（化学专业论文）复合配基亲和色谱填料的制备.pdf

摘要 摘要 亲和色谱是一种高效简便的蛋白纯化分离技术，高效亲和色谱( 1 p a c ) 是在 经典亲和色谱技术上结合高效液相色谱( h p l c ) 的特点发展起来的新技术，它具 有分离速度快、分离效果好、回收率高和操作简单等优点，适用于批量样品的分 析和制备。8 微米左右的表面多孔单分散交联聚甲基丙烯酸环氧丙酯甲基丙烯 酸乙二醇酯p ( g m a 一印姒) 微球可作为高效液相色谱柱填料中的基质材料。本文 将p ( g m a e d m a ) 微球作为高效液相色谱的基质材料。三嗪染料和金属作为亲和 配基，制备一种新型的复合配基亲和色谱填料并将其用于对蛋白质的分离纯化， 主要做了以下研究工作： 1 以分散聚合法制备的2 微米聚苯乙烯微球为种子，g 姒、e d m a 为单体，用 一步种子溶胀法制备了表面多孔的p ( g m a - e d m a ) 微球。该微球7 微米左右，粒径 单分散，表面多孔，刚性好，适合用做高效色谱柱填料。 2 以自制p ( g i i a e d m a ) 微球为基球，通过不同的连接方式，将染料配基p b m ) 【一r 和金属n i 2 + 固定在基球上，制备成两种复合配基高效亲和色谱填料 n i 2 + 一i d a p b p ( g m a e d m a ) 和n i 2 + - p b p ( g 姒一e d i i a ) 。 3 用匀浆法将所制的复合配基亲和色谱填料填装成高效亲和色谱柱，通过 比较复合配基亲和色谱与单一亲和配基亲和色谱对蛋白质的保留行为和吸附情 况，探究复合配基亲和色谱对蛋白质的保留机理，将含有染料配基和金属配基的 n i ”一i d a p b p ( g 姒一e d 姒) 、n i2 + - p b p ( g 姒一e d m a ) 复合配基亲和色谱柱与含有 单一配基的亲和色谱柱对蛋白质的吸附情况进行比较，选择最佳色谱柱 4 在1 0 0 4 6o m 的n i ”一i d a p b p ( g m a e d m a ) 色谱柱上，探讨t p h 、流速和 固定了不同金属离子的色谱柱对溶菌酶分离的影响，得出溶菌酶的最佳淋洗条件 为：流动相a 为0 0 2m o l l p h o 8 6 磷酸盐缓冲液，b 为含1 0 m o l l n a c i 的p h 6 8 6 磷酸盐缓冲液，淋洗梯度为1 5 _ m i n b 从o 到l o o ，进样量为2 0i il ，流速为0 m l m i n 。在最佳淋洗条件下对不同浓度溶菌酶进行测定，该高效亲和色谱柱具有 良好的线性、重现性、稳定性等色谱性能。实际应用中，它能将鸡蛋清样品中的 溶菌酶成功分离，并从猪心中分离纯化出高浓度的细胞色素c 。 摘要 关键词：p ( g m a - e d m a ) 微球，高效亲和色谱，复合配基，溶菌酶，细胞色素c 摘要 a b s t r a c t h i g h - p e r f o r m a n c ea f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h y ( m a c ) i sam e t h o dc o m b i n e dw i t h c l a s s i c a la f 陆_ i t yc h r o m a t o g r a p h yi na nh p l cs y s t e m i th a sa d v a n t a g e so fr a p i d a n a l y s i s ，h i g hc o l u m ne f f i c i e n c ya n dh i g hr e c o v e r y a f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h i c c o l u m nb a s e do np o r o u sp a r t i c l e so f8 岫p ( g m a - e d m a ) i sa p p l i c a b l ef o rt h e a n a l y s i sa n dm i c r o p r c p a r a t i v es e p a r a t i o no fp r o t e i n s i nt h i sp a p e r ，w ep r e p a r e d m u l t i p l e l i g a n da f f m i t yr e s i ni nw h i c hp ( g m a e d m a ) m i c r o s p h c r e sw o r eu s e da s t h e s u p p o r t , a n dd y el i g a n da n dm e t a ll i g a n d w o r e i n c o r p o r a t e di n t o t h e s e m i c r o b e n d sf o rt h es e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no f p r o t e i n s t h em a i nw o r kf o l l o w s ： 1 p o r o u sp a r t i c l e s ，p ( g m a e d m a ) m i c r o p h e r e s 谢t hd i a m e t e ro f7 u mw e r e p r e p a r e db yas i n g l e - s t e ps w e l l i n ga n dp o l y m e r i z a t i o nm c t h o c lu s i n gp o l y s t y r e n e m i c r o p h e r e sp r e p a r e db yd i s p e r s i o np o l y m a t i o na ss e e dp a r t i c l e sa n dg m a 、e d m a a sm o n o m e r s t h es y n t h e s i z e dm o n o d i s p c r s ep ( g m a - e d m a ) r e s i np o s s e s s e s u n i f o r m 、p o r o u sc h a r a c t e r i s t i c sa n dh i g hm e c h a n i ci n t e n s i t y 2 p r o c i o nb l u em d ( - ra n dn i ”w e r ec o u p l e dw i t hp ( g m a - e d m a ) m i c r u s p h c r e s t h r o u g h d i f f e r e n t w a y s ，t h u s t w on o v e l m u l t i p l e - l i g a n da f f i n i t y r e s i n s n i 2 + - i d a o p b p ( g m a - e d m a ) 、n i 2 + p b p ( g m a - e d m a ) w e r ep r e p a r e d 3 t h em u l t i p e l i g a n di m m o b i l i z e dp ( g m a - e d m a ) b e a d sw e 陀s l u r r yp a c k e d i n t os t a i n l e s ss t e e lc o l u m n t h ep r o t e i nr e t e n t i o nm a c h a n i s mo nm u l 卸l e - l i g a n d a f f m i t yc h r o m a t o g r a p h yw a se x p l o r e db yc o m p a r i n gp r o t e i nm e n t i o nb e h a v i o ra n d a d s o r p t i o na b i l i t y0 1 1m u l t i p l e - l i g a n da f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h yw i t ho nm o n o - l i g a n d a f f m i t yc h r o m a t o g r a p h y n i z + - 1 d a p b - p ( g m a - e d m a ) c o l u m nw a s s e l e c t e da st h e b e s tc o l u m nf o rp r o t e i ns e p a r a t i o na n d p u r i f i c a t i o n n i 2 + - d a - p b - p ( g m a - e d m a ) c o l u m n ( 1 0 x 0 4 6 e r al d ) w e r ei n v e s t i g a t e d i n s e l e c t i v i t y , s t a b i l i z a t i o n , l y r o t e i nl o a d i n gc a p a c i t ya n dr e c o v e r ye la 1 u s i n g l y s o z y m ea ss t a n d a r dp r o t e i n o nt h i sc o l u m n , l y s o z y m ew a sw e l le l u t e du n d e rt h e s e l e c t e de x p e r i m e n t a lc o n d i t i o n s t h ee l u e n tf l o wr a t ew a ss e ta to 5m l m i nw i t h 摘要 i n j e c t i o nv o l u m eo f2 c l u la n dt h em o b i l ep h a s el i n e a rg r a d i e n tw a ss e ti n 1 5r a i n f t o m0t o1m o l ls o d i u mc h l o r i d ei n2 0m m o l lp h o s p h a t eb u f f e ra tp h6 8 6 t h e c o l u m nh a sl o wc o l u m nb a c k p r e s s u r e ，g o o ds t a b i l i t y , h i g hp r o t e i nm a s sr e c o v e l y , a n dw k sf a c t u a lu s e df o rt h es e p a r a t i o no fl y s o z y m e e g gw h i t ea n dp u r i f i c a t i o n o f c y t o c h r o m ecf z o mp r o c i n eh e a r t k e yw o r d s ：p ( g m a - e d m a ) m i c r o s p h e r e ，h i g hp e r f o r m a n c ea f f m i t y c h r o m a t o g r a p h y ( h p a c ) ，m u l t i p l e - l i g a n d , l y s o z y m e ，c y t o c h r o m ec 独创性声明 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得澎鎏盘堂或其他教育机 构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文储签名同菰签字日期唧年6 月7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝鎏盘堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅。本人授权逝江盘茎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索。可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 声 翘 9 日签字日期：乒肉7 年6 月7 日 7 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签名：砺立谯 签字帆矽4 7 年月 电话： 邮编： 知识产权保护声明 本人郑重声明：我所提交答辩的学位论文，是本人在导 师指导下完成的成果，该成果属于浙江大学理学院化学 系，受国家知识产权法保护。在学期间与毕业后以任何形 式公开发表论文或申请专利，均需由导师作为通讯联系 人，未经导师的书面许可，本人不得以任何方式，以任何 其它单位作全部和局部署名公布学位论文成果。本人完全 意识到本声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名j 习氛 日期：问年6月7日 ， 第一章文献综述 第一章文献综述 蛋白质是生物体中含量最高，功能最重要的生物大分子。作为生命的物质基 础之一，蛋白质在催化生命体内各种反应，调节代谢，抵御外来物质入侵及控制 遗传信息等方面都起着至关重要的作用。因此蛋白质是生命科学及化学中极为重 要的研究对象。蛋白质的分离纯化是一项十分复杂的工作，同时分离纯化的方法 也很多“1 。对于不同的目标产物，根据其理化及生物特性，选择不同的分离纯化 的方法是蛋白质研究中非常重要的一方面项非常有意义的工作高效亲和色谱 ( h p a c ) 是在经典亲和色谱基础上结合高效液相色谱( h p l j c ) 的特点发展起来的 一项新技术，它使用耐高压的有机聚合物做载体，对蛋白质具有较好的分离效果 和回收率。亲和色谱是蛋白质纯化技术中效率和选择性最高的分离方法。亲和色 谱主要由载体和配基组成，配基的性质和密度决定了亲和色谱的选择性和吸附容 量，因此，亲和纯化的关键在于能否获得合适的配基。和生物亲和配基具有相似 活性的人工合成的小分子化合物是最有应用价值的仿生亲和配基，其中具代表性 的是金属螯合物类和活性染料类配基。它们具有种类繁多、价格低廉、易于合成、 与蛋白质的结合容量高和化学性质稳定等特点。金属配基和活性染料类配基具有 不同的亲和作用机理，将两类配基组合成复合配基，制备新型的复合配基亲和色 谱填料，研究蛋白质在该色谱柱上的保留行为，对了解各亲和配基对蛋白质的保 留机理和提高高效亲和色谱的对蛋白质分离效果是一项有意义的工作。 1 1 亲和色谱简介 1 1 1 亲和色谱 亲和色谱是一种利用生命现象中生物分子之间特异的作用，十分巧妙的对生 物大分子进行分离纯化的方法。生物体内生物分子之间，如酶与底物，酶与抑制 第一章文献综述 剂，酶与辅酶，激素与细胞受体，维生素与结合蛋白，基因与核酸，抗体与抗原， 外源凝集素与红血球表面上的抗原等，都互相具有亲和力，能形成可逆的络合物， 亲和色谱就是利用这种可逆络合物结合与解离的原理发展起来的新的纯化技术 嘲。基于分子识别的原理，亲和色谱常被描述为在蛋白质纯化技术中效率和选择 性最高的分离方法啪。 亲和色谱的技术基础是某些生物活性物质之间具有可逆又专一性的相互作 用。它也属于吸附色谱，但它的吸附作用主要是靠生物分子对它的互补结合体的 生物识别能力，这种专一性是由生物活性分子中的相关作用基团的化学结构和空 间排布所决定的“1 ，在结合过程中涉及到疏水力，静电力。范德华力以及空间构 型的影响。 在亲和色谱中，与流动相中的目标物发生特异性相互作用的基团称为配基 ( l i g a n d ) 。配基一般采用共价耦联的方法结合到载体基质g t a t r i x ) 上，基质 通常为有机聚合物，有时需要引入间隔臂，制成亲和色谱固定相分析操作时， 含有目标物的稀溶液流过色谱柱，目标物由于与固定相上配基发生亲和力作用被 吸附下来，而杂质由于不具有亲和能力而直接流出柱外。然后，通过改变淋洗液 条件，比如p h ，离子强度，温度，或加入特殊溶剂等，改变或破坏目标物与配基 之间的作用力使目标物得以洗脱，从而达到分离或纯化的目的。操作过程示意图 如图1 1 所示嘲。 鲁卜十。 h ”均b l b r 口d u 口bp 目d i d 呦b d 期喇h 弭删h 耵日h 酬岣- 一 图1 1 亲和色谱操作过程示意图 2 口 j 矗bb 删 d 口 口 玖笏纱 第一章文献综述 1 1 2 亲和配基 亲和色谱主要由载体和配基组成，配基的性质和密度决定了亲和色谱的选择 性和吸附容量，因此，亲和纯化的关键在于能否获得合适的配基。在理想情况下， 亲和配基应与目标蛋白可逆结合，并具有足够的亲和力和选择性，易于制备，易 于固定到固定相介质表面，对操作条件表现出足够的生物和化学稳定性，不易被 降解，不易脱落造成产品污染啪。 亲和配基的种类很多，按照亲和配基按与蛋白质亲和力的大小，分为两类， 一类即高亲和力亲和配基，其结合强度尼值为1 0 。7 1 0 - “，如生物素、激素、抗 原等。另一类即组特异性亲和配基或一般亲和力配基，尼值为1 0 1 1 旷。亲和 力越高，局值越小，如值小于1 0 1 ，则生产中需要的洗脱条件就非常苛刻，如 单克隆抗体。而如大于1 旷，则目标分子不能停留在色谱柱上，无法与杂质分开 川亲和配基的最佳厨值为1 0 。1 0 1 ，当肠值位于此范围时，亲和配基与蛋白 质分子的作用比较适中，组特异性亲和配基由于分子较小、容量高、成本低，因 而其实用性越来越受到重视。常用的组特异性亲和配基有天然配基、染料、氨基 酸或肽、核酸、肝素和螯合金属离子等。 亲和配基按照其来源可分为生物亲和配基和仿生亲和配基。生物亲和配基多 为高纯度的单克隆抗体或其他生物来源的分子( 如凝集素，辅酶等) ，虽然该类 配基具备较强的特异性，但是其生产纯化过程复杂的生物工程步骤和成本高、不 稳定等缺点在很大程度上限制了亲和色谱的应用范围。因此，与生物亲和配基具 有相似活性的人工合成的小分子化合物成为了克服生物亲和配基的缺陷的仿生 亲和配基，其中最具代表性的是金属螯合物类旧和活性染料类配基肌”1 。 1 1 3 亲和色谱的应用与发展 亲和色谱是吸附色谱的最新发展。1 9 1 0 年s t a r k e n s t e i n 报导了淀粉酶在不 可溶性淀粉上的选择性吸附，这是亲和层析的最初应用“”。但亲和层析作为一种 专门的分离技术，则应该是从c u a t r e c a s a s 等人于1 9 6 8 年第一次提出“亲和层 析”概念之后开始，他在配基和载体之间引入间隔臂，成功的解决了目标物和载 体之间的空间位阻效应“”。 第一章文献综述 亲和色谱的研究和发展主要围绕三大部分内容：基质，配基以及亲和色谱分 离机理。关于生物大分子在亲和色谱中的保留机制中，传统的观念认为亲和色谱 实际上是一种只能起组分分离作用的选择性过滤法，这种看法不仅不能定量描述 色谱过程，而且也解决不了多元组分分离问题。亲和色谱法机制的探索归根到底 都有赖于固定相上的配基和目标分子之间的作用。早期的亲和色谱理论中的配基 一配体亲和作用的研究都是建立在均相反应和宏观平衡态热力学的基础上。实际 上，亲和色谱中涉及到的亲和作用都是非均相反应，并且常常是多元体系；另外， 生物大分子的空间取向及运动方式也对亲和作用有重要影响“3 。 近几十年中，随着合适的载体基质和新配基的深入的研究亲和色谱的应用 领域不断扩展多种功能分子，包括酶，辅酶，抗体，氨基酸，多肽，核苷酸， 金属离子，染料等，都可以作为亲和色谱填料的配基。由配基的不同，亲和色谱 又可以分为生物专一性亲和色谱，免疫亲和色谱，金属螯和亲和色谱，染料亲和 色谱等越来越多的亲和色谱相关技术“”，详见图1 2 。调查表明，亲和色谱在生 物物质分离上的应用程度位居第二，仅次于离子交换法“”；关于生物物质纯化的 论文，6 0 涉及到亲和色谱及其相关技术，它正在逐渐取代传统的分离技术 ”】 亲和色谱的应用广泛，既能用于简单分子的分离，又可应用于功能的生物分 子复合体及细胞的分离，例如血液学界普遍采用的分离造血干细胞的磁性亲和细 胞分选系统( 姒c s ) 实质上也是亲和色谱法的演变“”。它既能用于许多微量生物 活性物质的分析中，例如应用于探针亲和质谱( p a m s ) “”，又可用于大规模的工 业生产。随着亲和色谱技术的进一步发展，这种独特的分离技术在未来蛋白质分 离纯化中必将发挥出更加重要的作用。 4 第一章文献综述 1 2 固定金属亲和色谱 = 图1 2 亲和色谱相关技术 固定金属亲和色谱( i m a c ) 由p o r a t h 在1 9 7 5 年提出脚1 ，并命名为金属螯合 亲和色谱。这种方法不仅用于组分离，更是一种从复杂生物基质中提纯目标蛋白 的高选择性纯化工具。经过近3 0 年的发展，固定金属亲和色谱已经发展成为和 离子交换色谱( i e c ) ，体积排阻色谱( g e lf i l t r a t i o n ) ，疏水色谱c h i c ) 相匹 敌的分离技术。i m a c 较其它色谱法有许多优点，主要有：不固定金属的裸柱可作 为阳离子交换剂来分离一些带正电荷的蛋白质。”，除去水中微量金属，对水进行 净化和消毒：固定金属离子的色谱柱，在低离子强度下可作为金属螯合柱分离亲 和金属的蛋白质，在高离子强度下金属螯合柱又显示疏水特性嗌1 ，可作为疏水柱 第一章文献综述 分离不同疏水性的蛋白质：利用同一基质可制成吸附性能不同的金属螯合柱，固 定金属离子的再生和更换非常容易，柱寿命长：在多数情况下蛋白质通过柱子仍 保持生物活性：与其它亲和柱相比，蛋白质负载量高，容易放大和工业化。 1 2 1 固定金属亲和原理 最经典的固定金属亲和色谱的理论是由p e a r s o n 提出的“3 ，将金属离子根据 与亲核试剂反应的活泼程度分为三种类型：硬金属，中等金属和软金属。硬金 属包括f e ”，c a ”，a 1 ”，他们对氧的配位作用较强，软金属：c u ”，h g ”，a g + 等对含硫 的蛋白质亲和作用较强，中等金属有c u ，n i ”，z n _ c 0 2 , 对含氮，硫，氧的蛋白 质均有相当的亲和作用。固定金属与蛋白质的相互作用是多位点的，跟蛋白质表 面的半光氨酸，组氨酸，丝氨酸，苏氨酸等残基含量有关。 但是，蛋白质在i m a c 中的保留机理至今还没有一个定论，多数学者认为蛋白 质在固定相的吸附是静电、疏水和配位作用的总和。所谓配位作用是蛋白质表面 富电子的给予基( 如- - n h 。、 s - - 和c 0 0 ) 将其孤对电子插入固定金属离子d 层空 价电子轨道形成配位键：静电作用是带电金属螯合配体与带电蛋白质分子间以及 近距离范围带电配位原子与固定金属离子电荷间的相互作用：疏水作用是固定相 疏水碳链与蛋白质表面疏水区域的亲和作用，这种作用随溶液盐浓度的增加而增 大。这三种作用力在不同条件下对蛋白质的保留贡献大小不一，常随流动相、固 定相和蛋白质的性质发生变化。在高盐浓度的流动相体系，根据疏溶剂理论，随着 盐浓度的增加，溶液表面张力增大，蛋白质与金属螯合柱间的疏水作用增强，此时 支配蛋白质保留的作用力不是静电和配位作用，而是疏水作用。然而在正常的 i m a c 体系中盐浓度较低( n a c l 0 5m o l l ，( n h ) 2 s 仉0 2 5t o o l l ) 。疏水作用对 蛋白质保留的影响不很显著，这时决定蛋白质保留的作用力主要为静电和配位作 用。 固定金属亲和色谱可以在很宽泛的条件下应用，尤其是固定了中等金属和硬 金属的亲和色谱，可以在较宽的p h 值范围内( p b 4 一1 0 ) 进行生物大分子的分离 纯化。i m a c 还可以在盐、竞争洗脱剂以及有强变性剂如：尿素或胍盐一盐酸存 在的情况下用于实际样品的快速纯化。 表1 比较了固定金属亲和色谱和其他几种色谱对蛋白质的吸附原理。 6 第一章文献综述 t i 妊l c 咖，一j 堋o f d 姐c 啪。缸r 柚蝴砸蝴k 1 2 2 固定金属亲和色谱固定相 i m a c 中的固定相是由基质、金属螯合剂和金属离子三部分组成。基质为固 体用以担载金属螯合配体。常用的基质有大孔硅胶、交联琼脂糖( s e p h a r o s e ) 和 交联葡聚糖( s e p h a d e x ) 以及有机聚合物。 金属螯合剂的作用是将金属离子固定在基质上，为此螯合剂既有能与基质共 价键合的活性基团如- - n 、- - o h 、c 1 等，又有能与金属离子配位的多个配位原 子。为保证固定金属离子可以接受蛋白质给予的电子对，络合剂上配位原子数应 小于金属离子的配位数。i m a c 中常用的金属整合剂有亚氨基二乙酸( i d a ) 、n ，n ，n 三( 羧甲基) 乙烯二胺( t e d ) 、氮基三乙酸( n t a ) 、羧甲基门冬氨酸( c m a s p ) 、四 乙烯戊胺( t e p a ) 、羧甲基a ，b 二胺丁二酸( c m d a s a ) 和乙二胺n ，n 二乙酸 ( e d d a ) 等。 ； 1 亚氨基二乙酸i d a ( i m i n o d i a c e t i ca c i d ) i d a 是一种三齿络合剂，它既能同金属离子形成稳定的金属螯合物，防 止色谱过程金属离子的泄漏，又使金属离子在螯合后留下足够能与蛋白质强烈结 合的配位点。i d a 适中的亲水性也为蛋白质的分离提供了温和的环境。z y m a , y p o u a n 汹1 用i d a 做金属螯合配基，通过铈( i v ) 引发接枝聚合，制备成高吸附 量的金属螯合吸附剂。基球( p v a c d v b i d a ) 经过c u “螯合后的微球可吸附牛血 红素蛋白。具有高吸附和低非特异性吸附的特点。a u r e l i oh i d a l g o 1 将亲和配 基i d a 分别接在环氧基质e u p e r g i t2 5 0a n ds e p a b e a d sf p e p 3 上，螯合c u ” 制备成金属螯合亲和吸附剂，从粗萃取得到的嗜热生物中提纯m n 一酶。发现了由 于两种不同基质表面的几何构相和酶表面几何构相的不同，导致了吸附活性的差 异。l u c i a n ac r i s t i n al i n sd ea q u i n o 将i d a 连接在p o l y ( e t h y l e n e v i n y l 7 第一章文献综述 a l c o h 0 1 ) 膜上，通过螫合c u ”，n i 2 + ，z n ”a n dc o ”制备成金属螯合亲和色谱，从 工业胰岛素产品中提纯胰岛素原( h i s ) 6 ，发现n i 2 + 具有高选择性和高容量。 m a r t i nl u n d 圳应用i d a 做金属螯合配基，螯合f e ”分离纯化干酪中水溶性含磷 缩氨酸。 2 c i b a c r o nb 1 u ef 3 g a f 3 g a 染料也是一种常用的亲和配基，它与蛋白质之间存在静电作用、疏水作 用、氢键及电荷转移作用等非特异性吸附。染料分子也可作为鳌合配基，和金属 鳌合形成金属鳌合亲和配基，增加了蛋白质与亲和基质的作用位点。染料分子中 存在葸醌或苯环部分可以与蛋白分子表面发生疏水作用，其分子上又带有磺酸基 团，具有阳离子交换作用，能与蛋白质分子表面的精氨酸发生静电作用。因此染 料作为鳌合配基，增加了金属鳌合亲和填料的疏水作用、静电作用和作用位点， 通过多重作用，更有利于蛋白质的分离和提纯。 h y a k u pa r c a 通过亲核反应将f 3 g a 接至i j p h e m a 膜上作为亲和配基，f e ” 螯合到辛巴蓝染料上制成金属螯合亲和吸附剂，分别对葡萄糖氧化酶、过氧化氢 酶和牛血清蛋白进行了吸附实验，发现由于金属离子和染料与蛋白的共同作用， 使螯合f e ”的染料膜比没有螯合金属离子的染料膜对蛋白和酶的吸附容量有明显 的提高。 c h u n - y iw u 。”通过四种螯合配基将c u 4 螯合到多微孔可再生纤维素膜上，制 备成金属螯合亲和膜，分别进行血球蛋白、人血清蛋白和溶解酵素吸附实验，发 现c i b a c r o nf 3 g a 作为整合配基的膜对蛋白的吸附比其他各种配基螯合金属制成 的亲和膜强。 3 壳聚糖( c h i t a s o n ) q 一h s h i 嘲，将壳聚糖附着在硅胶颗粒表面，c u ”鳌合在壳聚糖上形成金属 鳌合亲和吸附剂，对人血清蛋白进行吸附试验，发现表面处理过的硅胶颗粒对蛋 白的非特异性吸附明显提高。f e n g n a x i 嘲，将壳聚糖交联到无孔硅胶上，鳌合c u 制备成金属鳌合亲和色谱( c u c t s s i 0 2 ) ，聚乙烯乙二醇印记在壳聚糖上构成 大孔径结构，研究了壳聚糖和p e g 的浓度等对牛血清蛋白吸附的影响，该金属鳌 合亲和色谱柱可纯化粗牛血清蛋白。 第一章文献综述 4 m a h ( l m e t h a c r y l o y l l - h i s t i d i n em e t h y le s t e r ) m a h 由甲基丙稀酰氯和l 一组氨酸酯类合成，是一类新型的金属螯合配基。 s i b e le m i r 洲用m a h 作为金属螯合配基，制备新型的金属螯合吸附剂。b e m a 和m a h 通过悬浮聚合制成直径约为7 5 1 2 5l im 的微球，经过c u ”螯合后的微球可从水溶 液中提纯细胞色素c 。s i n a na k 西1 嘲，用m a h 作为金属螯合配基，e g d m a 和m a h 通 过悬浮聚合制成直径约为5 0 2 5 0um 的微球，经过f e ”螯合后的微球可纯化过氧 化氢酶。 a d i ld e n i z l i 1 用m a h 作为金属螯合配基，删a 和m a h 通过悬浮聚合制成直 径约为7 5 1 2 5 衄的微球，经过c u ”螯合后的微球可分别从水溶液和人血浆中提 纯人免疫球蛋白h i g g 。 5 其他 最近几年也开发了一些新的不含羧甲基胺的络合剂，如染料一耐黄2 k t 阱1 、o - 磷酸丝氨酸和8 羟基喹啉汹1 等。g u l a yb a y r a m o g l u ，用g 姒和m m a 通过悬浮聚合 制成直径为7 5 1 5 0 i im 的微球，用l ，6 - - - 氨基己烷作为间隔臂，卜丝氨酸做配 基，螯合c u ”制成金属螯合亲和微球。用来从人血浆中分离提纯球蛋i 刍：l g g 。 固定金属通常为具有d 层空价电子轨道的过渡金属如c r 、n i ”、c 矿、z n ”、 f e ”等，它们与螯合剂形成可与蛋白质结合的金属螯合配体。为了将金属螯合配体 固定在选择的基质上，连接前必须用活化剂将基质活化，使其末端具有能与络合 剂共价键合的活性基团如环氧基。硅胶常用的活化剂为y 缩水甘油氧丙基三甲氧 基硅烷。对有机载体常用环氧乙烷进行活化。可以看出，i m a c 实质是把蛋白质与 金属离子在液相中的均相反应转移到固液两相间进行。经过如此改进，反应的热 力学和动力学性质将发生改变：减小了蛋白质与金属离子在液相作用的自由度， 避免了蛋白质的变性：使分散在溶液中的蛋白质得到富集和分离。 1 2 3 固定金属亲和色谱的应用与发展 i 蛐a c 在生物大分子研究中的应用主要集中在两方面：蛋白质的识别和分离 纯化。 1 2 3 1 蛋白质的识别和鉴定 c h i c z 等1 利用i m a c 作为探针来区分天然均一蛋白及其变种，并将这种技术 9 第一章文献综述 扩展到基因工程，用以识别蛋白质表达错误。此法的依据是当蛋白质突变发生一 位或多位氨基酸取代时，必然影响其表面组氨酸与固定金属离子的作用，导致蛋 白质保留值发生变化，根据保留值的变化判断蛋白质遗传过程表达的正确性。他 们把野生枯草杆菌蛋白酶同一位或多位取代的枯草杆菌蛋白酶变种的保留值进 行了比较，发现无论一位或多位取代都使天然蛋白酶的保留值发生明显变化，并 且变化的大小与取代的氨基酸性质有关。 1 2 3 2 蛋白质的分离与纯化 g i s e l es e r p a 等1 ，利用固定了z n 2 的纤维素膜将免疫球蛋白g ，单克隆抗 体从大鼠细胞里纯化出来。 z h i - y am a , x i a n - q i a ol i u 等，将i d 键合在由硅胶制备成2 0 0n 0 1 的磁性 微球上，固定金属离子z n ”，用于牛血色素和牛血清白蛋白的分离，牛血色素可 以从混合溶液中完全纯化出来。 v g u p t a 等“3 1 利用s e p h a r o s e6 b 树脂作为基质，i d a 作为金属鳘合配基， 分别固定了c u ”和n i 离子，对绵羊生长荷尔蒙的保留行为进行研究，发现n i ” 柱对荷尔蒙的纯化效果优于c u 2 柱，且纯化效率可达到9 2 5 。 q u a n z h o ul u o ，h a n f az o u 1 等，应用丙烯酸酯类单体制备了大孔的聚合物整 体柱，表面修饰了i d a 作为金属鳌合配基，比较了固定有c u ，n i ，z n 和未固定 金属的裸柱对蛋白质的保留特性，并应用c u 柱和裸柱进行了蛋清中溶茵酶的纯 化和市售人血清白蛋白样品的纯化，得到了良好的效果。 由此可以看出，由于色谱基质的不同，固定了相同金属的亲和吸附剂也有不 同吸附特性。因此，固定金属亲和色谱的研究集中在固定相基质和金属鳌配基的 开发上。 1 3 染料亲和色谱 染料亲和色谱是一种重要的分离纯化生物大分子的方法，其机理非常复杂， 可以用以下两种机制来解释，一是由于染料分子模仿天然生物配基( 如 n a d h ，n a d p h ，n a d + ，n a d p + ，a t p ，g t p 等) 的形状、芳香性及电荷分配等，因此在这 些作用位置上与蛋白质形成竞争性吸附；二是染料分子与蛋白质之间存在静电作 1 0 第一章文献综述 用、疏水作用、氢键及电荷转移作用等非特异性吸附作用。当染料与蛋白主要以 特异性作用结合时，吸附作用强，需要用天然配基进行洗脱；当染料与蛋白主要 以强的非特异性作用结合时不需要用亲和配基进行洗脱，可以通过改变淋洗液的 p h ，离子强度等将蛋白洗脱下来。 1 3 1 染料亲和配基 随着亲和配基研究的发展，活性染料由于选择性好，稳定性高，价格低廉而 逐渐成为最具代表性的仿生亲和配基。染料配基通过模拟底物、辅助因子或结合 因子与蛋白及酶的活性位点作用。染料配基价格低廉，易于合成，能通过共价键 牢固的结合到亲和载体上同时与蛋白质的结合容量高，化学性质稳定，不易为生 物降解。经济性，安全性，稳定性，高吸附容量及固定的简易性等优点使其越来 越多的取代天然生物配基，成为最具应用前景的一类亲和配基。 应用于亲和色谱中的染料配基主要是染纺上所用的一些活性染料。这些活性 染料一般由一个载色体( 如偶氮分子或葸醌分子等) 连接一个活性基团( 如单氯或 双氯三嗪环等) 组成，可称为染料母体和染料活性基，它们通常通过联接基相联， 也可以直接相联。在母体染料中一般具有l 3 个磺酸基作为水溶性基团，有些 活性基本身也具有磺酸基或硫酸酯基作为水溶性基团。这些染料分子有些同时还 带有羧基，氨基，或金属螯合等基团，有助于提高染料分子的亲水性能。活性染 料通常可分为：三嗪型活性染料( a ) ，卤代嘧啶活性基类( b ) ，乙烯砜活性基类 ( c ) ，其它活性基类( 例如膦酸基型( d ) ，n 一卤代丙烯酰胺型) 和双活性基型活 性染料等，见图1 3 。 d 一日一c n c c i i ! j 、矿- ! - 占i ( i ) d - s 0 2 c h 2 c h 2 0 s o ，n a ( c ) 。一日一= 一 li 。兮i 二吣旦 图1 3 活性染料 第一章文献综述 三嗪染料是使用最广泛的一类活性染料，它又可分为一氯三嗪型，二氯三嗪 型和一氟三嗪型等，详见图1 4 。三聚氰氯( 1 4 a ) 是这类染料的基本单元结构。 三聚氰氯上的碳原子由于周围强电负性的氮原子的存在而非常容易受亲核试剂 的进攻，因此亲核性的载色体分子很容易进攻其中的碳原子，由此可衍变生成双 氯三嗪染料( 1 4 b ) 和单氯三嗪染料( 1 4 c ) 。两个双氯三嗪染料可以通过一个双官 能团相连成一个双三嗪环基团的染料分子( 1 4 d ) 。还有一些其它类型的三嗪染 料。其中，r e m a z o l 系列染料虽然没有三嗪环，但也被证明对蛋白具有亲和作 用。 掌r 鄢 影 f 交 彻b 、洲删2 码 图1 4 三嗪染料 ( a ) 三聚氰氯；( b ) p r o c i o n 姒( i c i ) ；( c ) c i b a c r o n ( c i b a - g e i g y ) 和p r o c i o n h ( i c i ) 系列染料；( d ) p r o c i o nh - e ( i c i ) ；( e ) 单氟三嗪染料( c i b a - g e i g y ；( f ) 三氯嘧啶染料( s a n d o z ) ；( g ) 二氟单氯嘧啶染料( s a n d o z ) ；( h ) r e m a z o l 系列染料 ( h o e c h s t ) 。 1 2 什y 讳 呻 霭 第一章文献综述 1 3 2 染料亲和色谱的应用与发展 染料配基亲和色谱的发展始于七十年代初期，人们偶然发现很多蛋白质在蓝 色葡聚糖色谱柱上的性能有明显的差异m 1 ，推测是因为蛋白与染料发生了类似于 生物大分子与其相应生物配基之间的亲和作用；研究表明某些活性染料与载体共 价结合后能够分离纯化许多蛋白质。于是，以染料作为配基的染料亲和色谱很快 被人们所认识并得到了广泛的应用。在染料配基的基础上，针对其选择性较差的 问题，人们又在染料其原有结构上定向改造使其更接近于天然生物配基，增强其 对目标蛋白的亲和性，于是仿生染料又成为染料亲和色谱的一个新应用。 n i e m 等人将c i b a c r o nb l u ef 3 g a 键合到涂敷了壳聚糖的尼龙亲和膜上，探 讨了木瓜蛋白酶的吸附特性，并对其进行分离纯化。 s m a l l 1 将p r o c i o nb l u e 呶一r 键合到制各级硅胶上，应用于大规模纯化 l d h ( l - 乳酸脱氢酶) ，还利用b l u es e p h a r o s ec l 一6 b 从厌氧极端嗜热菌中分离出 n a p d + 偶联的乙醇脱氢酶。另外，还有利用c i b a c r o nb l u ef 3 g a 和p r o c i o ny e l l o w 瞰4 g 从鼠肌肉中分离纯化出l d h 及丙酮酸激素的报道“”。 k a t s o s 等人研究了链霉菌谷氨酸氧化酶( g o x ) 与三种染料葸醌仿生染料 b m i 。三嗪染料p r o c i o ny e l l o w ，t u r q u o i s e 麟_ g 之间的亲和作用，从分子模型、 动力学、吸附平衡和亲和色谱分析等方面进行了研究，建立了能够保持高活性和 高回收率的g o x 分离纯化的基本模型。 r u c k e n s t e i n 等”制备了c i b a c r o nb l u ef 3 g a ，p r o c i o nr e db e 一3 b 和 p r o e i o nb l u em ) ( 一r 三种染料结合的大孔壳聚糖膜，并用人血清和牛血清作为 标准蛋白对其吸附能力作了比较。实验得出c i b a c r o nb l u ef 3 g a 染料结合的 壳聚糖膜比其它两种膜对蛋白的吸附能力都要强很多，用其可从人血浆中分离 出高纯化的人血清蛋白。 c l o n i s 等嘲在c i b a c r o nb l u ef 3 g a 和v i l m a f i xb l u ea - r 的基础上模仿 l 一乳酸脱氢酶的底物和抑制剂的结构合成相应的仿生染料，将其固定到交联琼 脂糖u l t r o g e la 6 r 上做成仿生染料亲和色谱。应用于从牛心粗提取物中分离 l 一乳酸脱氢酶，研究表明改进后的仿生染料要比相应的原染料有更高的纯化能 力。 h a n d a ny a c u z ，s i n a na k g o l 嵋3 1 等将活性染料g r e e nh e 4 b d 接在自制的粒径 第一章文献综述 为1 5 0 - 2 0 0 p m 的聚合物微球p o l y ( 咿m a ) 上，发现该染料亲和吸附剂对免疫球 蛋白( i g g ) 中的i g g ：有较强的吸附作用，同样应用在人血浆中白蛋白的分析中， 对i g g ：的吸附量是i g g 。、i g g ，和i g g 。的1 0 倍。 因此，染料亲和色谱成为分离纯化蛋白质的一种有力工具。 1 4 高效亲和色谱 1 9 7 8 年，o h l s o n 等”1 提出了高效亲和色谱的概念，将高效液相色谱与亲和色 谱两种色谱模式有机地结合起来，大大提高了亲和色谱的分离效率。目前，大部 分的高效亲和色谱柱以硅胶或有机聚合物作为基质材料通过连接各种亲和配基 对生物大分子进行分离纯化。 l u i sa j u r a d o 嘲，用填装好的二醇硅胶做基质，通过c n b r 和三乙氨的流动 激发，分别鳌合上d n a ，辛巴蓝，蜂毒素制备成高效亲和色谱。分别用来