（食品科学专业论文）苦瓜皂苷的提取、纯化工艺及活性的研究.pdf

、 西华大学学位论文独创性声明 1 1 1 1111i i l i l lli ii iiii y 17 5 0 5 2 4 作者郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下进行研究 工作所取得的成果。尽我所知，除文中已经注明引用内容和致谢的地方外， 本论文不包含其他个人或集体已经发表的研究成果，也不包含其他已申请 学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的贡献 均已在论文中做了明确的说明并表示了谢意。 若有不实之处，本人愿意承担相关法律责任。 学位论文作者签名：王疹莎指导教 日期：2 d f d 年6 ) 弓6 臼日期1 西华大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，在校 攻读学位期间论文工作的知识产权属于西华大学，同意学校保留并向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，西 华大学可以将本论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采 用影印、缩印或扫描等复印手段保存和汇编本学位论文。( 保密的论文在解 密后遵守此规定) 学位论文作者签名：王莎掺 日期：2 d o 年6 目6 1 3 西华大学硕士学位论文 摘要 苦瓜( 英文名：b i t t e rg o u r d ；拉丁名m o m o r d i c ac h a r a n t i al ) 为葫芦科苦瓜属植物苦 瓜的果实。又名凉瓜、锦荔枝、癞葡萄等。苦瓜中含有很多营养成分，苦瓜皂苷是苦瓜 中的有效成分之一，国内外研究表明，苦瓜皂苷具有降血糖、抗肿瘤、提高免疫、抑茵、 消炎等作用。 本文以苦瓜粉为研究对象，对其提取、纯化工艺优化，并对苦瓜皂苷的抗氧化和降 血糖活性做了探讨。 在苦瓜皂苷的提取工艺方面，我们采用了两种方法进行研究；首先是超声波辅助提 取方法，通过单因素试验确定五个因素的最佳条件，然后通过p b 试验和正交试验进一 步优化得到超声波辅助提取工艺的最佳条件是料液比为1 ：4 0 ，超声功率为3 6 0 w ，超声 时间3 0 m i n ，超声温度8 0 、乙醇浓度7 0 ；其次是酶解提取方法，通过单因素试验确 定六个因素的最佳条件，通过p b 试验和c c d 试验找出酶解最优提取条件是：酶用量 o 6 0 4 、p h 值5 5 4 、酶解温度5 1 。7 、料液比l ：2 1 5 5 、乙醇浓度7 0 、酶解时间9 0 m i n ； 通过对4 种大孔吸附树脂的比较，筛选出能有效纯化苦瓜皂苷的树脂a b 8 ，并进 一步研究了a b 8 纯化苦瓜皂苷的工艺条件。首先通过静态实验，确定了上样浓度为 5 m g m l ，上样液p h = 1 0 的条件下树脂对苦瓜皂苷具有最佳吸附性，浓度为8 0 乙醇对 苦瓜皂苷具有最佳洗脱效果。其次，通过动态试验对树脂柱的吸附、解析性能进行研究， 确定了树脂柱的上样流速为2 b v h ，洗脱柱体积为4 5 b v 。 对苦瓜皂苷的抗氧化活性和降血糖活性进行了探讨。研究发现，苦瓜皂苷对羟基自 由基、超氧阴离子自由基、2 ，2 二苯代苦味酰基自由基( d p p h ) 具有良好的清除作用； 通过应用建立抗糖尿病中药提取库并筛选具有胰岛素受体激酶( i r t k ) 激动剂作用的活 性部位，发现苦瓜皂苷提取物可能具有激活i r t k 活性，为抗糖尿病新药设计先导化合 物提供了基础。 关键词：苦瓜；皂苷；响应面分析法；大孔吸附；抗氧化；降血糖 一一一一 a b s t r a c t b i t t e rg o u r d ( l a t i nn a m e ：m o m o r d i c al - ) b e l o n g st ot h ec u r c u b i t a c e a ef a m i l y i th a so t h e r n a m e s ：l i a n gg u 幻i n l i z h i ，l a i p u t a oe t c i th a sm a n yc h e m i c a lc o m p o s i t i o n s t h es a p o n i o n si s0 n e o t 。t 1 1 em a i n l ya c t i v ei n g r e d i e n t sf r o mb i t t e rg o u r d i ti sr e p o r t e dt h a tt h es a p o n i n sf r o mb i t t e r g o u r dh a v eb e e nu s e df o rt h et r e a t m e n to f h y p e r g l y c e m i a , h i 曲b l o o d f a t ，r l l t l o ra i d s ，a n t i p h l o g g i s t i c ，i m m u n ef u n c t i o nt oh u m a nb e i n ge t c i nt h i st h e s i s ，o u rr e s e a r c hf o c u s e so ne x t r a c t i o n ，f r a c t i o n a t i o na n di s o l a t i o no fs a p o n i n s f r o mm o m o r d i c ac h a r a n t i ala n dw ea l s om a k ea s t u d yo f f - u n c t i o no f a n t i o x i d a t i o ni nv i 仃oa n d h y p o g l y c e m i ca c t i v i t y u s i n gt w om e t h o d st oe x t r a c ts a p o n i n s o n eo f t h em e t h o di su l t r a s o n i c ，t h eo p t i m u mo 。n d i t i o n so fe x t r a c t i n gs a p o n i n sa r ed e t e r m i n e dt h r o u g hs i n g l e f a c t o r ，p b a n do r t h o g o n a lt e s t w i t h ar a t i oo f1 ：4 0b e t w e e nm o m o r d i c ac h a r a n t i a la n d7 0 e t h a n o l ，3 0 m i n ，u l t r a s o n i cp o w e r i s 3 6 0 w ，8 0 c a n o t h e rm e t h o di se n z y r n o l y s i s ，w h e nt h es a p o n i n sw c t ee x t r a c t e db y 甑l z m o l y s i s m e t h o d ，t h eo p t i m u mc o n d i t i o n so fe x l r a t i n gs a p o n i n sa r ed e t e r m i n e dt h r o u g hs i n g l ef a c t o r ，p ba n dc c d t e s t w i t h7 0 e t h a n o l ，1 ：2 1 5 5l i q u i dr a t i o ，a l la d d i t i o no f o 6 0 4 p h 5 5 4 t h em a i na c t i v e i n g r e d i e n t sw e r ee x t r a c t e da t51 7 c f o u rk i n d so f m a c r o p o r o u sr e s i n sw e r es e l e c t e dt oc o m p a r et h e i r a b s o r p t i o na n dd e s o r p t i o no fs a p o n i n s r e s u l ts h o w e dt h a ta b 一8r e s i n sw a st h eo p t i o n a lt op u r i f yt h es a p o n i n sf r o m m o m o r d i c ac h a r a n f i al t h e nt h ec o n d i t i o n so fp u r i f i c a t i o no fs a p o n i n sw i t hm a c t o r e t i c u l a r r e s i na r es t u d i e db ys t a t i ca n dd y n a m i c e x p e r i m e n t t h ep a r a m e t e r so fd y n a m i ca d s o r p t i o na r e a sf o l l o w i n g ：t h eo r i g i n a lc o n c e n t r a t i o n5 m g m l ，t h ef e e d i n gr a t e2 b v ha n d p hv a l u e10 ： t h ep a r a m e t e r so fd y n a m i ce l u t i o na r ca sf o l l o w i n g ：t h ee l u t i n gc u b a g eo f8 0 a l c o h 0 1 t h e e l u t i n gr a t ei s2 b v h ，t h ee l u t i n gv o l u m ni s4 5 b v t h ea n f i o x i d a t i o ni nv i t r oa n d h y p o g l y c e m i ca c t i v i t ye f f e c to fs a p o n i n sf r o mm o r n o r d i c a c h a r a n t i aw e r es t u d i e d t h er e s u l t e ds h o w e dt h a t ：t h es c a v e n g i n gc a p a b i l i t i e st o s u p e r o x i d e a n i o nr a d i a l ，t h eh y d r o x y lf r e er a d i c a la n dd p p hr a d i c a lw e r ew e l l ，a n da l s ot h es a p o n i o no f m o m o r d i c ac h a r a n t i aw i t ha l c o h o lc o u l dh a v et h e a c t i v i t yo fa g i t a t i n gf o rl r t k t h e ni t p r o v i d e st h eb a s i sf o rd e s i g n i n gt h el e a dc o m p o u n do f n e wd r u g sf o rt r e a t i n gd i a b e t e s k e yw o r d s ：m o m o r d i c ac h a r a n t i a ；s a p o n i n s ；r e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g y ；m a c r o d o r o u sa b s o r p t i o nr e s i n ；a n t i o x i d a t i o n ；h y p o g l y c e m i c ； 西华大学硕士学位论文 目录 弓i 言1 1 1 苦瓜概述1 1 2 皂苷以及苦瓜皂苷6 1 3 本课题的主要研究内容及技术路线7 2 苦瓜皂苷提取工艺条件的研究9 2 1 引言9 2 2 试验器材与方法9 2 3 试验结果分析15 3 大孔吸附树脂分离纯化苦瓜皂苷条件的研究4 3 3 1 引言4 3 3 2 材料4 3 3 3 实验结果4 6 3 4 小结5 1 4 苦瓜皂苷的体外抗氧化活性研究5 3 4 1 引言5 3 4 2 材料与方法5 3 4 3 小结5 7 5 苦瓜皂苷体外降血糖活性的研究5 8 5 1 引言5 8 5 2 试验材料5 9 5 3 试验方法6 0 5 4 试验结果6 2 5 5 小结6 3 6l ；论6 4 6 1 j 、结6 4 6 2 实验完善之处6 4 参考文献6 6 攻读硕士学位期间学术论文及科研情况7 1 致谢7 2 u i d o c u m e n tr e v i e w 7 1 1 1b a l s a mp e a r 1 1 2s a p o n i n sa n db a l s a mp e a rs a p o n i n s 6 1 3 t o p i cr e s e a r c hc o n t e n t sa n dt e c h n i c a lr o u t e 7 2m e t h o d sf o ro p t i m i z i n gt h es a p o n i n sd i f f e r e n te x t r a c t i n gp r o c e s sc o n d i t i o n s 9 2 1i n t r o d u c t i o n 9 2 2t e s te q u i p m e n ta n dm e t h o d s 9 2 3t e s tr e s u l t s 1 5 3s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no fm a c r o p o r o u sa d s o r p t i o nr e s i nf o rt h er e s e a r c h 4 3 3 1 - o d u c t i o n 4 3 3 2m a t a i a l 4 3 3 3e x p e r i m e n t a lr e s u l t s 4 6 3 4 s u m m a r y 5 1 4b a l s a mp e a rs a p o n i n sa n t i o x i d a n ta c t i v i t yi nv i t r o 5 3 4 1i n t r o d u c t i o n 5 3 4 2m a t e r i a l sa n dm e t h o d s 5 3 4 3 s u m m a r y 5 7 5b a l s a mp e a rs a p o n i n si nv i t r oh y p o g l y c e m i ca c t i v i t y 5 8 5 1i n t r o d u c t i o n 5 8 5 2t e s tm a t e r i a l s 5 9 5 3t e s tm e t h o d 6 0 5 4t e s tr e s u l t s 6 2 5 5s u m m a r y 6 3 6c o n c l u s i o n 6 4 6 1 s u m m a r y 6 4 6 2e x p e r i m e n tp e r f e c t 6 4 r e f e f e n c e 6 6 a c h i e v e m e n t s 7 1 a c k n o w l e d g e 7 2 西华大学硕士学位论文 引言 1 1 苦瓜概述 苦瓜( m o m o r d i c ac h a r a n t i al ) ，别名凉瓜、锦荔枝、癞葡萄、红羊，英文名：b i t t e r m e l o n ，b i t t e rg o u r d ，因其具有特殊苦味而得名【l 】，苦瓜为葫芦科苦瓜属一年生攀援草 本植物的果实，原产于印度，1 7 世纪传入欧洲，多做观赏植物栽培，大约在明初传入我 国。苦瓜在全国各地均有栽培，主产于广西、广东、云南、福建等地，果实在广、川i 、 湖地区喜作蔬菜食用。苦瓜性味苦寒，具有清热解凉、滋养强壮、降血糖等功效，在医 药上还有增进食欲、明目、助消化、清凉解毒、利尿和治疗犊尿病等疗效【2 】，因此苦瓜 素有“药用蔬菜”之称【3 】。苦瓜耐热，病虫害少，易栽培。近年来各大中城市作为增加 夏秋淡季蔬菜花色品种来栽培。苦瓜不仅是夏季佳蔬，又是一味良药，已日益引起人们 的重视，逐渐扩大栽培的区域【2 】。 苦瓜果实中含有各种营养物质，每l o o g 嫩苦瓜中营养成分为：水分为9 3 9 - 9 4 9 、蛋白 质o 9 9 一1 o g 、脂肪0 i g 一0 2 9 、碳水化合物2 6 9 一3 5 9 、粗纤维1 i g - i 4 9 、维生素a 1 7 m g 一2 2 m g 、维生素b l0 0 3 m g 、维生素b 20 0 3 m g 、维生素c 5 6 m g - 1 2 0 m g 、维生素e o 8 5 m g 、 尼克酸0 3 m g 一0 4 m g 、胡萝卜素0 0 8 m g 一0 i m g 、钙1 8 m g 一2 2 m g ，磷1 9 m g 一3 5 m g 、铁 0 6 m g - o 7 m g 、钾2 5 6 m g 。与其他瓜类相比，营养略胜一筹。此外，苦瓜中含有1 6 种氨基 酸，如谷氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸等。其中酪氨酸、组氨酸含量特别高，8 种 必需的氨基酸含量高达3 8 。苦瓜中含有十种人体必需的微量元素，其中c u 、z n 、c r 、 c o 、n i 、m n 的含量比较高【4 1 。 对苦瓜的研究，世界各地均有药用记载。明代以前医书没有记载苦瓜，我国苦瓜的 记载始于明代兰茂所撰滇南本草，称苦瓜“苦、寒、平、入心、脾、胃三经泻 六经实火、清暑、益气、止渴”。清代张璐在本经逢原中也称苦瓜“为除热解烦、 清心明目之品 。明代救荒本草、本草纲目始列入，疑为三宝太监下西洋时， 从南洋群岛移植过来。清代王孟英的随息居饮食谱说：“苦瓜清则苦寒；去热，明 目，清心。可酱可腌。中寒者勿食。熟则色赤，味甘性平，养血滋肝，润脾补肾。” 李时珍在本草纲目中记载其“气味苦、寒、无毒，具有除邪恶、解劳乏，清心明目， 益气壮阳之功效”。近代中药大辞典中记载其根、茎、花、叶、果、籽均可入药。 1 1 1 苦瓜中的化学成分研究进展 苦瓜作为一种“药食两用”的天然植物，近年来，科研人员对苦瓜的成分进行了深 入的研究。苦瓜的化学成分是人们研究的热点，不断有新的化合物报道出来。目前，从 苦瓜中分离的化学成分主要有：苦瓜凝集素( m o m o r d i e ac h a r a n t i al e c t i n ，m c l ) ，a 苦 苦瓜皂苷的提取、纯化工艺及活性的研究 b 苦瓜素【5 】，苦瓜抑制剂以及核糖体失活蛋白【6 1 、苦瓜免疫缺 种苦瓜种仁蛋白等【7 1 。近年来，又从鲜苦瓜原汁中，提纯出一些 苦瓜素苷、胡萝b 甾醇和抗生育活性成分、植物胰岛素【8 】 苦瓜 亭，尿嘧啶等【9 1 。 杂的苷类化合物，由于它的水溶液在振荡时产生类似皂样的持久 苷广泛的分布在植物种类里，它们由含糖和不含糖的糖链单元所 组成。糖可以是一条两条或者三条组成，并且分别是单萜，二萜和三萜。自然界中的糖 苷配基能分成甾体和三萜烯两类。苦瓜皂苷主要在苦瓜果实中存在，苦瓜种子、茎叶中 也含有一定量的苦瓜皂苷。苦瓜皂苷主要包括甾体类皂苷和三萜类皂苷两种。苦瓜中的 三萜类皂苷主要包括葫芦素烷型四环三萜和乌苏酸型五环三萜皂苷等【l 。苦瓜皂苷的生 理功能大致有如下三种：降血糖功能。潘华等【l2 j 用不同剂量的苦瓜素对四氧嘧啶高血 糖鼠以不同剂量连续灌胃1 0 天，测血糖值。结果表明：苦瓜素对四氧嘧啶高血糖鼠具有 明显降血糖作用。孙宝莹【1 3 】给正常大鼠和患糖尿病的大鼠服用苦瓜皂苷和优降糖。结果 表明：苦瓜对正常大鼠、四氧嘧啶糖尿病大鼠均有明显的降血糖作用。张萍萍【1 4 】也证明 了苦瓜皂苷对四氧嘧啶模型动物降血糖作用显著，与对照药物优降糖相比，其作用缓慢 而持久。王先远【1 5 】也证明了苦瓜皂苷的降血糖作用，并对其降糖机理作了初步探讨。 提高免疫能力。试验证明苦瓜皂苷能够明显增加衰老小鼠胸腺c d 计一t 细胞数，明显降低 胸腺和脾脏c d 4 + c d 8 + 双阳性t 细胞数【1 6 1 。体外研究表明，苦瓜皂苷不但可以促进脾脏分 泌i l - 2 ，还可以显著增强腹腔巨噬细胞分泌t n f a ，但不影响胸腺细胞凋亡百分数。结果 也显示，苦瓜皂苷可通过改变t 细胞各亚群比例，促进i l - 2 分泌增强吞噬指数，提高衰 老小鼠免疫功能。抗氧化作用。实验结果表明【17 1 ，苦瓜皂苷具有良好的抗氧化功能， 可显著增强s o d 、g s h - p x 的活力。其机理可能与t n f a 的作用有关【l 列具有有诱导和增强s o d 和g s h p x 活力的功能，苦瓜皂苷能够增强巨噬细胞分泌t n f a 。但是苦瓜皂苷对血清、骨 骼肌、肝脏g s h - p x 活力的影响是不一样的苦瓜皂昔明显增高血清、肝脏中g s h - p x 活力， 却不影响骨骼肌中g s h - p x 活力。 ( 2 ) 苦瓜黄酮 黄酮类化合物是一类天然产物，广泛存在于植物界，是许多中草药的有效成分，具 有很高的药用价值。自然界中最常见的是黄酮和黄酮醇，其它包括双氢黄( 醇) 、异黄酮 双黄酮、黄烷醇、查尔酮、橙酮、花色苷及新黄酮类掣1 9 】。天然来源的生物黄酮分子量 小，能被人体迅速吸收，能通过血脑屏障，能进入脂肪组织，能够消除疲劳保护血管、 防动脉硬化、扩张毛细血管、疏通微循环、抗脂肪氧化、抗衰老、活化大脑及其他脏器 西华大学硕士学位论文 细胞的功能。黄酮类化合物具有抗癌、抗肿瘤、抗心脑血管疾病、抗炎镇痛、免疫机体 调节、降血糖、治疗骨质疏松、抑菌抗病毒、抗氧化、抗衰老、抗辐射等作用p o 。 ( 3 ) 苦瓜蛋白 苦瓜蛋白是苦瓜中一类小分子蛋白质或者多肽类物质，这些功能性蛋白质分子有极 高保健价值，其主要的作用主要表现为：极强的抑菌和抗菌作用。研究结果表明苦瓜 蛋白提取物对1 1 种1 6 5 株革兰氏阳性球菌、革兰氏阴性杆菌具有抑菌抗菌作用【2 1 】。抗 病毒作用。苦瓜和从其分离出的几种化合物如苦瓜凝集素、m a p 3 0 蛋白己被证明具有抗 病毒活性，苦瓜中的m a p 3 0 蛋白能抑铝i j h i v 活性，使h i v 在接触苦瓜提取物4 d 内抗原活性 完全不表达，有选择性的杀死被h i v 感染的淋巴细胞和巨噬细胞，能够抑制单核细胞 h i v - i 型病毒d n a 复制，而对未感染细胞没有毒性，因此具有抗艾滋病作用；苦瓜蛋白对 柯萨奇病毒具有直接灭活作用，苦瓜素在体内外对柯萨奇病毒的r n a 复制具有明显的抑 制作用，其抑制作用是通过抑制柯萨奇病毒的r n a 在心肌细胞内的转录和翻译，在病毒 复制的分子水平上发挥作用。抗肿瘤作用。科学家发现苦瓜粗提物有增强机体的免疫 力，抵抗肿瘤发生的功能。q 一苦瓜素能选择性杀死绒毛细胞和黑色素瘤细胞，抑制肿 瘤细胞蛋白质的合成；1 3 一苦瓜素能抑带u 3 h - 亮氨酸、3 h - 尿嘧啶和3 h 一胸腺嘧啶整合到人 舌喉鳞状上皮癌细胞中。研究表明，两种苦瓜素对人体胃癌n k m 细胞株的d n a 、r n a 和蛋一 白质的合成也均有明显的抑制作用【2 2 1 。 ( 4 ) 植物胰岛素 据文献报道【2 3 1 ，用醇、醚、纯碱等对新鲜苦瓜进行粗提，再经s e p h a d e x g - 5 0 i 分离纯化，冷冻干燥，得到2 5 的白色植物胰岛素( p l a n t i s u l i n ) 精品。 ( 5 ) 微量元素 文献报道【2 3 1 ，苦瓜中含有十多种人体必需微量元素，其中c u 、z n 、c r 、c o 、m n 、n i 的含量较高。研究表明苦瓜中的微量元素是其促进机体生理功能，防治某些疾病的重要 物质基础。 ( 6 ) 有机酸类 苦瓜中含有多种有机酸【2 4 1 ，包括a 一桐酸、丁酸、软脂酸、硬脂酸、油酸、棕榈酸、 月桂酸、肉豆寇酸、棕搁油酸及人体必需的脂肪酸、亚油酸、亚麻酸等。 1 1 2 苦瓜的药理作用 苦瓜药食兼用，在我国已经有5 0 0 年的历史了，为著名的民间中草药。苦瓜的记载 最早始于明代以后又有许多记载。本草纲目日：，去邪热，解劳之，清心明日【2 5 】。 近年来研究证明具有明显的降血糖【2 6 】、抗肿瘤【2 7 1 、抑制皮肤炎 2 8 】，还具有抗病毒和抗 艾滋病【2 9 3 、抗肿瘤3 2 1 、抗菌 3 3 , 3 4 】、抗氧化【3 5 1 、抗生育【3 6 矧、免疫调节 3 8 】、降血脂、驱 苦瓜皂苷的提取、纯化工艺及活性的研究 虫、止痛等功能【3 9 4 1 1 。中国现代医学也认为苦瓜性味苦寒，具有清热解凉、滋阴强壮抑 菌、消炎和降血糖等功效同【4 2 1 。 ( 1 ) 降血糖活性研究 苦瓜的降血糖作用是其最重要的功能之一，苦瓜中含有类胰岛素成分，有一些实验 还显示苦瓜可能具有肝脏糖异生作用，增加肝脏糖原合成，增加外围血红细胞和脂肪细 胞氧化【4 3 1 。w e l i h i n d a 等【删报道苦瓜具有增加胰岛素分泌的作用，理论上苦瓜提取物可 以增加1 3 细胞的生成。然而这种机理还没有被研究证实【4 5 舶】。苦瓜中降血糖成分主要为 苦瓜皂苷、生物碱、萜类、植物甾醇、甾体类和肽类等【4 9 1 。 1 9 6 0 年，r a o 研究发现，苦瓜皂苷有治疗四氧嘧啶糖尿病小鼠的作用【5 0 】；1 9 7 5 年， o l a n i y i 通过试验证明苦瓜苷的降血糖作用比降血糖药物甲糖宁的作用还要强；1 9 8 1 年， a k h t a r 5 1 通过观测苦瓜提取物不同活性部位对四氧嘧啶糖尿病小鼠的降糖作用，提出生 物碱和类胰岛素物质可能是其活性成分；k h a n n a 等从苦瓜中分离出有胰岛素的作用或 可促进胰岛素释放的活性物质。一些研究也把降血糖活性归因于苦瓜苷对外部胰腺的作 用，包括增加肌肉的g l u t 4 转移蛋白，增加胰脏和肌肉的葡萄糖利用率，抑制肝脏中 的6 磷酸葡萄糖脱氢酶活性，刺激红细胞和肝脏6 磷酸葡萄糖脱氢酶活性。苦瓜不仅直 接具有降血糖的作用，而且对糖尿病并发症具有治疗作用。糖尿病是导致肾病的直接原 因，苦瓜对于患糖尿病动物的肾病具有较好的治疗效果。谢春生等己发明了复方苦瓜胶 囊用于治疗糖尿病【5 列。另有报道，对四氧嘧啶型糖尿病家兔，灌胃给予鲜苦瓜果实的汁 液，连续1 3 天后，测定血清中n o 含量，观察心脏、肝脏、肾脏、 谷胱甘肽过氧化物酶( c s h p k ) 活力变化。结果表明，血浆中n o 含量苦瓜糖尿病组 比糖尿病模型组低，而肝肾组织中的c s h p k 活力苦瓜糖尿病组比糖尿病模型组高( p b c a 。 2 2 翘号。2 3 4 5 6 7 8 9怼瞄n也b叭吡们r q s 西华大学硕士学位论文 表1 1 5 b ( 3 4 ) 方差分析表 t a b 1 15 b ( 3 4 ) a n o v at a b l e e y = 1 2 1 5 3 ，p = 1 2 1 5 32 2 7 = 5 4 7 0 ，w = 5 4 7 8 ，s t = w p = 0 0 0 8 ，w l = 5 4 7 7 s t l = w l p = 0 0 0 7 ，s e 2 = s t s t l = 0 0 01 结果分析：根据直观分析和方差分析可以得到：料液比，超声处理功率、超声处理 时间和超声处理温度对皂苷提取含量有非常显著的影响，其中超声温度影响最大，其次 是超声处理功率和超声处理时间，料液比对其影响最小。 ( 8 ) 重复试验结果 分别按照正交实验得出的最佳条件和直观分析得到的最佳条件进行实验，平行3 次， 结果如表1 1 6 所示。 苦瓜皂苷的提取、纯化工艺及活性的研究 表1 1 6 重复试验结果表 t a b 1 16 r e p e a t e dt e s tr e s u l t s 结果分析：从表1 1 6 可以看出，经过三次重复试验后，直观分析得到的最佳条件所 测得的吸光度要高于正交试验得到的最佳工艺条件所测得的吸光度。我们可以得出结 论，超声波辅助提取苦瓜皂苷的最佳工艺条件：料液比为1 ：4 0 ，超声处理功率为3 6 0 w ， 超声处理时间3 0 m i n ，超声处理温度8 0 。 2 3 3 葡萄糖标准曲线的绘制 表1 1 7 不同含量的葡萄糖在5 2 0 n m 处的吸光度表 t a b 1 17d i f f e r e n tl e v e l so fg l u c o s ei nt h ea b s o r b e n c y5 2 0 n mt a b l e 试验数 12345678 0o 20 4o 6o 811 21 41 61 8 葡萄糖量( m g ) 图1 1 1 葡萄糖标准曲线 f i g 1 11 g l u c o s es t a n d a r dc u l v e 9 8 7 6 5 4 3 2 l o 翼登 西华大学硕士学位论文 2 3 4 酶活的测定 取3 支试管，底部各放一张l x 6c r n 的滤纸，分别加入等量适当稀释的酶液p h = 4 8 的缓冲液，在5 0 c 水浴中反应1 h ，隔2 0 m i n 摇一下试管，沸水浴5 r a i n 灭酶活，迅速冷却， 过滤，取四支试管，一支为空白参比，分别按表2 2 加入试剂。将各试管内液体混匀， 在沸水中加热5 m i n 取出后立即冷却至室温，再向各管中分别加入2 1 5 m l 蒸馏水，摇匀， 于5 2 0 n m 波长处测其a 值，查葡萄糖标准曲线，计算还原糖总量。以每毫升酶液每小 时产生l m g 葡萄糖为一个酶活单位，计算酶活，结果如表1 1 8 。 表1 1 8 试剂加量表 t a b 1 1 8 r e a g e n t sa n ds c a l e 根据测出的吸光值对应标准曲线求出还原糖的含量，然后计算酶活，最终得出酶活 力为6 7 8 m g ( m l x h ) 。 2 3 5 酶解单因素实验条件研究 ( 1 ) 酶加量试验 精确称取经过预处理的苦瓜干粉6 份1 0 9 于1 5 0 m l 的编号为1 - 6 的小烧杯中，按 顺序逐一向这6 个烧杯中按1 - 6 的顺序分别加入0 1 、0 3 、0 5 、0 8 、1 0 、2 0 的酶，然后加入浓度为7 5 的乙醇溶液3 0 m l ，摇匀，在温度为5 0 c 的恒温振荡器中酶 解1 2 0 m i n 后，按照测标准曲线的方法测定每个样品的吸光度，数据如表1 1 9 所示： 表1 1 9 酶解提取酶加量单因素试验结果 t a b 1 19 e n z y m a t i ch y d r o l y s i se n z y m ee x t r a c t i o no fs i n g l ef a c t o re x p e r i m e n tr e s u l t s 苦瓜皂苷的提取、纯化工艺及活性的研究 oo 20 40 6 0 8 酶加量( ) 图1 1 2 苦瓜皂苷吸光值与酶加量关系曲线图 f i g 1 12 b a l s a mp e a rs a p o n i n sv a l u ea n dq u a n t i t yr e l a t i o n s h i pc m w c s 从图1 1 2 可以看出酶加量在o 1 - 0 8 时，随着酶加量的增加苦瓜皂苷提取量不 断增加，但在酶加量在0 5 以后，随着酶加量的增加苦瓜提取量变化不大，因此我们 选择o 5 作为酶加量的最适应值。 ( 2 ) p h 值 精确称取经过预处理的苦瓜干粉6 份1 o g 于1 5 0 m l 的编号为1 - 6 的小烧杯中，按 顺序逐一向这6 个烧杯中按1 - 6 的顺序加入0 5 的酶，然后加入浓度为7 5 的乙醇溶 液3 0 m l ，摇匀，用缓冲液将其p h 值分别调为4 、5 、6 、7 、8 、9 ，在温度为5 0 的恒 温振荡器中酶解1 2 0 m i n 后，按照测标准曲线的方法测定每个样品的吸光度，数据如表 1 2 0 所示： 表1 2 0 酶解提取p h 值单因素试验结果 t a b 1 2 0 e n z y m a t i ch y d r o l y s i se x t r a c t i o np hv a l u eo fs i n g l ef a c t o re x p e r i m e n tr e s u l t s 5 3 5 2 5 l 5 o 3 2 1 o o 0 o o o o o 赢嚣i q 答 西华大学硕士学位论文 0 3 o 2 5 0 2 趔 米0 1 5 螫 0 1 0 0 5 0 p h 值 图1 1 3 苦瓜皂苷吸光值与p h 值关系曲线图 f i g 1 13 b a l s a mp e a rs a p o n i n sa n dp hv a l u er e l a t i o nc u r v e s 从图1 1 3 中可以看出p h 值在5 时吸光值达到最大，而吸光值在碱性条件下，吸光 值很不理想，这说明这种复合酶在碱性条件下活性不高，从而使其作用效果不明显，因 此我们选择p h 为5 作用反应的最佳条件。 ( 3 ) 料液比 精确称取经过预处理的苦瓜干粉6 份1 0 9 于15 0 m l 的编号为1 - 6 的小烧杯中，按 顺序逐一向这6 个烧杯中按1 - 6 的顺序加入0 5 的酶，然后加入浓度为7 5 的乙醇溶 液，料液比分别为1 ：1 5 、1 ：2 0 、1 ：2 5 、1 ：3 0 、1 ：3 5 、1 ：4 0 ，调节p h 值为5 ，摇匀，在温 度为5 0 的恒温振荡器中酶解1 2 0 m i n 后，按照测标准曲线的方法测定每个样品的吸光 度，数据如表1 2 1 所示： 表1 2 1 酶解提取料液比单因素试验结果 t a b 1 21 e n z y m a t i ch y d r o l y s i se x t r a c t i o nr a t i oo nt h es i n g l ef a c t o re x p e r i m e n tr e s u l t s 苦瓜皂苷的提取、纯化工艺及活性的研究 、- j 四 米 登 ：1 51 ：2 21 ：2 91 ：3 61 ：4 3 料液比 图1 1 4 苦瓜皂苷吸光值与料液比关系曲线图 f i g 1 1 4 b a l s a mp e a rs a p o n i n sv a l u ea n dh y d r o l y s i se x t r a c t i o nr a t i or e l a t i o nc u r v c s 从图1 1 4 中可以看出在料液比为1 ：2 0 的时候，吸光值最大，料液比越大有可能将 其他的物质提取出来影响苦瓜皂苷的含量，因此选择料液比1 ：2 0 为最宜。 ( 4 ) 乙醇浓度 精确称取经过预处理的苦瓜干粉6 份1 o g 于1 5 0 m l 的编号为1 6 的小烧杯中，按 顺序逐一向这6 个烧杯中按1 - 6 的顺序加入0 5 的酶，然后分别加入浓度为5 0 、6 0 、 7 0 、8 0 、9 0 、9 5 的乙醇溶液2 0 m l ，调节p h 值为5 ，摇匀，在温度为5 0 的恒 温振荡器中酶解1 2 0 r a i n 后，按照测标准曲线的方法测定每个样品的吸光度，数据如表 1 2 2 所示： 表1 2 2 酶解提取乙醇浓度单因素试验结果 t a b 1 2 2e n z y m a t i ch y d r o l y s i se x t r a c t i o ne t h a n o lc o n c e n t r a t i o no fs i n g l ef a c t o re x p e r i m e n tr e s u l t s 4 2 9 8 6 4 2 8 8 6 4 2 1 西华大学硕士学位论文 0 3 5 0 3 0 2 5 j 四0 2 米 惑0 1 5 0 1 o 0 5 o 乙醇浓度( ) 图1 1 5 苦瓜皂苷吸光值与乙醇浓度关系曲线图 f i g 1 15 b a l s a mp e a rs a p o n i n sv a l u ea n de t h a n o lc o n c e n t r a t i o nr e l a t i o nc u r v e $ 从图1 1 5 中可以看出，随着乙醇浓度的增大，苦瓜皂苷的吸光值增大，但是增大幅 度不是很大，在7