽群体遗传结构及遗传多样性提 供了新的机遇。分子标记被认为是一种有效的评价畜禽