（食品科学专业论文）淀粉预处理对环糊精制备影响的研究.pdf

摘要 摘要 环糊精是一类在制药、食品、农业及化妆品等领域应用广泛的大环化合物。环糊精 主要采用酶法合成，通过环糊精葡萄糖基转移酶作用于淀粉、多糖等形成。根据生产过 程中是否添加有机溶剂可分为有机溶剂法和无溶剂法。有机溶剂法可以获得较高的环糊 精产量，但有概溶荆的残留限制了环糊精的使用范围，并对环境造成一定的危害。无溶 剂法在生产过程中不添加有机溶剂，是一种环保的新型生产方式。随着环糊精应用范围 的不甑扩大，尤其在食晶、医药化妆品等领域，都将对无溶剂法生产的嚣糊精有着更广 泛的需求。但是，无溶剂法生产存在着转化率低，提取困难，成本高的问题，急待解决。 本文以通过无溶剂法，获得生产工艺简单，高转化率的环糊精特别是多环糊精为目标， 进行了相关研究： 对环糊精葡萄糖基转移酶作用淀粉产环糊精的影响因素进行了研究，结果表明：反 应p h 8 5 、温度6 5 2 2 为环糊精葡萄糖基转移酶作用淀粉产环糨精的最佳条件，但此时酶 活降低较快，在后面实验中考虑采用了分批加酶的方法来弥补酶活的损失；加酶量控制 在5 u g 淀粉左右，可以获得较高的一环糊精转化率，进一步加大酶量会使得环糊精水 解，降低产量；c a 2 + 对酶活具有一定的保护作用，而e d t a 、m g s 0 4 、k c l 、f e c l 3 等对 环糊精葡莓糖基转移酶作用淀粉产环糊精有明显的抑制作用，在生产中要避免这些化学 物质的干扰。 通过对底物进行不同的预处理，研究了底物的预处理方式对环糊精制备的影响。 选用玉米淀粉为原料，采用筛分、超声波、微波、糨化和酶解的预处理方法以期获彳导 理想的环糊精转化率。实验得出：将糊化处理的淀粉最为地物的总转化率最高，为 5 3 。6 4 ( 但在生产中由于高粘度，实现工业化较为困难) ，影响环糊精转化率的因素包 括淀粉颗粒的大小、晶体结构的破坏程度及小分子糖对环化反应的抑制作用 在对影响环糊精葡萄糖基转移酶作用淀粉产环糊精的因素和不同淀粉原料及其预 处理方式对环糊精制各的影响研究基础上，确定了一种无溶剂生产环糊精的方法，通过 将1 5 的玉米淀粉在4 5 0 r m i n 、8 5 条件下保温1 h ( 温和热处理法) ，并分别在反应进 行的0 、2 、4 和6 h 添加王2 5 u g 淀粉的环糊精葡萄糖基转移酶，反应确，所得环糊精 总转化率为3 7 6 3 ，总浓度为4 8 6 5 m g m l ，其中p 环糊精的转化率为2 4 6 8 ，浓度为 3 1 6 9 m g m l ，高于传统工艺酶解在1 5 浓度下反应1 2 h 所获褥的环糊精总转化率 ( 2 4 8 7 ) 和浓度( 3 7 3 0 m g m l ) ，以及p 环糊精的转化率( 1 4 8 0 ) 和浓度( 2 2 2 0 m g m l ) 。 本方法具有转化率高，操作简单，成本低的优点，对工业化无溶剂法生产环糊精有 定的指导意义。 关键词：环糊精；环糊精葡萄糖基转移酶；淀粉；转化率；温和热处理 a b s t r a c t c y c l o d e x t r i ni s ak i n d o fm a c r o c y c l i cc o m p o u n d w h i c hc a l lb ew i d e l yu s e di n m e d i c i n e ，f o o d ，a g r i c u l t u r ea n dc o s m e t i c s c y c l o d e x t r i n sa r ep r o d u c e df r o ms t a r c hc a t a l y z e d b yc y c l o d e x t r i n - g l u c a n o t r a n s f e r a s e ( c g t a s e ) t h ep r o d u c t i o np r o c e s sc a nb ed i v i d e di n t o s o l v e n ta n ds o l v e n t - f r e em e t h o d s o l v e n tm e t h o dc a l lg e tah i g hc y c l o d e x t r i ny i e l d b u tt h e s o l v e n tl i m i t st h ea p p l i c a t i o n 谢壤ah i 醢c o s ta n di ti sh a r m f u lt oh u m a nh e a l t ha n d e n v i r o n m e n t s o l v e n t - f r e em e t h o di san e ww a yt op t o d u c tc y c l o d e x t d n sh a sn o te o m p l e x i n g a g e n ti ni t sp r o c e s sw i t hn oh a r m i nf o o d ，m e d i c i n ea n dc o s m e t i c sa r e a , t h es o l v e n t - f r e e m e t h o dh a sag r e a td e m a n d b u th i g h c o s te x t r a c t i o np r o c e s sm a k e st h es o l v w n t f r e em e t h o d d i f f i c u l tt ob ea d o p t e di ni n d u s t r i a lm a n u f a c t u r i n g e x p e r e m e n t sw e r ed o n et og e tas i m p l e s o l v e n t - f r e ep r o c e s sw i t hah i 曲c o n v e r s i o nr a t e ，e s p e c i a l l y 1 3 - c y c l o d e x t r i n r e s e a r c hw e r ed o n et og e tt h ef a c t o r sa f f e c t i n gt h ec a t a l y s i so fs t a r c hb yc y c l o d e x t r i n g l u c a n o t r a n s f e r a s e ( c g t a s e ) ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ，p h 8 5 ，6 5 i st h eo p t i m i z e dr e a c t i o n c o n d i t i o n ，w h i l et h ee n z y m ea c t i v i t yi sr e d u c e dr a p i d l y i nt h ep r o d u c i n gp r o c e s s ，t h ee n z y m e a c t i v i t yl o s sc a nb er e l i e v e db yc h a n g i n gt h em e t h o do fa d d i n ge n z y m e ；ah i g h1 3 - c y c l o d e x l r i n c o n v e r s i o nr a t ew a sg o t t e nb ya d d i n g5 u gs t a r c h , e x c e s s i v ee n z y m ec a nc a u s eh y d r o l y s i sa n d r e d u c et h ey i e l d o fc y c l o d e x t r i n c a ? i sap r o t e c t i n ga g e n to ft h ee n z y m e ，b u te d t a ，m g s 0 4 ， k c l ，f e c l 3h a v ei n h i b i t i o ne f f e c t so ne n z y m e ，s ot h e yh a v et ob ea v o i d e di nt h ep r o d u c i n g p r o c e s s e f f e c t so fd i f f e r e n tp r e t r e a t m e n to fs t a r c ho nc y c l o d e x t r i np r o d u c t i o nw e r ei n v e s t i g a t e d s c r e e n i n g , u l t r a s o n i c ，m i c r o w a v e , p a s t i n ga n dh y d r o l y s i su s i n gc o r ns t a r c ha ss u b s t r a t eh a s b e e nd o n et oi m p r o v et h ec o n v e r s i o nr a t eo fc y c l o d e x t r i np r o d u c t i o n e f f e c t so ft h es i z eo f s t a r c h g r a n u l e s ，t h ed a m a g ee x t e n t o fc r y s t a l l i n es t r u c t u r ea n dt h ei n h a b i t i o no f m i c r o m o l e c u l a rs u g a ro nt h ec y c l o d e x t r i np r o d u c t i o nw a si n v e s t i g a t e da n di tw a sp r o v e dt h a t c g t a s ep r e f e r r e dg e l a t i n i z e ds t a r c h ( b u ti t sh i i g hv i s c o s i t yi n t e r f e r ei t su s ei ni n d u s t r i a l m a n u f a c t u r e ) o nt h eb a s i so ft h ep r o c e s sp a r a m e t e r so f1 3 - c y c l o d e x t r i nu s i n gs t a r c ha ss u b s t r a t ea n d e f f e c t so fd i f f e r e n tp r e t r e a t m e n to fs t a r c ho nc y c l o d e x t r i np r o d u c t i o n ，am o d e r a t eh e a t e d m e t h o dw a sp r o p o s e d , c o r ns t a r c hw a sh e a t e da t8 5 4 5 0 r m i nf o rlh ，1 2 5 u gs t a r c h c g t a s ew a sa d d e da t0 , 2 ，4 a n d 6 h ，a f t e r8 h sr e a c t i o n , t o t a lc y c l o d e x t r i nc o n v e r s i o nr a t ew a s 3 7 6 3 a n dt h ec o n c e n t r a t i o nw a s4 8 6 5 m g m l ，1 3 - c y c l o d e x t r i nc o n v e r s i o nr a t ew a s2 4 6 8 a n dt h ec o n c e n t r a t i o nw a s31 6 9 m g m l ，h i g h e rt h a nt h et r a d i t i o n a lm e t h o dw h i c ho b t a i n e d c y c l o d e x t r i nc o n v e r s i o n ( 2 4 8 7 ) a n dc o n c e n t r a t e ( 3 7 3 0 m g m l ) ，、析t l lt h e1 3 - c y c l o d e x t r i n c o n v e r s i o nr a t e ( 1 4 。8 0 ) a n dc o n c e n t r a t i o n ( 2 2 。2 0 m g m l ) a f t e rr e a c t i n gf o r1 2 h t h e a d v a n t a g e so ft h i sm e t h o dw e r eah i 曲c o n v e r s i o nr a t e ，l o wc o s t ，e a s yt oo p e r a t e ，w h i c hm a y s i g n i f i c a n t i yi m p a c ti n d u s t r i a lm a n u f a c t u r e a b s t r a c t ：c y c l o d e x t r i n ；c y c l o d e x t r i n g l u c a n o t r a n s f e r a s e ；s t r a c h ；c o n v e r s i o nr a t e ；m o d e r a t e h e a t e dp r e t r e a t m e n t i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得酌研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注争致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中锋了瞑确砖洗明并表示谢意。 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者究全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件争磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有荚数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容争纸质论文的走客相一致。 保密的学饭论 签名： 第一章绪论 第一章绪论 1 1 环糊精概述 环糊精( c y c l o d e x t r i n s ，通常简称为c d ) ，是一类由淀粉或多糖在环糊精葡萄糖基转 移酶作溺下生成的由d 。毗哺葡萄糖单元通过洳l ，4 糖苷键首尾相连的环状他合物的总 称渊，1 8 9 1 年它首次由v i l l i e r s i 5 1 发现，通常由6 - 1 2 个d 吡喃葡萄糖单元组成，常见的 有6 、7 和8 个葡萄糖单元的分子，分别称为洳、多和妒环糊精。 环糊精分子的内表面里疏水性，外表面呈亲水性，这种独特的分子结构使它可以通 过范德华力、疏水作用力等与一些疏水性客体分子或基团形成超分子包合物，进而在科 学技术的诸多领域得到广泛应用，甚前它已经发展成为超分子化学研究的最重要的主 体，越来越受到科学工作者的关注。 1 1 1 环糊精的结构 环糊精是一类截锥状的大环分子，其中的葡萄糖结构单元均采用扭曲的椅式构象【6 】， 图1 - 1 劐1 3 分别给出了静、多和哥环糊精的结构示意图。 网1 - 1 伽环糊精 t a b 。1 1 a - c d 网1 - 20 - 环糊精 t a b i - 2 f - c d 豳l - 3 丫- 环糊精 t a b 1 - 3 7 - c d 其中，小口端由c 6 位上的7 个伯羟基组成，由于羟基聚集在其分子的外侧边缘， 因此环糊精分子外壁具有较强的亲水性；环糊精的内腔是由c 3 和c 5 位上的氢原子与 c - 4 位上的氧原予组成，由于c 3 和c 一5 位上的氢原子对c 4 位上的配糖氧原子具有屏 蔽作用【7 ，8 1 ，使环糊精内腔具有较强的疏水性。环糊精的疏水性和亲水性区域可用图1 4 表示。 ；。 二) 0 一 ， ， 矿_ 弋) z ，。，j ? 、_ j 二7 ：萎；幕离； 图1 - 4 环鞠精的立箨结构承意图 f i g 1 - 4s o l i ds c h e m a t i co f c d 1 江南大学硕士学位论文 i 1 2 环糊精的性质 1 。1 2 1 环糊精的物理槛质 环糊精像淀粉一样，性质比较稳定，但与淀粉不同的一个重要的物理性质是具有良 好的结晶性。在毡、p 、p 环糊精中，叠环糊精的结晶性最好。当环糊精与客体发生包 含后，其水溶性会下降，更容易从溶液中结晶析出。环糊精水溶液具有旋光性，其粘度 稍高于永。利用差示扫描量热仪或热重方法对环糊精进行分析，发现环糊精没有明显的 熔点。a 、1 3 、p 环糊精在水中的溶解度差异较大，丫环糊精水溶性最好，其次是a 环 糊精，b 环糊精在水溶液中溶解度最低，这种溶解度的差异主要与其分子结构有关【1 0 1 。 环糊精不溶子大部分的有机溶剂，一些常用的有机溶剂，如苯、甲苯、石油醚和丁醇等 可以与环糊精形成包合物而使之结晶析出，所以常用这些作为沉淀剂将环糊精产品进行 选择性回收和纯化。 1 1 2 2 环糊精的化学性质 环糊精的化学性质较稳定，可以参与反应断裂的基团和键主要有：c - 2 、c 一3 、c 。6 位上的羟基以及c 。o 、c h 和c c 。环糊精可以通过羟基位置引入新的基团得到一系列的 环糊精衍生物。环糊精在强碱溶液以及弱酸中都是稳定的，但是强酸能作用环糊精生成 葡萄糖和一系列麦芽低聚糖，其水解程度取决于酸的浓度和反应温度。 1 。1 。2 3 环糊精的生物学性质 环糊精完全不被1 3 淀粉酶水解，伽淀粉酶可以缓慢水解环糊精，因为环糊精不含有 可以被p 淀粉酶水解的末端基团，蔼毡淀粉酶直接攻击分子内部，因丽能水解环糊精。 备种a 淀粉酶对环糊精的水解作用各异，且对a 、1 3 、丫环糊精的作用难易程度不同。 一般情况下，环糊精不被酵母所利用。 研究发现环糊精在体内只有小部分被肠道吸收，大部分在结肠中被微生物利用，生 成的产物如麦芽糊精、麦芽糖和葡萄糖等被机体吸收，进一步代谢成二氧化碳和水。因 此，机体摄入淀粉后1 2 h 就可以观察到代谢的最大强度，丽环糊精则需要6 8 小时。三 种环糊精的代谢速度比较，丫环糊精较p 一环糊精快得多，a 环糊精较p 拥；糊精慢1 1 1 1 2 】。 对环糊精的药理研究表鹱，其西服后无毒性，安全，l d s o ( 半数致死计量) 珂以与淀 粉和蔗糖相比，己被若干国家食品和药物法规批准使用，并制定了严格的质量规格f l 引。 1 王。3 环糊精的应躜 环糊精由于具有内疏水、外亲水的环状结构特征，可以包埋许多疏水性物质，起到 增加溶解度，改良品质，稳定性质等的作用，在食品、医药、化学、农业等都有广泛的 应用。 环糊精分子很容易以其内部空隙而与有机分子结合，生成复合物，减少了与周围环 境的接触，使得被包结的物质对光、热及氧化更加稳定，不易挥发、蒸发和升华，其物 理化学性质也会改变( 如溶解度、颜色、香、味及水中分散性等) 。利用该特性，环糊 精在食品工鲎作为食品添加弃| 发展很快，应用面广：如有效成分的包裹，异味或有害成 2 第一苹绪论 分的脱除，提高食品与改善食品的组织结构，保持与改善风味等。 因为环糊精空腔与绝大多数临床使用的药物分子尺寸相适宜，形成的包合物具有一 定的稳定性且无毒副作用，能增加脂溶性药物的溶解度，调控药物释放过程，实现药物 的特定靶向部位释放的目的【2 3 1 ，因此在医药中有广泛的应用。一些不溶性药物被环糊精 包合后，水溶性增加，且具有膜透过性，易于吸收，可以制成注射液 2 4 - 2 6 ；药物中的苦、 涩、异味是药物配方设计中常遇到的问题，当有环糊精存在且与药物形成包合物时，药 物分子不能达到味觉受体，从而可以降低药物的异昧；对于一些易挥发损失的药物，使 用环糊精包合后可使其稳定保存。用环糊精包裹药物可以减少皮肤肠胃的刺激。对于一 般口服药物，通过环糊精的包合作用可以调控其释放过程，达到即时、延迟、延长和控 制释放的目的。将药物结合到环糊精上形成环糊精药物配结物，利用配结物的特殊物化 性质可以实现药物在结肠、脑部以及特殊细胞等靶向部位释放的目的。 环糊精在化学方面的应用主要是在分析化学和电化学中。环糊精本身是手性化合 物，可以和客体分子形成非对映缔合物，呈现出对映体选择性，因此可以被广泛应用于 色谱和电泳分离位置异构体、结构异构体和对映化合物p 6 - 2 8 。 环糊精在日化用品中的应用主要是在化妆品和日用品中作为乳化剂、稳定剂、去味 剂和包埋剂使用，以增加化妆品的稳定性、改进化妆品的性质，使衣物等具有芳香的气 味和抗菌性质等的功能f 2 蜥1 。 环糊精对难溶有机物有明显的增溶作用，这一点可以应用到环境治理中，增加有机 污染物的溶解度，减少对环境的负担。环糊精还可以提高微生物有效性，促进污染物生 物转化，吸收吸附大气、水体和土壤中的有害物质，对污染物的催化降解及降低污染 物的毒性 3 6 - 3 8 。 1 2 环糊精的生产 1 2 1 环糊精的生产工艺 环糊精的制备大都是通过生物酶法进行的，化学合成的很少，环糊精的制备包括以 下主要阶段：菌种的筛选、培养、制备环糊精葡萄糖基转移酶；环糊精葡萄糖基转移酶 转化淀粉或预水解淀粉为环糊精；从转化混合物中分离环糊精、环糊精的纯化与结晶。 环糊精葡萄糖基转移酶( c y c l o d e x t r i ng l u c a n o t r a n s f e r a s e ，c g t a s e ，e c 2 4 1 9 ) 是一种 可以催化淀粉、糖原、麦芽寡聚糖等葡萄糖聚合物合成环糊精的酶。于1 8 9 1 年被v i l l l e r g 所发现，1 9 3 9 年被t i l e m 和h u d s o n 所证实并命名 3 9 - 4 0 】。大多数情况下，环糊精葡萄糖基 转移酶可以同时产生a 、p 和丫环糊精，但不同来源的酶，生成环糊精的先后及比例有 所不同，一般根据转化初期生成的环糊精的种类和量，将环糊精葡萄糖基转移酶划分为 q 环糊精葡萄糖基转移酶、d 环糊精葡萄糖基转移酶和丫葡萄糖基转移酶三种。由于 淀粉内有序的结晶结构和牢固的氢键作用，像大部分的淀粉酶类一样环糊精葡萄糖基转 移酶作用于原淀粉效率过低【4 2 舶l 。 目前，较被大家所接受的环糊精葡萄糖基转移酶作用机理是由四种作用方式构成 l 4 4 】。( 1 ) 环化反应：是环糊精葡萄糖基转移酶催化所特有的反应，c t 1 ，4 葡聚糖分子通过 3 江南大学硕士学位论文 分子内糖基转移反应生成环糊精，反应一般从g t 1 ，4 葡聚糖的非还原性末端开始，并受 s d s 、t r i t o n 等表面活性剂影响。往) 偶合反应：是环化反应的逆反应，打开环糊糟的环， 将它结合到葡萄糖和麦芽糖的受体上，其中二糖被认为是最为有效的受体糖。( 3 ) 歧化反 应：直链寡糖分子闯进行糖基转移的作用，生成聚合度不同的各种糖分子。( 4 ) 水解作用： 其水解速度一般为环化反应速度的万分之十五左右嘲。 传统的环糊精生产工艺主要由液化、转化和分离纯化几个步骤构成 4 9 - 5 0 1 。根据是否 在反应或分离过程中添加有机溶剂，可以将环糊精的生产工艺分为有机溶剂法和无溶剂 法，图1 5 和图1 - 6 分别为有机溶剂法和无溶剂法生产环糊精工艺流程图。 有机溶剂法就是在生产或分离的过程孛添加有机溶剃，根据环糊精内孔径的不同， 可以对有机溶剂进行选择性的包合，不溶包合物的生成改变了反应的体系平衡，会促使 更多的环糊精产生，而且可以有选择、有目的性的将单一的一种环糊精沉淀出来1 5 0 。5 引。 随着环糊精生产技术的发展，无溶剂法也得到了发展和应用，后期分离主要是靠环 糊精物理性质的差异，如溶解度、分子量大小等，对转化也进行分段浓缩来完成。生产 过程中不使用有褫溶剂可以减少对环境的污染，提高环糊精的安全性，但由予环糊精的 转化率较低，使得生产成本比较高。 豳l - 5 有机溶剂法生产环糊精 t a b 1 5c dp r o d u c t i o nw i t hs o l v e n t j 三 图1 - 6 无溶剂法生产环糊精 t a b 1 - 6c dp r o d u c t i o nw i t h o u ts o l v e n t 4 第一章绪论 环糊精的生产受到缀多因素的影响，包括温度、p h 、底物、糖类等。 ( 1 ) 温度和p h 环糊精的生产一般都要控制在最适温度和p h 下进行，也就是在环糊精葡萄糖基转 移酶活性最大的温度范围进行，以获得最高的产量。不同微生物所产的酶不同，酶的最 适温度和p h 也不相同，且有研究指出不同p h 条件下，环糊精葡萄糖基转移酶生产不 同环糊糟的活性不同，改变p h 可以改变生产不同环糊精之闻的比例。近年来的报道显 示，在有复合剂存在的条件下低温进行反应可以获得更高的收率，而无复合剂时低温反 应则只有 2 的总收率。因力在低温下更有利予环糊精与复合裁形成稳定的复合物， 从反应体系中沉淀出来，从而使反应的进程始终向生成环糊精的方向移动【5 1 1 。 ( 2 ) 底物 生产中通常采用淀粉作为原料生产环糊精，淀粉的种类很多，不同种类的淀粉生产 环糊精得到的产率也不经相同。淀粉由直链淀粉和支链淀粉组成，不同类型的淀粉具有 不同的直链与支链淀粉比例及不露的链长，这些结构上的差异，对环糊精的生产带来很 大的影响。国内外对各种不同淀粉所生产环糊精产率的研究结果各不相同，有研究【5 2 1 称支链淀粉含量高的木薯淀粉生产环糊精的产率较高，也有研究表翡玉米淀粉生产环糊 精的产率较高，这可能与不同种类的酶性质不同有关。 酶反应之前采取的淀粉液化工艺对环糊精的产率有很大的影响，淀粉液化会产生较 多的低聚糖，这不仅降低了底物淀粉的含量，同时由于偶合反应的存在，很大程度上抑 制了环化反应的发生。 ( 3 ) 糖类对环期精生成的影响 c g t a s e 主要催化四种类型的反应：一是环化反应，二是偶合反应，三是歧化反应， 四是承解作用。环化反应和偶合反应互为逆反应，c 2 ，c 3 ，c 叠位含游离羟基的d 吡喃葡萄糖结构的底物是可以促进偶合反应，对环化反应有较强的抑制作用【6 】。 相同络合剂，含糖量不同的底物三种环糊精生产的比例不同，淀粉水解物性质对环 糊精的生成有很大的影响。 l 。2 。2 国内外生产概况 国外研究环糊精的历史较为悠久。2 0 世纪3 0 年代中期到6 0 年代末，f r e u d e n b e r g 分离得到纯环糊糟，并表征了环糊精的物理化学性质。这一时期的研究使人们认识到环 糊精将有可能应用于工业，虽已建立实验室制备工艺，但由于对毒性的判断尚存在争议， 并没有大规模的工业化生产。从2 0 世纪7 0 年代初开始，有法定资格的单位出示毒理学 研究结果后，消除了人们的疑虑，从此环糊精开始迈向工业化生产阶段，并显示出了迅 猛的发展势头。目前工业化环糊精生产主要以d 环糊精为主，主要生产厂商是法国的 c e r e s t a r 、德国的w a c k e rb i o c h e m 朔日本的e n s u i k os u g a r 。醚本在早期的环襁精化学发 展中处于默默无闻的地位，但近段时间以来发展迅速，已经成为活跃的研究和生产基地。 他们通过碱性发酵条件下筛选分离如高转化率的环糊精葡萄糖基转移酶，使得b 环糊精 的价格大幅度下降，并用遗传工程的方法改造了a 、丫环糊精酶的遗传因子，使a 、丫 5 江南大学硕士学位论文 环糊精的产率提高，并实现了工业化。 我国环糊精的研究始于2 0 世纪7 0 年代来，中国科学院兰州化学物理研究所、微生 物研究所及江苏食品发酵研究所、上海医药工业研究院先后开展环糊精生成酶和制备环 糊精的研究工作。目前，p 环糊精已经实现了工业化生产，年产2 0 0 0 3 0 0 0 吨左右，洳 环糊精有小量的生产，但纯度不高，p 环糊精国内尚无工业级产品。 环糊精的价格与产量密切相关，1 9 7 3 年l k gp 。环糊精的价格为2 0 0 0 美元，并仅应 用于精细化学品中，3 0 年瑟，全世界每年的总产量有1 0 0 0 0 吨每、7 环糊精每年有1 1 0 0 吨的产量) ，价格根据品质的不同有所区别，一般l k gb 。环糊精只要几美元。 1 。2 。3 环糊精生产的研究近况 第一次国际环糊精研讨会于1 9 8 1 年召开，从1 9 8 4 年开始，每两年举办一次，每次 都有上百篇论文及多个报告总结这两年来的有关研究成果。目前对环糊精生产方面的研 究多集中在对酶的基因改造方面。发酵产生特异性的生产a 环糊精和p 环糊精的酶、耐 高温和可以作用生淀粉的酶是研究较多的热点，丽对于生产工艺改进方面的硪究较少。 日本目前成功开发出一种非固定超滤膜反应系统，其特点是在低底物浓度下的环糊 精葡萄糖基转移酶环化与超滤系统相连接、反应生成物由反渗透膜进行浓缩。该工艺可 以实现无溶剂条件下环糊精的连续离效生产。非固定超滤膜反应系统生产多环糊精的典 型工艺过程为：以5 8 淀粉为底物，控制反应体系6 0 、p h 7 5 8 2 ，加入产p 环糊 精型环糊精葡萄糖基转移酶，反应在搅拌罐中进行，罐与超滤系统( 锆膜，排斥极限 1 5 x 1 0 4 ) 连接，渗透速度为2 0 l h ；反应7 8 h 后转化收率为4 0 的p 环糊精和1 0 的中 环糊精，进一步使用结晶方法，将两种环糊精分离。随着生活水平的提高，人们对消费 品的要求越来越高，由于有机溶剂法生产环糊精可能带来的有枕溶剂残留，给人们的健 康带来潜在的危害。现在翻本已经将这种无溶剂的生产方式进行推广和应用。 1 3 苯课题立题依据和意义 我国子歹k 十年代末开始生产环颧精，并被有管部门认定为国家级新产品，现在主要 作为食品和药物的添加剂使用。 目前豳内生产环糊精采用的是有机溶剂法，有机溶剂法有着转化率离的优点，但是 有机溶剂通常为毒性试剂，产品中残留的有机溶剂限制了环糊精的使用，特别是在食品 和药品中的使用，且给环境带来一定的影响。随着工业化的进程，我国已经成为了一个 环境污染较为严重的国家，这也是经济发展所带来的个负面影响。因此采用无溶剂法 生产环糊精将成为未来的趋势，日本已经率先开始将无溶剂法生产环糊精作为生产标准 执行。但是采用无溶剂法生产环糊精转化率低，生产成本较高，因此研究如何提高无溶 剂法生产环糊精的转化率是一个很有意义的课题。 薹。4 本课题主要研究内容 本课题主要研究内容如下： ( 1 ) 研究环糊精葡萄糖基转移酶侔用淀粉产环糊糟的的影响因素，p h 、温度、加酶 第一章绪论 量和化学物质，确定环糊精葡萄糖基转移酶作用淀粉产环糊精的最佳条件； ( 2 ) 研究不弱淀粉原料及前处理方式对环糊精生产的影响； ( 3 ) 在研究环糊精葡萄糖基转移酶作用淀粉产环糊精的影响因素和影响环糊精生产 的底物条件的基础上，采用了温和热处理的方法制备环期糖。 7 江南大学硕士学位论文 第二章环糊精葡萄糖基转移酶作用淀粉产环糊精的影响因素 2 1 前言 环糊精是由d 吡喃葡萄糖基以伐1 ，4 糖苷键连接丽成的环形低聚糖，可以由环糊精葡 萄糖基转移酶作用淀粉、糖原等形成的。环糊精葡萄糖基转移酶是一种具有多种催化功 能的细胞外酶【翊，属于静淀粉酶系葡萄糖基转移酶，系统分类名称力l ，4 a d 葡萄糖基 4 a d 转移酶。环糊精葡萄糖基转移酶是仅淀粉酶系中一个较为特别的种类，与其他的 酶不同，它的水解活性非常的低。 报道的环糊精葡萄糖基转移酶有数十种之多f 5 8 1 ，大部分的环糊精葡萄糖基转移酶都 可以同时生产三种环糊精，但不同来源的酶性质差异很大。根据反应初期生成的环糊精 的种类和量，可以将环糊精葡萄糖基转移酶划分为程一环糊精葡萄糖基转移酶、争环糊精 葡萄糖基转移酶和p 环糊精葡萄糖基转移酶三种。环糊精葡萄糖基转移酶催化环化反应、 偶合反应、歧化反应和水解反应1 5 9 - 6 2 | ，环纯反应力它所特有。 本章研究了由工厂提供的环糊精葡萄糖基转移酶作用淀粉生成环糊精的条件，及影 响生成环糊精的一些因素，对后面的环糊精制备提供理论依据和指导。 2 2 实验材料与方法 2 2 1 实验材料 牛盘清蛋白 考马斯亮蓝g 2 5 0 环糊精葡萄糖基转移酶 p 环糊精标准品 环糊精标准品 丫环糊精标配品 2 。2 。2 实验仪器 d 一7 8 5 3 2t u t t i n g e n 冷冻离心机 u v - 2 0 0 0n 可见分光光度计 ( w 2 0 l d ) 电热恒温水浴 f l j s i g m a 公司提供 由f l 试溉进口分装 由企业提供 s i g m a 公司 s i g m a 公司 s i g m a 公司 德国h e t t i c h 公司 尤尼柯( 上海) 仪器有限公司； 江苏金坛国华仪器厂 2 。2 3 实验方法 2 2 3 1 酶活力测定 环糊精葡萄糖基转移酶活性用比色法测定。用0 。2 m o l l 甘氨酸缓冲液( p h 8 5 ) 配 4 的可溶性淀粉溶液，糊化，取l m l 糊化好的淀粉溶液，加入0 1 m l 的酶液，振荡， 8 第三章不同淀粉原料及前处理方法对环糊精生产的影响 在4 0 * ( 2 下反应l o m i n ，然后煮沸灭活。同时以加入预先失活的酶液为对照组，按照2 2 3 4 中的测定方法测定1 3 环糊精的含量。一个酶活性单位定义为每分钟形成l m m o l p 环糊 精的酶量【6 3 删。( 酶活：3 7 0 u m l ) 2 2 3 2 蛋白质含量测定 参照考马斯亮蓝法测定，以牛血清蛋白为标准，测定5 9 5 n m 处的吸光度，计算蛋白 质含量 6 7 1 。 2 2 3 3d e 值的测定 参照g b5 0 0 9 7 - 8 5 还原糖的测定方法。 2 2 3 4 环糊精的测定l 艄o l p 一环糊精的测定过程：准确移取l r r 儿1 3 环糊精标准溶液于试管中，加入3 5 m l 的氢氧 化钠溶液和0 5 m l 酚酞溶液( p p ) ，立即用涡旋混合器使其混匀，室温下静置2 0 m i n ，在波 长为5 0 7 锄下测定溶液吸光度。绘制标准曲线，其中，空白溶液不含岱环糊精，其余操 作均相同，吸光度差值( a ) = 空白溶液吸光度( a ，) 样品吸光度( a ) 。按相同步骤测定待 测溶液d 环糊精吸光度，从标准曲线上读取d 环糊精浓度值。 q 环糊精的测定过程：准确移取i m l 甲基橙( m o ) 溶液于试管中，分别加入 l m l l m o l l 的盐酸和适量的仅环糊精标准溶液，立即摇匀，1 6 恒温水浴中静置2 0 r a i n 后，在5 0 7 n m 处测定其吸光度。绘制标准曲线，其中，空白溶液不含a 环糊精，其余 操作均相同。吸光度差值( x a ) = 空白溶液吸光度( a ，) 样品吸光度( a ) 。按相同步骤测定 待测溶液洳环糊精吸光度，从标准曲线上读取a 环糊精浓度值。 丫环糊精的测定过程：准确移取4 m l 柠檬酸缓冲液，0 1 m l l m o l l 盐酸，0 2 m l 溴 甲酚绿( b c g ) 溶液和适量的丫环糊精于试管中，混合均匀，室温下静置2 0 m i n 后，在 6 4 0 h m 处测定溶液的吸光值。绘制标准曲线，其中，空白溶液不含t 一环糊精，其余操作 均相同。吸光度差值( a ) = 样品吸光度( a ) 一空白溶液吸光度( a ) 。按相同步骤测定待 测溶液丫环糊精吸光度，从标准曲线上读取丫环糊精浓度值。 2 2 3 5 酶的分离纯化 1 0 0 0 0 r m i n 冷冻离心酶液3 0 m i n ，去除其中的微生物及生物碎片，取上清液备用( 粗 酶液) 。按硫酸铵溶解饱和度计算表( o o c ) 【s l 】配置不同饱和度的硫酸铵溶液，将上清液在 4 。c 下边搅拌边加入硫酸铵，溶解后继续搅拌3 0 m i n ，4 c 下静置1 2 h ，1 0 0 0 0 r m i n 冷冻 离心2 0 m i n ，得上清液，二级沉淀操作步骤同上。所得沉淀用p h 8 ，5 的0 2 m o l l 甘氨酸 - n a o h 缓冲液溶解，然后在4 c 下用甘氨酸n a o h 缓冲液透析2 4 h 。分级沉淀的目的是 在首次沉淀中去除无用的杂蛋白，二级沉淀获得所需的酶蛋白。 2 2 3 6 环糊精葡萄糖基转移酶作用淀粉产环糊精的影响因素研究【1 3 i ( 1 ) p h 对环糊精葡萄糖基转移酶作用淀粉产环糊精的影响 分别在p h 4 3 0 、5 0 0 、6 0 0 、6 7 2 、7 7 6 、8 2 5 、8 5 0 、9 0 5 、1 0 0 0 的缓冲液中测定 9 江南大学硕士学位论文 酶活力，考察p h 对酶活力的影响。 将酶添加到p h 分别为4 3 0 、5 o o 、6 0 0 、6 7 2 、7 7 6 、8 2 5 、8 5 0 、9 0 5 、1 0 0 0 的缓 冲液中，4 c 保温3 0 m i n 后测定酶活力( 4 0 c ，p h 8 5 ) ，考察p h 对酶稳定性的影响。 ( 2 ) 温度对环糊精葡萄糖基转移酶作用淀粉产环糊精的影响 分别在3 0 、4 0 、5 0 、6 0 、6 5 、7 0 、8 0 和9 0 下测定酶活力，观察温 度对酶活力的影响。将酶液在上述温度下分别保温3 0 m i n 后测定酶活力，观察温度对酶 稳定性的影响。在酶活最高的温度下，保温3 0 3 9 0 m i n 钡t j 定酶活力( 4 0 c ，p h 8 5 ) 。 ( 3 ) j 昏f 糊精葡萄糖基转移酶的添加量对环糊精生产的影响 配制含7 n - i 溶性淀粉的甘氨酸缓冲液( p h 8 5 ) ，1 0 0 * c 水浴糊化，冷却至6 5 时 分别添加环糊精葡萄糖基转移酶1 、3 、5 、7 和9 u g 淀粉，反应2 4 h 后煮沸灭酶，5 0 0 0 r m m 离心2 0 m i n 后测定环糊精的含量。 ( 4 ) 金属离子对环糊精葡萄糖基转移酶作用淀粉产环糊精的影响 配锘1 1 0 m m o l l 不同浓度的化学溶液，与酶液按l ：l ( v v ) 混合，在4 下保温3 0 m i n 后 测定酶活力( 4 0 * c ，p h 8 5 ) 。 2 3 结果与讨论 2 3 1 硫酸铵分级沉淀 2 3 1 1 硫酸铵盐析一级沉淀 表2 1 为不同硫酸铵浓度下的一级盐析实验，由该表可知，当硫酸铵饱和度大于1 0 时酶蛋白开始沉淀，当硫酸铵饱和度达到8 0 时酶蛋白基本沉淀完全。当硫酸铵饱和浓 度在2 0 以下时，上清液酶活起主要作用，沉淀多为杂蛋白；硫酸铵浓度在7 0 以上时 沉淀中酶活较高，酶在上清液中残存很少。随着硫酸铵浓度的增加，酶活的损失率加大， 当浓度为1 0 时，损失率为1 3 7 ；当浓度达到6 0 时，损失率为1 4 3 8 ，原因可能是 硫酸铵的酸化作用1 6 1 。随着硫酸铵的加入，p h 值不断下降，导致酶活下降。 上述结果可以作为初步确定硫酸铵分段盐析最佳浓度的参考。 表2 1 不同硫酸铵浓度的一级盐析结果 t a b 2 - 1t h er e s u l to fp r i m a r ys a l t i n go u tw i t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t eo fa m m o n i u ms u l p h a t e 注：收率( ) = 【盐析后总酶活( 上清或沉淀的) ，原酶液酶活】l o o l o 第三章不同淀粉原料及前处理方法对环糊精生产的影响 2 3 1 2 硫酸铵盐析二级沉淀 图2 1 为硫酸铵二级沉淀实验的结果，从该图可知，l 号( 一级沉淀中硫酸铵饱和度 1 0 ，二级沉淀中硫酸铵饱和度8 5 ) 的酶活得率最高，达9 0 0 1 ，但由于引入了更多的 杂蛋白，造成其中蛋白含量过高，因此降低了纯化的倍数，故最终选择试验号4 ( 一级沉 淀中硫酸铵饱和度1 5 ，二级沉淀中硫酸铵饱和度8 0 ) 作为初步纯化最终方法。 盐析过程中酶蛋白活性保持良好，但由于带入了大量的n h 4 + 和s 0 4 2 。，必须通过透 析的方法除去这些离子。 0 0 3 0 5 0 0 3 0 0 2 9 5 0 0 2 9 、e 皿 0 0 2 8 5 嘲 0 0 2 8 蹈 0 0 2 7 5 0 0 2 7 lz3456 试验号 口相对酶活+ 总蛋白 图2 - 1 硫酸铵二级沉淀对酶活及总蛋白的影响 f i g 2 - 1e f f e c to fs e c o n d a r yd e p o s i t i o nw i t ha m m o n i u ms u l p h a t e o ne n z y