（食品科学专业论文）高产脂肽优良纳豆菌的选育.pdf

山东轻工业学院硕士学位论文 摘要 环脂肽是由微生物产生的一类生物表面活性剂，它是由亲水的肽环和亲油的 脂肪烃链两部分组成。由于其独特的化学组成和两亲型分子结构，除具表面活性 外，脂肽还具有抗真菌、抗细菌、抗病毒、抗肿瘤等生物活性，因而脂肽类在医 药、食品、微生物采油、化妆品等领域有着很重要的应用前景。 本研究利用脂肽类表面活性剂具有溶解血细胞，并且只有产生表面活性剂能 够乳化碳氢化合物的菌株才能吸收利用石油形成噬油斑等生物学特性设计选育方 案，采用血琼脂平板与油平板相结合的方法，从实验室现存的1 0 株纳豆菌株中分 离出了l 株产脂肽的高产纳豆菌菌株i n s 6 ，并以此为出发菌株，通过紫外线、 微波和d e s 连续诱变处理，血平板或血琼脂平板初筛和摇瓶发酵复筛相结合的方 法，获得了一株突变株n s 6 4 ，其脂肽产量比诱变前提高了1 3 2 8 ，在未经优 化的摇瓶发酵条件下，脂肽的发酵得率由出发菌株的1 1 2 0 9 l 提高到2 6 0 7 9 l 。 菌株经多次传代，遗传性状稳定。 在单因素实验和正交试验的基础上，先用p l a c k e t t b u r m a n ( p b ) 方法对影响 菌株n s 6 4 液体发酵培养基诸因素的效应进行评价，筛选出了三个影响较大的重 要因素，分别为：蛋白胨、酵母粉、c a c l 2 ，利用响应面分析法( r s m ) 确定了它 们的最佳工艺参数。实验结果表明，菌株n s 6 4 发酵产脂肽的最佳培养基组成为： 蛋白胨1 7 3 ，蔗糖0 5 ，酵母粉0 0 6 3 ，m g s 0 4 7 h 2 08 0 x 1 0 - 4 m o l l ，磷源 0 0 5 m o l l ( n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 ：k h 2 p 0 4 = 4 ：3 ，摩尔浓度比) ，c a c l 21 3 8 5 x 1 0 - 4 m o l l ， 培养基初始p h 值为7 0 ；通过正交试验确定了最佳的发酵条件为：6 0 m l 培养基装 入5 0 0 m l 的三角瓶中，接种量3 ，温度3 7 ，摇床转速1 10 r m i n 。 在优化后的发酵条件和发酵培养基的条件下，诱变选育的菌株n s 6 4 分批次( 3 次) 发酵，干重法测量发酵液中脂肽的产量，分别为3 2 1 0 9 l 、3 1 8 7 9 l 、3 1 6 5 l ， 其产量稳定，菌株适合以后的发酵生产。 关键词：脂肽；纳豆菌株；菌种选育；发酵优化；脂肽产量 a b s t r a c t c y c l i cl i p o p e p t i d ei s ak i n do fb i o s u r f a c t a n ts y n t h e s i z e db ym i c r o o r g a n i s m s ， w h i c hi sc o m p o s e dw i t hh y d r o p h i l i cp e p t i d er i n ga n dh y d r o p h o b i cf a t t ya c i dm o i e t i e s - i na d d i t i o nt ot h ec l a s s i c a la p p l i c a t i o na ss u r f a c t a n t ，t h e ya l s oh a v ea n t i b a c t e r i a l ， a n t i f u n g a l ，a n t i v i r a la n da n t i t u m o ra c t i v i t yb e c a u s et h e yh a v eu n i q u ec h e m i c a lf o r m a n db o l a - a m p h i p h l es t r u c t u r e ，w h i c hs h o w e dw i d ea p p l i c a t i o np e r s p e c t i v e t h u s s u r f a c t i nh a v eav e r yi m p o r t a n ta p p l i c a t i o ni nm e d i c i n e ，f o o d ，m i c r o - p r o d u c t i o n ， c o s m e t i c sa n do t h e rf i e l d s i nt h i ss t u d y , t h es t r a i n sb a c i l l u sn a t t on s 6p r o d u c i n gah i g h y i e l d i n gs u r f a c t i n c a nb ei s o l a t e df r o mt h ee x i s t i n g10n a t t os t r a i n si nt h el a b o r a t o r ya f t e rs c r e e e n i n gb y b l o o da g a rp l a t ea n do i lp l a t e ，a ss u r f a c t i nc a nd i s s o l v eb l o o dc e l l sl i p o p e p t i d e s u r f a c t a n t sw i t h ，a n dt h eo n l ys t r a i n sp r o d u c i n gs u r f a c t i ne m u l s i f y i n gh y d r o c a r b o n s s h a p et h eo i ls p o t s p h y s i c a lm u t a g e n e s i sw i t hu va n dm i c r o w a v ea n dc h e m i c a l m u t a g e n e s i sw i t hd e sw a su s e dt od e v e l o ps t r a i n s o fb a c i l l u s 刀口加( n s 一6 ) t h a t e n h a n c e ds u r f a c t i np r o d u c t i o n s w ef i n a l l yo b t a i n e dt h em u t a n tn s - 6 4a f t e rs c r e e n i n g w i t hb l o o dp l a t eo rb l o o da g a rp l a t ea sw e l la ss c r e e n i n go ff l a s kf e r m e n t a t i o n t h e m u t a n tn s 6 4p r u d u c e d2 6 0 7g ls u r f a c t i nc o m p a r e dw i t h1 12g lf o r t h ew i l d t y p e i tw a sv i e w e dt h a tt h em u t a n ts t r a i nh a dg o o dg e n e t i cs t a b i l i t yo fg e n e r a t i n go f f s p r i n g a f t e rb e i n gt i m e sw i t h o u tn u m b e r i tw a sv i e w e dt h a tt h em u t a n ts t r a i nh a dg o o d g e n e t i cs t a b i l i t yo fg e n e r a t i n go f f s p r i n ga f t e rb e i n gt i m e sw i t h o u t n u m b e r b a s e do nt h er e s u l t so fs i n g l e f a c t o r e da n do f t h o g o n a le x p e r i m e n t s ，ap l a c k e t t b u r m a nd e s i g nw a su s e dt oe v a l u a t et h ei n f l u e n c eo ff a c t o r sr e l a t i n gt of e r m e n t a t i o n m e d i u mo ft h es t r a i nn s 一6 4i nt h ef i r s to p t i m i z a t i o ns t e p i tc a nb ed e d u c e dt h a tp e p t o n e c o n c e n t r a t i o n y e a s t c o n c e n t r a t i o na n dc a c l 2c o n c e n t r a t i o ni n f l u e n c e d s u r f a c t i n p r o d u c t i o nn e g a t i v e l y a n dt h e n ，r e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g yw a su s e dt oo p t i m i z e t h ep a r a m e t e r so ft h e3f a c t o r sa b o v e i nc o n c l u s i o n ，t h eo p t i m i z e dr e s u l td e m o n s t r a t e d t h a tt h eb e s tc o m p o s i t i o no ff e r m e n t a t i o nm e d i u mi sp e p t o n e1 7 3 ，s a c c h a r o s eo 5 ， y e a s to 0 6 3 ，m g s 0 4 7 h 2 0 8 0 x1 0 4 m o l l ，p h o s p h o r u s0 0 5 m o l l ( n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 ：k h 2 p 0 4 = 4 ：3 ) ，c a c l 21 3 8 5x 1 0 4m o l la n dt h eb e s tp ho ft h em e d i u m i s 7 0 ，刀eo t h e rp a r a m e t e r sf o rt h ep r o d u c t i o no fs u r f a c t i na r e a sf o l l o w s ：t h ep r o p e r t e m p e r a t u r ei s37 ( 2 。t h eb e s tv o l u m eo ft h el i q u i df e r m e n t a t i o nm e d i u m f o rs u r f a c t i n s y n t h e s i si s6 0 m l 2 5 0 m l t h ea m o u n to f i n o c u l a t i o ni s3 a n dt h ea g i t a t i o ni s1 10r p m a b s t r a c t u n d e rt h eo p t i m i z e df e r m e n t a t i o nc i r c u m s t a n c e ，t h em u t a n ts t r a i nn s 一6 4s c r e e n e d f e r m e n t e di nt h eo p t i m i z e df e r m e n t a t i o nm e d i u mt h r e et i m e s t h ey i e l dw a sm e a s u r e d i nt h ew a yo f d r ym a t t e r t h ey i e l dw a s3 2 1 0 9 l ，3 1 8 7g la n d3 1 6 5g l t h es t r a i ni s f i tf o rf e r m e n t a t i o np r o d u c t i o nw i t hs t e a d yy i e l d k e yw o r d s ：s u r f a c t i n ，b a c i l l u sn a t t o ，s t r a i ns c r e e n i n g ，f e r m e n t a t i o no p t i m i z a t i o n ， s u r f a c t i ny i e l d i l 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文 中引用他人的成果，均己做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上 已属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人己用于其他学位申请的论文或 成果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 论文作者签名： 查选 一 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东轻工 业学院。山东轻工业学院享有以任何方式发表、复制、公开阅览、借阅以及申请 专利等权利，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时， 署名单位仍然为山东轻工业学院。 论文作者签名： 壅遂 日期：4 年五月一日 导师签名： 茸峨日期：j 艘争一年月 i l 日 山东轻工业学院硕士学位论文 第1 章绪论 纳豆是日本的传统食品，早在2 0 0 0 多年前，就已被日本人所食用，并用来治 疗和预防心脑血管疾病【l j 。纳豆是将大豆煮熟后，接入枯草芽孢杆菌( b a c i l l u s s u b d l 括) 或纳豆菌( b a c i l l u sn a t t o ) 经发酵后而形成的保健食品。纳豆中除富含多 种营养物质外，还含有一些生理活性物质如：纳豆菌、纳豆激酶、脂肽类、血管 紧张肽转化酶抑制剂、皂甙素、生育酚、吡啶二羧酸、维生素k 2 等，具有溶血栓、 降血压、抗菌消毒、防止骨质疏松等多种保健功能，深受日本人民的喜爱。纳豆 的制作工艺分传统法和工业法两种，传统法依地区和配方的不同而各有差异，工 业法在日本全国内则比较统一1 2 】。新鲜的纳豆色泽金黄、口感酥软，用筷子挑起时 有很长的拉丝状粘液物质( 主要成分是类似果聚糖的混合物一果糖和t 多聚谷氨 酸) ，食用时再配以适宜的佐料，是日本人用餐时必不可少的风味食品。纳豆除了 具有风味独特、制作方便等特点外，近来大量的研究结果表明，纳豆中含有多种 有助消化、抗癌、抗肿瘤、抗氧化以及延缓衰老等多种功能成份，经常食用纳豆 不但能够有效地预防和治疗心脑血管疾病，还具有强身健体、护肝美容、预防感 冒和防止醉酒等重要作用1 3 j 。 为了揭开纳豆中有益成分作用的奥秘，许多工作者都进行了不遗余力的研究， 东京大学的泽村教授早在1 9 0 5 年从纳豆中分离出了纳豆菌，并将该菌株命名为 b a c i l l u sn a t t os a w a m u r a l 训。1 9 4 6 年美国的s m i t h 等人认为纳豆菌应属于枯草芽孢杆 菌属( b a c i l l u ss u b t i l e ) 的类缘菌( 亚种) ，因此在分类学上从伯杰氏手册第6 版起，将纳豆菌归属于枯草杆菌【5 l 。但由于纳豆菌对维生素需求的特性，以及对噬 菌体的感染特异性明显与枯草杆菌不同，故在日本还是与枯草杆菌所区别，使用 纳豆菌的名称。纳豆菌是不产生毒素和对人体没有病源性的安全微生物，具有分 解蛋白质、碳水化合物、脂肪等大分子物质的性能，而且还能使发酵产品中富含 氨基酸、有机酸、寡聚糖等多种易被人体吸收的营养成分【6 】。 目前，国内外已对纳豆菌及其代谢产物纳豆激酶进行了大量细致的研究，随 着对纳豆菌研究的不断深入以及纳豆的一些新的保健功能的发现，纳豆菌的次级 代谢产物一脂肽类物质日益受到人们的关注。近年来，国内外对脂肽类生产菌株 和脂肽类的性质已有一系列深入的研究，发现了许多具有特殊作用的、新型的 s u f f a c t i n 结构类似物，脂肽类已成为研究开发的热点。 脂肽类一般是革兰氏阳性芽孢杆菌的次级代谢产物。脂肽分子是由亲水的肽 键和亲油的脂肪烃链两部分组成的环状结构【_ 7 1 ，由于其特殊的化学组成和两亲型 分子结构，脂肽类可作为一种新型的生物类表面活性剂。另外脂肽类还具有很多 第l 章绪论 非同寻常的生物活性，如溶解血细胞、抗支原体、溶解血栓、抗肿瘤等哗j ，是目 前很有前景的新型抗菌、抗肿瘤、抗高血压、抗病毒药物，用于治疗和预防人体 的一些疾病。因而脂肽类在医药、食品、微生物采油、化妆品等领域有着很重要 的应用前景i 圳。 近年来，我国的老年化现象越来越严重，癌症、高血压等系统疾病的发病率 不断增高。由于纳豆菌产生的脂肽类具有很多对人体有益的生物活性，是新型的 抗肿瘤、抗高血压、抗病毒药物。因此高产脂肽类的优良纳豆菌，不仅有助于人 们的健康水平的提高，且对将来脂肽类产品的开发乃至工业化生产也具有十分重 要的意义。 1 1 脂肽类表面活性剂的结构、种类与功能 1 1 1 脂肽类表面活性剂的结构 脂肽分子中多个氨基酸组成的肽链形成亲水基，脂肪烃链形成亲油基。其中， 亲水的氨基酸能和烃链卜的羧基、羟基或氨基结合形成环状，因此，脂肽类生物 表面活性剂一般是以内酯或酰胺键结合而成的环状脂肽( c y c l i cl i p o p e p t i d e ) 。不 同的细菌能产生不同种类的表面活性剂，枯草芽孢杆菌产生脂肽类生物表面活性 剂，而铜绿假单胞菌能产生鼠李糖脂表面活性剂。同一种细菌的不同菌株也能产 生几种不同的表面活性剂i l0 。2 】，如枯草芽孢杆菌的某些菌株只能产生s u r f a c t i n ， 某些菌株能够同时产生s u r f a c t i n 、i t u r i n 、f e n g y c i n 。而且，即使同一种菌株产生 的同一种表面活性剂，也不是纯的单一分子化合物，枯草芽孢杆菌产生的s u r f a c t i n 具有多个结构类似物。 多数细菌代谢产生的脂肽是七元肽，即脂肽分子中的肽链含有7 个氨摹酸； 脂肪链中的碳原子一般在1 2 1 7 个。由于肽链中氨皋酸的个数、种类及连接顺序 的不同，同一细菌在相同培养条件下代谢产生的脂肽往往是多个异构体的混合物， 因而会导致形成多种脂肽同系物。s u r f a c t i n 是一系列具有相似基本结构的生物表 面活性剂的总称。这些类似物具有s u r f a c t i n 的基本结构( 如图1 1 ) ，7 个氨基酸 通过一种马鞍型的立体结构的肽键联接成肽链，与d 羟基脂肪酸以内酯键结合成 环状，结构上的差别在于几个位置的氨基酸被其它氨基酸取代1 1 3 。容易被取代的 位置一般是7 ，4 ，2 一的氨基酸。同时，碳链的长度及支链位置也不相同。自1 9 6 8 年a r i m a f l 4 】等分离得到s u r f a c t i n 以来，其后的研究人员采用不同的分离技术和结 构鉴定手段发现不同的细菌能产生多种s u r f a c t i n 的结构类似物，并确定了多种结 构类似物的分子特征。研究发现，s u r f a c t i n 的结构类似物差别在于氨基酸的种类、 联接顺序、碳链的碳原子个数及支链位置不同；已经分离发现的s u r f a c t i n 结构类 似物有10 多种( 见表1 1 ) 15 - 1 6 j 。 2 山东轻工业学院硕士学位论文 1 1 2 脂肽类表面活性剂的种类 环脂肽( c l p s ) 由两部分组成，即7 1 0 个氨基酸组成的肽链和p 羟基脂肪 酸链或p 胺基脂肪酸链，其中脂肪酸链上的羟基或胺基与肽链氨基酸上的羧基结 合形成内酯键或酰胺键，使肽链闭合形成环状脂肽。 ( 1 ) 枯草菌脂肽( s u r f a c t i n ) 1 1 7 】 枯草菌脂肽由7 个o t 氨基酸残基和一个p 羟基脂肪酸残基组成，p 羟基脂肪 酸长度为c c 1 5 ，和肽链以内酯键结合。根据肽链与d 羟基脂肪酸形成内酯环 的位点氨基酸组成的不同，分为s u r f a c t i na 、b 、c ，s u r f a c t i n a 在7 位点是l 一 亮氨酸，s u r f a c t i n b 是l 缬氨酸，s u r f a c t i n c 是l 异亮氨酸。 ( 2 ) 伊枯草菌素( i t u r i n ) i l 副 i t u r i na 是最早发现具有抑菌活性的生物表面活性剂之一，是枯草芽孢杆菌 3 第l 章绪论 产生的有效抗真菌的脂肽类表面活性剂。l t u r i n 在结构上与其它环脂肽最显著的区 别是，具有p 胺基脂肪酸链，而其他环脂肽由p 羟基脂肪酸组成。肽环l 位上天 冬氨酰和天冬氨酸的变化，可将伊枯草菌素分成i t u r i na 和i t u r i nb 。 ( 3 ) f e n g y c i nf i 锄i l i e s 【1 9 】 f e n g y c i n 是枯草芽孢杆菌产生的另一类环脂肽，包括长度为c 1 6 一e 1 9 的d - 羟 基脂肪酸链，和1 0 个氨基酸组成的肽链。与其它环脂肽不同的是，0 【氨基酸除了 l 氨基酸还包括4 种d 氨基酸和鸟氨酸，其中后八位氨基酸形成肽环。f e n g y c i n 为同分异构体混合物，变化主要在脂肪酸链长度和支链、肽环氨基酸的组成上。 其中f e n g y c i n a 与b 区别主要是在6 位的氨基酸不同，f e n g y c i n a 为d 丙氨酸， f e n g y c i n b 为d 缬氨酸。 ( 4 ) l i c h e n y s i n 1 2 0 由b a c i l l u sl i c h e n i f o r m & 产生的l i c h e n y s i n ，在结构上与枯草菌脂肽类似，在 环肽中l 位的l 谷氨酸由l 谷氨酰胺取代。 ( 5 ) 其它微生物产生的环脂肽【2 1 1 目前研究较多的是芽孢菌产生的环脂肽，其种类丰富，包括s u r f a c t i n a 、b 、 c ；l t u r i na 、b ；m y c o s u b t i l i mb a c i l l o m y c i nd 、f 、l ；f e n g y c i nf a m i l i e s 类；结 构非常类似于s u r f a c t i na 的l i c h e n y s i na 等环脂肽。 1 1 3 脂肽类表面活性剂的功能 ( 1 ) 抗病毒作用 多数微生物脂肽都具有抗病毒作用。如脂肽表面活性剂( s u r f a c t i n ) ，又称枯 草菌脂肽、枯草菌溶血素或表面活性素，是一种由枯草芽孢杆菌产生的环状脂肽， 胞外有表面活性的抗生素和不产生免疫反应的溶血素，是由与d 羟基t o 甲基肉豆 蔻醚酸以环状缩肽键连接的九肽组成，是另一类知名的有抗微生物成分的脂肽。 s u r f a c t i n 除了抗真菌、细菌之外，还能抑制纤维蛋白凝结，诱导脂质双分子膜形成 离子通道，抑制环腺苷酸、血小板和脾细胞溶质磷脂酶a 2 ，并具有抗病毒和抗肿 瘤活性。s u r f a c t i n 能对抗多类病毒，包括塞姆利基森林病毒、单纯疱疹病毒、疱疹 性口炎病毒、猿猴免疫缺陷病毒、猫流感病毒和鼠脑心肌炎病毒【2 2 】。科学家认为， s u r f a c t i n 的抗病毒行为主要是由活性的表面活性剂和病毒质膜之问的物化作用导 致的。 ( 2 ) 发泡性能 s u r f a c t i n 在水溶液中能形成稳定的泡沫2 3 1 ，当s u r f a c i n 浓度从0 0 5 增加到 0 2 m g m l 发泡体积几乎不变，形成的泡沫i d 二b s a ( 牛血清白蛋白) 更加均匀细腻。 而且加入b s a 后s u r f a c t i n 的发泡产生协同增效作用。脂肽表面活性剂的脂基和肽 基结构对于发泡性能有影响。碳链数为1 4 个碳原子时发泡性能最好。碳数增加到 4 山东轻工业学院硕士学位论文 1 5 以上泡沫体积急剧减少，c 1 3 的乳化性能好而另两者的发泡性能好。碳数相同时， s u r f a c t i n 能产生更细腻的泡沫而且产生的泡沫稳定性更好，表明肽结构对于发泡 性能有重要影响1 2 4 1 。 ( 3 ) 防腐剂 用微生物来制取天然生物防腐剂是目前食品防腐的热点，其中，从传统发酵 食品的微生物的代谢产物中寻找天然生物防腐剂更是一个安全有效的方法【2 5 1 。脂 肽作为微生物的代谢产物就是一种良好的天然防腐剂。它具有抗真菌、抗细菌、 抗支原体等非同寻常的生物活性。通过测定其抗菌谱，发现其对溶壁微球菌、金 黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌等多种致病菌都有明显的抑制作用。 ( 4 ) 乳化剂 生物表面活性剂可在食品工业中广泛用作乳化剂，它能改善乳体各构相之间 的表面张力( 界面张力) 使之形成均匀稳定的分散体或乳化体，从而改善食品的 组织结构、口感和外观，使食品的色、香、味形成一个和谐体，以提高食品品质 和保存性质，防止食品变质【2 6 1 。 ( 5 ) 防治病原菌的危害 抗生素类伊枯草菌素( i t u r i n ) 具有广谱抑制植物病原菌的作用。试验表明， i t u r i n 能作为生物控制剂取代化学杀虫剂，使食品工业中的有机废料经细菌转化成 为具有生物杀虫剂作用的物质，有效地实现有机废料的循环利用。不同的枯草芽 孢杆菌株还能产生杆菌抗霉素类似物，也具有强烈的抗真菌活性【2 7 1 。i t u r i n a 一直 被当作一种有效的抗霉菌的抗真菌试剂，是一种由枯草芽孢杆菌产生的抗真菌脂 肽。在酵母细胞里，i t u r i n a 通过形成小泡和膜内粒子的聚集而破坏质膜。i t u r i na 也能释放电解质和高分子集合物，降解磷脂。i t u r i n a 还能增加生物质膜的电导率， 这被认为是刺激了脂肽的成孔活性，由此产生抗病原菌行为。1 个p a e n ib a c i l l u s 种的新菌株也能产生像伊枯草菌素一样的抗真菌化合物，试验证明它是一种能更 有效地对抗致病真菌的试剂。因此，类似伊枯草菌素的生物表面活性剂成员都可 作为一类潜在的抗真菌试剂。 ( 6 ) 降解农药污染 在农药污染的土壤中添加微生物脂肽表面活性剂或培养表面活性剂产生菌， 能显著降解有害成分【27 1 。在土壤中添加微生物脂肽表面活性剂降解硫丹杀虫剂， 可使降解率提高3 0 - - 一4 5 。农药污染在粮食作物与饲料原料中的危害也很严重， 如果利用微生物脂肽减轻其危害，对人或动物的健康都具有重要意义。 ( 7 ) 去除重金属离子 微生物脂肽能选择性地去除土壤中的p b 、z n 、c u 和c d 等重金属离子。其 c u 最易被除去，而且n a o h 或n a 2 c 0 3 对于c u 的去除有重要影响。微生物脂肽 能够去除重金属离子的原因在于微生物脂肽带有负电荷，能结合带正电的金属阳 第1 章绪论 离子。由芽孢杆菌产生的脂肽( s u r f a c t i n ) 能够和阳离子螯合，s u r f a c t i n c a 2 + 复 合物的个数比是l ：1 ，即1 个c a 2 + 能结合1 个s u r f a c t i n 分子【2 8 1 。目i j ，由于环 境的污染，许多饲料原料中c u 、h g 和p b 等微量元素含量往往都超出饲养标准的 规定限量。利用微生物脂肽的这种特性，在饲料配制中添加适量的微生物脂肽， 可以降低被重金属污染的饲料原料对动物的毒性。 1 2 微生物脂肽的研究现状及发展前景 1 2 1 脂肽类表面活性剂的生产菌株 自然界中有多种微生物能通过代谢产生表面活性物质，酵母菌、真菌、细菌 等都可以产生表面活性剂1 2 9 1 ，主要是假单胞菌( p s e u d o m o n a ss p ) 、芽孢杆菌 ( b a c i l l u ss p ) 、节杆菌( a r t h r o b a c t e rs p ) 、分支杆菌( m y c o b a c t e r i u ms p ) 和丁酸梭菌( c l o s t r i d i u mt y r o b u t y r i c u m ) 等。其中，研究的最多的是假单胞菌和 革兰氏阳性的芽孢杆菌。前者主要产生糖脂类生物表面活性剂如鼠李糖脂；后者 主要产生脂肽类生物表面活性剂，代表性的有s u r f a c t i n 和l t u r i n 。同一种细菌的 不同菌株也能产生一种或几种不同的表面活性剂。如枯草芽孢杆菌的$ 4 9 9 菌株1 3 0 l 能同时产生的脂肽类有表面活性素、伊枯草菌素和芬荠素3 大类；假单胞菌x d 一1 菌株【2 6 】所产生的表面活性剂为脂肽类和糖脂类混合物，脂肽类物质为主要成分； 而某些菌株( b a c i l l u ss u b t i l i sa t c c2 13 3 2 或b a c i ，螂u b t i l i s 夥) 只能产生 s u r f a c t i n 。表1 2 列出了几种主要的生物表面活性剂生产菌株及其产生的脂肽名 称3 l 】。 表1 2 脂肽类表而活性剂的生产菌株 t a b l e1 2p r o d u c t i o ns t r a i no fl i p o p e p t i d e 生产菌株生物表面活性剂 b a c i l l u ss u b t i l i s $ 4 9 9 b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i sb n p 2 9 b a c i l l u ss u b t i l i s b a c i l l u ss u b t i l i sa t c c213 3 2 b a c i l l u sp u m i l u s b a c i l l u sa m y l o i q e c f a c i e n ss t r a i nb 9 4 b a c i l l u ss u b t i l i s0 k b10 5 b a c i l l u sh a l l ok m d2 31 1 b a c i l l u ss u b t i l i sl a ml213 c a n d i d al i p o l y t i c a 6 嘴 砌 。 量 一一一 一 一一一一一 一 一一 一一一一一一 山东轻工业学院硕十学位论文 b a c i l l u sg l o b i g i i p s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n ss t r a i n9 6 5 7 8 b a c i l l u sp u m i l u s ( m a r i n e ) b a c i l l u ss p c n d 2 914 b a c i l l u ss p a1 2 3 8 b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i sb a s5 0 b a c i l l u sl i c h e n i f o 册豇i m13 0 7 b a c i l l u ss p q 2 5 5 b a c i l l u sp u m i l u s9 3 7 2 b1 f e n g y e i n t e n s i n b a c i r c i n e h a l o b a c i l l i n i s o h a l o b a c i l l i n l i c h e n y s i na l i e h e n y s i ng d a i t o c i d i n p u m i l a c i d i n 生物表面活性剂的早期研究见于1 9 4 6 年，1 9 6 5 年之后，微生物对烃类乳化 机制的研究引起人们的关注。1 9 6 8 年a r i m a 等【1 4 】首次发现枯草芽抱杆菌( b a c i l l u s s u b t i l i s ) 能够产生脂肽表面活性剂一表面活性素( s u r f a c t i n ) 以来，表面活性素 是迄今报道的最好的生物表面活性剂之一。由于一般的脂肽表面活性剂产生菌的 产量较低，因此要能达到有较好的利用价值，通常需要对产生菌进行高产突变株 的诱变选育。和其它微生物活性物质高产菌株的选育相类似，为了提高脂肽生物 表面活性剂产生菌的产量，首先对较高产量的出发菌株采用物理和化学诱变方法 进行诱变，诱变剂通常采用紫外线、微波、亚硝基呱和硫酸二乙醋等。除常规方 法外，随着对脂肽生物表面活性剂合成机理的认识和合成酶基因的定位、克隆和 表达，人们亦开始采用基因工程的手段，构建基因工程菌株用于脂肽表面活性剂 的生产【3 2 】。c a t h e r i n en m u l l i g a n l 3 3 】等，对b a c i l l u ss u b t i l i sa t c c213 3 2 进行紫 外诱变，得到突变株s u f - i 其产生脂肽的量比原始的出发菌株提高了约2 3 倍。 s u n c h y rl i n 等1 3 4 】在这方面进行了有益的尝试，经过诱变选育和筛选，获得了一 株高产突变菌株，其脂肽产量是出发菌株丑l i c h e n i f o 厂垅括j f 2 产生的生物表面活 性剂浓度的1 2 倍，且生物表面活性剂的种类相同。丁立孝【3 5 】在高产突变菌株选 育时，采用紫外诱变跟d e s 诱变相结合的复合诱变手段，连续对出发菌株进行诱 变处理6 次，获得了一株高产脂肽生物表面活性剂的突变株s d 5 9 6 ，其脂肽产量 比原始菌株提高了约2 8 倍。 1 2 2 脂肽生物表面活性剂的发酵生产 脂肽生物表面活性剂的生产除了菌种以外，培养基的成分对生物表面剂的生 产也有重要影响。脂肽表面活性剂的生产通常采用合成培养基，表面活性剂产量 7 第1 章绪论 的高低有赖于合理的c n 平衡和其生物量的多少，通常脂肽表面活性剂的产量高 低与其生物量多少成反比。培养基中各种元素的配比对脂肽表面活性剂的生产也 非常重要【3 6 】。例如，增加铁和镁的浓度能提高s u r f a c t i n 产量1 3 7 】。有时，培养基中 加入像青霉素、e d t a 和已胺丁醇等能改变细胞壁通透性或促使胞壁结合表面活 性剂脱离细胞壁进入介质的物质可能会进一步增加表而活性剂的产量1 3 引。还有许 多培养条件，如温度、p h 、输氧速度等等都会对产量产生影响。只有在各方面条 件都处于最佳状态时，微生物才能产生最高产量的生物表面活性剂。d gc o o p e r 和c r m a c d o n a l d l 3 9 】研究报道了通过改变发酵培养基中各种元素的配比浓度，例 如在培养基中增加铁和镁的浓度，加入像青霉素、e d t a 和已胺丁醇等能提高 b a c i l l u ss u b t i l i sa t c c2 1 3 3 2 发酵产脂肽的量。s a n d r alf o x 和g r e gb a t a l 4 0 1 报道了 用土豆加工过程中的废物做碳源培养b a c i l l u ss u b t i l i sa t c c 2 13 3 2 生产生物表面活 性剂的可行性。r s e n 和t s w a m i n a t h a n 4 l j 采用相应面的方法对b a c i l l u ss u b t i l i s d s m3 2 5 6 产脂肽的发酵培养条件进行了优化，经优化后其脂肽的产量达到了 1 5 9 l 。天津科技大学的曹小红1 4 2 】对于b a c i l l u sn a t t ot k l 发酵产脂肽的装液量、 转速、温度、接种量发酵条件进行了优化，经优化后，发酵液的相对溶血率由5 0 1 6 提高到8 6 2 7 ，提高了近7 0 。何困庆【4 3 】通过正交实验和单因素实验等方法 研究了各种营养和环境因素对菌株b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s 发酵生产脂肽生物表面 活性剂的影响，经过优化发酵条件，脂肽表面活性剂的产量可达到1 2 9 l 。 对于发酵条件的优化，大多数研究采用的都是单因素试验方法，用这种方法 优化影响发酵产脂肽的诸多因素缺乏对各因子间交互作用的分析；而在影响冈素 众多的情况下，采用正交试验设计进行各冈素及其之间的交互作用分析，试验处 理次数往往过多，操作起来不但费时、耗资，且难以满足实验对重复性的要求。 因此，寻找一种有效的试验设计方案，借助先进的分析统计软件来优化产脂肽的 发酵条件已成为了新的研究热点。目前，国内己有学者采用r s m 法，借助s a s 专业统计软件来分析影响脂肽产量的重要因素1 4 4 。 脂肽类生物表面活性剂是微生物代谢产生的一类重要化合物，由于其独特的 两亲分子结构和生物来源，使它们在研究应用方面受到重视，在许多工业领域有 应用前景。我国对脂肽类的研究才刚刚起步，处于初级阶段。在发达国家脂肽类 的研究也属于新兴领域，其工业化水平较低，但具有很大的发展潜力。目前脂肽 类的研究应用日益受到国内外研究学者的重视，因此脂肽类生产菌株和脂肽类物 质，已成为近年来研究的重点。然而，由于其产量较低，生产成本较高，大规模 的工业应用还未能实现。随着生物技术的不断进步和生物工程的发展，对脂肽类 生物表面活性剂的研究不断深入，尤其是对产生菌株进行分子生物学的研究，有 利于进一步认识脂肽的生产调控机制，进而通过构建基因工程菌和优化培养条件、 改善分离工艺】，人们能够在将来大规模应用具有商业价值的脂肽类物质。 8 山东轻工业学院硕士学位论文 1 3 立题依据和研究内容 1 3 1 立题依据 我国对脂肽类的研究才刚刚起步，处于初级阶段。在发达国家脂肽类的研究 也属于新兴领域，其工业化水平较低，但具有很大的发展潜力。目前脂肽类的研 究应用日益受到国内外研究学者的重视，因此脂肽类生产菌株和脂肽类物质，已 成为近年来研究的重点。目前化学合成的方法制备脂肽类受到原材料、价格和产 品性能等因素的影响存在着安全性能差、副产物多、成本高、环境污染严重等缺 点。微生物发酵制备脂肽，具有安全性好，副产物少、无污染等优点，但却存在 着产率低的问题。尽管国内外很多学者对脂肽产生菌的诱变选育做了大量的工作， 但是其发酵得率仍旧不高。 针对上述情况，本论文对筛选出的目标菌株采用物理和化学诱变相结合的方 法，提高了纳豆菌产脂肽的能力，然后从发酵动力学的角度对产脂肽的液体发酵 培养基及发酵条件进行了优化。这为纳豆菌产脂肽的工业化生产提供了科学的理 论依据，有助于脂肽作为新型抗肿瘤、抗高血压、抗病毒药物的开发普及以及应 用，具有良好的社会和经济效益。 1 3 2 研究内容 利用脂肽类表面活性剂能够溶解血细胞，并且只有产生表面活性剂才能够乳 化碳氢化合物的菌株能吸收利用石油形成噬油斑的原理，本研究采用血平板与油 平板相结合的方法，从实验室现有的1 0 株纳豆菌中筛选出产脂肽类的目标菌株， 然后对其进行紫外、微波和d e s 三者相结合的复合诱变方法获得了一株高产脂肽 的优良纳豆菌株。 在单因素实验结果的基础上采用p i a c k e t t b u r m a n ( p b ) 法对影响菌株n s 一6 4 产脂肽的液体发酵培养基的诸多因素进行考察和评价并对筛选得到的重要因素用 响应面法( r s m ) 进行优化，得到发酵培养基各因素的最佳浓度。然后采用正交 试验对其发酵条件的各个因素进行优化，从而得到最佳的发酵条件。 9 山东轻_ t 业学院硕上学位论文 2 1 引言 第2 章脂肽高产菌株的选育 自1 9 6 8 年a r i m a 等【1 4 】首次发现枯草芽抱杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 能够产生脂肽 表面活性剂一表面活性素( s u r f a c t i n ) 以来，表面活性素是迄今报道的最好的生物 表面活性剂之一，又被称枯草菌脂肽、脂肽表面活性剂。由于一般的脂肽表面活 性剂产生菌的产量较低，因此要能达到有较好的利用价值，通常需要对产生菌进 行高产突变株的诱变选育。和其它微生物活性物质高产菌株的选育相类似，为了 提高脂肽生物表面活性剂产生菌的产量，首先对较高产量的出发菌株采用物理和 化学诱变方法进行诱变，诱变剂通常采用紫外线、微波、亚硝基呱和硫酸二乙醋 等。除常规方法外，随着对脂肽生物表面活性剂合成机理的认识和合成酶基因的 定位、克隆和表达，人们亦开始采用基因工程的手段，构建基因工程菌株用于脂 肽表面活性剂的生产【3 5 1 。脂肽表面活性剂产生菌及高产突变株的初筛，通常采用 菌落在固体培养基上对红血细胞的溶解【4 5 】菌落在含油琼脂平板上产生的乳浊晕圈 来测定，还有根据阴离子表面活性剂与阳离子表面活性剂结合形成有色沉淀的原 理的初筛方法【4 6 1 。复筛则需直接测定发酵培养后脂肽类生物表面活性剂的含量【4 7 】。 迄今为止，一般的菌株产量均小于1