（食品科学专业论文）白酒窖泥中酵母菌的分离鉴定及发酵特性研究.pdf

摘要 酵母是工业酒精发酵和酒类饮料发酵不可或缺的微生物，对发酵过程中乙醇 的产量起着关键的作用。我国白酒酿造一般采用含有复杂微生物种类的酒曲进 行，并在酒窖这种特殊的发酵环境中进行发酵，因此酒窖中的窖泥中有非常丰富 的微生物群系，包括种类丰富的酵母。本试验的目的是从某白酒厂提供的窖泥中 分离酵母菌，对其生理生化特性和发酵特性进行鉴定，以期获得可以工业应用的 酵母菌种。 本试验将窖泥接种至麦芽汁液体培养基进行增菌培养，然后将增菌培养液接 种至含有氯霉素的y e p d 琼脂培养基。培养后选取符合酵母菌落特征的菌株9 8 株， 用于之后的进一步筛选和鉴定。 对这些菌株进行温度适应性试驻将其接种至y e p d 液体培养基，分别于3 2 、3 6 、4 0 、4 4 、4 8 条件下培养，获得耐受4 4 温度的菌株1 8 株。将 该1 8 株菌接种至y e p d 琼脂培养基，。生长后加入t t c 上层培养基，通过颜色的变 化观察其呼吸强度，选取呼吸强度高的红色菌落进行菌株的乙醇耐受性试验。将 这些菌株接种至含1 0 乙醇和加有杜氏小管的y e p d 液体培养基中进行培养，其 中有1 0 株菌生长良好，表现出对乙醇的耐受性。 。 对上述1 0 株菌进行形态学观察和生理生化鉴定，1 0 株菌均为酵母菌，分别 属于5 个种，其中酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 4 株，异形汉逊酵母 ( h a n s e n u l ap o l y m o r p h a ) 2 株，鲁氏接合酵母( z y g o s a c c b a r o m y c e sr o u x i l ) 2 株，耐热克鲁维酵母( k 1 u y v e r o m y c e st h e r m o t o l e r a n s ) 1 株，粟酒裂殖酵母 ( s c h i z o s a c c h a r o m y c e sp o m b e ) l 株。 从上述5 个菌种中各选取1 株菌进行生长和发酵特性研究，获得了各株菌的 最适生长和最适发酵条件参数。其中酿酒酵母a 1 在最适培养条件下乙醇产量最 高。以酿酒酵母a l 作为出发菌，以玉米面为发酵原料，探索了温度、p h 、接种 量、摇床速度、氮源等因素对乙醇产生量的影响，获得的优化发酵条件的参数。 本试验从白酒窖泥中分离出了5 种共1 0 株耐高温、呼吸强度高和耐乙醇的酵 母菌种，对其生长和发酵特性进行了研究，并对1 株菌进行了发酵条件的研究和 优化。在阐明白酒酵母菌系的同时，所获得的酵母菌种有望用于工业化生产，具 有良好的应用前景。 关键词：酵母菌白酒窖泥分离鉴定发酵 a b s t r a c t y e a s t sa r eo r g a n i s m st h a tw i d es p r e a di nn a t u r e ，a n dm o s to ft h e ma r ec a p a b l eo f p r o d u c i n ge t h a n o lw h i c hi se s s e n t i a lt ot h el i q u o ri n d u s t r y i nc h i n e s et r a d i t i o n a lc r a f t ， l i q u o ri s f e r m e n t e di nc e l l a ra n dh e n c et h ec e l l a rm u de o n m m sd i v e r s ek i n d so f m i c r o o r g a n i s m si n c l u d i n gm a n ys p e c i e so fy e a s t s t 【l i sp a p e ra i m sa ti s o l a t i n gy e a s t s f r o mc e l l a rm u dw h i c hw e r ec o l l e c t e df r o mad i s t i l l e r y , m a k i n gi d e n t i f i c a t i o nt h r o u g h p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a le x p e r i m e n t sa n dt e s t i n gf e r m e n t i n gc h a r a c t e r i s t i c s t h ec e l l a rm u dw a si n o c u l a t e di nm a l te x t r a c tm e d i u ma n dt h e nw a sp r o l i f e r a t e d i ny e p d c h l o r a m p h e n i c o ll i q u i dm e d i u m at o t a lo f 9 8s t r a i n sw h i c hc o n f o r m e dt o t h ec h a r a c t e r i s t i c so fy e a s tc o l o n yw e r ei s o l a t e df o rf u r t h e rs c r e e n i n g t h et e m p e r a t u r e - e n d u r i n gp r o p e r t i e so ft h e9 8s t r a i n sw e r ea n a l y z e d t h es t r a i n s w e r ei n o c u l a t e di ny e p dl i q u i dm e d i u ma t3 2 、3 6 、4 0 、4 4 、4 8 a n d1 8 s t r a i n sw e r ec a p a b l eo ff e r m e n t a t i n ga t4 4 c r e s p i r a t o r yi n t e n s i t yo ft h e18s t r a i n s w a st e s t e db yi n o c u l a t e di n1 v r ct o pa g a r b yi n o c u l a t e di ny e p dl i q u i dm e d i u m w h i c hc o n t a i n e d1o a l c o h 0 1 10s t r a i n sw e r es c r e e n e df o rs t r o n g e ra b i l i t yo f e n d u r i n ga l c o h 0 1 a c c o r d i n gt ot h em o r p h o l o g i c a la n dc u l t u r a lt r a i t s ，p h y s i o l o g i c a lp r o t e r t i e sa n d b i o c h e m i c a lr e a c t i o n s ，a n dt h ea b o v e1 0s t r a i n sw e r ep r i m a r i l yc l a s s i f i e da sf o l l o w s ： s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ( 4 ) ，h a n s e n u l ap o l y m o r p h a ( 2 ) ，z y g o s a c c h a r o m y c e sr o u x i l ( 2 ) ，k l u y v e r o m y c e st h e r m o t o l e r a n s ( 1 ) a n ds c h i z o s a c c h a r o m y c e sp o m b e ( 1 ) o nt h eb a s i so fs t u d y i n gt h er e s i s t a n c ec a p a b i l i t yo fa l c o h o l ，s u g a ra n da c i d ，t h e b e s tt e m p e r a t u r ea n dp hv a l u eo f e a c hg e n e r a , i ti ss u g g e s t e dt h a tt h ei s o l a t e ds t r a i no f a 1h a st h eh i g h e s ta b i l i t yt op r o d u c ea e o h 0 1 t h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o na n dm e d i u m o fa ih a v eb e e no p t i m i z e d t h r o u g hs i n g l ef a c t o ra n do r t h o g o n a le x p e r i m e n t s t h e o p t i m u mc o n d i t i o n so f a la r eo b t a i n e d i nt h i sp a p e r , 10s t r a i n sw i t hs t r o n g e ra b i l i t yo fe n d u r i n gh i g h a l c o h o la n dh i g h t e m p e r a t u r ew e r ei s o l a t e df r o mc e l l a rm u da n dt h ep r e l i m i n a r yr e s e a r c h o nf e r m e n t a t i o n c h a r a c t e r i s t i c sw a ss t u d i e d t h e s es t u d i e sh a v ei m p o r t a n tm e a n i n gt ot h es t r a i n si nm a k i n gf u l lu s e o f a l c o h o lp r o d u c t i o n k e yw o r d s ：c e l l a rm u d ，y e a s t , i s o l a t i o n , i d e n t i f i c a t i o n ，f e r m e n t a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨鲞盘鲎或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：蜘匆数 签字日期： ? 年 驴月乒日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解苤鲞盘鲎有关保留、使用学位论文的规定。 特授权丕奎态堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：新脚魂 签字日期；y 0 1 年0 月甲 日 导师签名： 闻乞j i z 签字日期：叩年乡月日 第一章文献综述 第一章文献综述 中国白酒是我国特有的传统酒种，在漫长的发展过程中形成了独特的工艺和 风味特征，在世界范围内享有很高的声誉，与白兰地、威士忌、朗姆酒、伏特加、 金酒齐名，被誉为世界著名的六大蒸馏酒之一。白酒传统酿造以含有复杂微生物 种类的酒曲作为发酵剂，以淀粉质、糖质为原料，在泥窖窖池中完成酒精的发酵 过程。在发酵过程中，窖泥和发酵糟醅密封接触，大量微生物在两者间扩散、交 换，最终使得作为发酵容器的窖泥中含有包括酵母菌在内的非常丰富的微生物群 系，因而也使得白酒厂窖池窖泥成为酵母菌及其他微生物分离选育的良好来源。 1 1 白酒客泥概述 窖池大多由弱酸性黄泥粘土建造而成，白酒发酵时以泥窖窖池作为发酵容 器，将经蒸煮糖化的糟醅密封于窖池中，使其自然发酵。当糟醅被封盖发酵后。 随着发酵产热、产气，窖内压力增加，产生了大量“黄浆水”，成为窖泥与糟醅 物质交换的载体【1 1 。酒糟中的养份和来自曲药、环境的微生物及其代谢产物不断 通过黄浆水渗入泥中，使窖泥成为大量微生物的生长介质。每一次发酵过程，黄 浆水都为窖泥中的微生物带来营养物质，同时也带来更多种类的微生物，在实现 窖泥自身新陈代谢的同时，也完成窖泥与糟醅的物质能量交换，窖龄越长，微生 物和香味物质越多，酒香越浓。简而言之，窖泥是发酵中几乎所有菌种的集合载 体，在发酵过程中协助合成各种风味。 窖池在酿造使用过程中通过长期的驯化会因使用环境、用水、温度的不同而 形成特定的微生物环境【2 】。我国历史悠久的几大名窖都是长期不问断地培养，再 加上特殊的地质土壤气候条件等才形成的。以五粮液酒厂窖池为例，经过几百年 不间断发酵的积累，该厂窖池中的窖泥中的菌群种类极为丰富，被视作国宝。 作为酒精发酵容器，窖池的窖泥中含有种类丰富的酵母菌。这些酵母菌长期 处于发酵环境中，经过自然筛选、诱变而具有一定的特殊性质，如耐高温、耐高 糖、耐乙醇等。 1 1 1 国外酒精生产现状 酒精，化学名为乙醇，分子式为c 2 h 5 0 h ，是一种分子结构简单的二元醇， 第一章文献综述 具有很强的挥发性和刺激性气味，极易燃烧。同时放出大量的热量。化学性质上， 乙醇十分活泼，可与水、醇类、乙醚、苯、甘油等有机溶剂混合，也可与多种金 属盐类、碳氢化合物、脂肪酸等起化学反应，是许多化工产品如乙酸、乙醛、丁 醇和乙烯的生产原料。酒精广泛地应用于人们生活的各个方面，有着巨大的需求。 在国民生产中，酒精工业也占有重要的位置，长期以来在医药、化工、食品、农 业及国防工业都有广泛的应用。 自2 0 世纪7 0 年代石油危机以来，各国出于战略考虑，纷纷开始了可替代石 油的新燃料研究。燃料酒精作为生物燃料的重要，在国外已经有了比较成熟的产 业化发展。目前发展燃料酒精项目最为活跃的国家是美国和巴西，这两个国家酒 精产量约占全球总产量的9 5 以上，其中，巴西产量约占全球总产量的5 8 ， 美国产量约占全球总产量3 8 。其次是加拿大墨西哥等国家而现在欧洲各国也 开始逐步研究、推广和使用生物燃料【3 j 。研究表明，酒精作为内燃机的燃料与汽 油相比有很多优势。酒精便于储存、输送，并且完全与现有的加油站设施相容， 且在减少环境污染方面还有极大的优势。 巴西自然条件优越，甘蔗资源丰富，在以甘蕉作为原料发展燃料酒精工业方 面极具代表性。目前巴西是世界上最大的燃料酒精生产和消费国。2 0 0 0 年巴西 共消费了3 4 0 亿升汽油，消费燃料酒精约1 6 0 亿升( 其中约1 2 3 4 用于酒精汽油， 其余直接使用) ，这也使得巴西成为世界上唯一不使用纯汽油作为汽车燃料的国 家；美国是能源消耗大国，每年石油消耗量中的5 0 是需要进口，占美国贸易赤 字的4 5 左右。目前美国燃料酒精年产5 0 0 万吨，美国政府已颁布法令规定 3 7 个大城市的汽车所用的汽油中必须添加5 的燃料酒精，这一法令的实施给美 国国家贸易平衡贡献将近1 5 亿美元1 4 】：欧洲已对发展生物燃料表现出极大兴趣， 因此世界范围内酒精生产新一轮增长很可能会发生在欧洲，欧盟目前酒精年产量 为1 7 5 万吨左右，酒精汽油的使用量大约1 0 0 万吨。1 9 9 2 年欧共体通过法律， 统一各种矿物油的消费税。对于可再生资源为原料生产燃料的试验性项目，成员 国可采取免税政策，而燃料酒精包括在有税收优惠之列。由于燃料酒精的生产成 本较汽油高，故税收优惠的原则是将酒精汽油的价格调到与汽油相当的水平l5 1 。 纵观各国燃料酒精的推广和发展，不难发现其成功的应用都离不开两方面因 素：一是政策保障：如巴西为了增加酒精对消费者的吸引力，在加油站以汽油价 格的5 9 来出售；美国采取税收鼓励政策，即减免燃料货物税，数额由燃料中酒 精含量而定，含量越高，物税减免比例就越大：二是技术保障，包括实验室中酵 母菌株的筛选选育、培养条件的优化、生产工艺的创新以及生产设施的完善等。 其中作为发酵核心的优良酵母选育，在降低成本、提高生产效率方面无疑起到至 关重要的作用。 2 第一章文献综述 1 1 2 国内酒精生产现状 中国酒精工业的发展已有近百年的历史，但工业基础十分薄弱建国后，随 着国民经济的发展和白酒液态法生产法的推广，酒精工业进入崭新的发展阶段。 发酵原料主要以甘蔗糖蜜、甜菜糖蜜、玉米、木薯、红薯干为主，黑龙江、吉林、 山东、安徽、河南、广西等地酒精制造业较为发达，是目前中国酒精的主要产区。 但是目前国内供求需求以及发展趋势都朝着有利于燃料酒精的方向发展。自 上世纪9 0 年代中期开始，我国酒精生产能力就己经开始过剩。酒精价格受甘蔗、 玉米等的生产和市场供求关系影响较大。一方面，由于近年粮食生产的丰收以及 消费者喝酒习惯由白酒转向果酒而导致酒精生产市场疲软。另一方面，由于经济 的发展，生活水平的提高以及汽车关税的人幅度下降，我国的汽车消费浪潮逐渐 到来，由此汽车燃料的需求将大幅度提高。与此同时，作为一个人口众多、能源 相对匮乏的国家，在新时期又面临着能源开发与环境保护的双重问题。一方面， 我国煤炭、石油等能源资源有限，开采成本高昂，而国际原油价格受国际部分国 家操控，制约工业、制造业等行业的迅速发展；另。一方面由于技术所限导致的 开采利用低效，以及过多依赖化石燃料，环境污染和资源过度开采已经引发了大 量的环境问题，影响到可持续发展的顺利进行。生产和使用燃料酒精在一定程度 上不但可以缓解石油供求矛盾，而且也可以扩大玉米等原材料消费市场，带动农 业生产增加农民收入、消化陈化粮【6 】。另外，燃料酒精的使用还可以有效降低汽 车尾气中有害气体的排放，改善了环境和空气质量，节约石油资源、减少对进口 石油的依赖并且以酒精替代m t b e ，避免了m t b e 引起的污染，减少汽车尾气 中一氧化碳和碳氢化合物的排放，改善环境质量。 为此。我国政府正大力推进包括太阳能和燃料酒精在内的清洁能源研究计划 的进行。2 0 0 1 年我国已经将“大力发展燃料酒精”产业列入十五燃料酒精高产 酵母菌株选育及应用研究计划中，并且在国民经济和社会发展第十个五年计划 纲要中做了明确的要求。2 0 0 1 年9 月2 2 曰，中国石油天然气集团公司、吉林 粮食集团公司和中国华润总公司共同出资，在我国吉林省吉林市建立了第一个 6 0 万吨燃料酒精项目，项目总投资达2 9 亿元人民币，并计划在交通运输行业中 推广使用燃料酒精【7 】。而在技术方面，我国工业微生物技术人员也正在积极探求 选育具有发酵力强，繁殖速度快，耐酒精能力强，耐温性能好，抵抗杂菌能力强， 生产性能稳定，变异性小等优良特性的菌种【6 1 ，以期投入生产获得高效回报。 第一章文献综述 1 2 酒精发酵的研究现状 酒精生产方法通常有两类：微生物发酵法和化学合成法。其中化学合成法生 产的酒精往往夹杂高级醇类，对人体神经中枢有麻痹作用，不能食用，一般被称 为工业酒精。用化学合成法生产酒精，生产设备要求、生产条件和成本均比较高， 我国一般不用此方法，基本上是用淀粉质或糖质原料进行发酵生产：发酵法又分 为固体发酵法、半固体发酵法和液体发酵法三种。目前固体发酵法和半固体发酵 法在我国主要用于生产白酒，一般产量较小，生产工艺较古老，劳动强度大。而 在现代大生产中，都采用液体发酵法生产酒精，它与固体发酵法相比，具有生产 成本低、生产周期短、连续化、设备能自动化，大大减轻劳动强度等优点。 不论是固体、半固1 1 奉、液体发酵法，都是利用淀粉作原料，经过微生物发酵 转化为糖，再由糖转化为酒精。转化时原料中的可溶性淀粉在糖化酶的作用下被 转化为可发酵的糖，然后在酵母作用下糖水解成酒精并放出二氧化碳。食用酒精 必须以薯类、谷物或废糖蜜为原料，并通过发酵法酿造。菌种是发酵工程的关键， 发酵和酿造工业都是以微生物菌种为核心组织生产的酒精发酵工业也不例外。 选育高产高效的优良菌种，可以大幅度地提高酒精的发酵生产率，显著提高酒精 产业的经济效益。 1 2 1 酵母菌及分类 酵母菌是单细胞真核微生物，在自然界中普遍存在主要分布于含糖质较多 的偏酸性环境中，如水果、蔬菜、花蜜和植物叶子以及果园土壤中。石油酵母较 多地分布在油田周图的土壤中。细胞的形态通常有球形、卵圆形、腊肠形、椭圆 形、柠檬形或藕节形，其大小随培养基成分的改变，菌龄的长短，及培养时间的 不同而有差异，一般为( 8 3 0 ) u m ( 1 5 ) u m ，最长的可以达到1 0 0u m 。 无鞭毛，不运动。细胞构造具有真菌细胞的一般特征，细胞壁不含纤维素，由葡 聚糖、甘露聚糖等多糖组成。大多数酵母菌的菌落多为乳白色，少数为红色，个 别为黑色，表面光滑、湿润、粘稠，容易挑起，质地均匀。其繁殖方式可分为有 性生殖和无性生殖绝大多数酵母都以芽殖、裂殖来进行无性繁殖，极少数种可 以产生子囊孢子进行有性繁殖。酵母菌生长温度为4 - 3 0 ，最适培养温度为2 5 3 0 ，p h 5 - 6 。常用的培养基为麦芽汁、y e p d 、g y p 和p d a 等【8 】。酵母菌在自然 界中分布很广，尤其喜欢在偏酸性且含糖较多的环境中生长，在水果、蔬菜、花 蜜、植物叶子表面和在果园土壤中最为常见，也有一些酵母如白假丝酵母会生长 于生物体内，是临床常见的致病菌。在油田周图的土壤中也分布着大量石油酵母。 由于酵母菌主要利用单糖和二糖，不能利用多糖，因此淀粉和纤维素等多糖 4 第一章文献综述 物质需经过淀粉酶和糖化酶的转化，形成葡萄糖，再经e m p 途径生成乙醇1 8 1 。 酵母菌这一名称其实并非基于分类学，而通常是用来定义以芽殖或裂殖方式 来进行无性繁殖的单细胞真菌，以此与霉菌区分开。对酵母菌的分类可以追溯到 1 8 6 0 年，丹麦的酵母专家e m i lc h r i s t i a nh a n s e n 首先对酵母菌进行分类研究，他 被公认为是最早系统研究酵母菌的微生物学家。随后人们又相继提出了多种分类 方法并不断改进。1 9 7 0 年，l o d d e r t 9 】将酵母菌分为四大类，即子囊酵母类、黑粉 菌目酵母类、掷孢酵母类和无孢酵母类。1 9 8 2 年，k r e g e rv a nr i j 研究资料显示， 己知的酵母菌有5 0 0 多种，共有5 6 个属，分属于子菌亚门、担子菌亚门及半知 菌门。其中比较著名的是，1 9 8 3 年l o d d e r 和b a r r i e r 对酵母菌进行了系统分类方 法其原则步骤是： 第一步：依据是否具有有性生殖过程、能否形成子囊孢子、具有掷孢子或冬 孢子以及孢子的形状、特点、数目以及能否形成真假菌丝分类到纲、目、科。 第一步：依据菌落形态、细胞形状、增殖方式、是否形成真假菌丝，并结合 少数糖类发酵和硝酸盐利用等试验分类归属。 第三步：根据生理特征，尤其是糖发酵、同化试验和利用硝酸盐的情况分类 到种。 目前酒精工业生产中使用的酵母菌大多属于真菌门( e u m y c o t a ) 、子囊菌纲 ( a s c o m y c e t e s ) 、半子囊菌亚纲( h e m i a s c o m y c e t e s ) 、酵母目( e n d o m y c e t a l e s ) 、 酵母科( s a c c h a r o t n y c e m c e a e ) 。大多数用于酒精发酵的酵母菌都属于酵母属的酿 酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 、卡尔斯伯酵母( s a c c h a r o m y c e sc a r l s b e r g e n s i s ) 、 清酒酵母( s a c c h a r o m y c e ss a k e ) 及其变种。其它的属如粟酒裂殖酵母 ( s h i z o s a c c h a r o m y c e sp o m b e ) 、脆壁克鲁维酵母( k l u y b e r o m y c e sf i e g i l i s ) 、树干 毕赤酵母( p i c h i as t i p i t i s ) 、克劳森酒香酵母( b r e t t a n o m y x e sc l a u s s e n i i ) 、热带假 丝酵母( c a n d i d at r o p i c a l i s ) 和管囊酵母( p a c h y s o l e nt a n n l p h i l u s ) 等也有一定应 用f 8 】。 工业上常用的酒精发酵菌株有k 字酵母、南阳1 3 0 0 酵母、南阳1 3 0 8 酵母、 拉斯2 号、拉斯1 2 号、古巴i 和古巴n 等，均属于酿酒酵母。 酒精生产中对酵母菌菌株的生理特性有一定的要求】：( 1 ) 发酵力强而且迅 速，有较强的酒化酶；( 2 ) 繁殖速度快，有较强的增殖能力：( 3 ) 耐乙醇能力强， 能在较高浓度的酒精发酵醪中发酵；( 4 ) 耐温性能好，能在较高温度下发酵；( 5 ) 抵抗杂菌能力强( 6 ) 耐酸能力强：( 7 ) 生产性能稳定，变异性小，发酵时产生 泡沫小。 第一章文献综述 1 2 2 酒精发酵机理 酒精发酵作用是酵母菌将可发酵的糖。在无氧条件下，经e m p 途径先分 解为丙酮酸，然后在丙酮酸脱羧酶的作用下脱羧成乙醛和二氧化碳，再经过细胞 内酒化酶的作用转变成乙醇最后通过细胞膜将产物排出体外引。其反应过程如 下： ( 1 ) 葡萄糖生成丙酮酸 c 6 h 1 2 0 6 ( e m p 途径) ( 2 ) 丙酮酸脱羧生成乙醛 c h ，c o o h亘塑堕壁丝堕c h ，c h o + c o ：1 、 ( 3 ) 乙醛进一步还原为乙醇 c h3 c h o + 2 h 一c 2 h 5 0 h + h ：o 总反应式如下： c 6 h n 0 6 2 c 2 h s o h + 2 c 0 2 + 112 9 k j 1 2 3 酵母菌鉴定方法 1 2 3 1 传统鉴定方法 常规的酵母菌鉴定方法【l o _ 1 3 】主要是通过对菌株菌落形态特征、细胞形态、特 殊的细胞形态( 如假菌丝、子囊孢子等) 观察、酵母菌菌的生理生化特征( 如糖发酵、 碳源和氮源的同化、产酯试验、石蕊牛乳试验等) 、查检索表这样几个步骤来确 定所测菌株的种属。微生物的形态特征和生理生化特性是传统分类方法的依据， 而形态特征和生理生化特性是受多方面影响的，有时同种也会出现不同的形态及 生理生化特征，而且因实验条件的所限，实验结果偶尔会出现波动，重现性和可 靠性不够理想。通常整个步骤需要做6 0 一9 0 次试验，需要花费大量的人力、时间 和金钱，比较繁琐费时【1 3 】。 1 2 3 2 快速鉴定方法 几十年来，在菌种快速鉴定系统产品中，也出现了如a p i2 0 ca u x 系统、 b i o l o g 微生物鉴定系统等较为成熟可靠、使用广泛的产品，在短时间内极大的提 高了菌株鉴定的特异性、重复性和准确性。同时随着分子生物学技术的前进和发 展，出现了多种基于p c r 的d n a 多态性鉴定方法，常用的几种酵母菌鉴定d n a 分子标记技术包括r a p d ( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i c ，随机扩增多态性d n a ) 、 r f l p ( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，限制性片断长度多态性) 、a f l p 6 第一章文献综述 ( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，扩增片断长度多态性) 及s s r ( s i m p l e s e q u e n c er e p e a t ，微卫星d n a 分子标记) ，在短时间内极大的提高了菌株鉴定的 特异性、重复性和准确性。 ( 1 ) a p i2 0 c a u x 菌种快速鉴定系统产品多达2 0 多种，如a p i2 0 c ，a t b3 2 c ，a u x a c o l o r ， v i t e ky b c 和a p i c a n d i d | 15 】系统等，克服了传统菌种鉴定费时、操作要求高的缺 点，其中a p i 菌种鉴定系统在世界范围内应用较广，其鉴定结果的准确性已被微 生物学界所公认。a p i 由法国生物梅里埃公司出品，始创于1 9 7 0 年，其通过对 传统技术标准化、微量化的变革，使细菌鉴定更加简单、快速和可靠。在世界范 围内得到广泛认可。在我国，该系统己广泛应用于临床医学微生物检验。徐红等 i h j 利用a p i2 0 ca u x 系统鉴定了1 2 0 株病原酵母菌，鉴定结果与常规方法相比 较符合率达9 5 。 a p i2 0 c a u x 系统包括试剂条和数据库，试剂条通常包含2 0 个微量生化试 验。系统内含一塑胶带，配有2 0 个独立细管，每管内含有不同化学试剂，可进 行生化反应试验。先把待鉴定菌在萨布罗右旋糖琼脂( s a b o u r a u dd e x t r o s e a g a r ) 上培养4 8 h 7 2 h ，然后用无菌环挑取菌落于上述液体培养基中制成标准浊度的菌 悬液，将其依次添加到含化学试剂的独立细管内，在3 0 培养7 2 h 。菌体在生长 时，菌悬液的浊度不断变化，通过与系统的阴性对照相比，配合鉴别图表和电脑 辅助系统来鉴定菌种。 s g 。g t l n d e s 等【1 6 1 应用a p i2 0 ca u x 系统对1 1 6 株分离的酵母菌株的正确 鉴定率为8 7 ，其中对自假丝酵母( c a n d i d aa l b i c a n s ) 的正确鉴定率为8 9 7 ， 对热带假丝酵母( c a n d i d at r o p i c a l i s ) 的正确鉴定率为1 0 0 ，对中型近平滑假丝 酵母( c a n d i d ap a r a p s i l o s i s ) 的正确鉴定率为8 3 3 。王丽敏等1 1 7 利用酵母粉葡 萄糖琼脂培养基对1 5 个批次苹果原料样本中的酵母菌进行分离，并用a p i2 0 c a u x 系统进行鉴定，得到2 5 株酵母菌分别属于假丝酵母菌属、酿酒酵母菌属和 克勒克酵母菌属的6 个种：克柔平常假丝酵母菌( c a n d i d ak r u s e i ) 1 3 株，酿酒 酵母菌( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 5 株，克勒克酵母菌属酵母菌( k l o e c k e r as p p ) 2 株，木蓝假丝酵母菌( c m a g n o l i a e ) 2 株，热带假丝酵母菌( c t r o p i c a l i s ) 和 乳酒假丝酵母菌( c k e f y r ) 各一株，鉴定准确率均超过9 5 ，其中模式菌酿酒 酵母的鉴定准确率为9 8 7 ，相似度1 0 0 ，证明该系统能够快速、准确地鉴定苹 果原料中的酵母菌。 ( 2 ) b i o l o g 微生物自动分析系统 b i o l o g 自动分析系统是美国b i o l o g 公司于1 9 8 9 年开发的微生物鉴定产品， 其微生物鉴定数据库容量是目前世界上最大的，可鉴定包括细菌、酵母和丝状真 7 第一章文献综述 菌在内总计1 9 7 3 种微生物，几乎涵盖了所有人类、动物、植物病原菌以及食品 和环境微生物。b i o l o g 鉴定系统由浊度计、读数仪、软件、数据库、微孔鉴定板 组成，其独创碳源利用方法针对每一类微生物筛选9 5 种不同碳源，配合显色 物质固定于孔板上。当微生物利用9 5 种不同碳源进行呼吸时，会将显色物质氧 化还原，从而在鉴定板上形成该微生物特征性的反应模式或“指纹”。通过设备 读取颜色变化，将目标微生物与数据库的相关菌的特征数据进行对比，就可以在 瞬间得到鉴定结果，确定所分析的微生物的属名或种名i ”j 。 目前b i o l o g 微生物自动分析系统在酵母菌多相分类鉴定中应用较广。 p r a p h a i l o n g 等【l8 】用该系统对7 2 株酵母进行了1 5 4 次鉴定实验，结果表明b i o l o g 系统对c a n d i d ak r u s e i 、c p a r a p s i l o s i s 等常见酵母准确鉴定到种的概率达到1 0 0 ， 取得了良好结果。 ( 3 ) 分子生物学方法 随着分子生物学技术的前进和发展，在菌种鉴定领域还出现了多种基于p c r 的d n a 多态性鉴定方法【2 0 1 ，常用的几种酵母菌鉴定d n a 分子标记技术包括 r a p d ( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i c ，随机扩增多态性d n a ) 、r f l p ( r e s t r i c t i o n f r a g m e n ti e n g t hp o l y m o r p h i s m ，限制性片断长度多态性) 、a f l p ( a m p l i f i e df r a g m e n t l e n g t hp o l y m o r p h i s m ，扩增片断长度多态性) 1 2 l 】及s s r ( s i m p l es e q u e n c er e p e a t ， 微卫星d n a 分子标记) 2 2 1 ，都能在短时间内准确鉴定菌株。但对于每一种方法 来说，都有其局限性。因此并非任何一种方法都适用于所有的酵母菌鉴定，甚至 有时使用不同的方法会产生不同的结果。尽管近年来人们不断应用新技术对酵母 菌进行鉴定和分析，但对一些疑难菌株的鉴定往往需要应用多种方法才能获得满 意结论。随着技术的进步，酵母菌的分类方法将会不断地更新和完善。 1 2 4 酵母菌育种研究 针对不同的用途及特性，可以通过育种改进产酒精酵母的生产性能。目前主 要的选育方向集中于发酵原料拓展和菌种的耐抗性两个方面 2 3 1 。 1 2 4 1 发酵材料 长期以来，酵母发酵酒精多采用玉米、非糖蜜或蔗糖作为原料，成本较低廉， 但是受粮食危机影响，近几年来这些原料价格不断提高，在一定程度上限制了燃 料酒精的发展。酵母菌所能利用的底物范围非常有限，大多数既不能利用由淀粉 水解产生的大部分寡糖，包括比麦芽三糖链更长的糊精和异麦芽糖，也不能利用 纤维素、半纤维素、纤维二糖和大多数戊糖，而长远看来粮食危机很难在短期内 解决，因此要发展燃料乙醇发展清洁能源，就必须培育出能够直接发酵纤维素等 第一章文献综述 廉价而来源广泛原料的菌种。 目前的育种研究主要集中于两个方面( 1 ) 分解淀粉质原料的菌种研究。目 前已有研究先后将黑曲霉、泡盛曲霉、米根霉或米曲霉等的糖化酶c d n a 、糖化 酵母或拟内抱霉的糖化酶基因、地衣杆菌或解淀粉芽抱杆菌的a 淀粉酶基因克 隆到酿酒酵母中，并获得了表达。此外，也有研究利用原生质体融合技术，完成 了糖化酵母与酿酒酵母的原生质体燃料酒精高产酵母菌株选育及应用研究融合， 实现了酿酒酵母与出芽短梗霉的原生质体融合，获得了能发酵淀粉的稳定融合 子。另外，z a s t r o w 等【2 4 】人分离到能利用麦芽三糖发酵的酵母菌，同样拓宽了酵 母菌利用淀粉材料的范围。( 2 ) 分解纤维质原料的菌种研究。目前已知的具有工 业应用前景、能利用木糖发酵生成酒精的三种酵母菌是管囊酵母( p a c h y s o l e n t a n n l p h i l u sj 、树干毕赤酵母( p i c h i as t i p i t s ) 和休哈塔假丝酵母( c s h e c h a t a e ) 。 在筛选和培育戊糖发酵菌株方面，科学家也取得了一定的进展，如张继泉等1 2 5 1 从木糖固体培养基中筛选到一株能发酵戊糖的管囊酵母( p a c h y s o l e n t a n n l p h i l u s ) ，产乙醇能力相当于理论产量的6 0 ，耐乙醇能力为1 4 ( v v ) ，4 2 下能正常发酵。n a n c y _ 【2 6 】利用大肠杆菌酵母菌穿梭质粒将树干毕赤酵母( p i c h i a s t i p i t s ) 的木糖分解基因转入到酿酒酵母中，构建的工程菌既能利用葡萄糖也能 利用木糖发酵生产乙醇。m o n i r u z z r n a n t 27 】构建的1 4 0 0 酵母工程菌能高效表达木 糖还原酶、木糖醇脱氢酶和木酮糖激酶，在含有8 0 l 葡萄糖和4 0 9 l 的木糖的 混合培养基中可产生5 2 9 l 的乙醇，理论转化率为8 5 。 1 2 4 2 菌种耐受性 在酒精发酵生产中，生产商会根据菌种的不同特性配制条件最适于发酵的培 养基质，包括最适p h 、培养基、温度等，以保证最大的回报率，但是考虑到实 际生产成本以及随着发酵进行带来的条件改变，需要菌种对不良环境有较高的的 抗性与耐受性。通过育种培育出耐高温、耐高渗、耐酸碱等特性的菌株，对于改 进工艺、降低能耗均有重要意义【2 8 】。 ( 1 ) 耐高温酒精酵母 耐高温酒精酵母的育种方法主要有自然分离、高温驯化、诱变和原生质体融 合四种【2 9 】。国外在7 0 年代末掀起了研究热潮，国内则在8 0 年代以后投入了研究。 目前国内较有代表性的耐高温酵母主要是沈睿的y h 4 1 3 0 1 ，蒋亚平的w v h y 8 【3 ， 宜昌酵母基地的y y 和w y ，北京酒精厂的8 0 1 4 2 8 。国外的研究主要集中在东 南亚和日本。日本有学者以s a i c e s a k e 为菌种，培养出的酵母在2 0 下清酒发 酵2 0 d 可得到的乙醇体积分数为1 9 0 t 3 2 l 。 ( 2 ) 耐乙醇、耐高渗酵母 9 第一章文献综述 乙醇是酿酒酵母厌氧发酵的重要工业产物，但对酵母细胞本身又是毒素和抑 制荆。酵母菌耐乙醇的生化机理是十分复杂的，细胞中的许多组分与酵母菌耐乙 醇能力有密切的关系，所以细胞的许多基因控制着酵母菌耐乙醇的特性。通过连 续筛选分离的方法，e e n a n d e s 等【33 】通过改变温度等方法分离出乙醇耐性株，以 蔗糖为原料，可产乙醇1 6 3 l ，他们还发现由于乙醇抑制酵母的生长和发酵， 温度增加乙醇在酵母中的毒性，通过改变温度使酒精耐性株的存活率提高了，发 酵能力也提高了。b e r t o l i n i 掣3 4 】分离出可在最初浓度为3 0 的可发酵糖中发酵的 新酵母菌株，并且具有酒精耐性和温度耐性，最终酒精浓度为1 6 3 9 l 。酵母存 活率也增加了。陈国潮等p 5 1 通过原生质体融合而获得的酿酒酵母菌株h u 1 a 与糖化酵母菌株5 2 0 6 1 b 的不同核倍性融合株，在3 0 培养时，其生长速度和 生物量略高于亲株，4 0 时明显高于双亲，耐高渗透压和涌精能力高于5 2 0 6 1 b ， 与h u 佯1 a 相当，4 0 时发酵能力优于双亲株。 ( 3 ) 其他特性酵母 耐酸酵母在发酵的过程中可以大大减少染菌机会，给操作带来方便。酸度大 的环境中耐酸酒精酵母能提高原料的利用率和出酒率。中科院成都生物所自浓香 型大曲酒酒糟中分离到一株耐酸型酒精酵母，并进行了中试试验，证明该菌在浓 香型大曲酒的生产中确实起到了一定的作用。 低产乙醇酵母因产品乙醇含量低，使其味道更适口，受到饮料行业青睐。利 用该类酵母可以生产无醇啤酒【2 3 1 。我国微生物学工作者先后选育了几株低产或不 产酒精的的酵母菌株，以期实残产生风味物质的同时少产或不产酒精的目标。 1 3 耐高温酒精酵母研究 耐高温酒精酵母的研究已成为当前国内外酒精行业的热门课题。使用耐高温 酵母不仅有利于降低生产水耗、电耗，充分利用现有设备，缩短生产周期，提高 生产率，而且在夏季保证了正常生产【3 6 | 。运用生物工程技术，培育具有特殊性能 的生产菌株及改进传统酒精发酵工艺，科学研究机构和酒精生产企业都在为之作 不懈努力。早在上世纪5 0 年代以来我国微生物学家就从事驯化育种以糖蜜原料 发酵的耐高温酒精酵母。上世纪末期宜昌酵母基地从收集到的耐高温酵母菌中筛 选出耐高温、发酵性能良好的菌株，并将其制成活性干酵母。它们在生产上获得 了较成功的应用。也有研究者对生产用菌株通过驯化与筛选，得到了适合于玉米 醪发酵的耐高温酒精酵母1 2 引。 耐高温酵母不是微生物分类学上的名词，而是从生态方面表达此类酵母对温 度的忍耐性与普通酵母的差异【3 7 】。对生活条件的变化有迅速的适应能力，这是微 1 0 第一章文献综述 生物的一大特点。外界环境的变化，使微生物群体中迅速产生变种。驯化就是通 过破坏微生物正常的生活条件，积累定向变异而实现的。它跟诱变育种或利用细 胞原生质体融合，进而发生细胞核染色体基因间的重组获得新种相比较，具有培 育条件温和、操作简单、投人少、易掌握诸优点。华子安f 38 】以酵母为出发菌株， 通过驯化、筛选，使其发酵温度从3 2 3 4 提高到3 8 - 4 0 的选育方法，作为改 良菌种的一种尝试，获得了一定成功。 对传统酵母菌株来说，其发酵温度低、酶活性低，易污染杂菌，浪费能源。 如酿酒酵母传统菌株的发酵温度控制在2 8 3 4