（食品科学专业论文）生姜蛋白酶的提取及其在牛肉嫩化中的应用研究.pdf

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关键词：生姜蛋白酶；牛肉；提取；嫩化 生姜蛋白酶的提取及其在牛肉嫩化中的应用研究 a b s t r a c t ln e wm e t h o do f e x t r a c t i n go fg i n g e rp r o t e a s ea n dd i f f e r e n c ea m o n gs p e c i e s t a k i n gf r e s hg i n g e r 笛t h em a t e r i a l ，n e wm e t h o do fe x t r a c t i n go fg i n g e r p r o t e a s ew a ss t u d i e db a s e do nu l t m t i o n c r i n g e rp r o t e a s em a i n l ye x i s t si nt h e d e n s ej u i e e ，a n dc a l lb ed e p o s i t e du n d e rd e f e c t i o no fa c e t o n e s i g n i f i c a n t l yo f i n f l u e n c eo fp ha n dv o l u m eo fa c e t o n eo nt h ed e p o s i t i o no fg i n g e rp r o t e a s e d i f f e r sa m o n gd i f f e r e n ts p e c i e so ff r e s hg i n g e r p r o p e r t yo fg i n g e rp r o t e a s e s h o w nt h r o u g he x t r a c t i n gd i f f e r sa m o n gd i f f e r e n ts p e c i e so ff r e s hg i n g e r t h u s i ts h o u l db ee x t r a c t e du n d e rd i f f e r e n tc o n d i t i o n s t h r o u g hf r e e z i n ga n dd r y i n g , t h eo u t p u tw a s0 6 ，m ep r o t e o l y t i ca c t i v i t yw a s1 2x10 3 u g 2 c h a r a c t e ro f g i n g e rp r o t e a s e c a s e i na ss u b s t a n c e ，t h eo p t i m u mp 8o fg i n g e rp r o t e a s ei s 5 5 ，t h e o p t i m u mt e m p e r a t u r ei s 6 0 e d t ac a na c t i v a t eg i n g e rp r o t e a s et os o m e e x t e n t t h ek mi s0 3 0 1 m m o l l a c i d i cc o n d i t i o ni sg o o df o rt h em a i n t e n a n c e o fa c t i v eo fg i n g e rp r o t e a s e 3t e n d e f i z a t i o no fg i n g e rp r o t e a s eo l lb e e f g i n g e rp r o t e a s ec a l lt e n d e r i z eb e e fs i g n i f i c a n t l y b a s e do nt h ea s s e s s m e n t o fs i n g l ef a c t o rt e s t , t h r o u g ht h eo r t h o g o n a le x p e r i m e n t , t h eb e s t t e c h n o l o g i c a l c o n d i t i o n so ft e n d e r i z a t i o no f b e e fb yg i n g e rp r o t e a s ea l e ：t h ec o n c e n t r a t i o ni s 0 0 6 ，p hi s7 0 ，t h et r e a t m e n tt e m p e r a t u r ei s5 0 c ，t h et r e a t m e n tt i m ei s 2 h n l ed e n s i t ya n dt e m p e r a t u r ei n f l u e n c et h er e s u l ts i g n i f i c a n t l y ；t h et i m ea n d p h i n f l u e n c et h er e s u l ti n s i g n i f i c a n t l y 4m e c h a n i s mo ft e n d e d z a t i o no f b e e fb yg i n g e rp r o t e a s e s g i n g e rp r o t e a s ec a l li m p r o v em f io fb e e f , l o wd e n s i t yo fg i n g e rp r o t e a s e c a nd e c r e a s et h ed i a m e t e ro fm y o f i b r i l ，h i 曲d e n s i t yo fg i n g e rp r o t e a s ec a l l i n c r e a s et h ed i a m e t e ro fm y o f i b r i l ，g i n g e rp r o t e a s ec a np r o m o t ep r o t e i no fb e e f d e t e r i o r a t ei n t os m a l lp i e c e s k e yw o r d s ：g i n g e rp r o t e a s e ；e x t r a c t ；b e e f ；t e n d e r i z a t i o n 2 玉东农鼗大学磺士学位论文 1 引言 1 1 生姜蛋白酶 生姜原产中国和东南亚热带地区，在我国栽培历史悠久，以广东、浙 江、安徽、山东、云南等省为主要产区。著名的品种有山东莱芜姜、广东 疏轮大魔姜、浙江红瓜姜和安徽铜陵皇姜等。生姜以肥大的离质根茎供食 用，含有芳香挥发油，可做香辛调料，又称植物味精，是重要调味品之一， 又是良好的健胃、祛寒和发汗剂。 生姜含挥发油0 2 5 3 。o ，主要成分为姜醇、姜烯、水芹烯、莰烯、 柠檬醛、芳樟醇、 甲基庚烯酮、壬醛、d 龙脑等。尚含辣味成分姜辣素， 分解则变成油状辣昧成分姜烯酮和结晶性辣昧成分姜酮、姜萜酮的混合 物。又含谷氨酸、天门冬氨酸、丝氨酸、营氨酸等。此外，尚含树脂状物 质及淀粉( 黄雪松，1 9 9 8 ) 。 生姜烹饪时能将自身的辛辣芳香渗入菜肴内，使味鲜清辣，能去鱼腥 除肉膻，是煎鱼、烧鸭的重要作料，在吃螃蟹、海鲜对蘸上姜末醋可解寒 尝鲜；对冰冻的肉食、海味、河鲜在加热前用姜汁浸泡可返鲜提味。姜还 可制成各种加工品，如糖姜片、蜜饯姜、五味姜、甜酱姜等，昧美适口。 既作食疗，又佐膳下饭。姜味辛辣性温，自古就作药用，可生用、熟用， 或制成片、粉、或干姜、炮姜、爆姜入药。吉医书记载，生姜“生用发散， 热用和中，解肉禽中毒或喉痹，姜汁开痰，治噎隔反胃，煨姜和中止呕； 此外，姜皮、姜叶、姜露均可入药。可觅生姜既可调味，又是温胃散寒良 药，止呕圣药，受到人民重视。 生姜蛋白酶是在继木瓜蛋白酶等以后发现的一种新的植物蛋白酶，它 在结构与性质上与木瓜蛋自酶、菠萝蛋白酶以及无花果蛋白酶等具有很多 的相似性，被认为是本瓜蛋白酶家族的又一新成员。生姜蛋皇酶在巍类嫩 化、酒类澄清以及凝乳中均具有广泛的应用前景，开发潜力较大。生姜蛋 白酶用于肉类嫩化，不仅可以显著提高肉的嫩度，而且可以使其具有良好 的风味。生姜蛋自酶用予酒类澄清，可显著提高啤酒和葡萄酒的澄清度( 唐 晓珍等，2 0 0 3 ) 。我国传统食品“姜撞奶”用姜汁作为凝乳剂，其中的凝 乳因子被证明就是生姜蛋白酶( 张平平等，1 9 9 9 ) 。 生姜蛋白酶的提取及其在牛肉嫩化中的应用研究 1 1 1 生姜蛋白酶的提取方法 生姜蛋白酶目前广泛采用的提取方法主要有沉淀法和超滤法两大类， 提取后所得的酶液都需经过冷冻干燥获得酶粉。 1 1 1 1 沉淀法 该方法是目前提取生姜蛋白酶的主要方法。沉淀法是比较传统的分离 纯化蛋白质的方法，目前仍在实验室内广泛使用。该法所需设备简单，操 作方便，在生姜蛋白酶纯化的初期，可以迅速减少样品体积，起到浓缩的 作用，便于后续的纯化，降低纯化成本；还可以尽快将目的酶与杂质分开， 提高其稳定性；通过该方法，生姜蛋白酶的收率比较高。通常采用的沉淀 剂主要是有机溶剂如丙酮和乙醇，盐类如硫酸铵，以及单宁等。沉淀法大 都以丙酮粉作为酶的来源，其制作方法为( 张平平等，2 0 0 1 ) ：将黄姜洗 净、切碎，加上5 倍( w v ) - 2 0 下预冷的丙酮，用组织捣碎机捣碎，放 入布氏漏斗抽滤，再用适量的冷丙酮抽滤洗涤三次，将丙酮粉放入通风橱 中干燥至无丙酮气味，然后用筛子筛去粗纤维之类，装入塑料袋中真空密 封，放入2 0 下冰箱中存放备用。 目前国内研究中采用较多的沉淀法有三种。 ( 1 ) 有机溶剂沉淀法 有机溶剂沉淀提取生姜蛋白酶的基本机理被认为是有机溶剂破坏了 酶分子间的某些键，使酶的分子结构发生了变化，一些原先存在于其内部 的疏水基团被暴露于表面，并与溶剂分子上的疏水基团结合，形成了疏水 层，使得蛋白质沉淀。有机溶剂沉淀蛋白质的效率，受到操作温度，p h ， 蛋白质分子大小等因素的影响。温度低，沉淀比较完全，在整个沉淀及分 离沉淀的过程中，可在盐水冰、浴中进行，以保持低温操作。 张平平在制取丙酮粉后，用丙酮沉淀生姜蛋白酶，其工艺为：取丙酮 粉，用p h 5 6 的缓冲液溶解，离心后取上清液，加入1 2 倍体积的丙酮， 再离心取沉淀，冷冻干燥。唐晓珍( 2 0 0 2 ) 则直接用无水乙醇从姜汁中沉 淀生姜蛋白酶，其工艺为：用无水乙醇( - 2 0 c ) 与姜汁配成6 0 的乙醇 姜汁溶液混匀后，4 放置3 0 m i n ，离心取沉淀，真空中除去乙醇并冷冻 干燥，即得粗酶粉。 ( 2 ) 硫酸铵沉淀法 4 出东农妲大学硕士学缎论文 硫酸铵沉淀法条件温和、操作简便。加入中性盐到蛋白质溶液中，蛋 自质溶解度开始增大，郎为盐溶，僵隧着继续加入盐，蛋白质溶解度却逐 步减小，并形成沉淀，这就是盐析。不同蛋白质在不同的中性盐浓度下析 出，利用此原理，可对溶液中的杂质蛋白及目的蛋白进行分级沉淀，通常 蛋白质受到中性盐的保护作用，不会因为盐的作用而变性失活。盐析受到 蛋皇质表面吸本性的影响。疏东基团主要存在于蛋自质内部，也有一些分 布在蛋白质的表面，水分子与这些基团接触，加入盐到溶液中后，随着盐 浓度的提高，水分子被从蛋白质分子周围移开，蛋白质分子表面的疏水基 霞互相作用，导致了蛋皇质的凝聚、沉淀。 硫酸铵是最常用的盐，因为它便宜，溶解度高，对温度的敏感性低， 在纯水的饱和浓度接近4 m o l l ，饱和溶液的密度为1 2 3 5 9 m l ，由于蛋白 质沉淀的密度与硫酸铵饱和溶液的密度比较接近，因此离心分离沉淀物质 时一般需要高速离心机。 硫酸铵的浓度多用饱和度表示。实际所需的硫酸铵饱和度，应通过试 验来确定，可以先使蛋白质溶液带到某一硫酸铵饱和度，此时目的蛋白不 发生沉淀，离心除去杂质蛋盘沉淀，再加入硫酸铵至更高的另一饱和度， 尽量多的沉淀目的蛋白，离心后获得目的蛋白沉淀。 盐析操作在4 下进行，操作时一边缓慢搅拌用缓冲液溶解丙酮沉淀 所得的溶液一边缓慢加入固体硫酸铵，以免造成局部硫酸铵浓度过高。通 过离心( 1 2 0 0 0 r m i n ，3 0 r a i n ) 过滤可得到沉淀物。对予尽的蛋白的沉淀 物，可用1 2 倍体积的缓冲液溶解，然后用透析袋进行透析除盐。 张平平( 2 0 0 1 ) 通过实验确定了如下提取工艺：取经丙酮沉淀获得的 粗酶粉，加入固体硫酸铵至4 毛饱和度，离心后取上清液，秀籍入硫酸铵至 6 0 的饱和度，再离心取沉淀，透析除盐即可获得生姜蛋白酶。而代景泉 ( 2 0 0 3 ) 确定的工艺则与之略有不同：取丙酮粉用2 0 倍( w v ) 0 1 m m o l l ， p h 8 0 的磷酸缓冲液提取，上清液加硫酸铵至4 0 饱和度，其间控制p h 7 0 ，离心弃去沉淀，上清液继续添加硫酸铵至8 0 饱和度，离心取沉 淀，透析除盐后冷冻干燥即可。 ( 3 ) 单宁沉淀法 h a r u o ( 1 9 9 6 ) 研究了焦性没食子酸糖苷与牟血清蛋自( b s a ) 类的 生姜虽鑫酶瓣提取及其在牟褒嫩诧孛静瘦耀研究 “单宁蛋白质反应体系，认为单宁与蛋白质反应分两阶段进行：第 一阶段为“亲和”阶段，且不同类型单宁与不同类型蛋白质的结合力是不 同的。第二阶段是形成“单宁蛋白质 沉淀阶段，而且该反应一旦发 生，沉淀过程就是非常完全的。 唐晓珍( 2 0 0 1 ) 用单宁沉淀法提取生姜蛋白酶，其方法为：取丙酮粉， 角p h 6 0 的缓冲液溶解并浸提3 5 m i n ，然后离心，予上清液中加入单宁至 0 1 2 的浓度，离心取沉淀，冷冻干燥即可。 1 1 1 2 超滤法 超滤法是一种新型离效的膜分离技术，广泛的应用于物质的分离、浓 缩和提纯，如电子、医药、食品工业中纯水的净化等。这种方法是在离心 力或较藏的压力下，选择适当孔径的半透膜，从而使水和其他小分子物质 通过半透膜，而所需的蛋白质不能通过膜。超滤浓缩与其他方法相比有其 优点。 影响超滤的医素主要是流量，尤其对予大规模的浓缩。操作压力、样 品溶液的组成以及黏度、流速、膜以及超滤系统的选择都影响到流量。高 的压力能够提高流量，但如果超过定的限制值鼓舞，极化作用就会限制 流量，而且会增加膜的污染和泵的运行费用；高的流速可以减轻膜的污染 和极化作用，但是过高的剪切力会使蛋自质变性；溶液黏度升离会使流速 减慢，提高温度虽然可以降低黏度，但一般不考虑此措施，以免因为热而 使蛋白质变性。 2 0 0 1 年，唐晓珍首先报道了采用超滤法提取生姜蛋自酶，基本工艺 如下： 生蒌一洗净_ 切碎叶榨汁一离心除去淀粉一抽滤一超滤一取浓汁耐 真空冷冻干燥保存。 唐晓珍通过实验得出结论：操作压力为0 0 6 m p a 时，酶活力和膜通量 最好；膜通量随操作温度、姜汁流速的提高而增加，随姜汁浓度、操作时 间的增加而降低。 以上是提取生姜蛋白酶最常用方法，近几年的一些新的提取方法，剡 综合运用了上述各种方法，例如：2 0 0 0 年，k y t m g 在研究生姜蛋白酶的 氨基酸序列时，采用絮下的提取方法：生姜切成小块，3 下，在1 0 0 0 m l 2 0 r n m o l lp h 7 0 的磷酸缓冲液中研磨，混合物搅拌1 h 然后用纱布过滤，取 6 由东农娩大学硕士学位论文 滤液；滤渣再用5 0 0 m l 缓冲液浸提，过滤，合并滤液，加入2 的氯化钠， 搅拌潍，在4 下1 5 0 0 0 9 离心3 0 m i n 。上清液用硅藻主过滤以除去悬浮 物，然后加入硫酸铵至2 0 饱和度，将溶液搅拌l h ，然后1 3 0 0 0 9 离心 3 0 m i n ，上清液继续添加硫酸铵至6 0 饱和度，用n a o h 调节p h 至7 2 ， 4 下搅拌3 h ，离心取沉淀，用约15 0m l 2 0 m m o l l p h 7 0 的磷酸缓冲液( 含 有5 m m o l l 的连四硫酸钠) 溶解。溶液用截流分子量为1 2 0 0 0 的透析袋 对2 0m m o l l p h 7 0 的磷酸缓冲液( 其中含有5m m o l l 的连四硫酸钠，l m m o l l e d t a ) 透析1 6 h 以上。透析液在4 下1 0 0 0 0 9 离心3 0 r a i n 以除去 任何不溶性物质，褥褪酶液，在此基础上进行层橱纯化。 又如：2 0 0 5 年，a d u l y a t h a m 等在研究生姜蛋白酶的部分纯化和稳定 性的时候采用如下的提取方法：鲜姜，切片，与4 倍( w v ) 的冷t r i s 盐酸 缓冲溶液( 0 0 5m o l l ，p h s ) 混合均匀，均质，四层纱布遭滤，滤液在5 ， 1 2 0 0 0 9 的离心机中离心2 0 m i n 。上清液，即生姜蛋蛊酶，在5 1 2 保存。 1 1 。2 生姜蛋白酶的蛋白质性质 1 1 2 1 等电点和分子量 1 9 6 8 年m i c h i 等人首先报道了生姜蛋白酶。1 9 7 3 年t h o m s o n 等人把 从姜根茎中制取的酶命名为z m g i b a m ，认为生姜蛋白酶是蛋白水解酶的一 种新来源，用嚣酮沉淀法初步分离了这种酶并研究了它的酶学性质及其在 肉类嫩化中的应用，并预计它会有较好的应用前景。同年，i e k i k a w a 和 r o s h i e 等人用d e a e - 纤维素柱层析对该酶进行了纯化，并且证明该酶是 毒两个组分( 1 、积2 ) 构成的，除电泳迁移率外，两个组分在其他 方面基本相同；用s e p h a d e xg - 1 0 0 测得两个组分的分子量均为2 2 5 0 0 ，等 电点为7 0 和8 0 ，纯酶结晶为六面体。1 9 7 8 年o h t s u k i ，k o z o 等人用p 1 0 0 生物胶过滤对该酶进行纯化，得出该酶分子量为2 9 0 0 0 。1 9 9 5 年，赵帜平 等以安徽舒城的生姜为原料，采用d e a e - 纤维素d e 5 2 和s e p h a d e xg 7 5 纯化得两个组分，等电点分别为7 0 和8 0 ，用苯酚硫酸法鉴定均为糖蛋 白，并证明糖肽键型均为菲o 型。同年，o h t s u l d 再次发表论文，报道了 用d e a e 。s c p h a r o s e 稠s e p h a d e x ( 3 - 7 5 纯化该酶，用等电聚焦电泳将该酶 分为三个组分，等电点分别为4 5 、4 6 和4 。8 ，并用s d s 。聚蔼烯酰胺凝 胶电泳和t s k g 2 0 0 0 s w 凝胶过滤再次证明该酶分子量为2 9 0 0 0 。2 0 0 2 7 生姜蛋白酶的提取及其在牛肉嫩化中的应用研究 年，代景泉以莱芜生姜为原料，用硫酸铵沉淀法对生姜蛋自酶进行粗 提，证明了生姜蛋白酶具有酸性蛋白酶的性质，并用d e a e - 纤维素d e 5 2 对该酶进行纯化，将该酶分为两个组分，用s d s 聚丙烯酰胺凝胶电泳得 出其分子量分别为4 7 0 0 0 左右和1 4 0 0 0 左右。2 0 0 5 年，a d u l y a t h a m 等 用d e a e t o y o p e a l - 6 5 0 柱层析对生姜蛋白酶进行纯化，得出该酶的分子量 为3 4 8 0 0 。 由以上研究结果可以看出，目前对生姜蛋白酶的等电点和分子量 的分歧，基本形成了以下几种观点，如表l 所示。 表1 生姜蛋白酶的等电点和分子量的分歧 t a b l e ld i s a g r e e m e n to nt h ei s o e l e c t r i cp o i n ta n dm o l e c u l a rw e i g h to fg i n g e r p r o t e a s e 1 1 2 2 分子结构 1 9 9 9 年，k y u n g 等利用x 一射线晶体衍射法研究了生姜蛋白酶 2 1 a 精确度下的晶体结构。发表了以下重要研究成果： ( 1 ) 生姜蛋白酶i i 是一个含有2 2 1 个氨基酸残基的糖蛋白，在 a s n 9 9 和a s n l 5 6 上有两条n 型寡糖链，糖基含量占8 ，并阐明了寡 糖残基的组成及连接方式。 ( 2 ) 生姜蛋自酶i i 总体结构类似于木瓜蛋白酶等其他植物巯基 蛋白酶，肽链折叠成两个独立的大小差不多的结构域，两者之间有一 道裂隙，活性中心就位于裂隙中。 ( 3 ) d t t 对该酶有强烈的激活作用。 ( 4 ) 讨论了酶与底物作用专一性的机理。 ( 5 ) 结晶为四聚体，阐明了单体间的连接方式。 2 0 0 0 年，k y u n g 等报道了生姜蛋白酶的两种形式( 生姜蛋白酶一i ， 生姜蛋白酶i i ) 的氨基酸顺序，并用质谱法测定了糖基的位置以及糖 山东农业大学硕士学位论文 链中单糖连接顺序。 1 1 3 生姜蛋白酶的酶学性质 1 1 3 1 基本酶学性质 由于不同的入在提取生姜蛋毒酶时，采用的生姜晶种不同，提取纯化 方法不同，纯化的程度不同，因此对酶学性质的研究也没有形成一致的结 论。目前关于生姜蛋白酶的酶学性质的基本研究结论如表2 所示。 表2 生姜蛋自酶的基本酶学性质 量洒l e 2b a s i ce n z y m o l o g yo fg i n g e rp r o t e a s e 项目性质 最运温度 6 0 最逶争珏戮酪虽叁蔻藤锈嚣童6 0 ， ；乏豢盘涛餐奎隽魔物时5 0 抑制剂汞、镧、铬和锌等二价重金属离子，p c m b ，亚硫酸氢钠 激活剂巯基化合物，e d t a ，d t t 1 1 。3 2 稳定性 生姜蛋白酶在常温下放置活性很快降低。张平平经研究得出绐论：生 姜蛋白酶在3 0 保温3 0 r a i n ，酶活力不会降低。随着温度进一步升高，酶 活性下降，6 0 、7 0 、8 0 时，该酶的半衰期( 即酶活丧失5 0 所需的 时闯) 分别力1 7 、董2 和3 m i n ( 张平平等，2 0 0 1 ) 。粗酶在5 存放艇时， 其活力已损失了8 0 ，粗酶的半衰期从5 的2 圭o 1 6 d 降至3 0 的1 7 m i n 。 0 2 的维生素c ( w v ) 能使生姜蛋白酶稳定，在5 保存1 4 天没有活力 损失。维生素c 钠也增加了生姜蛋白酶的活力5 倍多。继续增加用量， 效果变化不大。在6 0 时，生姜蛋皇酶的半衰期是2 3 r a i n ，添加0 2 ( w v ) 维生素c 后变成2 4 m i n 。当温度低于5 0 时，生姜蛋白酶完全可以被维 生素c 稳定( a d u l y a t h a me t c ，2 0 0 5 ) 。 生姜蛋自酶活性降低的一些可能的原因是巯基被氧化，巯基与s 0 2 的相互转化，形成了醌一硫醇复合物，巯基基团被强金属离子环绕，形成 氨基硫醇复合物，并且自降解。生姜蛋白酶也可以因为氢键或静电作用 而与单宁结合。 从鲜姜中提取的褪酶很快褐变。这一过程可能包括g 在内源多酚氧化 9 生姜簧自酶的提取及其在牟肉嫩化中的应用研究 酶的作用下，多酚氧化形成醌类化合物。醌进而可以和氨基，巯基以及生 姜蛋白酶中的其他亲核残基反应，因此导致了酶活性的降低。d t t 和维 生素c 都是褐变的抑制裁，然而，前者并不能稳定生姜蛋蛊酶。显然， 对褐变的抑制不能说明维生素c 稳定生姜蛋白酶的机理。 在丙酮粉的制备过程中，生姜中的疏水性多酚被去除。浆状物质也在 低温下毒子丙酮的作用丽脱水。与从鲜姜中提取的粗酶相比，丙酮粉有较 高的稳定性。这可以有如下解释：一方谣降低了植物色素的浓缩度，另一 方面降低了水分活度，而酶的三维结构在低水分活度的系统中更易于保 持。这些影响确实可以通过弓l 入玻璃态化临界温度来证实。因此，丙酮粉 可作为生姜蛋自酶的一种长期的保存方式。徨是，丙酮粉仍然需要经过浸 提才能获得纯度较高的可直接使用的酶制剂，因此有必要进一步研究较纯 的生姜蚤白酶的稳定方法，例如采用微胶囊包被等方法使其固定化。 1 2 肉类嫩化效果的研究以及机理推断 随着人们经济水平的提高，人们对肉类的品质要求越来越高，在肉类 的众多品质指标当中，嫩度是一个极其重要的指标，凌的嫩度主要是指人 们在食用时，用牙齿咬碎和咀嚼肉的难易程度。于是人们采用了电刺激， 高压处理，酶处理，钙盐注射，多聚磷酸盐处理以及超声波处理等多种方 法来使亵类嫩化。器前，研究肉类嫩化效果的方法主要有感官分析方法， 物理性指标分析法，生化指标分析方法以及组织学分析方法鳃种。 1 2 1 感官分析方法 1 2 1 1 嫩度感官评分 感官分析方法是通过舌头与肉接触时产生的触觉来评价肉的嫩度，嫩 凌感觉细 悉软，老岗感觉粗蔼本质化；牙齿咬断肌岗纤维的容易程度，易 嚼碎的嫩，不易嚼碎的老( 孔晓玲等，2 0 0 3 ) 。感官分析可从以下方耍进 行：咬碎肌纤维的难易程度，达到正常吞咽程度时的咀嚼次数以及剩余残 渣的量。李同树( 2 0 0 4 ) 等在评价鸡肉的嫩度时，采用感官评定方法，将 嫩度分为细嫩，一般，糖硬三个等级。采用这种分析方法的缺点是主观牲 较大，难以达到量化，公正。可以用来对嫩度进行评定，对嫩化效果进行 初步检验，但不宜用来作为嫩化机理的研究方法。 l o 山东农业太学硕士学位论文 l 。2 。1 2 颜色 肉的颜色在正常的变化范围内不影响肉的薰养价值，但是却决定着人 们对肉的感官判断，因而也是肉的品质的重要指标。霹翦评价肉色的方法 主要有圜测评分法以及与标准比色板进行比较评分的方法。肉色除根据视 觉判断外，还可采用色度仪测定，国际上通常采用h u n t e r 值，以毛拳( 亮度) 、 扩( 红色) 和b 奉( 黄色) 值表示。 。 自艳红等( 2 0 0 4 ) 在对超高压处理对绵羊究嫩纯机理的研究中指爨， 在1 0 0 - - - 4 0 0 m p a 范围内，随着压力的升高，绵羊肉的鲜红色逐渐淡化。 压力达到4 0 0 m p a 时，样品莹粉红色并伴有轻微的囱色小斑点出现。 重2 1 3 大理石花纹 大理石花纹是指肌内脂肪在牛癌组织中分布形成的可见花纹，因其形 似大理石酶花纹蓊得名。大理石花纹是衡量牛肉品蕨的重要指标，与牛肉 的嫩度和风味密切相关( s a v e l l 等，1 9 8 8 ：m i l l e r ，1 9 9 4 ) ，还影喃牛岗的 品质等级和人们的视觉感官，是消费者俸出购买决定的主要依据。肌内脂 肪的含量和分布是决定牛肉大理石花纹的主要因素( k a z a l a 等，1 9 9 9 ) ， 当脱内脂肪达到一定比例且分布比较均匀时牛肉断面即呈现出美丽的大 理石花纹，这样的牛肉质地鲜嫩、柔软、多汁，是理想的肉晶。 1 2 。2 物理性指标分析方法 常用的有势切力僵，蒸煮损失与熟肉率，系水力等。 1 2 。2 。l 剪切力值 这是嚣翁研究虑类嫩化效果的最常用垂冬方法。w a m e r - b r a t z j e r 提出了 剪切力的测定方法，该方法在国内被许多人采用。唐晓珍等( 2 0 0 3 ) 在研 究生姜蛋自酶对猪肉的嫩化效果时，将样品在8 5 的水中水浴l h ，并用 穿刺温度计，以肉样几何中心为准测定中心温度，使肉样几何中心温度为 7 5 ，保温2 0 r a i n 。然后冷却至室温，放入冷藏箱( o 4 ) 过夜。从瓶肉 块中顺瓿纤维方向取截面积为1 c m 2 的岗柱，然后用质构仪测定。赵立艳 等( 2 0 0 3 ) 在研究磷酸盐对牛肉的嫩化效果时，用嫩度计测定每个肉柱的 剪切力值。韩玲在研究冷却牦牛分割肉酶嫩讫技术对，采用本瓜蛋自酶注 射使牦牛肉嫩化，以剪切力降幅为主要指标，选择嫩化条彳牛( 韩玲等， 2 0 0 3 ) 。刘计民等认为，牛肉背最长肌和臀肌的剪切力在4 5 k g 时，为中 生姜蛋白酶的提取及其在牛肉嫩化中的应用研究 等嫩度的肉( 王建民等，1 9 9 8 ) 。由于这种方法是仿照牙齿切割肌纤维的 方式，与食用时咬断肉块的感受较为接近，规范条件下测定的剪切力值具 有较高的可比性，已在凌类嫩化方法的研究中广泛使用。 1 2 2 2 蒸煮损失与熟肉率 蒸煮损失是指肉在一定温度的水中加热一段时间以后其重量的损失， 一般采用蒸煮前后肉样重量豹减少量占蒸煮蔚的分数来表示( 王建民等， 1 9 9 8 ) 。李兰会在研究超声波处理对羊肉嫩度的影响时，采用测蒸煮损失 率的方法来比较嫩化效果，并指出肉块在成熟达到最终嫩度时，其蒸煮损 失率增大，保水率降低。熟肉率是与蒸煮损失相对应的概念，是指将肉蒸 煮至熟以后，肉的重量与蒸煮前肉的重量的比例关系。蒸煮损失率越小， 熟肉率越大。孙卫青等在研究氯化钙注射对羊肉嫩化的作用时指出，对处 理的肉样加工后进行分析发现蒸煮损失降低显著( p 研究了姜汁对鸡肉的嫩化效果，结果表弱：姜 汁处理增加了肉的p h ，含水量，熟肉率，总色素持水力，胶原蛋皇溶解 度，蛋白浸出物，肌纤维直径，降低了剪切力。通过感官评分还可以看出， 经姜汁处理的样品在外观，风味，多汁性，嫩度以及总体可接受性方面都 显著提高。这证明了姜汁是种有效的肉类嫩化裁，英嫩化作用是由予其 中含有的生姜蛋白酶对肌原纤维和结缔组织共同作用的结果。经姜汁处理 的样品电泳图案中蛋白带数量的减少表明生姜蛋白酶具有广泛的蛋白质 水解毵力。姜汁对冷却后的样品的嫩能效果较好，最佳处理浓度为3 。 n a v e e n ae ta l ( 2 0 0 4 ) 研究了生姜蛋白酶对印度水牛虑的嫩化效果， 结果表明：生姜蛋白酶处理增a n - ；样品的胶原蛋白溶解度，增加了肌浆蛋 白以及肌原纤维蛋白的分解，降低了剪切力，肌肉蛋白质的电泳图案中蛋 盘带数量的减少，同样表明生姜蛋白酶具有广泛的蛋皂水解能力。毒生姜 蛋白酶处理过的肉表现出了良好的外观，风味，嫩度等。研究结果表明， 生姜蛋白酶可作为木瓜蛋白酶的替代品。 由以上研究结论可以看出，露薷对生姜蛋自酶在岗类嫩化中的应震还 主要是嫩化效果的方面，对嫩化机理尚未进行深入的研究，在生姜蛋自酶 对肉类其他方面品质的提高作用的研究也不够深入。 1 5 本研究的主要内容和意义 本研究将在上述结论的基础上研究将超滤法与沉淀法结合提取生姜 蛋自酶的新工艺，不同晶种的生姜中提取的蛋自酶在提取工艺参数上的差 异，新工艺条件下提取的生姜蛋白酶的基本酶学性质以及稳定性，生姜蛋 自酶嫩化牛肉的最佳工艺条件，初步推断生姜蛋白酶嫩化牛肉的机理。 通过探索生姜蛋自酶提取的新工艺及其品种差异，可以为生姜蛋白酶 的工业化生产进一步提供新的理论依据，透过初步推断生姜蛋蛊酶嫩化牛 肉的机理，可以为其在肉类嫩化中的应用研究提供理论基础，为熟肉类制 品的加工前处理提供有效途径。这些内容的研究，对于扩大生姜资源的利 用途径，调节农业产业结构均具有重要意义。 生姜蛋白酶的提取及其在牛肉嫩化中的应用研究 2 材料与方法 2 1 试验材料 生姜莱芜姜，青州姜，面姜，由潍坊神农食品公司提供。 牛肉从泰安银宝公司购买，宰后冷却排酸2 4 h 。 2 2 主要试剂 酪氨酸 酪蛋白 考马斯亮蓝g 2 5 0 三氯乙酸 冰乙酸 乙醇 盐酸 磷酸 钼酸钠 钨酸钠 硫酸锂 磷酸氢二钠 磷酸二氢钠 其它为实验室常规试剂。 2 3 主要仪器 控温多用高速组织捣碎机 s h b 型循环水多用真空泵 p h s 3 型酸度计 离心机 电热恒温培养箱 7 5 2 c 型紫外可见分光光度计 电热恒温水浴锅 l s l 型科研型超滤机 中国科学院生物化学研究所 上海化学试剂供应站 上海化学试剂采购供应站 上海化学试剂采购供应站 济南试剂总厂 天津市永大化学试剂开发中心 天津市永大化学试剂开发中心 天津市永大化学试剂开发中心 天津市巴斯夫化工有限公司 天津市巴斯夫化工有限公司 天津市巴斯夫化工有限公司 天津市巴斯夫化工有限公司 天津市巴斯夫化工有限公司 江苏江阴周庄科研器械所 郑州长城科工贸有限公司 上海第二分析仪器厂 上海医疗器械厂 上海华连理化器材厂 上海第三分析仪器厂 龙口先科仪器公司 海口立升饮料设备有限公司 山东农业大学硕士学位论文 真空冷冻干燥机 质构仪 2 4 试验方法 上海华连理化器材厂 s t a b l em i c r os y s t e r m sl t d ，v i e n n a c o u r t ，l a m a a sr o a d ，g e d a l i n i n g ，s u r r e y g u t i y l ，u k 2 4 1 试剂及溶液的配制 2 4 1 1f o l i i l 一酚试剂 往1 5 l 磨口回流瓶加入1 0 0 9 钨酸钠( n a 2 w o a 2 i - 1 2 0 ) 、2 5 9 钼酸钠 ( n a 2 m 0 4 2 h 2 0 ) 及7 0 0 m l 蒸馏水、8 5 正磷酸5 0 m l 及l o o m l 浓盐酸 充分混合，接上回流冷凝管，以小火回流1 0 h ，回流完毕，再加入1 5 0 9 硫酸锂，5 0 m l 蒸馏水及数滴浓溴水，烧开后继续沸腾15 m i n ，以除去多 余的溴，冷却后稀释至1 0 0 0 m l ，过滤，得到的滤液为浓试剂，呈黄绿色： 盛于棕色试剂瓶中，冷却保存。使用时将浓试剂用蒸馏水稀释一倍。 2 4 1 2l o o o r t e d r r 正酪氨酸溶液 将酪氨酸在1 0 3 ( 2 烘箱中烘干，称取1 0 0 m g ，加少量0 2 m o l l 盐酸溶 解，用蒸馏水定容至l o o m l ，得1 0 0 0 1 t g m l 的酪氨酸溶液，可按需要稀 释至所需浓度。 2 4 1 30 0 1 ( w v ) 考马氏亮蓝g 一2 5 0 溶液 称取1 0 0 m g 考马氏亮蓝g 一2 5 0 ，溶于5 0 m l 9 0 乙醇中，加入8 5 正磷酸1 0 0 m l ，最后加蒸馏水定容至1 0 0 0 m l ，此溶液可在常温下放置一 个月。 2 4 1 40 5 5 m o l l 碳酸钠溶液 称取5 8 3 9 碳酸钠( n a e c 0 3 ) ，用蒸馏水溶解后，置l o o m l 容量瓶中， 定容。 2 4 1 55 m g m l 酪蛋白溶液 称0 5 9 酪蛋白，先用少量0 5 5 m o l l 碳酸钠溶液湿润，再加少量 o 0 2 m o l l p h 7 5 的磷酸缓冲液稀释，在水浴中煮沸溶解，定容至l o o m l ， 为5 9 m l 的酪蛋白溶液，贮存于冰箱中，用时按需要稀释为所需浓度的 酪蛋白溶液。 1 7 生姜蛋自酶的提取及箕在牛肉嫩傀中的应用研究 2 4 。1 6 不同p h 的缓冲液 用乙酸一乙酸钠配制成p h4 叽5 5 缓冲溶液；用磷酸氢二钠磷酸三 氢钠配制成p h 6 。o 8 。0 缓冲溶液。 2 4 2 分析测试方法 2 4 2 。l 鲜姜中水分的测定 加热干燥法：鲜姜- 洗净_ 切碎_ 称取3 0 e , 份，a 、b 两份_ 干燥( 电 加热恒温箱1 0 0 。c 左右) 一至相隔3 0 r a i n 的重量相差不到0 0 5 0 9 为止。得 鲜姜水分含量必8 7 圭1 。 2 4 2 2 蛋白质含量的测定 取6 支试管，按表中顺序，分别加入样品、水和试裁，配成不同浓度 的标准蛋白溶液l m l ，混合均匀后每管取0 1 m l ，然后在各试管中分别加 入5 0 m l 考马颠亮兰p - 2 5 0 试剂。 表3 蛋白质含量测定标准曲线的制作 强b i e 3s t a n d a r dc u r v eo f d e t e r m i n i n gt h ep r o t e i n 试剂 绽鼍 蒸馏承m ll0 。8色60 40 20 1 0 0 0 p g m l 标准龋白，m l 0 0 2o 4 0 60 81 标准蛋鑫最终浓嶷，g m l 02 0 04 0 0 6 0 0 8 0 0 1 0 0 0 加完试剂2 5 分钟后，即可开始用比色皿在分光光度计上测定各样 鼹在5 9 5 n m 处的吸光度筐，空皇对照为第l 号试管，即o 。l m l 蒸馏水加 5 0 m l 考马斯亮蓝g - - - 2 5 0 试剂。 用吸光度值为横坐标，用标准蛋白质量为纵坐标，作图，即得到一条 标准曲线。所得标准曲线为：y = 2 4 6 3 7 x - 3 6 8 6 4 ，r 2 = o 9 9 3 8 。 样品的测定时，吸取提取液o 1 m l ，放入具塞试管中，加入5 m l 考 马颠亮蓝混合，放置2 r a i n ，以蒸馏水代替酶液调消光度0 ，在5 9 5 n m 处 测定吸光度值。 2 4 2 ，3 生姜蛋自酶活力测定 按下表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液。 山东农业大学硕士学位论文 表4 生姜蛋自酶活力测定标准基线憋髑俸 t a b l e 4s t a n d a r dc u r v eo fd e t e r m i n i n gt h ep r o t e o l y t i ea c t i v i t y 取6 支试管编号按表1 分别吸取不同浓度酪氨酸l m l ，各加入 0 4 m o l l 碳酸钠溶液5 m l ，再各加入已稀释的f l i o n ，酚试剂lm l 。摇匀置 于本浴锅孛。4 0 保温发惫2 0 m i n ，在波长6 8 0 n m 处，用l 号管调消光度 o ，测定其它各管的吸光度。 以净吸光度值为横坐标，酪氨酸的浓度为纵坐标，绘制成标准盐线。 所得标准曲线为y = 9 6 1 5 1 x + 0 1 6 1 7 ，r 2 0 9 9 9 1 。 生姜蛋白酶活力定义：温度为4 0 c 时，l m i n 内分酪蛋白产生1 1 t g 酪 氨酸的所需要酶量为1 个酶活力单位( u ) 。 生姜蛋白酶活力的测定步骤：鬣白酶液1 0 m l 与1 0 m l 0 5 的酪蛋白 混合，4 0 c 水浴下保温反应1 0 m i n ，加入2 0 m l 0 4 m o l l 的三氯乙酸终止 反应，静置1 0 m i n 后过滤。取1 0 m l 滤液与5 0 m l 0 4 m o 儿碳酸钠溶液和 1 0 m l f l i o n - 酚试剂混合，4 0 。c 下保温发色2 0 r a m 。空自的反应方法同上， 唯独是加入酪蛋自和三氯乙酸的顺序相反。然后在6 8 0 h m 处，以空囱调 消光度0 ，测吸光度。 蛋自酶活力的计算：蛋自酶活力单位( u ) = a x k x n 式中：k 1 0 0 除以酪氨酸标准曲线上1 0 0 1 l l g m l 对应6 8 0 r i m 处的 吸光度值，酶液稀释倍数。 2 4 2 4 蒸煮损失 取2 5 c m 厚的肉块，修正去除可见的皮下脂肪和结缔组织。肉块称重 ( w 1 ) 后进行嫩化处理，肉块封麓包装在8 0 c 水涤中加热至肉块孛心温 度达到7 5 ，保持2 0 m i n ，将熟肉块放于o q 过夜，用滤纸吸干肉块表 面的汁液，称重( w 2 ) ；按以下公式计算蒸煮损失( c o o k i n gl o s s ) 。 1 9 生姜蛋白酶的提取及其在牛肉嫩化中的应用研究 c o o k i n gl o s s ( ) = 旦墨1