（物理化学专业论文）ag核au壳复合纳米粒子在表面增强拉曼免疫分析（seria）中的应用.pdf

a g - a ul 复合纳米粒子在衷面增强拉曼免疫分析( s e r i a ) 中的应用 中文摘要 中文摘要 表面增强免疫分析( s e r i a ) 是充分利用表面增强拉曼光谱( s e r s ) 的高灵敏 度和光谱选择性，结合抗体抗原的特性吸附作用所发展出来的一种新的检测技术。在 以s e l l s 为检测手段进行免疫分析过程中，s e r s 光谱的高选择性，高分辨率是其优 于传统红外光谱，荧光光谱的一大关键。而如何提高s e r i a 的检测灵敏度是其最终 能否成为临床检测技术的关键所在。一般情况下，a g 纳米粒子表面的s e r s 增强因 子要比a u 纳米粒予高，但a u 纳米粒子与a g 相比更具有生物兼容性，而核壳纳米 粒子通常具有其单组分纳米粒子所没有的独特性质。因此将a u 包裹在a g 纳米粒子 表面，形成a g # a u 壳复合纳米粒子，这样一方面可以通过电磁场增强的长程效应， 从“借力”角度使其获得比a u 更强的s e r s 增强，另一方面a u 壳的亲生物性使a g # a u 壳复合纳米粒子在s e r i a 中的应用具有可能性。 本文通过种子生长法合成了a g 棱a u 蠢复合纳米粒子，研究表明随着a l l 摩尔分数 的增加，a g 纳米粒子表面首先出现一些孔洞，随后孔洞消失。以对巯基苯胺( p a t p ) 和苯硫酚( t p ) 为标记分子研究a g 姨a u 竞复合纳米粒子的s e r s 活性，发现随着a n 摩尔分数的增加，其s e r s 活性呈现先增强后减弱的趋势，最大的增强为a g 纳米粒 子表面的1 0 倍。这可能是由于复合纳米粒子表面孔洞产生较强的电磁场增强所引起 的。将s e r s 活性较强的a g * a u 蠢复合纳米粒子用抗体和标记分子修饰进行免疫检 测，若抗体抗原发生特异性吸附，则可以通过a g 挂a u 竞复合纳米粒子表面标记分子 信号的检测确定待测抗原的种类。a g 棱a u 光复合纳米粒子作为一种具有较强s e r s 活 性和生物兼容性的纳米粒子可应用于s e r i a 研究中。 关键词：a g 麓a u 壳复合纳米粒子，表面增强拉曼光谱( s e r s ) ，表面增强拉曼免疫分 析( s e r i a ) 作者：崔颜 指导教师：顾仁敖 t h e a p p l i c a t i o no f a g e o r e a u s h e l lb i m e t a l l i cn a n o p a r t i c l e si n s u r f a c e e n h a n c e dr a m a n i m m u n o a s s a ya n a l y s i s a b s t r a c t s u r f a c ee n h a n c e dr a m a ni m m u n o a s s a ya n a l y s i s ( s e r i a ) i san e wd e t e c t i v e t e c h n i q u et h a tc o m b i n e st h ea d v a n t a g e so fs u r f a c ee n h a n c e dr a m a ns p e c t r o s c o p ya n dt h e i m m u n o a s s a ya n a l y s i s h o w e v e r , w h e t h e rs e r i a c a nb er e a l l ye m p l o y e di nc l i n i cd i p 廿l d s 0 1 1i t sd e t e c t i o ns e n s i t i v i t y i np r e v i o u sr e s e a r c h e s ，a un a n o p a r t i c l e sw e r em a i n l yu s e da s t h er a m a ne n h a n c e rf o ri m m u n o a s s a yd u et oi t sb i o c o m p a t i b i l i t ya n de a s yp x 却a r a t i o n , b u t a un a n o p a r t i c l e ss h o wal o w e re n h a n c e m e n ti nt h ev i s i b l el i 窖】a tr e g i o ni nc o m p a r i s o nw i t h t h a to fa g t h em o t i v a t i o no ft h ep r e s e n ts t u d yi st op r e p a r et h ea g c a u 洲ib i m e t a l l i c n a n o p a r t i c l e sw i mu n i q u eo p t i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t i e sf o ri m m a n o a s s a y i ti se x p e c t e d t h a to i lo n eh a n dt h ea ul a y e r so nt h en a n o p a r t i e l es u r f a c ea r eb i o c o m p a t i b l ea n do nt h e o t h e rh a n d ，t h eu n d e r n e a t ha gc o r em a yp r o v i d ee x t r ae n h a n c e m e n t i nat y p i c a l e x p e r i m e n t , l a y e r e dc o r e - s h e l lb i m e t a l l i cs i l v e r - g o l dn a n o p a r t i c l e sw e r ep r e p a r e db y c o a t i n ga ul a y e r so v e ra gs e e d su s i n gas e e d - g r o w t hm e t h o d w i t ht h ei n c r e a s eo f t h ea u m o l a rf r a c t i o n , s o m ep i n h o l e sa p p e a r e d0 1 1t h en a n o p a r t i e l es l f f f a c e , w h i c hw a st h e nc o a t e d w i t hac o m p l e t ea us h e l l c o r r e s p o n d i n g l y ，t h es e r si n t e n s i t yo fa d s o r b e dp r o b e m o l e c u l e s ( t pa n dp a t p ) e n h a n c e df i r s ta n dt h e nw e a k e n e d , w i t ht h em a x i m a li n t e n s i t y b e i n gl ot i m e sh i g h e rt h a nt h a to na g t h i su n e x p e c t e dr e s u l tc o u l db ea t t r i b u t e dt ot h e p r e s e n c eo fs o m ep i n h o l e st h a ta c ta sh o ts p o t sf o r t h ee l e c t r o m a g n e t i cf i e l de n h a n c e m e n t t h es e r sa c t i v eb i m e t a l l i cn a n o p a r t i c l e sw e t h e nm o d i f i e dw i t hp r o b em o l e c u l e sa n d a n t i b o d i e st of o r mar e p o r t e r - l a b e l e da g c m a u 蜘i an a n o p a r t i c l e sa n du s e df o ri m m u n o a s s a y a n a l y s i s p a r a l l e lt ot h i s t h ea n t i b o d i e s 、 帆i m m o b i l i z e do n as o l i ds u b s t r a t ef o rc a p t u r i n g a n t i g e n sf r o ms o l u t i o n t h ec a p t u r e da n t i g e n sc o u l dt h e nb i n dt h er e p o r t e r - l a b e l e d a g 研e 细幽d in a n o p a r t i c l e sm o d i f i e dw i t h 鞠1 n ea n t i b o d i e s ，f o r m i n gas a n d w i c ht y p e c o m p l e x“c a p t u r ea n t i b o d ys u b s t m t e a n t i g e n r e p o r t e r l a b e l e d i n l m u n o - a g 甜c a u 如u b i m e t a l l i cn a n o p a r t i c l e s ”t h eb i n d i n gs p e c i f i c i t yw a ss u c c e s s f u l l yd e m o n s t r a t e db yt h e d e t e c t i o no fc h a r a c t e r i s t i cr a m a nb a n d so ft h ep r o b em o l e c u l e s t h i sp r i m a r ys t u d y d e m o n s t r a t e st h a tt h ea g c o m a i l s h e l lb i m e t a l l i cn a n o p a r t i c l e sl a b e l e db yt h em o n o e l o n a l a n t i b o d i e sa n ds e r sp r o b e sc o u l db eu s e df o ri m m u n o a s s a ya n a l y s i s w r i t t e nb yc u iy a n s u p e r v i s e db yg ur e n a o ( p r o f e s s o r ) 2 ( ) 0 6 s 8 i i 苏州大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立 进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文 不含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏 州大学或其它教育机构的学位证书而使用过的材料。对本文的研究作 出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人承担本 声明的法律责任。 研究生签名：盗亟日期：立翌垒：驽 学位论文使用授权声明 苏州大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、清华大学论 文合作部、中国社科院文献信息情报中心有权保留本人所送交学位论 文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论 文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的 保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以公布( 包括刊登) 论文的 全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权苏州大学学位办办理。 研究生签名：盛逸 日期：呈型! ：羔：! 导师签名：日期：蔓趔 a gu a ut 复合纳米粒子在表面增强拉曼免疫分析( s e r i a ) 中的应用 第一章 第一章绪论 1 1 拉曼效应的发现、发展及其在生物化学研究中的应用 拉曼光谱的发现和发展 光散射是自然界最常见的现象，当一束光照射到介质时，大部分的光被介质反射 或透过介质，另一部分的光被介质向各个方向散射。透射光，反射光以及大部分散射 光的频率与原先的入射光频率相同，但一小部分散射光运动方向和频率皆发生变化， 这一部分光的光强仅约为入射光强的1 0 d o 。1 9 2 3 年s m e k a l 【1 】从理论上预测了该现 象的存在，1 9 2 8 年印度物理学家r a m a n ( 拉曼) 【2 】等以汞灯、棱镜和照相底板作 为实验工具，以苯液体为试样，首次发现了该效应。他在两年之后即获得诺贝尔奖， 拉曼光谱的名称也由此而来。 拉曼散射的原理可结合图1 1 解释。根据量子理论，频率为v o 的单色光的光子能 量为h v o ，h 为普朗克常数，当光子h v o 和分子作用时，可能发生弹性和非弹性两种 碰撞。在弹性碰撞过程中，光子与分子之间不发生能量的交换，即光子仅改变运动方 向而不改变频率，这种散射过程被称为瑞利散射( 图1 - l b ) 。在非弹性碰撞过程中， 光子与分子之间发生了能量的交换，光子的运动方向和频率皆发生了变化。处于e v - 0 基态的分子受入射光子h v o 的激发而跃迁到一个受激虚态( 实际上该受激虚态是不稳 定的，因此是不存在的) ，随后分子跃迁到基态e 产o ，此过程对应于弹性碰撞，跃迁 过程中放出的光子的能量仍为h v o ，即瑞利散射线。而当处于虚态的分子跃迁到e v _ 1 ， 则对应于非弹性碰撞，光子中的部分能量传递给分子，散射光子能量等于h ( v o v ) ， 这通常称为拉曼散射斯托克斯线( 图i - l a ) ：相类似的过程也可能发生在处于e 产l 的分子受入射光子h v o 的激发而跃迁到受激虚态，然后又跃迁到基态e ，= 0 ，光子从分 子得到部分能量而变为h ( v o + v ) ，称为反斯托克斯线( 图i - l c ) 。由此可见拉曼散射 光子的频率都是相对于入射光子的频率而言，因此拉曼光谱中得到的振动谱峰的频率 为拉曼位移( r m ms h i f t ) ，并且拉曼光谱的斯托克斯线和反斯托克斯线对称分布在 瑞利线的两侧 3 - 6 。当选取的入射激光频率非常接近或处于散射分子的电子吸收峰范 围内时( 图1 - i d ) ，与虚态情况相比，由于其在电子激发态停留的时间明显变长，这 就使拉曼跃迁的几率大大增加，这种现象被称为共振拉曼效应( r r ) 。 拉曼光谱在发现初期由于实验技术上存在许多困难而导致其发展缓慢。随着仪器 第一章a g a a u 复合纳米粒子在表面增强拉曼免疫分析( s e r i a ) 中的应用 设备的不断发展和更新，拉曼光谱开始被有效地利用，二十世纪六十年代初，激光技 术的问世给拉曼光谱带来了新的生机。和早期使用的汞弧灯相比，激光具有输出功率 大且能量集中，单色性和相干性能好，几乎是线偏振等优点【7 】。而且分光元件和检 测设备的改进激发了拉曼光谱的快速发展，特别是拉曼光谱仪和计算机的联用大大简 化了拉曼光谱的记录和数据分析处理。 七十年代初期，激光技术有了进一步的进展，激光器的多谱线输出和可调谐激光 器的连续谱线输出，对在很大光谱范围有吸收的样品，可以很方便地选择合适的激发 线进行共振拉曼光谱测量【8 】。共振拉曼效应比正常拉曼效应强二至四个数量级。但 是必须指出，只有少数分子的电子吸收能级与处于可见光区的激发光的能量相匹配， 而且，共振拉曼效应不是一种表面专一的效应，溶液相同物种可能会对表面谱产生严 重的干扰【9 】。 v i r t u a ls l a t e 一一一一一一一一一一一一一t 一一一一 ： l 。j h v o i h ( v o - o h v o 艇脚+ 订 i矗坳 h v o e l e c t r o n i c a l l y e x c i t e ds t a t e e l c c t r o n i c a l l v g r o u n ds t a l e m a t t e r i n gs c a t t e r i n gs c a t t e r i n gr a m a ns c a t t e n n g ( a )( b )( c )d ) f i g 1 - 1 s c h e m a t i cd i a g r a mf o rr a m a na n dr a y l e i g hs c a r e r i n g 拉曼光谱在生物化学研究中的应用 近年来，拉曼光谱成为研究生物分子结构的常用光谱手段，尤其在研究水溶液中 蛋白质的结构和构象方面发挥了重要作用。拉曼光谱与其他振动光谱技术如傅立叶变 换红外光谱( f t i r ) 和近红外吸收光谱( n 瓜) 相比在生物化学研究中有着其独特的 优越性 i l l 。首先，它具有优秀的指纹能力，在“1 0o m - i - 一“4 0 0 0o m - i , , 范围内的谱线 对应着生物大分子的振动基频，因而拉曼光谱能够在分子水平上直接得到基团和化学 键的信息以及微生物对生物样品的影响；其次，由于水的拉曼散射强度极弱，因此拉 曼光谱对样品无特殊要求，能够不破坏样品结构，在生理条件下进行原位置的测量。 再次，由于拉曼光谱是一种散射技术，可以进行单端测量，因而能够测量厚器官的上 2 a g - a u 复合纳米粒子在表面增强拉曼免疫分析( s e r i a ) 中的应用 第一章 层组织，这与基于红外吸收光谱的检测技术更具有特殊的诊断优越性。另外，拉曼光 谱技术具有很高的空间分辨能力，结合显微镜其空间分辨能力可达到1 岬；结合光 纤，利用内窥镜技术，拉曼光谱技术不但可以运用于体表的肿瘤探测，而且还可以进 行体内的探测。拉曼光谱的这些优点使得其早在二十世纪6 0 年代末至7 0 年代初，就 开始被用于生物医学方面的研究。虽然在研究分子的结构以及分子的动力学变化等方 面取得了很大的成就，但是拉曼光谱技术在临床医学上的发展却非常缓慢，主要原因 有二：( 1 ) 生物体自身的强荧光背景降低了拉曼光谱的信噪比。( 2 ) 拉曼光谱具有散 射截面低、散射光强弱的缺点，这使得获得清晰的生物样品的拉曼光谱变得困难重重。 9 0 年代后，近红外拉曼光谱技术、紫外共振拉曼光谱技术以及表面增强拉曼光谱技 术的发展，有效地克服了生物组织的强荧光背景，提高了拉曼光谱的信噪比；拉曼光 谱多维成像技术能在不破坏生物组织的情况下对生物组织进行成像，测试结果不再是 一些深奥的谱线，而是非常直观的二维、三维图像，这更易被广大医务工作者接受。 1 2 表面增强拉曼光谱( s e i 心) 的发展、s e r s 增强机理及其在生物化 学研究中的应用 表面增强拉曼光谱( s e r s ) 的发展和特点 1 9 7 4 年，f l e i s c h m a n n 小组将a - g 电极电化学氧化还原粗糙化处理后，成功地获 得吡啶吸附在粗糙a g 电极表面的高质量的拉曼光谱，而且拉曼信号随所加的电位会 发生明显的变化，表明它们来自于电极表面物种【1 1 】。但他们对该现象的解释仅仅归 结于电化学粗糙化导致电极表面积的增加，从而可检测到更多的吸附分子。直到1 9 7 7 年，j 碰u m a a i m 和v a nd u y n e 等 1 2 1 3 1 则敏锐地意识到，如此之强的表面拉曼信号不 可能简单地来源于粗糙电极的表面积增大。他们对此作了详细的实验验证和理论计 算，发现吸附在粗糙a g 表面上的吡啶的拉曼散射信号与溶液相中的同数量的吡啶的 拉曼散射信号相比，增强了约6 个数量级，这是一种从未被认识到的、与粗糙表面有 关的巨大的增强效应，即s e r s 效应。1 0 6 倍表面信号的增强相当于将人们所感兴趣 的表面单层分子( 或离子) 放大成一百万层，因而s e r s 能避免溶液相中相同物种的 信号干扰，轻而易举地获取高质量的表面分子信号。 经过大量的实验理论研究，人们归纳得出s e r s 效应具有以下一些特点 1 4 - 1 8 】： 第一章 a gu a ut 复合纳米粒子在表面增强拉曼免疫分析( s e r i a ) 中的应用 1 在贵金属a u 、a g 和c u 体系的表面增强因子( s e f ) ，通常高达1 0 6 。其他“自 由电子”金属( 如碱金属) 的报道则很少。许多过渡金属( 如p t 、r h 、f e 、c o 和 n i 等) 的s e f 值取决于金属性质，范围在1 0 1 0 3 。 2 只有经过合适的表面预处理后的粗糙金属表面才能产生s e r s 效应，表面粗 糙方法有许多种，最常见的是电化学氧化还原循环法( o r c ) ，其余还有化学刻蚀法、 电沉积法、真空溅射法、溶胶自组装法以及氧化铝模板法等等。 3 微观尺度粗糙表面对化学增强机理起着关键作用。通常在金属电极表面产生 几十至上百纳米的粗糙颗粒能够起到最佳的增强效果。 4 吸附在金属表面的第一层分子能够得到最大增强，随着吸附分子层数的增多， 增强效应逐步减弱，但同时s e l l s 具有长程效应，在离金属电极表面几十纳米处吸附 分子的信号也能得到一定的增强。 5 不同吸附分子在相同粗糙度的金属表面所得到的增强效应也不一定相同。例 如c o 和n 2 的极化率几乎相等，但是它们的增强因子却相差很大。一般通过物理作 用吸附于表面的分子( 离子) 增强较小。 6 s e r s 谱峰的频率和位移与金属电极电势有关，这是因为不同的电极电势下 吸附分子的吸附强度和方式都会有所不同。s e r s 活性有时可能会不可逆的消失。但 是在重新进行o r c 过程后又会恢复。 s e r s 增强机理 对于s e l l s 效应，人们提出许多不同的理论模型来解释这种现象。由于分子的拉 曼散射是分子在外电场作用下被极化而产生极化率，交变的极化率在再发射的过程 中，受到分子中原子间振动的调制，从而产生拉曼散射光。散射光的增强可能是由于 作用在分子上的局域电场的增加和分子极化率的改变。已提出的理论模型可分为两大 类：电磁场增强( e m ) 和化学增强( c t ) 1 9 2 1 。电磁场增强理论认为s e r s 的发 生起源于金属表面局域电场的增强，而化学增强理论认为s e r s 与分子极化率的改变 有关。 1 电磁场增强理论 电磁场增强机理是一种物理模型，具有一定表面粗糙度的金属基底的存在，使得 入射激光在表面产生的电磁场较大地增强，由于拉曼散射强度与分子所处光电场强度 的平方呈正比，因而极大的增加了吸附在表面的分子产生的拉曼散射强度，从而提高 4 a g - a u 复合纳米粒子在表面增强拉曼免疫分析( s e r i a ) 中的应用 第一章 检测到表面拉曼强度。但该种模型无法解释一些问题，如不同的吸附分子在同一s e l l s 活性基底上出现不同的增强效应；s e r s 谱峰的相对强度与常规拉曼光谱相比发生了 明显的变化；只有当吸附分子以化学成键或形成表面络合物的方式吸附于金属表面才 可能表现出非常高的增强因子；分子吸附在某些特殊的活性位上才产生s e l l s 信号， 而一些实验表明在基底上只存在少量的表面活性位；电化学体系中，吸附分子的s e r s 强度往往是所加电极电位的函数 1 5 ，2 0 ，2 2 2 4 。以上现象表明除了电磁场增强作用 外，必然还有化学( c t ) 增强效应在起作用。 2 化学增强理论 化学增强机理则主要研究吸附物种和金属表面作用以及成键效应，科学家们提出 的化学增强模型有活位模型和电荷转移模型等。活位模型认为，不是所有吸附在基体 表面的分子都能产生s e l l s 信号，只有吸附在基体表面某些被称为活位上的分子才有 强的s e r s 效应。用电化学方法粗糙化的a g 电极表面，用欠电位法沉积上覆盖度为 3 的n 后，吸附分子的s e l l s 信号消失，该结果证明了能产生s e r s 的活位只占基 体表面很小的一部分。在化学增强机理中最受关注的是金属和吸附分子间电荷转移增 强，即金属一电荷转移络合物模型。迄今一般认为，电荷转移有电荷从金属转移到吸 附分子或从吸附分子转移到金属表面两种，以前者为例，主要包括以下四个过程 2 5 - 2 6 ： ( 1 ) 处在金属费米能级附近的电子吸收激发光子而被激发到比费米能级更高的 轨道上，在费米能级以下轨道产生空穴，因此在金属一侧形成了电子一空穴对； ( 2 ) 吸收了光子能量的电子转移到吸附分子的l u m o 能级，此过程的完成需要 吸附分子和金属表面之间存在化学作用并与吸附原子或原子簇等活性中心形成表面 化合物； ( 3 ) 电子再次跃迁回到金属，此过程中分子的某些振动能级发生变化，吸附分 子处于某一振动激发态； ( 4 ) 返回的电子与金属内部的空穴复合并辐射出一个拉曼光子。在这四个过程 中起决定作用的是第一和第二两个过程，它关系到激发光的光子能量能否与电子跃迁 所需能量匹配，两者接近或相等才可能发生类共振现象，才可能通过改变激发光波长 实现电荷转移。 化学增强效应只在分子尺度的短程范围内对s e r s 有贡献。这种机理依赖于吸附 第一章 a gm a u 复合纳米粒子在表面增强拉曼免疫分析( s e r i a ) 中的应用 位、成键的构型与吸附分子的能级。电荷转移过程对总的s e r s 增强因子的贡献约为 l o 1 0 3 。 虽然e m 和c t 两种机理的研究已开展得很广泛，但由于s e r s 实验现象十分复 杂，一般体系中同时存在这两种增强机理，对于何种条件下以何种机理为主以及定量 研究两机理的贡献尚未有定论。 s e r s 在生物化学研究中的应用 发展日渐成熟的s e l l s 技术极大地提高了拉曼光谱检测的灵敏度，单分子检测的 出现 2 7 2 8 为s e r s 在生物化学方面的应用开拓了全新的局面。s e l l s 在生物分子检 测的应用无论从宏观还是痕量分析方面都优于普通拉曼光谱，主要体现在三个方面 2 9 - 3 3 ：1 、极高的检测灵敏度。在具有s e r s 活性的金属表面，极大的增强赋予其 高的灵敏度、分辨率以及极低的检测极限。在浓度为1 0 q o m o l l 的样品里还能获得样 品的拉曼光谱，这对于研究价格高、数量少、浓度低的生物样品是非常合适的。如果 入射光的频率与吸附分子的吸收带频率发生共振，产生表面增强共振拉曼谱( s e 砌峪) 时，其检测灵敏度会更高。在一些纳米“热粒子”上，某些分子如染料分子、血红蛋 白等的s e r s 信号灵敏度可与荧光光谱媲美，甚至超过了荧光光谱；2 、荧光淬灭。 用拉曼光谱研究生物分子时，经常会产生荧光背景，使得很多拉曼信号湮灭在很强的 荧光背景中，而s e r s 可以使荧光发生淬灭，获得清晰的拉曼谱峰；3 、s e l l s 表面选 律。只有在租糙金属表面或很接近表面的分子能够在s e r s 光谱中提供信号，因此可 以借此判断生物分子的吸附模型和活性作用位。目前，s e r s 在化学生物中的应用主 要有以下几个方面： 1 s e r s 在小分子检测和分析中的应用 s e r s 技术在小分子检测和分析中最主要的应用是对麻醉剂和药物的检测。例如 b e l l 和s i r i m u t h u 3 4 用可重复使用的聚合物包裹的a g 胶基底定量检测了o 1 - 1 0p p m 范围内烟碱。但在多数情况下，检测烟碱需要分析生理液体如血液、尿液、唾液等， 此时便会出现两大问题：首先分析物数量少，其次这些生理液体通常含有大量的干扰 物质。因此在进行s e r s 检测前必须将样品进行提纯和分离。s c h n e i d e r 小组 3 5 3 7 1 将液相色谱仪( h p l c ) 和s e l l s 技术进行联用研究了大量的烟碱包括可卡因、吗啡、 安非他明、l ，4 苯( 并) 二氮唑以及各种药类代谢物。他们的结果表明h p l c 能从血 液和尿液中有效地分离各种物质进行可重现性的s e r s 分析，但由于乙氰能够吸附在 6 a gt t a ut 复合纳米粒子在表面增强拉曼免疫分析( s e r i a ) 中的应用 第一章 s e r s 基底上并很难被低浓度的分析物所取代，因此不能用乙氰洗脱液进行洗脱分离 烟碱及各种药类代谢物，避免乙氰分子对s e r s 光谱带来的干扰。另外一些能与s e l l s 技术联用的技术还包括毛细管电泳法 3 8 1 ，流动注射分析法( f i a ) 3 9 1 。人们更关注 于f i a 与s e r s 联用的研究，这是因为s e r s 和f i a 的联用可以从植物提取物中定量 地分析氰化物的含量，而这一物质的含量是对那些含有氰酸甙植物的食物安全性进行 检测的一重要指标。 唾液是另一种用于临床分析的生理液体。f a r q u h a r s o n 等采用s e r s 在水溶液中 测得与唾液中浓度相当的5 氟二氧嘧啶。然而在实际唾液体系中，通常会存在生理硫 氰酸盐干扰测量 4 0 】。尽管如此，只要能够扣除干扰物质的影响，s e r s 还是可以成 为一种检测唾液成分的有效分析手段。在使用s e r s 技术进行分子检测过程中需要考 虑的另一个因素是p h 对s e l l s 光谱的影响，例如青霉胺在不同的p h 值下会产生不 同的s e r s 谱峰 4 1 1 。 s e r s 在小分子检测中另一个令人感兴趣的方向是用s e r s 来研究各种药物分子 与生物分子和环境的相互作用。s e r s 已经被用于研究各种抗癌药与蛋白的丰旺作用 4 2 - 4 3 ，从而佐证药物作用机理。如f a b r i c i o v a l 等人对大黄素与脱去脂肪酸的人血清 白蛋白，和未脱去脂肪酸的人血清白蛋白作用的s e r s 谱图进行分析，佐证了大黄素 与人血清白蛋白的作用位与作用机理 4 3 1 。 2 s e r s 在生物小分子检测中的应用 对于一些氨基酸、二肽的s e r s 研究，目前主要是通过讨论其振动谱峰的归属， 判断分子在基底表面的键联模型、几何模型、吸附类型以及增强机制等。人们发现在 一些氨基酸、二肽的s e r s 谱图中存在一个很有趣的现象便是谱峰会随时间发生改变， 这些变化可能是由于氨基酸一开始是通过羧基与a g 纳米粒子表面相连，发生重排后 通过胺基与表面相连。在以薄层层析( ) 基底进行氨基酸分析时，选用近红外光 ( n i r ) 比可见光更适合于该体系的s e r s 研究【4 4 】，目前，用s e r s 技术已经可以检 测到浓度范围为0 4 5 “m o l l 的兴奋性氨基酸( 谷胺酸、天冬胺酸) 4 5 。 在对较复杂的生物分子如寡聚核苷酸的分析中，可以将s e r s 和s e r r s ( 表面增 强共振拉曼散射) 交替使用。由于分析物中发色团的存在，s e r r s 光谱的产生除了 s e r s 效应之外还存在着表面共振效应，这两种效应的叠合产生了一个很高的增强， 因此可以获得比荧光光谱更高的检测灵敏度【4 6 】。目前s e r r s 已被成功地应用于微流 7 第一章 a g s a u 复合纳米粒子在表面增强拉曼免疫分析( s e r i a ) 中的应用 控体系中 4 7 】，通过选择合适的发色团可使检测物的浓度低至1 0 1 1m o l l 4 8 。寡聚糖 是另一种重要的生物分子，用s e r s 光谱可以区别出两个非常相似的寡聚糖化合物， 并且进行定量地分析【4 9 】。此外，用s e r s 光谱还可以模拟研究谷胱甘酸过氧化酶的作 用机理 5 0 1 。 3 s e r s 在生物大分子分析中的应用 s e r s 对于蛋白质研究也逐渐显示出它的优越性。采用s e 黜峪已经可以从单分 子层次上研究g f p 蛋白质( 绿荧光蛋白) 【5 1 】，用s e l l s 光谱还能区别相类似的蛋白 分子，如人类的胰岛素和其类似物离脯胰岛素【5 2 】。 另外标记免疫分析技术的发展使得s e r s 技术可以应用于检测更为复杂的蛋白 质。在此状况下，蛋白质信息的获得无需通过复杂的谱峰归属，而是可以通过连在纳 米粒子上标记分子信号的读出，以及生物体内反应的特异性来获得复杂蛋白质的信 息。 4 s e r s 在细胞和细菌检测中的应用 s e l l s 也可以应用于生物体内更复杂的体系研究，例如哺乳动物细胞和细菌。在 这些体系中，由于可采用近红外光作为激发光源，与荧光技术相比对生物体的损伤更 小，因而显示出更大的优越性。此外，s e r s 还可用于一些生理环境变化如p h 变化 对细胞影响的研究 5 3 】，对于处于特殊位置的一些细胞可以采用包裹上一层s e r s 基 底的锥形光纤进行测量【5 4 】，将先进的光纤技术与显微操纵系统相结合可以精确地从 细胞腔内获得s e r s 谱图，尽管在这项工作中，只是将光纤应用到植物细胞内研究， 但为将这一技术运用到人类和动物细胞内研究奠定了很好的基础。 s e r s 还可以用于大小为微米级整个细菌的研究。将s e r s 与化学统计结合，通 过对不同菌种和不同菌株的大肠杆菌的s e r s 谱图进行统计分析，成功区分不同的细 菌菌株【5 5 】。在两极生态系统中，存在着一种细菌，能够在零摄氏度下生存，但人们 至今仍不知道在这些细菌的外细胞表面到底存在什么物质使它们能够在低温下生存。 l a u c k s 等人对5 种北极存活的细菌菌株的s e l l s 谱图进行研究，并与大肠杆菌、绿脓 杆菌的s e r s 谱图进行比较。研究表明这5 种菌株的s e r s 光谱非常相似，然而与大 肠杆菌、绿脓杆菌的s e r s 谱图明显不同，通过5 种菌株s e l l s 谱图的指认表明在这 些细菌的外膜内含有未饱和的脂肪酸f 5 6 】。s e r s 光谱可以获得很强的拉曼谱峰并降 低荧光背景的干扰，区分不同细菌的生理成分的不同。 r a ga a u 复合纳米粒子在表面增强拉曼免疫分析( s e p i a ) 中的应用 第一章 1 3 标记免疫学的发展 免疫学是近代生物化学和医学的一个重要分支，是人们在长期与疾病斗争的实 践过程中产生的- - f 3 重要学科。而免疫分析方法( i m m u n o a s s a y ) 则是研究免疫学的 工具。免疫分析主要是利用抗体( a n t i b o d y ) 能够与相应抗原( a n t i g e n ) 及半抗原 发生自发的、高选择性的特异性结合这一性质，通过将特定抗体( 或抗原) 作为选 择性试剂来对相应待测抗原( 或抗体) 进行分析测定的方法。它的提出及发展是2 0 世纪以来在生物分析化学领域所取得的最伟大的成就之一。同时，由于m i l s t e i n 和 k 0 h l e r 于1 9 7 5 年首次在体外( i nv i t r o ) 合成单克隆抗体，极大地促进了免疫分析方 法的发展和应用。为此，m i l s t e i n 和k 6 h l e r 也获得了诺贝尔化学奖。 由于大部分抗体不能被直接观察，也不能直接被定量，因此人们发展了标记免疫 分析方法，其基本原理是利用抗体抗原结合反应的特异性，加上各种标记物的可测 量性来方便敏感地检测各种体内微量生物活性物质，包括内分泌激素、蛋白质、多肽、 核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物、血药浓度等：今天， 经过几十年的飞跃发展，在标记免疫分析方法上，已经建立了包括放射免菠分析 ( r i a ) 、荧光免疫分析( f i a ) 、酶联免疫分析( e l i s a ) 、发光免疫分析( l a ) 、电 化学免疫分析( b c 认) 在内等一系列分析方法，并在临床肿瘤诊断和手术后观测、 环境及食品领域的质量监测等人类生活中的方方面面发挥着重要的作用 5 7 6 0 。 1 、放射免疫分析 放射免疫分析是1 9 5 9 年由b e r s o n 和y e l o w 等首先发展并用于糖尿病患者胰岛素 含量的测定。该方法包括放射免疫分析( r i a ) 和免疫放射分析( i r m a ) ，通过放射 活性分子共价交联至抗体或抗原上，免疫反应后测定放射活性分子的放射信号来定量 检测相应抗体或抗原等，可用于测定包括病毒、细菌、寄生虫、肿瘤以及小分子药物 等的多种抗原和抗体。由于该方法特异性好，灵敏度高，且仪器自动化，操作简便， 样品制备简单等，因而自5 0 年代末问世以来已在许多领域中得到广泛的应用。但该 方法中操作人员需要接触放射性物质，会损害操作人员的身体，同时测定完成后放射 性材料的处置也是个严重的问题。因此自7 0 年代末至8 0 年代初出现的非同位素标记 技术得到了极大的重视和发展，并迅速降低了放射免疫分析在诊断中的地位，尽管如 此，放射免疫分析在现代免疫分析中仍然占有较大的比例。 2 、荧光免疫分析 9 第一章 a g t a u 复合纳米粒子在表面增强拉曼免疫分析( s e r i a ) 中的应用 本世纪4 0 年代，c o o n s 等采用荧光素标记抗体检测可溶性肺炎球菌多糖抗原， 首次创建了荧光抗体检测技术。至今，利用一些有机化合物( 例如荧光素) 、荧光底 物或稀土鳌合物等标记物的荧光免疫分析技术已广泛应用于微量、超微量物质分析测 定。该技术包括竞争结合荧光免疫分析( c o m p e t i t i v eb i n d i n gf l u o r o i m m u n o a s s a y , f i a ) ，免疫荧光分析( i m m u n o f l u o r e m e t r i ca s s a y s ，i f m a ) ，荧光偏振免疫分析 ( f l u o r e s c e n c ep o l a r i z a t i o ni m m u n o a s s a y ) 和时间分辨荧光免疫分析( t i m e - r e s o l v e d f l u o r e s c e n c ei m m u r t o a s s a y ) 。由于相对较低的灵敏度和需要相对昂贵的仪器。该方法 在定量测定中的应用受到一定的限制。 3 、酶免疫分析 酶免疫分析( e n z y m ei r n m u n o a s s a y , e i a ) 是将抗原、抗体的特异性免疫反应和 酶的高效催化作用有机结合起来的一种免疫分析方法。将特定的酶标记在抗原或抗体 上，在免疫反应后。通过肉眼观察或借助简单的光学仪器测定酶催化底物所生成的有 色产物的颜色或吸光度可方便的进行定量测定。该方法中酶标试剂容易制备、性质稳 定、有效期长，且克服了放射免疫分析中放射性同位素对操作人员的危害及荧光免疫 分析中所需仪器复杂的缺点，保持了放射免疫技术的灵敏度，成为目前临床检验中应 用最为广泛的免疫分析技术。 4 、发光免疫分析 发光免疫分析依据发光物质不同，一般包括利用鲁米诺、吖叮酯及它们的同系物 等发光物作为标记物的化学发光分析( c h e m i l u m i n c s c e n ti m m u n o a s s a y , c l i a ) 和利 用荧光素酶、水母发光蛋白等作为标记物的生物发光免疫分析( b i o l u m i n e s c e n t i m m t m o a s s a y , b l i a ) 。化学发光免疫分析最常用的方法为竞争结合化学发光免疫分析 ( c o m p e t i t i v eb i n d i n gc h e m i l u m i n e s c e n ti m m u n o a s s a y , c i a ) 和免疫化学发光分析 ( i m m u n o c h e m i l u m i n o m e t r i ca s s a y , i c m a ) 。 5 、电化学免疫分析法 电化学免疫分析法( e l e c t r o c h e m i c a li m m u n o a s s a y , e c i a ) 是将免疫技术与电化学 检测技术相结合的一种免疫分析新方法。1 9 5 1 年b r e y e r 和r a d c l i f 首次用极谱方法测 定了由偶氮标记的抗原，这成为电化学免疫分析的开端。虽然这种方法早于r i a 法， 但由于受当时电化学分析技术及仪器的限制。还不能满足抗原测定的需要，所以，该 方法在将近3 0 年里没有引起科学家的重视。六七十年代后，电化学分析仪器及技术 1 0 垒! 竺! 墨鱼竺鲞塾三垄耋里苎墅垫呈叁壅坌塑! ! 墅坠! 主塑查旦 墨二兰 有了突破性的进展，如液相色谱电化学检测、电化学流动注射分析、微分脉冲伏安法、 阳极溶出伏安法等方法的发展，可以用现代电化学技术测定小体积的样品中的痕量物 质，同时由于电化学仪器固有的成本相对低廉，灵敏度高，易于微型化等特点，从而 使得电化学免疫分析法在临床测定方面发展迅速。 除了上述几种主要的免疫分析方法外，人们还发展了核酸免疫、d n a 免疫、免 疫p c r 技术、基因免疫技术等高专一性、高灵敏性的技术。从测定原理和应用上看， 免疫分析的发展将存在两条并行的路线。一是免疫分析法继续在分析的可靠性和灵敏 性上不断的革新、完善和进步，为生化研究和临床分析提供更为准确和实用的新方法； 二是伴随现代生物技术的不断发展，免疫分析将渗透到各种全新的研究领域，这将集 中表现在以下方面：( 1 ) 基因