（食品科学专业论文）大米蛋白的提取与改性研究.pdf

摘要 大米储藏过程中s h 易氧化成s s ，从而导致蛋白质的空间构象发生变化， 蛋白质沉降系数和平均分子质量明显增大，蛋白质的提取率下降。其中，谷蛋白 占大米蛋白总量的8 0 左右，其不溶于水的性质限制了大米蛋白的进一步开发利 用。 本文以早籼陈米为原料，对还原剂碱法复合提取大米蛋白的工艺条件、大 米蛋白的酶法改性和还原剂酸法改性等进行了系统研究，旨在通过还原剂。碱法 提高大米蛋白的提取率，对其进行蛋白酶法和还原剂一酸法改性，以提高大米蛋 白的溶解性，增加其实际应用范围。主要研究结果如下： 为提高大米蛋白的提取率，本文提出了用还原剂碱法复合提取大米蛋白的 思路。大米蛋白提取过程中使用还原剂亚硫酸钠、二硫苏糖醇可以使陈米蛋白质 分子中的s s 还原成s h ，增加可溶性蛋白质的溶出，从而提高大米蛋白的提取 率。还原剂碱法复合提取大米蛋白的最佳提取工艺和条件为：n a o h 浓度0 0 5 m o l l ，n a 2 s 0 3 用量为0 5 0 ，d t t 用量为2 5 0 ，固液比1 ：1 2 ，3 5 。c 提取4h ， 大米蛋白的提取率为9 5 2 6 。还原剂碱法复合提取工艺与传统碱法提取工艺相 比，不仅提高了大米蛋白的提取率，保护了大米中的淀粉并且降低了碱液浓度， 减少对环境的破坏。 由于大米蛋白的溶解性差，以提高其溶解性为主要目的，在对大米蛋白提取 研究的基础上，本文对其进行了系统的改性研究，改性方法采用生物酶法和还原 剂酸法两种方法。酶法改性选择胰蛋白酶，考察大米蛋白用量、胰蛋白酶用量、 酶解时间等主要影响因素对大米蛋白水解产物的溶解度和水解度的影响，确定酶 法改性大米蛋白的最佳工艺和条件：大米蛋白用量3 0 0 ，胰蛋白酶占大米蛋白 用量5 0 0 ，在温度5 0 。c ，p h 8 0 下作用2 5 0h ，在此试验条件下，大米蛋白酶 水解产物的溶解度为8 3 6 5 ，水解度为2 8 7 。h p l c 分析表明，大米蛋白经胰 蛋白酶改性后其相对分子质量显著变小，降解成小分子的肽类物质，从而提高了 大米蛋白的溶解度。 其次，研究了大米蛋白的还原剂酸法复合改性，以高纯度大米蛋白为原料， 加入二硫苏糖醇、盐酸对大米蛋白进行改性，考察盐酸浓度、大米蛋白用量、 d t t 用量、温度、时间等因素对大米蛋白水解产物的溶解度和水解度的影响， 通过单因素试验和正交试验确定还原剂酸法改性大米蛋白的最佳工艺和条件： 盐酸浓度为0 6 0 m o l l ，大米蛋白用量为2 5 0 ，d t t 用量为0 6 0 ，反应温度 为9 0 ，反应时间2 0h ，在此试验条件下，大米蛋白水解产物的溶解度为9 5 3 7 ， 水解度为5 2 1 。与传统酸法改性相比，还原剂酸法复合改性提高了大米蛋白 水解产物在中性水溶液中的溶解度，增强了大米蛋白的改性效果。而且，减少了 酸液的浓度，既降低了生产成本又保护了环境。h p l c 分析表明，大米蛋白的还 原剂酸法复合改性与酶法改性相比，改性后肽键的水解程度较低，溶液体系中 存在的是大米蛋白的亚基和少量肽键水解形成的肽类物质。 关键词：大米蛋白；还原n - 碱法提取；酶法改性；还原剂一酸法改性；高效液相 色谱 i i a bs t r a c t t h eq u a n t i t yo fs u l f h y d r y lo fr i c ep r o t e i ni n c r e a s e dd u r i n gt h er i c es t o r a g e b e c a u s eo ft h et r a n s f o r m a t i o no f - s ht o - s - s 一，w h i c hl e dt ot h ec h a n g e so fp r o t e i n c o n f o r m a t i o na n di n c r e a s e so fp r o t e i ns e d i m e n t a t i o nc o e f f i c i e n ta n da v e r a g e m o l e c u l a rw e i g h t ，a l s ol e dt h ed e c r e a s eo ft h ep r o t e i ne x t r a c t a b i l i t y m o r e o v e r , t h e m a j o rs t o r a g ep r o t e i no fr i c ei sg l u t e l i n ( a b o u t8 0 ) t h ei n s o l u b i l i t yo fi tr e s t r i c t e d t h ef u r t h e ra p p l i c a t i o no ff i c ep r o t e i n b a s e do np r o p e r t i e so fa g e di n d i c ar i c e ，t h i st h e s i ss y s t e m a t i c a l l ys t u d i e dt h e e x t r a c t i o no fr i c ep r o t e i nu s i n gr e d u c t a n t a l k a l is o l u t i o na n di t se n z y m a t i ca n d c h e m i c a lm o d i f i c a t i o n t h ea i mi st oo b t a i n h i g h e re x t r a c t a b i l i t y a n di m p r o v e d s o l u b i l i t y , a n de x p a n dt h ea p p l i c a t i o n so f f i c ep r o t e i n so nv a r i o u st y p e so ff o o d t h i st h e s i su s e dr e d u c t a n t a l k a l is o l u t i o nt oe x t r a c tr i c ep r o t e i ni no r d e rt oo b t a i n h i g h e re x t r a c t a b i l i t y s o d i u ms u l f i t ea n dd i t h i o t h r e i t o l ，w h i c hr e d u c e dt h ed i s u l f i d et o s u l f h y d r y l ，w e r eu s e dd u r i n gt h ee x t r a c t i o n t h eb e s te x t r a c t i o np r o c e s sa n dc o n d i o n w e r e ：0 0 5m o l ln a o h ，o 5 0 n a 2 s 0 3 ，2 5 d i t h i o t h r e i t 0 1 t h es o l i d l i q u i dr a t i o w a s1 ：1 2a t3 5 。cf o r4 h t h er i c ep r o t e i ne x t r a c t i o nr a t ew a s9 5 2 6 c o m p a r e dt o t h et r a d i t i o n a la l k a l ie x t r a c t i o np r o c e s s ，t h ep r e s e n tm e t h o di n c r e a s e dt h ee x t r a c t i o n r a t e ，p r o t e c t e dt h er i c es t a r c h ，a n dr e d u c e dt h ea l k a l ic o n c e n t r a t i o ni e r e d u c e dt h e d a m a g et ot h ee n v i r o n m e n t e n z y m a t i cm o d i f i c a t i o na n dr e d u c i n ga g e n t a c i dm e t h o d sw e r eu s e dt oi m p r o v e t h es o l u b i l i t yo fr i c ep r o t e i n t r y p s i nw a ss e l e c t e d t h i st h e s i s i n v e s t i g a t e dt h e c o n c e n t r a t i o no ft r p s i n ，c o n c e n t r a t i o no fr i c ep r o t e i na n de n z y m a t i cr e a c t i o nt i m eo n t h es o l u b i l i t ya n dd e g r e eo fd y d r o l y s i s ，a n dd e t e r m i n e dt h eo p t i m u me n z y m a t i c p r o c e s sa n dc o n d i t i o n ：5 0 0 t r y p s i n ，3 0 0 r i c ep r o t e i n , a t5 0 ，p h8 0f o r2 5 h t h es o l u b i l i t yo ff i c ep r o t e i nh y d r o l y s a t e sw a s8 3 6 5 ，a n dd e g r e eo f h y d r o l y s i sw a s 2 8 7 u n d e rs u c hac o n d i t i o n t h er e s u l t so fh p l cs h o w e dt h a tr e l a t i v em o l e c u l a r w e i g h to fr i c ep r o t e i nd e c r e a s e ds i g n i f i c a n t l ya f t e rt r y p s i nm o d i f i c a t i o n r i c ep r o t e i n i i i w a sd i s s o c i a t e dt os o m es m a l lp e p t i d e s ，t h u st h es o l u b i l i t yo fr i c ep r o t e i nw a s i m p r o v e d r e d u c i n ga g e n t ( d i t h i o t h r e i t o l ，d t t ) - a c i d ( h y d r o c h l o r i ca c i d ) m o d i f i c a t i o nw a s a l s ou s e df o rr i c ep r o t e i nm o d i f i c a t i o n t h ec o n c e n t r a t i o no fh y d r o c h l o r i ca c i d ，r i c e p r o t e i na n dd t t , r e a c t i o nt e m p e r a t u r ea n dt i m ea f f e c t e dt h es o l u b i l i t yo fr i c ep r o t e i n h y d r o l y s a t e sa n dd e g r e eo fh y d r o l y s i s t h eo p t i m u mp r o c e s sa n dc o n d i t i o n so f r e d u c i n ga g e n t a c i dm o d i f i c a t i o nw e r ea sf o l l o w s ：0 6 0m o l lh y d r o c h l o r i ca c i d 2 5 0 r i c ep r o t e i n ，0 6 0 d i t h j o t h r e i t o l s ，a t9 0 f o r2 0h t h es o l u b i l i t yo fr i c ep r o t e i n h y d r o l y s a t e sw a s9 5 3 7 ，a n dd e g r e eo f h y d r o l y s i sw a s5 2 1 u n d e rs u c hac o n d i t i o n c o m p a r e dt ot h et r a d i t i o n a la c i dm o d i f i c a t i o n ，t h ep r e s e n tm e t h o di m p r o v e dt h e s o l u b i l i t yo fh y d r o l y s a t e so fr i c ep r o t e i nu n d e rn e u t r a la q u e o u ss o l u t i o n ，e n h a n c e d e f f i c i e n c yo fr i c ep r o t e i nm o d i f i c a t i o n ，r e d u c e dt h ea c i dc o n c e n t r a t i o n ，d e c r e a s e dt h e c o s to fp r o d u c t i o na n dp r o t e c t e dt h ee n v i r o n m e n t t h er e s u l t so fh p l cs h o w e dt h a t t h ed e g r e eo fh y d r o l y s i sw a sl o w e ra f t e rr e d u c i n ga g e n t - a c i dm o d i f i c a t i o nc o m p a r e d t ot r y p s i nm o d i f i c a t i o n ，a n dt h er e s u l t a n ts y s t e m sw e r ec o m p o s e do fs o m es u b u n i t so f r i c ep r o t e i na n ds o m es m a l lp e p t i d e s k e y w o r d s ：r i c ep r o t e i n ；r e d u c i n ga g e n t - a l k a l ie x t r a c t i o n ；e n z y m a t i cm o d i f i c a t i o n ； r e d u c i n ga g e n t - a c i dm o d i f i c a t i o n ；h p l c 长沙理工大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体己经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 作者签名： 弓j 钝咳 日期：y 律肛月药日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权长沙理工大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密口。 ( 请在以上相应方框内打“4 ) 作者签名：匐地夜 日期：肛月万日 导师签名。 纠豕嘭日期：加夕年肚月玎日 1 1前言 第一章绪论 大米蛋白占大米总质量的8 o 左右，是人们膳食中蛋白质的重要来源，具 有高营养、低过敏性的特点。目前，国外大米蛋白的研发已是稻米深加工的重要 方向。随着人们对大米蛋白营养价值和低过敏性的认同以及国际行情对大米蛋白 的关注，使其从植物类蛋白的研究和开发中脱颖而出，成为大米深加工的一个热 点。本章对大米蛋白的营养价值、提取与改性以及开发现状进行了概述。 1 2 大米蛋白的营养价值 1 2 1大米蛋白的必需氨基酸组成 大米蛋白的必需氨基酸组成比较合理，与w h o f a o 推荐的理想模式十分接 近，是一种高营养价值的植物蛋白。大米蛋白的必需氨基酸组成如表1 1 所示t i 。 而且，大米蛋白的生物价为7 7 ，不但在各种粮食作物中占第一位，还可以与牛肉 ( 生物价为6 9 ) 、鱼( 生物价为7 6 ) 及虾( 生物价为7 7 ) 相媲美( 见表1 2 ) 哪。 表1 1 大米蛋白质的必需氨基酸组成 表1 2 不同蛋白质的生物价( b v ) 和蛋白质功效比值( p e r ) 1 2 2 大米蛋白的低过敏性特征 大米蛋白具有低过敏性是不同于其它植物蛋白的一个显著特徂，】。植物蛋白 中的大豆蛋白含有胰蛋白酶抑制剂等抗营养因子以及棉子糖、水苏糖等胀气因 子，直接食用后人体易产生胀气、呕吐等不良反应。牛乳是备受人们欢迎的动物 性食品，但牛乳中p 哥l 球蛋白含有卵类粘蛋白等抗营养因子，有些婴幼儿对其特 别敏感，食用牛乳后易产生过敏反应；大米蛋白却不含类似的抗营养因子，大米 是可以免于过敏试验的谷物类食品。目前，世界上不少国家和地区选择以大米蛋 白粉作为婴幼儿的营养强化剂。 1 2 3 大米蛋白的重要生理功能 m o r i t a t 4 j 研究发现，大米蛋白能明显降低血液中胆固醇、磷脂和甘油三脂的 浓度，同时具有减少雌性鼠乳腺癌变等重要生理功能。 1 3 大米蛋白的结构特征 1 3 1 大米蛋白的组成 大米蛋白和淀粉是构成大米的两大主要成分，两者的含量分别约占大米质量 的8 0 和8 0 o 。大米蛋白按照其溶解性可分为四大类：( 1 ) 用水提取大米中 的蛋白质得到的蛋白组分为清蛋白( a l b u m i n ) ；( 2 ) 残留物用盐溶液提取得到的 蛋白质为球蛋白( g l o b u l i n s ) ；( 3 ) 然后残留物用7 5 的乙醇溶液提取得到的蛋 白质为醇溶蛋白( p r o l a m i n s ) ；( 4 ) 剩下的残留物用碱溶液提取得到的蛋白质为 谷蛋白( g l u t e l i n s ) f 5 j 。上述四类蛋白质在大米胚乳、米糠和米渣中的含量有所 不同见表1 3 1 6 1 3 1 。 表1 3 不同原料中的大米蛋白含量 由表1 3 可知，清蛋白和球蛋白在米糠中含量较高，在大米胚乳和米渣中的 含量却较低。两者都是生理活性蛋白，相对分子质量分别为1 6 1 3 0 k d a 和 1 0 2 0 0 k d a 【7 】。 醇溶蛋白和谷蛋白分别在米糠、胚乳和米渣中含量较高，是构成米糠蛋白、 胚乳蛋白和米渣蛋白的主要蛋白组分。与其它三种蛋白组分相比，醇溶蛋白含量 较低，但它参与胚乳蛋白体的形成有着非常密切的关系。相对分子质量为1 3 k d a 的亚基是构成醇溶蛋白的主要成分，亚基又分为1 3 a 和1 3 b 两种不同类型，1 3 a 亚基中的半胱氨酸含量较高，而1 3 b 亚基中则含有少量的半胱氨酸【8 】。 谷蛋白是构成大米蛋白的主要成分，约占蛋白总量的8 0 。y a m a g a t a h 等i 。1 用电泳分离技术出可以分出相对分子质量分别5 7k d a 、3 7 3 9k d a 和2 2k d a 的 谷蛋白以及1 3 k d a 的醇溶蛋白。而且，刚合成的谷蛋白是相对分子质量较大的 大分子物质，然后在其形成蛋白体的过程中，前体被水解成相对分子质量较小的 酸性q 亚基和碱性1 3 亚基，两者的相对分子质量分别为3 7k d a 和2 2k d a 。w e n tn 等 1 0 l 用聚丙烯酰胺凝胶电泳结合等电聚焦技术从酸性q 亚基分离出1 2 条谱 带，它们的相对分子质量分布范围为2 8 5 3 0 8 k d a ；同时从碱性b 亚基分离出9 条谱带，他们的相对分子质量分布范围为2 0 6 2 1 6 k d a 。 k r i s h n a n t 1 用电泳技术从谷蛋白中分离出4 条颜色较深的谱带，其相对分子 质量分别为1 4 k d a 、2 1 2 2 k d a 、3 4 3 7 k d a 和5 1 k d a 。实验表明，酸性仅亚基 和碱性b 亚基是5 1 k d a 谱带的降解产物。 1 3 2 大米蛋白的存在状态 大米胚乳中蛋白质主要以蛋白体( p r o t e i nb o d y ) 形式存在。上世纪八十年代， 3 t a n a k a l , + j 选择成熟稻谷胚乳为原料，采用水多聚物双相系统，并通过蔗糖密度梯 度离心方法得到两种不同的蛋白体( 即p b i 和p b i i ) ，并用电子显微镜观察 两者的形状、大小和结构等特征。两者的特征比较见表1 4 。 表1 4 蛋白体p b i 与p b - i i 的特征比较 1 4 大米蛋白的提取现状 目前，提取大米蛋白的主要方法有溶剂法、碱法和酶法以及复合提取方法。 1 4 1 溶剂法提取大米蛋白 溶剂法是利用蛋白质次级键破坏剂如氢键破坏剂、二硫键破坏剂等破坏蛋白 质的次级结构，促使蛋白质与淀粉发生分离。常用的提取溶剂有氢键破坏剂( 尿 素) ；还原剂( 亚硫酸钠，亚硫酸氢钠，二硫苏糖醇) ；表面活性剂( 十六烷基三甲 基溴化铵，十二烷基磺酸钠) 和脂肪酸盐等。溶剂法不仅提取率较低，而且提取 溶剂不容易去除，同时易给产品带来安全性问题1 1 3 州】，不同溶剂提取大米蛋白的 提取率结果见表1 5 1 5 l 。 表1 5 不同溶剂提取大米蛋白的提取率 注：( 1 ) 2 0 0m l 溶齐u + l o om g 过1 0 0 目米粉搅拌提取6h ；( 2 ) 除二氯乙醇外，其余均为 水溶液。 1 4 2 碱法提取大米蛋白 碱法是提取食用大米蛋白的主要方法之一。碱法主要根据大米蛋白中8 0 以上的蛋白质可以溶于碱溶液的原理，先通过离心除去大部分杂质，然后调整上 清液的p h 值，使其达到大米蛋白的等电点，让大部分蛋白等电沉降下来，再次 离心分离上清液中的杂质- o 甜。研究发现，高浓度碱液提取大米蛋白易使淀粉糊化 和蛋白质发生变性，并产生有毒物质( 1 y s i n a o a l n i n e ) 。很多学者采用不同种类碱液 及不同浓度碱液提取大米蛋白的提取率见表1 6 阳研。 碱法提取大米蛋白的工艺流程如下： 淀粉 t 大米_ 粉碎叶碱液浸提_ 离心一蛋白液_ 酸沉_ 离心一水洗沉淀一千燥_ 大米蛋白 表1 6 不同浓度碱液对大米蛋白的提取率 1 4 3 酶法提取大米蛋白 1 4 3 1 蛋白酶法 蛋白酶法提取主要是利用蛋白酶对大米的蛋白质进行降解和修饰，将其降解 成相对分子质量较小的可溶性肽类物质，再通过离心等分离手段将蛋白质提取出 来。蛋白酶法反应条件比较温和，但酶制剂成本高、产品色泽较深及纯度不高。 按照蛋白酶作用方式的不同，蛋白酶有内切蛋白酶和外切蛋白酶之分。外切 蛋白酶从肽链的任意一端切下一个单位氨基酸残基；工业用蛋白酶主要是内切蛋 白酶，内切蛋白酶在多肽链的内部破坏肽键，依赖不同水解程度产生一系列分子 量不同的多肽。内切蛋白酶和外切蛋白酶对底物的作用方式的差异会影响蛋白质 的提取。按照蛋白酶作用条件的不同，又可以分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱 性蛋白酶等。酶法提取大米蛋白的工艺流程如下【6 】： 原料叶粉碎- 脱脂一调节p h 值一加酶一灭酶_ 离心_ 上清液_ 浓缩_ 冷冻 干燥_ 大米蛋白 1 9 8 5 年日本特许公报提到用酸性蛋白酶提取大米蛋白，提取率9 0 以上， 提取蛋白质后的大米生产的淀粉、淀粉糖、清酒质量明显提高。江南大学葛娜等 【1 7 】采用酸性蛋白酶在温度4 5 c 下，以大米为底物添加1 酶量，固液比1 ：8 水解 4h ，大米蛋白的提取率可达到9 1 2 5 。四川大学王威等【1 8 】以米渣为原料提取大 米浓缩蛋白，按照料液比1 ：1 0 加入蒸馏水，添加l 中性性蛋白酶在5 0 c 下酶 提4h ，再经离心分离回收上清液；沉淀水洗3 次后回收洗液，蛋白质的提取率 可达到5 2 。而且，中性蛋白酶提取的大米浓缩蛋白在色泽、口感等方面均取得 良好效果。此外，葛娜等【1 9 1 采用提取温度5 8 9 。c ，在大米中添加0 8 9 碱性蛋白 酶，以固液比1 ：8 酶法提取4h ，大米蛋白的提取率达7 9 8 6 。目前，研究者选 择不同的蛋白酶类，以不同底物为原料对大米蛋白进行提取而获得不同的提取 率，试验结果如表1 7 所示1 1 7 _ 2 3 1 。 表1 7 蛋白酶法提取大米中蛋白质的蛋白酶类及蛋白质提取率 1 4 3 2 非蛋白酶法 非蛋白酶法提取大米蛋白的原理与蛋白酶法刚好相反，主要是利用淀粉酶、 纤维素酶、果胶酶和植酸酶等将大米淀粉降解成小分子的低聚糖和糊精，再通过 离心或过滤等分离手段将非蛋白物质去掉，从而提高残留物中蛋白质的含量。 暨南大学谭志光等 2 4 1 以早籼米为原料，添加6 m l l o o g ( 米粉) 高温a 淀粉 酶，在温度9 5 c 、固液比l ：4 试验条件下酶解lh 制备早籼米浓缩蛋白，提取率 高达9 4 6 9 ，产品纯度达到8 2 4 1 。江南大学王章存【2 5 】等以糖渣为原料，选择 纯化工艺路线，用淀粉酶水解法制备大米蛋白，蛋白质回收率达9 0 5 ，产品蛋 白含量达8 8 6 。该法使用淀粉酶降解淀粉产生易溶的低聚糖和糊精，促进蛋白 质与淀粉的分离并取得良好的分离效果。w a n gm 2 6 1 等以脱脂米糠为原料，用植 酸酶和木聚糖酶在温度5 5 下酶解2h 制备大米蛋白，蛋白质回收率达7 4 6 。 国内外不同学者以不同原料为底物，选择不同的非蛋白酶类对大米蛋白进行提 取，试验结果见表1 8 l m 6 i 表1 8 非蛋白酶法提取大米中蛋白质的酶类及蛋白质提取率 1 4 4 复合法提取大米蛋白 由于单纯使用酶法存在生产成本高、提取率低的问题，而碱法所需碱液浓度 较高，高浓度碱液易破坏环境带来不良影响。因此，人们开始考虑采用复合提取 方法，以做到既保证产品质量和产率又尽可能地降低生产成本、保护环境。为此， 不少人做了许多研究试验。复合法与酶法提取相比，可以降低降低酶的用量，减 少酶制剂的生产成本。复合法与碱法提取相比，可以节约工业生产用水。同时， 可以减少对环境的破坏，保护生态环境。但是，复合法与酶法或碱法相比，其生 产工艺变得更加复杂，实际生产中会增加设备投资费用。 邹小明等1 2 7 1 以米糠为原料，采用酶碱复合方法对米糠蛋白进行提取并取得较 好提取效果。方法是先通过碱性蛋白酶对米糠进行酶解，经离心分离后所剩沉淀 物再进行碱液提取，提取率达7 9 6 2 。江南大学金世合 2 8 1 等以脱脂米糠为原料， 选用复合糖酶( 含有纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶的混合酶制剂) 和碱法对蛋 白质进行提取。该法是将脱脂米糠溶于一定比例的水，再加入0 2 0 复合糖酶， 在温度4 0 下酶解4h ，经离心分离后沉淀物再用弱碱进行二次提取，蛋白质提 取率达5 5 左右，产品蛋白含量8 0 左右。 国外有关学者以脱脂米糠为原料，采用物理方法结合生物酶法对米糠蛋白的 提取进行了系统研究。当用剪切、超声波和超高压等物理方法提取米糠中的蛋白 蛋白质时，提取率分别为1 6 、1 5 和l l 。先对脱脂米糠进行超声波处理，然 后用蛋白酶对残留物进行酶解，米糠蛋白的提取率可达5 7 8 ；如果用淀粉酶进 行酶解，米糠蛋白的提取率则相对较低。若先对脱脂米糠进行超高压处理，再用 蛋白酶和淀粉酶进行酶解，米糠蛋白的提取率可达6 6 6 。 江南大学奚海燕等【2 9 ，以米粉为原料，采用碱法和酶法分步制备大米浓缩蛋 白，即先用碱法提取部分蛋白质，然后采用碱性蛋白酶对残渣进行微水解，以提 高蛋白质的溶解性，进行蛋白质二次提取，蛋白质的提取率可达到9 0 4 9 。此 外，奚海燕等m ，还采用超高压辅助酶法对大米蛋白进行提取研究，该法是以米粉 为原料，先用超高压设备对米粉进行预处理，在添加l 。4 碱性蛋白酶，在温度 5 8 下酶解4h ，蛋白质提取率达7 8 7 2 ，跟单独使用碱性蛋白酶提取方法相比， 蛋白质的提取率增加1 8 7 2 。 王亚林等 3 q 以米渣为原料，采用碱酶两步法从米渣中分步提取大米蛋白的研 究，获得较好的效果。该方法先用碱溶法提取部分蛋白质，然后采用蛋白酶对残 留物进行水解，以提高蛋白质溶解性，再次对蛋白质进行提取，蛋白质提取率达 7 8 8 。国内不同学者，以不同原料为底物，选择不同复合提取方法对大米蛋白 进行提取的试验结果见表1 9 i z 瑚l 表1 9 复合方法提取大米中蛋白质的提取率 1 4 5 碱法与酶法提取的大米蛋白功能性质比较 碱法与酶法提取的大米蛋白在持水性、吸油性、溶解性、乳化性、乳化稳定 性、气泡性和气泡稳定性等功能性质上存在很大差异，其中碱法提取的大米蛋白 在持水性、吸油性和气泡性方面优于酶法提取的大米蛋白，而酶法提取的大米蛋 白在溶解性、乳化性、气泡稳定性等功能性质方面优于酶法提取的大米蛋白酸 法与酶法提取的大米蛋白功能性质比较如表1 1 0 所示1 3 2 l 。 表1 1 0 碱法与酸法提取的大米蛋白功能性质比较 1 5 大米蛋白的改性现状 食品蛋白质功能特性是指食品体系在加工、储藏、制各和消费过程中蛋白质 对食品产生需要特征的那些蛋白质的物理和化学性质 3 3 1 。蛋白质功能性质主要包 括以下几个方面：( 1 ) 水化性质，取决于蛋白质与水的相互作用，如溶解性、分散 性、持水性、黏着性、粘度等；( 2 ) 界面性质，主要包括蛋白质的表面张力、乳 化性、起泡性、成膜性和气味吸收持留性等；( 3 ) 结构性质，蛋白质与蛋白质相 互作用所表现的有关性质，体现在产生弹性、沉淀和凝胶作用等；( 4 ) 感官性质， 如颜色、气味、口味、适口性、咀嚼度和爽滑度等【，3 5 】。 食品蛋白质功能特性改善是目前该领域的研究热点，改性方法包括物理、化 学和酶法改性等。从分子水平看，改性实质是切断蛋白质分子中主链或是对蛋白 质分子侧链基团进行修饰，从而引发蛋白空间结构和理化性质改变，使蛋白功能 特性得到改善。 大米蛋白的功能性质主要包括大米蛋白的溶解性、乳化性、乳化稳定性、起 泡性、起泡稳定性、持水性和持油性及其它功能性质。大米蛋白中8 0 的蛋白组 分是水不溶性谷蛋白，严重影响大米蛋白在食品工业中的应用。因此，对大米蛋 白进行改性具有重要的理论意义和实践应用价值。目前，大米蛋白的改性方法主 要有酸法改性和酶法改性。 1 5 1 大米蛋白的酸法改性 采用酸或碱处理大米蛋白，使之部分溶解后，可增加蛋白质的溶解性，从而 提高持水性、乳化性和起泡性等。江南大学易翠平等 3 6 - 3 7 ，采用酸法脱酰胺和酶法 脱酰胺对大米浓缩蛋白进行改性研究。结果表明，酸法脱酰胺优于酶法脱酰胺， 并且酸浓度和温度是影响酸法脱酰胺度和水解度的主要影响因素。脱酰胺从0 6 3 5 的范围内，蛋白质的溶解度在p h 值为7 0 呈线性增加至9 9 4 。脱酰胺度 超过6 3 5 ，溶解度有所下降。脱酰胺度在2 5 1 3 3 4 范围，大米蛋白的乳 化性能最好；5 9 5 的脱酰胺度时，起泡性比较理想。此外，改性蛋白与未改性 蛋白比较，持水性提高1 5 5 - 1 7 8 倍，持油性提高3 2 8 - - - 3 6 4 倍。 江南大学蒋甜燕1 3 8 等采用酸法脱酰胺对大米分离蛋白进行改性研究，选择质 量浓度2 5 l 大米蛋白液，在温度9 2 。c 1 j h 入浓度为0 1 9m o l l 的盐酸溶液进行 脱酰胺反应3 1 8h ，此条件下脱酰胺度达4 8 9 。结果发现，脱酰胺度在1 9 6 - - 一 6 4 5 之间，随着脱酰胺度的增加，大米蛋白的溶解性增加，溶解度最大可达 9 6 6 。脱酰胺度在1 9 6 - - - 3 5 7 时大米蛋白乳化性较好。脱酰胺度为6 4 5 时， 起泡性达到2 7 ，但持水、持油性能变化不大。 1 5 2 大米蛋白的酶法改性 酶法改性是采用胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等蛋白酶水解食品蛋白质 而改变它们的溶解性、起泡性和乳化性等功能性质。在一定条件下，蛋白酶能使 不易溶解的蛋白质水解，生成由多个氨基酸残基组成的低相对分子质量的肽，提 高疏水性蛋白质的溶解度。 江南大学金世合等1 3 9 】采用复合蛋白酶p r o t a m e x 对米糠蛋白进行了改性研究。 采用复合蛋白酶对米糠蛋白进行限制水解，研究了不同水解度下米糠蛋白水解物 的功能性质。结果表明，随水解度的提高，蛋白质的溶解度显著提高，但过度水 解会增加水解液中游离氨基酸的含量。水解物的乳化活性在水解度为3 时最高， 过度水解对蛋白质的乳化活性明显降低。因此，根据实际需要，适当水解能提高 蛋白质的功能性质。 浙江大学玄国东等采用碱性蛋白酶对米渣中的大米蛋白进行了改性研究。 研究表明，酶解反应条件为酶量 e 】【s 】_ 1 o 、p h 8 0 、温度6 5 。c 、固液比1 ：5 的条件下进行改性，改性后的大米蛋白在中性条件下，4 蛋白酶解物溶液的氮 溶解指数叫s i ) 为9 5 、乳化性为5 5 、起泡性为7 0 。由此可见，改性后的大 米蛋白与未改性的大米蛋白相比，蛋白质的氮溶解指数洲si ) 、起泡性、乳化性 得到了显著的改善，且氨基酸组成保持均衡，比较适合食品工业上应用。 华中科技大学顿新鹏等l 选择胃蛋白酶、胰蛋白酶、碱性蛋白酶和中性蛋白 酶等四种蛋白酶对米渣蛋白进行改性研究。结果表明，以胰蛋白酶的改性效果最 好，在酶反应条件在底物浓度为8 、胰酶与底物比值为6 、温度为5 0 、时 间为6h 的水解条件下取得良好的试验效果。经高效液相色谱凝胶过滤法测定， 水解产物的分子量均小于5 0 0 0 d a ，其中分子量小于1 0 0 0 d a 的占5 2 3 0 ，并且 小分子的肽更有利于人体消化吸收【。- 】。但水解度过高，易产生小分子苦味肽而带 来不良影响。 武汉工业学院胡中泽【4 2 】以早籼米为原料，选择胃蛋白酶对大米蛋白进行了改 性研究。在温度4 0 c 、溶液p h 值为2 5 、酶用量0 3 5 、固液比l ：3 5 、水解时 间8h 的试验条件下，可以得到发泡性能及持泡性均较好改性大米蛋白。此外， 中德联合研究院李雁群等【4 3 】以大米糖渣为原料，采用a s l 3 9 8 中性蛋白酶对大米 蛋白进行改性研究。测定了酶用量、酶解时间对大米蛋白水解物发泡性能的影响， 并分析了大米蛋白水解度与发泡性能的关系。结果表明，大米蛋白的水解度控制 在9 0 时可得到最好的发泡性能。 1 6 大米蛋白的开发应用 大米蛋白的高营养价值和低过敏性引起国内外的广泛关注。目前市场上已开 发的产品主要有：大米蛋白营养补充剂、大米乳饮料、蛋白食品添加剂和大米生 物活性肽等。 1 6 1 大米蛋白营养补充剂 大米蛋白具有氨基酸营养平衡和低过敏性的特点。上世纪八十年代出现的高 蛋白米粉主要是作为婴幼儿的代乳粉，其蛋白质含量约为2 5 ，这类产品并没有 经过蛋白质的水解。研究表明，小肽分子比游离的氨基酸更容易被人体肠道吸收 和利用1 2 3 川】。蛋白营养补充剂是经蛋白酶作用的一种蛋白质水解产物，具有溶解 性能好、易于消化吸收等特点。 江南大学葛娜等1 4 4 1 根据氨基酸的互补原理将大米蛋白粉和乳清蛋白以6 5 ：3 5 比例混合作为复合蛋白，同时以酪蛋白为对照组进行营养学评价。动物试验表明， 复合蛋白的蛋白质生物价、功效比值、蛋白质消化率及净利用率等各项营养指标 均高于对照组，最终制备出一种具有较高营养价值的复合米蛋白营养粉。 1 6 2 大米饮料的研发 大米蛋白作为一种优质植物蛋白引起人们的日益重视，开发出的大米蛋白类 产品多种多样。目前，国内在米乳饮料研发方面主要有发酵型米乳酸饮料和非发 酵型米乳饮料两大类： 1 6 2 1 非发酵型米乳饮料 江南大学周鹏等】等以粳米为原料，采用磨浆提汁和酶解提汁两种不同方法 制备大米乳饮料。试验表明，酶解提汁方法不论在产品总固形物含量还是稳定性 方面均优于磨浆提汁方法，该产品具有大米特有的色泽和香味。 烟台大学金海珠等【舶，等以糙米和精米为原料，经淀粉酶和蛋白酶酶解、再经 过滤和灌装等工艺研制出保留糙米和精米原有风味的大米乳饮料。该产品具有色 泽清亮、香气宜人等特点，且各项感官、理化和微生物指标均达国家标准规定要 求。 1 6 2 2 发酵型米乳酸饮料 暨南大学傅亮等 4 7 1 等以大米为原料，经淀粉糊化等预处理后加入保加利亚乳 杆菌和嗜酸乳杆菌进行乳酸发酵，最后研制出一种色泽乳白、口感细腻、组织状 态良好、乳酸风味浓郁、米香味独特的发酵型营养米乳饮料。 中南林业科技大学黄亮等1 4 8 皖对发酵菌种保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌进 行驯化培养，以提高其在米乳环境下的发酵能力，再以早籼米为原料，经浸泡磨 浆、过滤添加菊糖等功能性甜味剂，再经糊化、高压灭菌，冷却后再添加驯化后 乳酸菌进行发酵，制备出一种具有发酵风味、酸甜合适、质地细腻、具有独特米 香风味的发酵型功能早籼米乳饮料。 湖南农业大学扈麟等1 4 9 从营养学角度，根据谷物蛋白和牛奶蛋白的互补原 理，以糯米和牛奶为主要原料，接种根霉和酵母菌发酵成大米发酵液和开菲尔， 辅以其他原调配成新型大米牛乳发酵饮料。该产品具有营养全面、酸甜适中、清 凉爽口等特点。 1 6 3 大米功能肽的开发 功能肽是具有调节人体生理节律、提高机体免疫能力、预防疾病等功能的生 物活性分子。目前，生物活性肽现己成为蛋白质水解研究的热点，大米蛋白水解 可以产生某些活性肽，现已发现多种具有潜在应用价值的生物活性肽如下： 1 6 3 1 免疫调节肽 免疫调节肽是指具有提高机体免疫功能的肽类，具有激活巨噬细胞和淋巴细 胞的吞噬功能、刺激外周淋巴细胞转化、诱导淋巴细胞增生、诱导淋巴细胞分泌 淋巴因子等作用m 。目前报道较多的大米来源活性肽是o r y z a t e s i n 活性肽。经结 构分析证实，o r y z a t e s i n 的一级结构为：g l y - t y r - p r o - m e t t y r - p r o - l e u - a r g 。经豚 鼠试验表明，o r y z a t e s n i 具有引起回肠收缩和免疫调节作用，并且主要是通过激 活磷脂酶水解溶血磷脂酸释放花生四烯酸引起收缩【s 。5 2 1 。 1 6 3 2降血压肽 随着人们生活水平的提高，在许多发达国家高血压成为一种文明病。研究证 明，大米蛋白经蛋白酶水解后可产生具有降低血压功能的生物活性肽。江南大学 吴建平等 5 3 5 4 1 以米糠蛋白为原料，经胃蛋白酶水解后，用色谱分离纯化获得三种 降血压肽，它们的一级结构分别为：l i e a l a p r o a s n t y r ，v a l a l a - p r o g l y - t h r - t y r ， g l y - g h r - c y s p r o a l a - a s n - c y s c y s g l y - g l y 。 1 6 3 3 抗氧化肽 天然的抗氧化肽由于其较高的安全性和较强的抗氧化能力使其在医药和食 品工业有着良好的应用前景。目前，国内有些学者从大米蛋白水解物种分离出具 有抗氧化作用的生物活性肽。江苏大学曹辉等5 5 】人以大米蛋白为原料，加入木瓜 酶进行酶解，大米蛋白水解物表现出有定的清除d p p h 自由基和羟基自由基能 力，其i c 5 0 分别为1 7 3 8m g r n l 和0 2 3 8m g m l 约为维生素ci c 5 0 的3 2 8 倍和 2 7 6 倍，是一种良好的天然抗氧化肽。但该天然抗氧化肽的一级结构及高级结构 尚未给出，还有待于进一步研究。 1 6 4 食品添加剂 食品添加剂是为改善食品品质、色、香、味以及为防腐和加工工艺的需要而 加入食品中的化学合成或天然物质 5 6 1 。不同相对分子质量的蛋白质分子具有不同 的溶解性、乳化性、起泡性，持水性和持油性等物理和化学性质。大米蛋白( 谷 蛋白) 本身溶解性差，经适当酸法或酶法改性后不仅可以提高蛋白质的溶解性还 可以改性其乳化性和起泡性等功能性质。 改性后的大米蛋白在食品工业中具有广泛的应用前景，如在肉类食品中作为 增稠剂增加肉类粘度，改善肉类品质，在焙烤食品中作为发泡剂增强产品的发泡 性能，提高产品的感官品质等。 1 7 课题的立项意义 蛋白质是维持生命活动的基本物质之一。我国南方地区是稻米的主产区，同 时稻米也是南方地区人民日常生活的主食。由此可见，