（环境工程专业论文）混合菌的构建及其对硝基苯的好氧生物降解.pdf

大连理工大学硕士学位论文 摘要 本论文研究的目的是考察三株硝基苯降解菌降解硝基苯的特性；利用三株硝基苯降 解菌构建混合菌，考察混合菌处理硝基苯废水的降解特性，并结合固定化技术对混合菌 进行了吸附固定化研究；针对实际工业废水高冲击负荷和水力负荷、高盐度以及与其他 有机物共存的特点，对该混合菌的实际应用前景进行了初步评估。 选取d w - 2 2 型聚氨酯泡沫载体对1 0 、2 0 和3 菌进行固定化。三株固定化菌降解硝 基苯的条件为：载体投加量均为5 1r a g h a ；温度：3 0 、3 0 和2 5 ；p h 均为7 o ； 摇床转速均为1 5 0r r a i n ：接种量分别为：6 m g l 、1 0 m g l 和6 m g t , 。与游离茵相比， 固定化菌的耐热性、耐酸碱性和耐毒性均得到提高。消除剂s d s 对3 菌株质粒能够部 分消除，消除质粒后的菌株对抗生素的抗性及有机物降解能力都明显下降，表明质粒与 菌株生长特性的变化有一定的相关性，可能携带与有机物降解相关的基因。 通过正交实验，得到1 0 、2 0 和3 0 菌混合的最佳配比为1 ：3 ：3 ( 干重) ，构建了混 合菌。混合菌降解硝基苯的最佳条件为：3 0 ，p n 7 0 ，1 5 0r m i n ，接种量1 0r a g l ： 与3 株单菌相比，混合茵能够在较为苛刻的环境条件下降解硝基苯，具有较宽的底物范 围；同时结合实际硝基苯工业废水特点，考察了在高盐度以及苯酚、苯胺与硝基苯共存 时混合菌对硝基苯的降解。结果表明：混合菌具备较强的耐盐能力，可在3 的高盐条 件下有效降解硝基苯；当苯酚( 1 0 0 m g l ) 或苯胺( 5 0 m g l ) 和硝基苯( 2 0 0 m g l ) 共 存时，混合菌对硝基苯的降解不受影响。 固定化混合菌降解硝基苯的最佳条件为：接种量8m g l ，温度3 0 ，p h 7 0 ，摇床 转速1 3 0r r a i n ，其对硝基苯的降解速率和耐受能力均得到提高。固定化混合菌对硝基苯 ( 苯胺 苯酚。生物强化实验表 明，游离态强化系统和固定化强化系统均可以将系统启动时间缩短1 0 天。投加量为 9 3 2 的游离菌强化系统处理效果稳定，连续运行3 4 天降解率维持在8 5 以上，游离菌 强化系统抗冲击负荷能力更强。 混合菌的构建及其对硝基苯的好氧生物降解 关键词：硝基苯；微生物；聚氨酯泡沫；固定化技术；苯酚；苯胺；盐度 大连理工大学硕士学位论文 t h ed e f i n a t i o no f m i c r o b i a lc o n s o r t i u ma n di t sa e r o b i cb i o d e g r a d a t i o n o f n i t r o b e n z e n e a b s t r a c t 1 1 1 ep u r p o s eo ft h i sd i s s e r t a t i o ni st oi n v e s t i g a t et h ed e g r a d a t i o nc h a r c t e r i s t i c so f3s t r a i n s w h i c hc o u l dg r o wo nn i u - o b c n z c n ca si t ss o l ec a r b o ns o u r ad e f m e dm i c r o b i a lc o n s 矾u m w 码c o n s t r u c t e dt h r o u g ho r t h o g o n a l “p e 血嘣啦b ) ru s i n gl 。，少a n d3 。n ed e g r a d a b i l i t ya n d i m m o b i l i z a t i o nb ya d s o r b e di np o l y u r e t h a n ef o a mw a ss t u d i e d a sf a ra st h ec h a r a c t e r i s t i c so f t h er e a ln i l r o b c n z e n ew a s t e w a t e ra c o n c e r n e d , t h ed e g r a d a t i o no fn i l r o b e n z e n eu n d e rh i g h s h o c k - l o a d i n g sa n dh y d r a u l i cl o a d i n g sa n di nh i g hs a l i n i t yo ri nt h ep i 懿黜o f o t h e ro r g a n i c c o m p o u n d s ( p h e n 0 1 a n i l i n eo rp h e n o l a n da n i l i n e ) w a sc a r r i e do u tt oe v a l 眦t h e p e r s p e c t i v e so fa p p l i c a t i o n s i tp r o v i d e dt h et h e o r e t i c a le v i d e n c ef o rt h ed e g r a d a t i o no f n i t r o b e n z e n e t h ep o l y u r e t h a n ef o a mo fd w - 2 2w a ss e l e c t e da st h ei m m o b i l i z e dm a t e r i a l ，t h eo p t i l l l a l c o n d i t o n sf o rn i t r o b e n z e n ed e g r a d a t i o nb yp o l y m - e t h a n e - f o 锄- i m m o b i l i z e dc e l l s 矾嬲 f o u o w c d ：a m o u n t so fc a r r i e r ：5 1m g n l l ；t e m p e r a t u r e ：3 0 ，3 0 a n d2 5 ；p h7 0 ； s h a k i n gv e l o c i t y 1 5 0r r a i n , i n n o c l ：t l a6m g ，l ，1 0m g la n d6m g l ，r e s p e c t i v e l y 1 1 l e h e a t - r e s i s t a n t , t o l e e r a n c 七o fh i g h 硫ic j _ t ya n dp ho ft h ei m m o b i l i z e dc e l l sw m e n h a n c e d c o m p a r e dt of r e e l ys u s u p c n d c dc e l l s t h er e s u l t sa l s oi n d i c a t e dt h a ts d sc o u l dl e m o v e p a r t i a l l yt h ep l a s m i d 1 1 地a n t i b i o t i cc a p a b i l i t yo f t h e s t r a i nd e c r e a s e da f t e rt h ep l a s m i dc u r i n g ， a n ds od i dt h ed e g r a d i n gc a p a b i l i t ya l s od e c r e a s e d , 咏t u r i n gt h a tt h ep l a s m i dw a sr e l a t e d d e f i n i t e l yt ot h eg r o w t hc b a 哺c k 墙o ft h eb a c t e r i as t r a j n w i t hp o s s i b l yt h er e l a t i v eg l u eo f o r g a n i s md e g r a d a t i o n ad e f i n e dm i c r o b i a lc o n s o r t i u mw a sc o n s t r u c t e dt h r o u g ho n l l o g o n a le x p e r i m e n t sb yu s i n g o f s t r a i n l 4 ? a n d3 4 mo p t i m a lr a t i oo f l 4 t 0 2 。t o3 。w a s l ：3 ：3 mo p t i m a lc o n d i t o n s f o r t h en i t r o b c n z c n cd e g r a d a t i o nb yt h ec o n s o r t i u mw 讹丛f o l l o w e d ：t e m p c r a t u r e3 0 。p h 7 0 ， s h a k i n gv e l o c i t y 1 5 0r m i n ，i n n o c u l a1 0m g l c o m p a r e dt o3p u r es t r a i n s ，t h ec o n s o r t i u m d e g r a d e dn i 缸 o b e n z e n eu n d e rs c v e 犯c o n d i t i o n sa n dh a daw i d e rs u b s t r a t e sr a n g e 1 1 把 c o n s o r t i u md e g r a d e dn i t r o b e n z e n ee f f e c t i v e l yi nh i g hs a l i n i t yo f 3 a c l ) t h ed e g r a d a t i o n o fn i t r o b e n z e n e ( 2 0 0m g l ) b yt h ec o n s o r t i mw a sn o ti n f l u e n c e di nt h ep r o f1 0 0 m g lp h e n o lo r5 0m g la n i l i n e 一i i i - 混合菌的构建及其对硝基苯的好氧生物降解 1 1 把o p t i m a le o n d i t o n sf o rt h en i t r o b e n z e n ed e g r a d a t i o nb yt h ei m m o b i l i z e dc o l l s o f t i l n l l w c l e 笛f o l l o w e d ：t e m p e r a t u r e3 01 2 ，p h 7 0 ，s h a k i n gv e l o c i t y1 3 0r r a i n , i n n o e u l a8m e , l 1 kn i t r o b c n z e n ed e g r a d a t i o np r o c e s ss h o w e dt h a tt h ed e g r a d a d o - e f f i c i e n c yo fi m m o b i l i z e d c o n s o r t i u mw a sa p p a r e n t l ys u p e r i o rt ot h a to ff r e es u s p e n d e dc e l l s t h ed e g r a d a t i o no f n i t r o b e n z e n ef o l l o w e dt h em o d e lo ff i r s to r d e rr e a c t i o nk i n e t i c sw h e nt h ei n i t i a lr t i t r o b e l l z e n e e o n e e m t i o n sw 撇l o w e rt h a n1 1 2 1 8m g l u n d e rt h eo p t i m a le o n d i t i o m ，t h ed e g r a d a t i o n k i n e t i c so fi m m o b i l i z e dc e l l sw a sf i tw e l lw i t l aa n d r e w sm o d e lw i t hg = 1 1 8 4 5 1 h , k r = 2 5 4 6 4 6 4m g ，l ，k i = 1 2 9 1 5 7 0m g l ，r e s p e c t i v e l y d u r i n gs e m i - c o n t i n u o u sd e g r a d a t i o ni n t h es h a k e nc u l t u r e ，t h ei m m o b i l i z e dc e l l sc o u l dd e g r a d en i t r o b e n z e n eo v e i l o n gp e r i o d so f1 0 0 a n d5 7d a y sw i t h o u tl o s i n gt h ed e g r a d 崦- a c t i v i t ya tt h ei n i t i a le o n e e n t r a t i o m2 0 0m g ，la n d 4 0 0 m e e k ，r e s p e c t i v e l y t h ei m m o b i l i z e d c e l l sc o u l dt o l e r a n th i g h 盯n i t r o b e n z c n e s l a o e k - l o a d i n g sb ye o n l l a s tw i t hf r e e l ys u s p e n d e dc e l l s ，a n dc o u l dd e g r a d a t i o nn i t l o b e n z e n e ( 2 0 0m e l ) i n5 鞠l i n i t yw i t h o u ti n h i b i t i o n f u r t h e r m o r e d e c r e a s e dp e r f o r m a n c e0 1 1t h e d e g r a d a t i o no fn i t t o b c n z e n eb yt h ei m m o b i l i z e dc e l l si nt h ep r e s e n c eo fp h e n o l ，a n i l i n e0 1 p h e n o la n da n i l i n ew a sa c h i e v e d 1 tc a l lb ec o n c l u d e dt h a tt h ep r e s e n c eo f p h e n 0 1 a n i l i n eo r p h e n o lp l u sa n i l i n ei n h i b i t e dt h ed e c o m p o s i t i o no f n i t r o b e n z e n ei nt h es e q u e n c e ：p h e n o lp l u s a n i l i n e a n i l i n e p h e n 0 1 t h u s m o l ee 佑e i e n td e g r a d a t i o ao fn i t r o b e n z e n ec o u l db e a c h i e v e db yi m m o b i l i z e dc e l l sa n dt h ei m m o b i l i z e dc e l l sm i g l l tb es u p e r i o r i t yt or e m o v e n i t r o b e n z e n ei np r a c t i c a lw a s t c w a t 盯t r e a t m e n ts y s t e m t h er e s u l t sd e m o n s l r a t et h a tt h e s y s t e m 谢出9 3 2 i a o e t t l u m sh a st h es t r o n g e s tr e m o v a le f f l e i e n e y d m - i n g3 4d a y so p e r a t i o n , t l a ed e g r a d a t i o ne f f i e i e n e ym a i n l a i mm o t l ot h a n8 5 ： k 。yw o r ( i b ：n i t r o b e n z e n e ；b i o m i e r o g r a m s ； a n i l i l 瑜s a l i n i t y 1 1 一 独创性说明 作者郑重声明：本硕士学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作及取得研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外， 论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得大连理 工大学或者其他单位的学位或证书所使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意 作者签名：翻江日期：筮o l 大连理工大学硕士学位论文 大连理工大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解“大连理工大学硕士、博士学位 论文版权使用规定”，同意大连理工大学保留并向国家有关部门或机构送 交学位论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连理 工大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，也 可采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。 作者签名：圣塑 导师签名垂盈 _ 2 z 避年_ 2 月- j l e t 1绪论 1 1硝基苯的危害性及其硝基苯废水的处理方法 1 1 1硝基苯的环境危害 硝基苯为一种淡黄色透明油状液体，有苦杏仁味，微溶于水，易溶于苯、乙醇、乙 醚等大多数有机溶剂。遇明火、高热会燃烧、爆炸，与硝酸反应剧烈。硝基苯是一种重 要的有机合成中间体，主要用于合成苯胺，也是制造n 盯、染料及染料中间体的重要原 料，而且在医药、农药、香料等工业中具有重要用途，可通过废水废气或因贮运、生产 过程中的意外事故和贮存器罐的不当处置而大量进入环境。硝基苯在水中具有极高的稳 定性。由于其密度大于水，进入水体的硝基苯会沉入水底，长时间保持不变。又由于其 在水中有一定的溶解度，所以造成的水体污染会持续相当长的时间。硝基苯是高毒性物 质，具有“三致”效应，危害人体健康，可引起高铁血红蛋白血症、溶血和肝损害。由 于其生物毒性，硝基苯被列入世界环境优先控制有毒有机污染物的名单前列。表1 1 给出了硝基苯的物理化学性质和环境参数。 表1 1 硝基苯的物理化学性质及其环境参数 t a b 1 1t h ee n v i r o n m e n t a lp a l a m c g l so f n i n o b e n z e n e 1 1 2 硝基苯废水的物理、化学处理方法 目前，国内外硝基苯污染废水的治理方法主要有物理法、化学法和生物法。物理和 化学法处理硝基苯废水的研究一直受到人们的重视，并取得了较为满意的效果。徐中其 等【1 】采用活性碳纤维( a c f ) 作为新型吸附剂对硝基苯废水进行了研究，试验表明：a c f 不但吸附量较大，而且吸附速度极快，在高温再生过程中，碳纤维有序微晶结构可发生 重新刻蚀，形成新的微孔，增大了比表面积，进一步提高了吸附量。张全兴等【2 】采用 混合菌的构建及其对硝基苯的好氧生物降解 c h a - 1 1 l 树脂吸附含硝基苯生产废水，发现废水中的p h 对c h a - 1 1 1 树脂吸附性能的 影响很小；当废水中硝基苯类化合物的初始浓度为6 3 9m g l 时，经处理后浓度小于5 m g l ，表明该树脂吸附性能良好。n a k a it o s h i l d r o 等 3 1 用超临界c 0 2 萃取硝基苯废水。 在温度为3 5 ，压力为1 0m p a 的条件下，将硝基苯浓度为4 0 0m g l 的废水与超临界 c 0 2 接触，硝基苯去除率达到1 0 0 。林忠祥等 4 1 采用萃取汽提法处理含硝基苯2 0 0 m g l 、苯胺3 0m g l 的废水，处理后的废水达到国家二级排放标准。 化学氧化法是处理硝基苯废水的一种常用方法。前几年国内外采用的化学氧化法用 的最多的氧化剂是臭氧。臭氧氧化硝基苯废水的特点是反应速度快、去除率高，但臭氧 溶水性差。k g l l l l aa s i m 等【5 】人采用膜反应器多相臭氧化硝基苯等有机污染物解决了这 一问题，使得反应速度大大加快。但仅采用臭氧处理废水的缺点是耗电量大、成本较高 此外，臭氧气体有毒，当质量浓度达到一定量时容易导致人类死亡。近年来，高级化学 氧化技术取得了较大的进展。高级化学氧化( a o p s ) 技术是利用复合氧化剂，或在光 催化条件下，或通过非均相催化途径不断产生具有极强氧化能力的h o 自由基，该自由 基几乎可以无选择的与任何有机物发生反应，并将其直接氧化为二氧化碳、水和矿物盐， 不会产生任何中间产物。 常用的高级化学氧化技术有：均相催化氧化技术、光催化氧化技术、非均相催化氧 化技术等。e c h a m a r r o 等旧用低剂量的f e n t o n 试剂预氧化提高硝基苯废水的可生化性。 实验结果表明，影响硝基苯可生化性和降解率的主要因素为h 2 0 2 的用量，而f e 2 + 的用量 主要影响反应动力学。f e n t o n 试剂作为一种强氧化剂，在投加量足够的情况下可使硝基 苯氧化分解，但处理成本较高，难于实际应用，采用f e n t o n 试剂预氧化一生物处理联用 法净化硝基苯工业废水，可降低处理成本。 超临界水氧化技术是近年来迅速发展起来的一种处理有机废水的高新技术，其原理 是在超临界水中将有机污染物氧化为二氧化碳和水。将有机废水加温、加压至超临界状 态，有机物和氧气充分溶解于超临界水中，反应不受相间传递及氧浓度的限制，同时高 的反应温度和压力也使反应速率大大加快，短时间内有机物可被完全去除。赵朝成等【7 】 将这项技术应用于硝基苯废水的处理中，在温度3 9 0 、压力2 8m p a 条件下，当硝基 苯初始浓度为2 5 0 0m g l 时，1 0r a i n 钟后硝基苯去除率可达9 9 9 。 非平衡等离子体技术也是在环境领域中日益受到重视的一项高新技术。电子束技 术、电子锤技术、汽液混合体脉冲电晕技术等都展现了良好的应用前景。朱先军等 8 1 考 察了p d g c 电极在酸性条件下的硝基苯电化学机理，研究表明，玻璃碳( c j c ) 对硝基 苯的电还原有很高的催化活性。李劲等唧利用电流体直流放电降解水中的硝基苯，当硝 基苯初始浓度为5 0m 盯，、电压4 0k v 时，经过两次放电，总降解率可达8 0 0 0 。 1 1 3 硝基苯废水的生物处理方法 物理、化学法处理硝基苯废水虽然具有处理效率高、处理工艺相对简单等优点，但 是存在处理成本高、容易造成二次污染、反应条件较为苛刻等缺点，因此给实际工程应 用带来了困难。生物法处理废水是一种应用最为广泛的方法，也是目前应用最为成熟的 方法。生物法具有处理成本低、运行管理简单、没有二次污染、处理效果显著等特点。 因此，生物法成为处理有机污染废水的理想方法。 硝基苯废水的生物处理法可分为厌氧法和好氧法。厌氧条件下硝基苯较易被还原为 苯胺，苯胺又可以进一步被彻底矿化。与厌氧法相比较，好氧条件下硝基苯可直接矿化， 因此近年来已引起人们的关注，并且分离筛选出许多好氧硝基苯降解茵( 如表1 2 所示) 。 目前，好氧降解硝基苯的微生物资源有原核生物和真核生物，其中原核生物主要为 细菌，真核生物主要为白腐菌。如表1 2 所示，这些微生物可在好氧条件下以硝基苯为 唯一氮源，唯一碳源和能源或唯一碳、氮、能源进行生长、繁殖，从而降解硝基苯。蔡 邦成等【j 8 1 从南京化工厂下水道底泥和废水处理系统曝气池活性污泥中驯化分离得到一 株能快速降解硝基苯的不动杆菌。该菌株降解硝基苯的最适宜环境条件为温度2 5 - 3 5 ，p h t - 8 ，振荡速率大于1 2 0r m i n 。在适宜环境条件下，该菌株能够在2 4h 内全部降 解初始浓度不超过4 0 0m g l 的硝基苯。韦朝海等【1 川分离筛选出3 株硝基苯好氧为降解 细菌：b a c i l l u ss u b t i l i s ，p s e u d o m o n a sm e n d o c i n a 和k l e b s i e l l ap e n u m o n i a e 。这3 株菌均 能以硝基苯为唯一的碳、氮和能源，其中b a c i l l u s s u b t i l i s 的降解活性最高，当硝基苯初 始浓度为2 0 0m g l 时，1 4 5h 硝基苯可被完全降解；将三株菌混合，硝基苯完全降解的 时间缩短至1 2 0h ；b a c i l l u ss u b t i l i s 在p h 值5 0 - - 8 0 ，温度3 0 - 4 0 的条件下有较好的生 长。李明堂等l l 川以长期受硝基苯污染的土壤和某化工厂污水处理厂曝气池活性污泥、捧 污口底泥为混合茵源，采用硝基苯浓度梯度增加的好氧振荡瓶法进行降解菌的驯化与富 集培养，分离和纯化出1 株能以硝基苯为唯一碳源、氮源和能源的细菌，初步鉴定为芽 孢杆菌属。该菌株降解的最适温度为3 0 - 3 5 ，p h 值7 5 8 0 ，摇床速度为1 5 0r m i n 。 菌株在硝基苯初始浓度为1 0 0m g l 的营养盐液体培养基中培养6d 后，硝基苯被完全降 解，降解过程中无苯胺的积累。此外，在硝基苯浓度低于1 0 0 0m g l 条件下降解动力学 符合零级反应动力学。 一3 一 混合菌的构建及其对硝基苯的好氧生物降解 表1 2 好氧降解硝基苯的微生物资源 t a b 1 2 m i c r o o r g a x d s m s c a p a b l eo f d e g r a d i n g n i 仃o b e n z c n e 岫d 盯a e m b j cc d i n o 璐 一4 一 大连理工大学硕士学位论文 王竞等u 5 1 分离筛选出一株在好氧条件下以硝基苯为唯一碳、氮、能源的细菌 p s e u d o m o n a ss p j x l 6 5 。该菌对硝基苯的最大耐受浓度为8 0 0m g l ，当硝基苯初始浓度 为2 0 0m g l 时，6 0h 内硝基苯可被完全降解；该菌的最佳生长条件为：p n 值6 0 - 7 0 ， 温度3 0 - 3 5 。s j n 等【1 4 , 2 0 分离筛选出能够好氧降解硝基苯的细菌：p s e u d o m o n a s p s e u d o a l c a l i g e n e $ j s 4 5 和c o m a m o n o ss p 7 6 5 ，当硝基苯初始浓度为2 0 0m g n 时，2 4h 内这两株菌均可完全降解硝基苯；这两株菌的最佳生长条件均为p h 值7 0 ，温度3 0 王庆生等【2 l 】利用白腐菌对硝基苯类化工废水进行了好氧生化降解实验研究。在常温( 2 5 ) ，p n 值为7 0 ，进水c o d c ，为2 0 0 0m g ，l ，硝基苯类进水质量浓度为1 0 0m g l ，停 留时间为6 0h 的条件下，c o d c ，降解率达到9 9 0 , 4 。l e v i n 等p 2 将白腐菌t r a m e t e st r o g i i 好氧培养4 天后，培养液中含有由t r a m e t e sf r p 鲥产生的漆酶，接入初始浓度2 0 0 - - 5 0 0 m g l 的硝基苯，1 扣2 4 天硝基苯去除率达9 0 以上。张学才等【1 7 1 将白腐菌好氧培养4 天后，接入初始浓度1 5 0m g t , 的硝基苯，7 2h 硝基苯去除率为8 6 以上。白腐茵独特 的细胞外解毒机制使得它能承受并降解相当浓度的有毒物质，尤其对多环芳烃( p a h s ) 的降解，白腐菌在水污染治理中有广阔的应用前景。 1 2 硝基苯的生物好氧降解机理 硝基苯属于生物难降解物质，这是由于硝基的吸电子效应导致苯环上电子云密度下 降从而阻碍了氧化酶的亲电进攻】。虽然硝基苯难以生物降解，然而在过去的几十年里， 大量可好氧降解硝基苯的微生物被分离筛选，硝基苯的好氧生物代谢途径也被研究。一 般而言，好氧条件下，硝基芳香类化合物的代谢途径可分为两类，即好氧途径和还原途 径。 1 2 1 硝基苯的氧化途径 n i s h i n o 等i 硎对菌株c o m a m o n a ss p j s 7 6 5 在好氧条件下降解硝基苯的途径进行了研 究。图1 1 显示了菌株j s 7 6 5 对硝基苯的氧化降解途径。菌株降解硝基苯的第一步反应为 氧化反应，在双加氧酶( d i o x y g e n a s e ) 的催化下硝基苯的1 ，2 位氢受到攻击生成邻苯二酚 ( c a t e c h 0 1 ) ，硝基从苯环上脱除，并释放出亚硝酸盐；接着邻苯二酚再在邻苯二酚2 3 双加氧酶的催化下发生间位开环( o m a o d i o lf i s s i o n ) 生成m d s ；i - i m s 在脱氢酶和水解 酶的作用下进一步催化降解。 一5 一 混合菌的构建及其对硝基苯的好氧生物降解 o y g h 儿茶酚 2 羟基粘康酸半醛 h o b o h b o h 图1 1 菌株j s 7 6 5 对硝基苯的氧化降解途径 ( 1 ：硝基苯l ，2 双加氧酶；2 ：邻苯二酚2 ，3 双加氧酶；3 ：2 羟基粘康酸半醛水解酶； 4 ：2 掘基粘康酸半醛脱氢酶) f i g 1 1t h ep r o p o s e dp a t h w a yf o ro x i d a t i v ed e w a d a t i o no f n i t r o b e n z e n eb ys t r a i nj s 7 6 5 ( 1 ：n i l 口o b e n z e n e - 1 ，2 - d i o x y g e n a s e ；2 ：c a t e c h o l - 2 ，3 - d i o x y g e n a s e ；3 ：2 - h y d r o x y m u c o n i cs e n a a l d e h y d e h y d r o l a s e ；4 ：2 h y d r o x y m u c o n i cs e m i a l d e h y d ed e h y d r o g e n e ) i , e s s n e r 等【2 5 】研究了菌株c o m a m o n a ss p j s 7 6 5 降解硝基苯酶系中的第一步反应酶 - n b d o 双加氧酶的基因编码。n b d o 是由还原酶( r e d 咖) 、铁氧化还原蛋白 ( f e r r e d o x i n 栅z ) 、加氧酶( o ) 【y g e 9 e n b 孙) 和加氧酶( o x y g e n a s e n b n ) 组成，相应的 基因码为n b z a a ，n b z a b ，n b z a c 和n b z a d 。序列分析表明，n b d o 和萘的离子加氧酶( 特 别是舟e u d o m o n a ss p s t r a i nj s 4 2 的2 硝基甲苯双加氧酶) 具有很高的同源性。n b d o 是 萘加氧酶系中首个能够氧化一硝基和二硝基甲苯，并且释放亚硝酸盐的双加氧酶。 硝基苯 罐l 儿茶酚 图1 2n 】如d 加氧酶催化分解硝基苯 f i 9 1 2 d i o x y g e m t i o n o f n i 仃o b e n z e n ec a t a l y z e d b y n b d o - 6 0 咖 卜 产 6 大连理工大学硕士学位论文 l l 图1 3p s e u d o m o n a s p s e u d o a l e a l i g e n e sj s 4 5a n dc o m m n o n a ss p j s 7 6 5 降解硝基苯途径比较 f 培1 3c o m p a r i s o no f t h en i u o b e n z e n ed e g r a d a t i o np a t h w a y si np s “d 咖o n 笛p s e u d o a l c a l i g e n e sj s 4 5 a n dc o m a m o n a s s p j s 7 6 5 l ：l l j 订o b c l l 珊e ，2 ：h y d a o x y a m i n o b e n z e n e ，3 ：2 - a m i n o p h e n o l ，4 ：2 - a m i n 伽u c o i l i cs e m i a m e h y d e 5 ： 2 - a m i n o m u c o n a t e ，6 ：2 - o x o - 3 一h e x e n e l ，6 - d i o a m ，7 ：2 - o x o - 4 - p e n t e n o a t e ，8 ：4 - h y d r o x y - 2 - o x o v a l e r a t e , 9 ：a c e t a l d e h y d e ，l o ：p y m v a t e ，1 1 ：c a t e c h o l ，1 2 ：2 2 - h y d r o x y m u c o n i c s e m i a l d e h y d e ，1 3 ：2 - h y d r o x y m u c o n a t e 。 1 4 ：2 - h y d r o x y - 2 , 4 p e n t a d i e n o a t e ；1 5a n d1 6a r ei s o m e r s a ：n i t r o b e n z e n e n i t r o r e d u c t a s e ，b ：h y d r o 圳- a m i n o b e n z e n em u t a s e , c ：2 - a m i n o p h e a o l1 , 6 - d i o x y g e n a s e ( a m n b a ) g ：c a t e c h o l 2 , 3 - d i o x y g e n a s e , d ：2 - a m i n o m u c o n i c s e m i a l d e h y d ed e h y d r o g e n a s e ( a m n c ) ，h ：2 - h y d r o x y m u c o n i cs e m i a l d e h y d e d e h y d r o g e n a s e ，e ：2 - a m i n o m u c o n a t ed e a m i n a s e ，i ：4 - o x a l o c r o t o n a t et a u t o m e r a s e ，j ：4 - o x a l o c r o t o n a t e d e c a r b o x y l a s e , k ：2 - o x o - 4 - p e n t e n o a t eh y d r a t a s e ，l ：4 - h y d r o x y - 2 - o x o v a l e r a t ea l d o l a s e 。f ：n i t r o b e n z e n e d i o x y g e n a s e , a n dm ：2 - h y d r o x y m u c o n i cs e m i a l d e h y d eh y d r o l a s e 一7 一 混合菌的构建及其对硝基苯的好氧生物降解 图l - 4 硝基苯双加氧酶( n b d o ) 的结构( a ) n b d o 的a 炳俯视图；( b ) a p 侧视图； ( c ) n b d 0 ( 浅褐色和棕色) 、n d o ( 青绿色) 和b p h a l a 2 ( 樱桃色) 的结构差异 f i g 1 4 t h eo v e r a l ls t z u c t u r eo f n b d o t h er i e s l 【2 f e - 2 s 】a n dt h em o n o n u c l e a ri r o na ms h o w ni nc p k m o d e lr e p r e s e n t a t i o n ( i r o ni sr e da n ds u l f u ri so r a n g e ) ( a ) t o pv i e wo f t h e “3 融h e x a m e r t h eas u b u n i 协a l e c o l o r e di nb e i g e ，b l u ea n dp i n k s i d ev i e wo f o n ea bl 蛳r o d i m e r t h eas u b u n i ti sc o l o r e db e i g e ，t h eb s u b u a i ti sb r o w n r o m a dn u m b e mi n d i c a t es t r u c t u r a ld i f f e r e n e e sb d - w 啪n b d o ( c o l o r e db e i g ea n d b r o w ) 。n d o ( t u r q u o i s e ) a n db p h a i a 2 ( c e r i s e ) w h i c ha 坤由a o w ni n ( c ) t h ep i 曲i 聆哪m a d eu s i n g p y m o l ( b t t p ：w w w p y m 0 1 o r o d a v i s 闭比较了菌株两a i 面棚d 旭，p s e u d o a l c a l i g e n e sj s 4 5 和c o m a m o n a ss p j s 7 6 5 蹙j 硝基苯的降解途径。如图1 3 所示，虽然硝基苯的两种降解途径在初始时完全不同，但是 p s e u d o m o n a sp s e u d o a l c a l i g e n e sj s 4 5 郇j 2 - 氨基酚脱氨酶与儿茶酚问位开环的4 草酰丁烯 酸异构酶酶催化反应极其相似，这一过程中相应的酶系已被纯化，并对其物理、生物化 学特性进行了表征。生物化学特性及蛋白质序列分析显示，2 氨基粘康酸半醛脱氢酶和 一8 一 大连理工大学硕士学位论文 儿茶酚间位开环的2 氨基粘康酸半醛非常相似。通过对p s e u d o m o n a sp s e u d o a l c a l i g e n e s j s 4 5 菌株2 氨基1 。6 双加氧酶和2 氨基粘康酸半醛脱氢酶基因码的确定。及其对这两种 酶在 s e u d o m o n a sp s e u d o a l e a l i g e n e sj s 4 5 和c o m a m o n a ss p j s 7 6 5 降解2 一氨基酚和儿茶酚 过程中的比较，为硝基苯降解过程中2 氨基酚开环这一步骤提供了有利的证据。 f d e m a n n 等1 2 7 1 研究了菌株c o m a m o n a s 印j s 7 6 5 的硝基苯双加氧酶( n b d o ) 系，并 确定了n b d o 的结构，指出n b d o 双加氧酶的结构类似于r d o s ( r i e s 1 【en o n - h e i n ei r o n d i o x y g e n a s e s ) ，它的催化亚基由一个f e s 中心和一个金属原子的活性部位组成。 图1 5 n b d o 活性位电子密度图 f 嬉1 5 1 e e e l e c t r o n d e n s i t y 唧i n t h e a c t i v es i t e o f n b d o n b d o 的结构如图1 4 所示，与萘双加氧酶( n i x ) ) 和联苯双加氧酶( b p