（食品科学专业论文）莲子中蛋白质的分离及其食品功能特性研究.pdf

中文摘要 莲子中蛋白质的分离及其食品功能特性研究 摘要 莲子含有丰富的营养物质，历来被视为营养保健的佳品，但是目前为止，国 内外还没有关于莲子中蛋白质组成及其分子特性的系统研究，特别是缺乏关于莲 子蛋白质食品功能特性的研究，因此，本课题是首次对莲子蛋白质的这些方面进 行研究。本文在提取莲子蛋白质基础上，进行了莲子蛋白质氨基酸分析及热变性 分析，研究了莲子主要蛋白质组分清除羟自由基作用；运用s d s p a g e 电泳、i e f 等电聚焦电泳研究了莲子主要蛋白组分亚基相对分子质量、等电点，同时运用 d e a e 2 3 离子交换层析及s e p h a d e xg 2 0 0 凝胶过滤层析对莲子主要蛋白质组分 进行分离纯化；优化了莲子总蛋白提取工艺并进行了莲子总蛋白食品功能特性研 究。主要结果如下： 1 莲子水溶、盐溶、酸溶、碱溶四个主要蛋白组分中含硫氨基酸、缬氨酸、 苯丙氨酸和酪氨酸含量均超过推荐标准，异亮氨酸、赖氨酸、苏氨酸为限制性氨 基酸。经差示扫描量热法分析可知，莲子盐溶蛋白变性温度最高( t 0 4 5 2 ) ， 焓变最小( 8 8 0 1 3 j g ) ；水溶蛋白焓变最大( 9 3 0 1 4 8 j g ) 。而莲子四种主要蛋白 组分对o h 均有较好清除作用( p 0 0 1 ) 。 2 经s d s p a g e 、i e f 电泳分析可知，莲子水溶蛋白有1 0 个亚基 ( 6 9 4 8 7 8 k d a ) ，4 个等电点蛋白组分( p 1 4 9 4 p 1 5 8 5 ) ；盐溶蛋白有l o 个亚基 ( 1 4 2 1 1 0 5 k d a ) ，2 个等电点蛋白组分( p 1 5 1 7 、p 1 5 3 4 ) ；酸溶蛋白有1 2 个亚 基( 7 2 9 7 3 k d a ) ，3 个等电点蛋白组分( p 1 5 4 0 p 1 6 3 1 ) ；碱溶蛋白有6 个亚基 ( 1 5 0 4 6 8 k d a ) ，4 个等电点蛋白组分( p 1 5 5 1 p 1 6 4 6 ) 。经d e a e 2 3 离子交换 层析分离纯化可知，莲子水溶、酸溶、碱溶蛋白均出现2 个洗脱峰，盐溶蛋白仅 出现1 个洗脱峰。经s e p h a d e xg 2 0 0 凝胶过滤层析可知，莲子水溶蛋白和碱溶 蛋白均有1 0 个洗脱峰，盐溶蛋白有2 个洗脱峰，酸溶蛋白有9 个洗脱峰。 3 莲子总蛋白最佳提取条件为：料液比1 ：2 5 ，p h l l 0 ，4 0 4 c 浸提3 h 。莲子 总蛋白提取液氨基酸组成与莲子粉相近，但缬氨酸、酪氨酸、蛋氨酸a n ( 半) 胱氨 酸的含量明显高于莲子粉。莲子总蛋白经差示扫描量热法分析可知，其峰值温度 为10 2 2 。c ，热焓为5 7 9 2 j g 。 4 莲子总蛋白提取液经酸沉淀( p 1 4 5 0 ) 后制备成冻干粉，进行功能性研究 中文摘要 可知：莲子蛋白持油率随样品质量的增加由2 6 0 升高至6 5 0 。莲子蛋白持水 力在5 0 时达最大值。莲子蛋白发泡力随样品浓度增大而增强，n a c i 浓度为1 0 时，蛋白发泡力最强，而泡稳定性在p h 5 0 达到最高。莲子蛋白乳化能力及乳化 稳定性随着样品浓度从1 0 升高至4 o 过程增大，在等电点附近，蛋白乳化能 力与乳化稳定性均较差。随着莲子蛋白浓度增加，蛋白凝胶硬度、脆度及粘性逐 渐增加，胶凝性和弹性也逐渐增强，这种趋势在蛋白浓度高于1 2 o 后尤为显著： 莲子蛋白凝胶的硬度、脆度、粘性、胶凝性和弹性在p h 9 0 时均达到最大值。 关键词：莲子；蛋白质；提取；分子特性；功能特性 英文摘要 s t u d yo ns e p a r a t i o no fp r o t e i nf r o ml o t u ss e e da n di t s f o o df u n c t i o n a lc h a r a c t e r i s t i c s 。a b s t r a c t l o t u ss e e dh a sa l w a y sb e e nr e g a r d e da st h eh i g hq u a l i t yg o o d sf o ri t sr i c h n u t r i e n t s ，b u tu n t i ln o w ，t h e r ew e r en o ts y s t e mr e s e a r c ho ni t sp r o t e i nc o m p o s i t i o n a n dm o l e c u l a rp r o p e r t i e s ，s p e c i a l l y l a c k i n gs t u d ya b o u ti t sp r o t e i nf u n c t i o n a l p r o p e r t i e si nd o m e s t i ca n df o r e i g n t h e r e f o r e ，t h er e s e a r c hi nt h i sa r t i c l ew a st h ef i r s t t i m et os t u d yo nt h e s ea s p e c t so fp r o t e i ni nl o t u ss e e d i nt h i sr e s e a r c h ，a m i n oa c i d a n dt h e r m a ld e n a t u r a t i o na n a l y s i sw e r ed o n ea f t e rw i t h d r a w i n gt h el o t u sp r o t e i n s c a v e n g i n ga c t i v i t i e so ff o u rm a i np r o t e i nf r a c t i o n si nl o t u ss e e do n o hh a v eb e e n d o n ea n dt h e i rm o l e c u l a rp r o p e r t i e s ，s u c ha sm o l e c u l a rw e i g h to fp r o t e i ns u b u n i t s ， i s o e l e c t r i c p o i n t w e r ed e t e r m i n e d b y s d s p a g ea n di s o e l e c t r i c f o c u s i n g e l e c t r o p h o r e s i s ( i e f ) a n dt h ep u r i f i c a t i o no ff o u rm a i np r o t e i nf r a c t i o n si nl o t u ss e e d w e r ed o n eb yt h em e a n so fd e a e c e l l u l o s ei o n e x c h a n g ec o l u m nc h r o m a t o g r a p h y a n dg e lf i l t r a t i o no ns e p h a d e xg - 2 0 0 t h eo p t i m u me x t r a c t i o nc o n d i t i o n so ft o t a l p r o t e i ni nl o t u ss e e d sa l s oh a v eb e e nd o n e ，a n da f t e rt h a t ，l o t u sp r o t e i nf u n c t i o n a l p r o p e r t i e sw e r es t u d i e d t h em a i nr e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 i nf o u rm a i np r o t e i nf r a c t i o n so fl o t u ss e e d ，t h ec o m p o s i t i o no fv a l ，p h e ，t y r a n ds u l f u rc o n t a i n i n gw e r eh i g h e rt h a ns t a n d a r dp a t t e r n ，b u tt h ei l e ，l y sa n dt h rw e r e t h e i rl i m i t i n ga m i n oa c i d s d i f f e r e n t i a ls c a n n i n gc a l o r i m e t r y ( d s c ) a n a l y s i sh a sb e e n d o n ea n dt h er e s u l ts h o w e dt h a tt h es a l t s o l u b l ep r o t e i nh a dt h eh i g h e s td e n a t u r a t i o n t e m p e r a t u r e ( 1 0 4 5 2 。c ) a n dt h es m a l l e s te n t h a l p y ( 8 8 0 1 3 j g ) ，a n dt h ew a t e r - s o l u b l e p r o t e i nh a dt h el a r g e s te n t h a l p y ( 9 3 o14 8 j g ) f o u rm a i np r o t e i nf r a c t i o n sc a n s c a v e n g eh y d r o x y lf r e er a d i c a l ( o h ) o b v i o u s l y ( p 0 01 ) 2 a c c o r d i n g t ot h e a n a l y s i s o fs d s - p a g ea n di s o e l e c t r i c f o c u s i n g e l e c t r o p h o r e s i s ( i e f ) ，t h e r ew e r et e np r o t e i ns u b u n i t s ( 6 9 4 - 8 7 8 k d a ) a n df o u r i s o e l e c t r i cp o i n t so fp r o t e i nc o m p o n e n t s ( p 1 4 9 4 - p 1 5 8 5 ) i nw a t e r - s o l u b l ep r o t e i ni n l o t u ss e e d ，t e np r o t e i ns u b u n i t s ( 14 2 - 110 5 k d a ) a n dt w oi s o e e c t r i cp o i n t so fp r o t e i n c o m p o n e n t s ( p 1 5 17 p 1 5 3 4 ) i n s a l t - s o l u b l e p r o t e i n ，t w e l v ep r o t e i ns u b u n i t s ( 7 2 9 7 3 k d a ) a n dt h r e ei s o e l e c t r i cp o i n t so fp r o t e i nc o m p o n e n t s ( p 1 5 4 0 - p 1 6 31 ) i n 1 1 i 英文摘要 a c i d s o l u b l ep r o t e i n ，a n ds i xp r o t e i ns u b u n i t s ( 15 0 - 4 6 8 k d a ) a n df o u ri s o e l e c t r i c p o i n t so fp r o t e i nc o m p o n e n t s ( p i 5 51 - p 1 6 4 6 ) i na l k a l i s o l u b l ep r o t e i n m e a s u r e db y t h em e a n so fd e a e - c e l l u l o s ei o n - e x c h a n g ec o l u m nc h r o m a t o g r a p h y , t h e r ew e r et w o e l u a t i o np e a k si nw a t e r - s o l u b l ep r o t e i n ，s u c ha sa c i d - s o l u b l ea n da l k a l i s o l u b l e p r o t e i n s ，a n do n ep e a k i ns a l t - s o l u b l ep r o t e i n d e t e r m i n e db y g e l f i l t r a t i o no n s e p h a d e xg 一2 0 0 ，t h e r ew e r et e ne l u a t i o np e a k si nw a t e r - s o l u b l ep r o t e i n ，s u c ha s a l k a l i - s o l u b l ep r o t e i n s ，t w oe l u a t i o np e a k si ns a l t - s o l u b l ep r o t e i n ，n i n ee l u a t i o np e a k s i na c i d - s o l u b l ep r o t e i n 3 t h eo p t i m a lc o n d i t i o n sf o rt o t a lp r o t e i no fl o t u ss e e dw e r er a t i oo fl o t u st o s o l u t i o n1 ：2 5 ，p i l l1 0 ，e x t r a c t i o nt e m p e r a t u r e4 0 。c ，a n de x t r a c t i o nt i m e3 h a m i n o a c i d si n t o t a lp r o t e i ne x t r a c t i o nw e r es i m i l a rt ot h a ti nl o t u sp o w d e r , b u tt h e c o m p o s i t i o no fv a l ，t y r , m e ta n dc y sw e r eh i g h e rt h a nt h o s ei nl o t u sp o w d e r d s c a n a l y s i so nt o t a lp r o t e i ne x t r a c t i o na l s oh a sb e e nd o n ea n dt h er e s u l ts h o w e dt h a ti t s d e n a t u r a t i o nt e m p e r a t u r ew a s10 2 2 ca n dt h ee n t h a l p yw a s5 7 9 2 j g 4 f u n c t i o n a lp r o p e r t i e sh a v e b e e ns t u d i e du s i n gf r e e z e d r i e dp o w e ro ft o t a l p r o t e i ne x t r a c t i o nf r o ml o t u ss e e db yt h em e t h o do fa c i dp r e c i p i t a t i o na tp 1 4 5 0 t h e o i l - h o l d i n gr a t i oo fp r o t e i nf r e e z e d r i e dp o w e ri n c r e a s e df r o m2 6 0 t o6 5 0 b yt h e i n c r e a s i n go fs a m p l eq u a l i t y t h ew a t e r - h o l d i n gc a p a c i t yo fp r o t e i nf r e e z e - d r i e d p o w e rr e a c h e dh i g h e s ta t5 06 c f o l l o w i n gs a m p l ec o n c e n t r a t i o ne l e v a t i o n ，f o a m i n g c a p a c i t y o fp r o t e i nf r e e z e d r i e d p o w e re n h a n c e da n dr e a c h e dh i g h e s ta t 1 o c o n c e n t r a t i o no fn a c l f o a ms t a b i l i t yr e a c h e dh i g h e s ta tp h 5 0 e m u l s i f y i n gc a p a c i t y a n ds t a b i l i t ya l s oi n c r e a s e di nt h es a m p l ec o n c e n t r a t i o nr a n g eo f1 0 4 o a n db o t h w e r el o wn e a r b yi t sp i t h ep r o p e r t i e so fh a r d n e s s ，f r a c t u r a b i l i t y , a d h e s i v e n e s s ， g u m m i n e s sa n ds p r i n g i n e s so fp r o t e i ng e l a t i o ne n h a n c e db yt h ei n c r e a s i n go fs a m p l e c o n c e n t r a t i o n ，a n dt h i st r e n dw a ss i n g n i f i c a n tw h e ns a m p l ec o n c e n t r a t i o nw a sh i g h e r t h a n12 o t h o s ef i v ep r o p e r t i e so fp r o t e i ng e l a t i o nr e a c h e dt h eh i g h e s tv a l u ea t p h 9 0 k e yw o r d s ：l o t u ss e e d ；p r o t e i n ；e x t - ：a c t i o n ；m o l e c u l a rp r o p e r t i e s ；f u n c t i o n a l c h a r a c t e r i s t i c s 学位论文独创性声明 本人郑重声明： 1 、坚持以“求实、创新”的科学精神从事研究工作。 2 、本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取 得的研究成果。 3 、本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均 是真实的。 4 、本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或 其它机构已经发表或撰写过的研究成果。 5 、其他同志对本研究所做的贡献均己在论文中作了声 明并表示了谢意。 作者签名：拯蜇 日 期：幽。左盆 学位论文使用授权声明， 本人完全了解南京师范大学有关保留、使用学位论文的规 定，学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构 送交论文的电子版和纸质版；有权将学位论文用于非赢利目 的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅：有权将学 位论文的内容编入有关数据库进行检索；有权将学位论文的 标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规 定。 作者签名：旅亟 日期：出基：童：盘 第一章文献综述 第一章文献综述 1 莲子 莲子古称为莲实、水芝丹，亦称莲肉、湘莲等，为睡莲科植物莲成熟种子， 其味甘、涩，性平，归脾、肾、心经【l 】。本草纲目记载，莲子补中养神、益 气力，久服轻身耐老，不饥延年，益心肾、固精气、强筋骨、补虚损、利耳口1 2 】。 因此，莲子历来被认为是药食之佳品，在传统中医药中占有重要地位。 现代分析表明，莲子营养价值很高，除含大量淀粉和棉子糖外，还含有蛋白 质、脂肪、p 谷甾醇、生物碱及丰富的钙、磷、铁和维生素等营养成分，其中蛋 白质含量达到了l7 以上1 3 j 。药理研究也证实莲子有镇静、强心、抗衰老、抗肿 瘤作用，其中含有丰富钙、磷和钾，除可以构成骨骼、牙齿成分外，还有促进凝 血，使某些酶活化，维持神经传导性，维持肌肉伸缩性和心跳节律等作用【4 - 5 】。 近几年，随着对莲子研究的逐渐深入，人们对莲子的化学成分和药用价值有了更 加深刻的认识，但是目前仍然缺乏关于莲子蛋白质的相关研究。 2 蛋白质提取与纯化技术 研究蛋白质，首先要得到高度纯化并具有生物活性的目的物质。蛋白质的制 备工作涉及物理、化学和生物等各方面知识，但基本原理不外乎两方面：一是利 用混合物中几个组分分配率的差别，把它们分配到可用机械方法分离的两个或几 个物相中，如盐析，有机溶剂提取，层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相 中，通过物理力场的作用使各组分分配于不同区域而达到分离目的，如电泳，超 速离心，超滤等。由于蛋白质不能溶化，也不能蒸发，所能分配的物相只限于固 相和液相，并在这两相i 旬相互交替进行分离纯化【6 j 。 在所有这些方法的应用中必须注意保存生物大分子的完整性，防止酸、碱、 高温及剧烈机械作用而导致所提物质生物活性的丧失。 2 1 蛋白质的提取 大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质 则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因些，可采用不同溶剂提取分离和纯化 蛋白质。 2 1 1 水溶液提取法 稀盐和缓冲系统的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大，是提取蛋白质最常 用的溶剂，而提取的温度要视有效成份性质而定。一方面，多数蛋白质的溶解度 随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面， 温度升高会使蛋白质变性失活，因此，基于这点考虑提取蛋白质时一般采用低 第一章文献综述 温操作。为了避免蛋白质提取过程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制剂( 如二异 丙基氟磷酸，碘乙酸等) 【7 1 。 2 1 1 1p h 值 蛋白质是具有等电点的两性电解质，提取液的p h 值应选择在偏离等电点两 侧的范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团 发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化。一般来说，碱性蛋白质用偏酸性 的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液1 7 】。 2 1 1 2 盐浓度 稀浓度盐可促进蛋白质的溶解，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋 白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中常加入少量 n a c l 等中性盐，而缓冲液常采用o 0 2 0 0 5 m o l l 磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。 2 1 2 有机溶剂提取法 一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质，可用乙醇、丙 酮和丁醇等有机溶剂提取，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性，是理想 的脂蛋白提取液，但必须在低温下操作【6 j 。 2 2 蛋白质的分离纯化 蛋白质分离纯化方法很多，根据蛋白质不同的理化特性，如溶解性、分子大 小：带电性等可以将蛋白质的分离纯化方法概括为下文所述的几种【8 】。 2 2 1 根据蛋白质溶解度不同的分离方法 2 2 1 1 蛋白质的盐析 中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高， 蛋白质的溶解度增加，称为盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程 度下降并先后析出，这种现象称盐析。盐析时若溶液p h 值在蛋白质等电点则效 果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也 不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。 影响盐析的因素有：一是温度，除对温度敏感的蛋白质在低温( 4 ) 操作外， 一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶解度降低；二是p h 值，大多数蛋白 质在等电点时在浓盐溶液中的溶解度最低。三是蛋白质浓度，蛋白质浓度高时， 欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质一起沉淀出来( 共沉现象) j 。 2 2 1 2 等电点沉淀法 蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋 白质的等电点有差别，可调节溶液的p h 值达到某一蛋白质的等电点使之沉淀。 2 第一章文献综述 2 213 低温有机溶剂沉淀法 用与水可混溶的有机溶剂，如甲醇，乙醇或丙酮，使多数蛋白质溶解度降低 并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。 2 2 2 根据蛋白质分子大小差别的分离方法 2 2 2 1 透析与超滤 透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。超滤法是利用高压力或 离心力，使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同 孔径的半透膜截留不同分子量的蛋白质。 2 2 2 2 凝胶过滤法 也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有 效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶和琼脂糖凝胶。 2 2 3 根据蛋白质带电性质进行分离 蛋白质在不同p h 值环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分丌。 2 2 3 1 电泳法 各种蛋白质在同一p h 条件下，因分子量和电荷数量不同在电场中迁移率不 同，从而得以分开。常见的有p a g e 凝胶电泳、s d s p a g e 凝胶电泳以及i e f 等 电聚焦电泳。 2 2 3 2 离子交换层析法 离子交换剂有阳离子交换剂( 如：羧甲基纤维素，c m 纤维素) 和阴离子交换 剂( 二乙氨基乙基纤维素等) ，当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带 有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后改变p h 值或离 子强度将吸附的蛋白质洗脱下来。 2 2 4 根据配体特异性的分离方法一亲和层析法 亲和层析法是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理 即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，其主要是根据 某些蛋白质与另一种称为配体的分子能特异而非共价地结合从而达到物质分离 的目的。 总而言之，蛋白质的分离、提纯和鉴定是生物化学中重要的一部分，但至今 还没有单独或一套现成的方法能够把任何一种蛋白质从复杂的混合蛋白质中提 取出来，因此往往采取几种方法联合使用。 2 3 干燥与贮存 生物大分子制备得到产品，为防止变质，易于保存，常需要干燥处理，最常 第一章文献综述 用的方法是冷冻干燥和真空干燥。真空干燥适用于不耐高温，易于氧化物质的干 燥和保存；而冷冻干燥操作时一般先将待干燥的液体冷冻到冰点以下使之变成固 体，在低温低压下将溶剂变成气体而除去。此法干燥后的产品具有疏松、溶解度 好、保持天然结构等优点，适用于各类生物大分子的干燥保存。 生物大分子的稳定性与保存方法有很大关系。干燥制品一般比较稳定，在低 温情况下其活性可在数日甚至数年无明显变化，贮藏要求简单，只要将干燥的样 品置于干燥器内( 内装有干燥剂) 密封，保持0 4 c 冰箱即可【6 8 j 。 3 自由基与自由基清除剂 3 1 生物体内自由基的存在及产生机制 自由基( f r e er a d i c a l ，f r ) 是生物体生命活动过程中由其机体生物化学反应所 产生的中间产物，常指独立带有不配对电子( 即奇数电子) 的原子、分子、离子或 化学基团，因含有一个未成对电子而具有顺磁性和很高的反应活性【9 】。生物体内 常见的自由基有超氧阴离子自由基( 0 2 。) 、分子氧( 0 2 ) 、一单线态氧( 0 2 ) 、过氧化 氢( h 2 0 2 ) 、羟自由基( 0 h ) 和脂过氧化物( r ，r o ，r 0 0 ，r o o h ) 1 1 0 。12 1 。生物体 内自由基的产生机制在于生物体内具有共价键的有机分子发生均裂后使带有成 对电子的原子、原子团、分子转变为带有奇数电子的自由基，或带有成对电子的 化合物，多获得一个电子后，转变为带有奇数电子的自由基。生物体内自由基生 成反应的一大特点是它们往往以链式反应进行i l 3 。 在众多自由基中，羟自由基作用最强，是氧气的三电子还原产物，放应性极 强，可以参与抽氢、加和及电子转移等反应l l 训。有很多途径可以产生羟自由基， 常见的有离子辐射、h a r b e r - w e i s s 反应、臭氧产生羟基自由基以及过氧化氢同金 属离子的反应，而f e n t o n 反应是过氧化氢同金属离子反应中最典型的例子【l 5 。 3 2 自由基对机体的损伤 在正常的生理情况下，机体内自由基的产生和消除处于一个动态平衡之中， 其浓度也维持在较低水平，这时自由基不仅不会损伤机体，还可显示出独特的生 理作用，而在某些病理情况下，机体自由基的产生和消除功能失去平衡，导致自 由基在机体内积累，由于自由基具有很高的反应活性，因此它将在分子、细胞乃 至器官水平给机体造成损伤，从而加快机体的衰老过程，并可诱导癌症、心血管 等疾病的发型1 6 】。 自由基对蛋白质的主要作用是修饰氨基酸残基，引起结构和构象的改变，造 成肽链断裂、聚合、交联等损伤，而蛋白质结构的改变能引起酶和受体等的生物 学活性改变、功能破坏1 1 7 2 2 1 。 自由基可引起细胞内d n a 的氢键断裂、碱基降解和主链解旋，所有核酸成 4 第一章文献综述 分均可受到自由基的攻击，因此，当细胞d n a 受损时，轻者可引起细胞的生物 学活性改变，重者造成基因突变、致癌和细胞死亡【2 3 - 2 6 1 。 自由基对不饱和共价键具有一种特殊的亲和力，因此，在机体内，自由基最 容易攻击生物膜磷脂中的p u f a s ，从而引起膜脂质过氧化反应【27 1 。 3 3 蛋白质对自由基清除作用 尽管所有的生物有机体内都具有内源性的抗氧化防御和修复系统，使得机体 一定程度上免受氧化损伤，然而这些系统不足以彻底阻止机体的氧化损伤1 2 舶。 所以，使用抗氧化剂或者摄食具有抗氧化功能的食品将有助于降低人体由自由基 引起的氧化损伤【2 9 】。自2 0 世纪8 0 年代以来，在全世界范围内掀起了一股规模 空前的开发、研究和利用天然抗氧化剂的热潮【3 0 引】，而关于植物蛋白质抗生物氧 化作用方面的研究也已有了很多相关的报道，如白果活性蛋白的抗生物氧化作用 1 3 2 1 、富硒灵芝中不同蛋白提取物的抗氧化活性研究【3 3 】及小球藻糖蛋白的抗氧化 活性评价【3 4 j ，等等，这些研究为本文对莲子主要蛋白质组分清除o h 作用的研 究提供了有用的参考。 4 差示扫描量热法( d s c ) 4 1 热分析技术 热分析技术是指在温度程序控制条件下，测量物质的物理性质与温度关系的 一类技术，其包括的范围很多，有热重法、热光学法、热电学法、热磁学法、热 机械分析、动态热机械法、差热分析和差示扫描量热法，等等【35 1 。尽管热分析 技术的范围很广，但在食品研究方面的应用却屈指可数，上述热分析技术中，差 示扫描量热技术应用最为广泛。 差示扫描量热技术( d i f f e r e n t i a ls c a n n i n gc a l o r i m e t r y ，d s c ) 是6 0 年代以后研 制出的一种热分析方法，它是指在样品和参比物同时程序升温或降温且保持两者 温度相等的条件下，测量流入或流出样品和参比物的热量差与温度关系的一种技 术。根据测量方法的不同，又分为两种类型：热流型d s c 和功率补偿型d s c 3 6 。7 1 。 4 2 差示扫描量热法( o s c ) 在蛋白质热变性研究中的运用 热变性温度是食品蛋白质的一个重要的加工影响因素，因为蛋白质的变性会 导致蛋白质高级结构的展丌，使其各种食品功能性质明显降低或丧失。因此测定 食品蛋白的变性温度及过程对于蛋白质的应用具有重要的指导意义【3 8 j 。而差示 扫描量热仪( d s c ) 是测定植物蛋白热变性温度的一个重要工具和手段，可提供与 蛋白质热变性有关的大量信息，如蛋白质空间构象的变化、热稳定性、热变性、 热变性动力学、热稳定性与生理活性的关系等，近年来被广泛运用于生物大分子 的研究1 3 9 j 。 第一章义献综述 d s c 可根据图谱中的吸放热过程提供有关结构稳定性的信息，测定蛋白质构 型变化的热效应。相关热转变包括：熔融、重结晶、分解裂解、释放气体与热容 变化、热焓变化等【4 0 1 。此外，d s c 曲线上峰面积与峰高的比值可用于表示蛋白 质结构中间态的情况。利用d s c 法测定的热焓值能正确反映般蛋白质的热变 性【4 1 1 ，总体上看，以蛋白质热变性为主的过程是热力动力学过程，最终表现出 试样的吸热程度。一般地，热焓值越大，试样蛋白质变性程度越小，即蛋白质热 稳定性越好。 5 蛋白质功能特性 蛋白质是维持人类生命的第一营养素，是人体组成及代谢的物质基础，也是 人类饮食结构的重要成分，添加到食品中可以有效地提高其营养价值，更重要的 是蛋白质在食品中可以体现出不同的功能特性，影响食品的感官性状。因此，蛋 白质广泛用于食品加工的各个领域【4 2 1 。 5 1 蛋白质主要功能性质 蛋白质的功能性质主要分三类【4 3 】：( 1 ) 水化性质，包括水吸收及保留、湿润性、 溶胀、粘着性、分散性、溶解度和粘度。是由蛋白质肽键骨架上的极性基团与水 分子发生水化作用。( 2 ) 与蛋白质蛋白质相互作用有关的性质，包括产生沉淀作 用、凝胶作用和形成各种其它结构( 如蛋白质面团和纤维) 。蛋白质分子受热舒展， 内部的疏水基团暴露出来，通过疏水作用( 高温能提高此类作用) 、静电作用( 通过 c a 2 + 和其它二价离子桥接) 、氢键( 冷却能提高此类作用) 或二硫交联形成空间网状 结构。( 3 ) 表面活性，包括表面张力、。乳化作用和泡沫特征。蛋白质结构中既有 亲水基又有亲油基，能够吸附在油水或空气水界面上，一旦被吸附后，蛋白质 形成一层膜，可阻止小液滴或气泡凝聚，有助于稳定乳化液和气泡。 但是这些不是完全独立的，例如，胶凝作用不仅包括蛋白质蛋白质相互作用 而且涉及到水相互作用；粘度和溶解度同时取决于蛋白质水和蛋白质蛋白质相 互作用。 5 2 食品蛋白质功能特性的影响因素 影响食品蛋白质功能特性的因素包括：内在因素、外在因素以及蛋白质的加 工条件，如表1 1 所示【4 4 1 。值得注意的是，蛋白质的功能特性与其结构密切相关， 主要是氨基酸组成、排列顺序、构象、分子的形状和大小、电荷分布以及分子内 和分子间键的作用。蛋白质共有四级结构：氨基酸的排列顺序是第一级结构；由 局部形成的0 【螺旋体和b 折叠片是其第二级结构；此外，蛋白质内部通过离子 力、氢键、二硫键、憎水力和偶极作用力等，形成三维空间构型，是第三级结构； 各种蛋白质亚基组合起来则形成第四级结构。 6 第章文献综述 表1 1 食品蛋白质功能性质的影响冈素 t a b l e1 - 1f a c t o r si n f l u e n c i n gt h ef u n c t i o n a lb e h a v i o ro f p r o t e i n si nf o o d 表1 2 在各种食品中所必需的蛋白质功能性质 t a b l e i 一2f u n c t i o n a lp r o p e r t i e sa n da p p l i c a t i o n so f e d i b l ep r o t e i n si nf o o d s 食品蛋白质功能特性 饮料 汤、调味汁 面团形成 焙烤产品( 蛋糕和面包) 乳品 肉制品 食品涂层 糖果产品 在不同p h 下的溶解性、热稳定性、粘度 粘度、乳化作用、水保留 形成骨架和带有粘弹性的膜、粘着性、热变性 胶凝作用、水吸收、乳化作川、起泡作用、褐变 乳化作用、脂肪保留、粘度、起泡作用、胶凝作川、聚集作用 乳化作刚、胶凝作用、粘着性、水和脂肪的吸收和保留 粘着 分散性、乳化作川 5 3 蛋白质功能特性在食品中的应用 民以食为天，质构、风味、色泽和外表等感官品质是人们取舍食品的重要依 据。一种食品的感官品质是食品中各种主要和次要组分之间复杂的相互作用的净 结果【4 5 1 。在食品准备、加工、贮藏和消费的整个过程中，蛋白质功能特性对食 品感官品质的影响，如表1 2 所示【4 6 4 7 1 。 6 国内外关于植物蛋白质研究现状 国内外在植物蛋白质方面的研究，应属对大豆蛋白质的研究比较深入，其蛋 白质的分离纯化技术已非常成熟，而对于大豆蛋白质功能特性如溶解性、乳化性、 发泡性、胶凝性等方面的许多研究成果也已成功的应用到日常食品生产加工过程 7 第一章文献综述 中，如烤制食品、冷冻食品、肉食品加工等。这些都将为莲子蛋白质的研究提供 许多值得借鉴的实验方法与技术。 但是，虽然大豆是一种优质的蛋白质，其含有的胰蛋白酶抑制素、血球凝聚 素、植素等抗营养因子的存在往往影响了其利用效率，同时大豆蛋白质制品常会 伴有异味源，如豆腥味、鱼腥味、青豆味、苦涩味等，而且大豆蛋白质的各种功 能特性受电离强度、温度、p h 等的影响比较大，这些常常会影响到大豆蛋白质 在食品工业的应用。同时，国内外研究的其它许多植物蛋白质，如花生蛋白质等 在食品加工中也都存在着一些局限性。 7 国内外关于本课题的研究现状 国外对莲子的研究主要是形态学、细胞学、解剖学方面以及莲子提取物( 主 要是植物碱) 抗氧化作用的研究及其在医学上的应用。国内有关于莲子中水溶性 多糖、总黄酮、超氧化物歧化酶等功效成分的测定和提取、莲子抗衰老实验、莲 子中微量元素的测定以及莲种子的耐热性及抗氧化酶活性等研究。在莲子蛋白质 研究方面，目前只有莲子贮存蛋白质、莲子萌发时叶绿体蛋白质复合体、莲子糖 蛋白分离纯化以及利用高效液相色谱测定莲子中氨基酸等研究有过报道【4 昏5 0 j 。 总体上，目前为止，国内外对莲子蛋白质的研究报道甚少，还没有发现关于 莲子中蛋白质的组分、分子特性的系统研究，特别是缺乏关于莲子蛋白质食品功 能特性的研究，因此，本课题是首次对莲子蛋白质的这些方面进行研究，并希望 通过对莲子蛋白质的研究，为莲子蛋白食品的丌发提供基础性技术支持。 8 本课题研究的意义 自古以来，莲子就因其具有丰富营养性及特殊的滋补和疗效作用一直受到人 们的青睐，现代研究也表明，莲子含有丰富的蛋白质、糖、多种维生素及钙、磷、 。铁等多种人体必需的矿质元素及人体所需的8 种必需氨基酸，由此可见，莲子具 有很高的丌发利用价值。 对于莲子而言，除了其特殊的药补成分之外，对其营养、食用品质和加工性 能影响最大的就是蛋白质。但是，迄今为止，却未曾有过对莲子中重要的成分 蛋白质做过详细研究的报道，而市场上也还未出现莲子蛋白质相关的食品。 因此，本文按照溶性的不同对莲子蛋白质进行了分类提取，并对莲子各蛋白 组分的分子特性和清除羟自由作用进行了研究，同时对莲子蛋白质的主要功能特 性进行了研究，希望能够通过这样的研究，为莲子蛋白质应用于食品工业生产提 供必要的基础技术。 一 8 第章文献综述 9 本课题研究的主要内容 ( 1 ) 利用莲子中蛋白质组分不同的溶解性，采用氯化钠、蒸馏水、乙醇、盐 酸和氢氧化钠等溶液进行蛋白质的提取，并进行了各主要蛋白质组分的氨基酸分 析、清除羟自由基的作用以及差示扫描量热法( d s c ) 分析实验。 ( 2 ) 运用s d s p a g e 电泳、i e f 等电聚焦电泳来研究莲子主要蛋白质组分亚 基的相对分子质量、等电点等分子特性；运用d e a e 2 3 离子交换层析、 s e p h a d e x g 2 0 0 凝胶层析等方法对莲子主要蛋白质组分进行分离纯化。 ( 3 ) 以莲子总蛋白提取率为标准，在进行单因素实验的基础上，对莲子总蛋 白提取条件进行了f 交实验，确定了最佳的：i 二艺参数；进行了总蛋白质氨基酸分 析及差示扫描量热法( d s c ) 分析实验。 ( 4 ) 通过等电点沉淀、冷冻干燥等方法得到大量莲子蛋白质后，测定其功能 特性，包括：持油性、持水性、发泡能力( f c ) 和泡沫稳定性( f s ) 、乳化能力 ( e c ) 和乳化稳定性( e s ) 及凝胶质构特。f ，t 等。 9 第二章莲子各蛋白质组分分离提取及组分特性分析 第二章莲子各蛋白质组分分离提取及组分特性分析 莲子作为一种营养佳品，历来是人们喜欢的保健食品原料之一，其含有的丰 富蛋白质更是一种可贵的研究资源，然后至今关于莲子蛋白质的研究甚少，制约 了莲子食品的开发，因此，对莲子蛋白质进行一些基础性的研究是十分有必要的。 众所周知，天然存在的蛋白质种类繁多、结构复杂，主要可以分为清蛋白、球蛋 白、谷蛋白、醇溶蛋白、精蛋白、组蛋