（特种经济动物饲养专业论文）野桑蚕细胞色素P450基因的研究.pdf

蚶桑蛩绑釉也索p 4 5 0 壮h 的 j f 究中立摘要 中文摘要 细胞色素p 4 5 0 单加氧酶系是一种广泛分布于各种需氧生物体内的氧化酶系由 多种成分组成。很多证据表明，昆虫细胞色素p 4 5 0 酶系介导的代谢抗性是大多数昆 虫产生抗性和对寄主植物适应性的主要机制。 以氟化物诱导的野桑蚕中肠组织为基础材料，根据家蚕c y p 3 0 5 8 1 基因序列设计 特异性引物，通过r t p c r 分两段扩增了野桑蚕的c 3 0 5 8 1 v i c d n a 基因；通过拼 接获得了完整c y p 3 0 5 8 1 1 1 基因。测序结果显示，野桑蚕c y p 3 0 s b l v l 基因的o r f 为1 4 6 4 n l ，编码4 8 7 a a ，具有细胞色素p 4 5 0 蛋白的共同特征。同源性分析表明，在 i 鱼 d n a 水平上，野桑蚕c y p 3 0 s b i v 基因与家蚕c y p 3 0 s b i 基因的同源性达9 哇，而 推导的氮基酸序列则完全一致。通过n c b i 中家蚕基因组数据库查询、比对和拼接， 预测野桑蚕c y p 3 0 s b l v l 基因结构中至少含有7 个内含予，且内含子一外显子之间的连 接符合g t _ a t 法则。 将c y p 3 0 s b l 吲的c d n a 序列克隧迸原核p e t 2 8 a ( + ) ，构建了原核表达质粒，再转 化到大肠杆菌b l 2 1 细胞中，通过i p t g 诱导表达。s d s - p a g e 、w e s t e r o nb l o t t i n g 分 析表明，带有h i s 6 标签的重组c y p 3 0 5 b j v i 蛋白的分予量为5 7 k d a 左右，与理论值相 符。为通过纯化蛋白，进一步构建细胞色素p 4 5 0 的体外代谢体系奠定了基础。 抽提不同条件下野桑蚕的各组织总r n a ，利用d 1 6 标记的随机引物制各了野桑蚕 缈赐垓聊v i c d n a 探针，通过点杂交的办法尝试进行了c y p 3 0 s b l i l l 基因表达的组织特 异性研究。初步结果显示，c y p j o s b i v l 基因在氟化物诱导的野桑蚕中肠、脂肪体、 马氏管、体壁中有特异性转录。 关键词：c y p 3 0 s b l v l 基因克隆序列分析原核表达组织表达定位 作者：陈玉华 指导老师：沈卫德 ! 堕! ! ! ! 堡! ! ! 曼塑! ! 竺竺! ! ! ! ! 鱼! ! ! ! ! 皇! 竺笪兰竺! ! 型! ! 竺! 一垒! ! ! ! ! 璺 a b s t r a c t c y t o c h r o m ep 4 5 0m o n o o x y g e n a s ew h i c hi sc o m p o s e do f v a r i o u sk i n d so f c o m p o n e n t si sa no x i d a s es y s t e mw i d e l ye x i s t si na e r o b i co r g a n i s m s al o to f e v i d e n c e si n d i c a t e dt h a ti n s e c tc y t o c b r o m ep 4 5 0m o n o o x y g e n a s em e d i a t e d r e s i s t a n c ei st h em a i nm e c h a n i s mo ft h ed e v e l o p m e n to fi n s e c t i c i d er e s i s t a n c e a n da d a p t a b i l i t yt o h o s tp l a n t s f l u o r i d e i n d u c e dm i d g u t so fb o m b y xm a n d a r i n aw e r eu s e da se x p e r i m e n t a l m a t e r i a l s s p e c i f i cp r i m e r sw e r ed e s i g n e db a s e do nc y p 3 0 5 8 1s e q u e n c eo fb o m b y x i n o r l t w os e g m e n t so fc y p 3 0 5 b iv ic d n a sw e r ec l o n e dw i t hr t p c r ，a n dc o m p l e t e c y p 3 0 5 8 1g e n ew a so b t a i n e dt h r o u g ht h ej u n c t u r eo ft h e m s e q u e n c i n gr e s u lt s s h o w e dt h a tt h eo r fo fc y p 3 0 s b lv 1w a s1 4 6 4n u c l e o t i d e sl o n ga n de n c o d e s4 8 7 a m i n oa c i d sw h i c hp o s s e s s e sac o m m o nc h a r a c t e r i s t i co fc y t o c h r o m ep 4 5 0 p r o t e i n s h o m o l o g o u sa n a l y s i ss h o w e dt h a tt h eh o m o l o g yo fc y p 3 0 s b i v io fb o m b y x 遗 m a n d a r i n aa n dc y p 3 0 s b lo fb o m b y xm o r yr e a c h e s9 9 。a n db o t ho ft h e i rd e d u c e d s e q u e n c e so fa m i n oa c i d sa r ee x a c t l yt h es a m e i tw a sp r e d i c t e dt h a tc y p 3 0 5 8 1 v l g e n es t r u c t u r eo fb o m b y xm a n d a r i n aw a sp o s s e s s e do fa tl e a s t7 i n t r o n sa n d a l1t h ei n t r o n so b e yt h eg t a gr u l eb ys e a r c h i n gs ii k w o r mg e n o m ed a t a b a s ei n n c b i t h ec y p 3 0 e b l v lc d n aw a sc l o n e di n t op e t 2 8 a ( + ) v e c t o ra n dt r a n s f o r m e di n t o c o l ib l 2 1t oe x p r e s su s i n gi p t ga s a ni n d u c e m e n t s d s p a g ea n dw e s t e r n b l o t t i n ga n a l y s e ss h o w e dt h a tt h em o l e c u l a rw e i g h to fr e c o m b i n a n tc y p 3 0 5 8 1 p r o t e i nw i t hh i s 6t a gisa b o u t5 7 k d at h es a m ea st h e o r e t i c a lv a l u e t h i sr e s u l t l a y st h ef o u n d a t i o nf o rp u r i l y i n gc y t o c h r o m ep 4 5 0p r o t e i na n dc o n s t r u c t si n v i t r or e a c t i o ns y s t e mi nt h ef u t u r e a f t e re x t r a c t i n gt o t a lr n a so fv a r i o u sk i n d so fb o m b y xm a n d a r i n at i s s u e s a n dp r o d u c i n gd i g t a g g e dr a n d o mp r i m e r so fc y p 3 0 s b i v le d n ao fb o m b y xm a n d a r i n a ， w et r i e dt or e s e a r c ht h et i s s u ee x p r e s s i o ns p e c i f i c i t yo fc y p 3 0 5 8 1 v 1 t h e i t ! 堕! ! ! ! ! 璧! ! 垦塑! ! 竺璺! ! ! ! ! 鱼! 些! ! 丝竺坚竺璺! 塑! ! ! 丝垒墼! ! 竺! p r e li m i n a r yr e s u l ts h o w e dt h a tc y p 3 0 s b l v lt r a n s c r i b e ss p e c i f i c a l l yi nm i d g u t ， f a tb o d y ，m a p i g h i a nt u b u l e s ，a n db o d yw a l1 k e yw o r d s ：c y p 3 0 5 8 1 w ：c l o n i n g ：s e q u e n c ea n a l y s i s ：p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n t i s s u ee x p r e s s i o nl o c a l i z a t i o n w r i t t e nb y ：c h e ny u h u a s u p e r v i s e db y ：s h e nw e i d e 苏州大学学位论文独创性声明及使用授权声明 学位论文独创性声明 本人郑重声明：所提交的学位论文是本人在导师的指导下，独立进行研究工 作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不含其他个人或集体已 经发表或撰写过的研究成果，也不含为获得苏州大学或其它教育机构的学位证书 而使用过的材料。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确 方式标明。本人承担本声明的法律责任。 研究生签名：畔 学位论文使用授权声明 日期：色丝互! 生 苏州大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、清华大学论文合作部、 中国社科院文献信息情报中心有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文 档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质 论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论文被查阅和借阅，可以 公布( 包括刊登) 论文的全部或部分内容。论文的公布( 包括刊登) 授权苏州大 学学位办办理。 研究生签名：哩壅窆坐日期：乏竺! ! 垒 导师签名：日 期 野桑蚕绑胞色素p 4 5 0 基因的研究刖带 刖舌 细胞色素p 4 5 0 是一簇结构、性质相似而又有差异，分子量在4 6 6 0 k d a 之问， 由基因超家族编码的含血红素和硫羟基的结合蛋白。其重要的特征是还原型细胞色素 p 4 5 0 与c 0 结合形成的复合物，在波长4 5 0 r i m 处有最大的特征性吸收峰( y 峰) 。细 胞色素p 4 5 0 命名正是由来于此。 细胞色素p 4 5 0 广泛地存在于包括人在内的所有动物、植物和微生物之中，参与 许多外来物质( 杀虫剂、环境物质等) 和内源物质( 激素、脂肪酸等) 的代谢，关系 到昆虫的生长发育及对环境的适应，具有重要的生物学和进化意义。许多事例表明在 昆虫体内，细胞色素p 4 5 0 酶系对植物毒素的代谢，是昆虫对寄主植物适应性的主要 机制；而细胞色素p 4 5 0 酶系对杀虫剂、环境化学物质氧化代谢，则是昆虫产生抗药 性的普遍机制。 正由于细胞色素p 4 5 0 在生物体中具有如此重要的生理代谢和防御等作用，因而 越来越受到了研究人员的重视。自1 9 6 3 年，细胞色素p 4 5 0 作为氧化酶的功能被阐明 以后，这一血红蛋白的研究发展很快。近年来，每年公开发表的有关细胞色素p 4 5 0 的文章更是超过2 0 0 0 余篇。 但是由于昆虫体内，细胞色素p 4 5 0 蛋白的总量很微少、极不稳定且存在着种类 繁多的分型。从蛋白质研究的角度，来纯化、分型和鉴定昆虫代谢内源物质或导致昆 虫对寄主适应性及抗药性的特异性细胞色素p 4 5 0 ，代价昂贵而且还存在着很多其他 困难。这大大阻碍了昆虫细胞色素p 4 5 0 的深入了解，所以昆虫细胞色素p 4 5 0 的研究 一直滞焉于人类及其他哺乳动物。 而自2 0 世纪八十年代以来，随着分子生物学、基因组学和生物信息学的飞速发 展，从分子水平上来鉴定各种特异性( 特别是与昆虫抗性相关) 细胞色素p 4 5 0 ，并 逐步揭示细胞色素p 4 5 0 介导抗性的遗传基础，已经成为研究细胞色素p 4 5 0 的另外一 条捷径。近年来，以家蝇、果蝇、北美尾凤蛱和冈比亚按蚊等为模型的昆虫细胞色素 p 4 5 0 研究已经逐步深入n td n 分子水平。目前，基因组学与生物信息学的研究预 测表明，果蝇有9 0 个不同的细胞色素p 4 5 0 基因，而冈比亚按蚊有1 1 1 个，家蚕则有 8 6 个之多，等等。因此，我们完全可以利用分子生物学的手段和基因组学、分子生 蚶桑盘细胞也柰p 4 5 0 埔洲的俐究前矗 物学的研究成果，短期内克隆出昆虫( 特别象果蝇、冈比弧按蚊、家蚕等已经知道全 基因组序列的昆虫) 的各种细胞色素p 4 5 0 基因。通过乖j 用异源原核或真核表达系统 表达出昆虫的抗性相关细胞色素p 4 5 0 蛋白，构建细胞色素p 4 5 0 的体外反应体系，来 研究细胞色素p 4 5 0 功能的特异性及与昆虫抗性的关系；或通过转基因的手段，来研 究细胞色素p 4 5 0 功能，并选育和培育出新型抗性品种。 本研究正是基于家蚕基因组工作框架图绘制成功的背景下，利用r t - - p c r 以及基 因拼接的分子生物学与生物信息学手段，获得野桑蚕的抗性相关细胞色素p 4 5 0 c d n a 基因序列和基因组数据。并利用n c b i 的基因组数据库，将上述c d n a 序列进行基因组 序列拼接，尝试进行该基因的内含子、启动子等调控序列结构及进化方面的预测和分 析。而后又构建该基因的原核表达载体，成功地进行了原核表达。并制备了野桑蚕细 胞色素p 4 5 0 基因的探针，利用点杂交的手段，在该基因的组织表达定位上做了一些 尝试。为进一步的野桑蚕抗性相关基因的组织表达定位、异源真核表达、蛋白功能研 究及转基因研究做了一些有意义的探索。 2 野桑蚕细胞色素p 4 5 0 基用的研究第一章细胞色素p 4 5 0 o 昆虫的代谢抗性 第一章细胞色素p 4 5 0 与昆虫的代谢抗性 摘要：本文回顾了细胞色素p 4 5 0 发现、命名的研究历程以及细胞色素p 4 5 0 结构特 征、分布与主要功能。并从昆虫细胞色素p 4 5 0 的功能出发，介绍了细胞色素p 4 5 0 酶系介导昆虫代谢抗药性的分子机制。 关键词：细胞色素p 4 5 0昆虫代谢抗药性分子机制 细胞色素p 4 5 0 单加氧酶系是一种广泛分布于各种需氧生物体内的氧化酶系，由 多种成分组成。而细胞色素p 4 5 0 则是细胞色素p 4 5 0 单加氧酶系( 多功能氧化酶) 的末 端氧化酶，不仅负责活化氧分子，同时还负责与底物结合，并决定酶系底物的专一性， 在整个酶系的功能中起着关键的作用。 昆虫细胞色素p 4 5 0 介导的代谢抗性是大多数昆虫产生抗性和对寄主植物适应性 的主要机制。可见，细胞色素p 4 5 0 在昆虫的生长发育以及对环境的适应方面，具有 重要的生物学和进化意义。 1 细胞色素p 4 5 0 单加氧酶系与细胞色素p 4 5 0 细胞色素p 4 5 0 单加氧酶系是一种广泛分布于各种需氧生物体内的氧化酶系，由 多种成分组成。目前己知的组分有：两种细胞色素( 细胞色素p 4 5 0 、细胞色素b 5 ) 、 两种黄素蛋白( n a d p h 一细胞色素p 4 5 0 还原酶、n a d h 一细胞色素b 5 还原酶) 以及磷 脂等，它们共同组成了一个氧化还原的电子传递体系。其中以细胞色素p 4 5 0 和细胞 色素p 4 5 0 还原酶最为重要。 细胞色素p 4 5 0 则是细胞色素p 4 5 0 单加氧酶系( 多功能氧化酶) 的末端氧化酶，它 决定了底物和产物的特异性，并且可以与底物结合将电子从n a d p h 传递到n a d p h 还原 酶。细胞色素p 4 5 0 的重要特征是还原型p 4 5 0 与c o 结合形成的复合物，在波长4 5 0 n m 处有最大的吸收峰( y 峰) 。具有这种特征蛋白就是细胞色素p 4 5 0 。因此，c 0 差光谱 是定性和定量分析细胞色素p 4 5 0 的重要方法。 另外，氨基酸序列测定和进化分析表明。所有细胞色素p 4 5 0 是由共同的“祖先” 野桑蚕细胞色素p 4 5 0 基因的研究 第一章细胞色素p 4 5 0 与昆虫的代谢抗r + 进化而来的。 2 细胞色素p 4 5 0 发现、研究和系统命名的历程 2 i 细胞色素p 4 5 0 发现 1 9 5 5 年h a y a i s h i 和m a s o n 等分别同时独立地发现了单加氧酶。1 9 5 8 年 k 1 i n g e n b e r g 在哺乳动物肝微粒体中发现，有一种色素被还原后能够与一氧化碳( c o ) 结合，并在4 5 0 n t o 处有一个特征性的吸收峰。o m u r a 和s a t o ( 1 9 6 4 年) 证明，这是 一种b 型细胞色素，并将其命名为p 4 5 0 ，其中p 代表p i g m e n t ( 色素) 。1 9 6 7 年r a y 首次在家蝇中确定了细胞色素p 4 5 0 的存在。1 9 8 3 年，s n y d e r 和d a v i d s o n 分离出了 昆虫第一个细胞色素p 4 5 0 的c d n a ，但当时并不知道这是细胞色素p 4 5 0 基因，后来 被重发现而定名为c y p 4 e i 。由于细胞色素p 4 5 0 在生物体中的重要生理代谢和防衡作 用，而越来越受到科研人员的重视。此后研究人员相继在很多生物中也都发现了有细 胞色素p 4 5 0 的存在。 2 2 细胞色素p 4 5 0 研究历程 细胞色素p 4 5 0 的研究已经有五十多年的历史，经历了由蛋白质水平到基因水平 的发展过程。上世纪6 0 年代一开始，对于p 4 5 0 的研究主要集中在对这一血红素蛋白 的生物化学和生物物理学特性的了解及膜结合细胞色素p 4 5 0 酶系的酶学功能方面。 7 0 年代的研究则集中在酶的分离纯化及其活性的重组。8 0 年代以后随分子生物学技 术的发展，对细胞色素p 4 5 0 的研究也进入了一个崭新阶段，研究人员主要致力于p 4 5 0 基因的克隆、序列分析以及利用特异性探针测定影响p 4 5 0 分布和合成的因素。而9 0 年代以后至今，则把p 4 5 0 表达调控机制及其结构和功能关系作为了主要的研究目标。 2 3 细胞色素p 4 5 0 的系统命名 自1 9 8 3 年获得第一个细胞色素p 4 5 0 c d n a 全序列以来，越来越多的细胞色素 p 4 5 0 c d n a 、蛋白质或基因被分离、纯化和测定，由于缺乏一个统一的标准命名体系， 因而命名十分混乱。同时细胞色素p 4 5 0 种类、基因序列、分布表达、催化反应和功 能具有多样性，也要求有一套系统科学的命名法。 1 9 8 5 年自发地出现了国际细胞色素p 4 5 0 基因命名委员会；1 9 8 7 年n e b e r t 等人 提出了根据氨基酸序列的相似程度作为划分细胞色素p 4 5 0 家族和亚家族的系统命名 4 野桑盘细胞色素p 4 5 0 基因的研究第一章细胞色素p 4 5 0 与昆虫的代谢抗性 依据；1 9 8 9 年n e b e r t 等人再次对以上的命名体系进行了修正，使得该体系进一步简 明丽被大家所接受。1 9 9 3 年n e s o n 等人又进一步进行修订，形成了以下的命名体系； 以英文缩写c y p 代表细胞色素p 4 5 0 英文名c y t o c h r o m ep 4 5 0 的缩写，后接着的是 一个代表基因家族的数字，再接着是一个大写英文字母代表亚家族，再后面一个数字 代表单个基因或c d n a 或m r n a 和蛋白质的名称，譬如：侧五即表示该基因属于细 胞色素p 4 5 0 第6 家族中a 亚族的第一个基因；同源性超过4 0 的为同一家族的基 因成员，而同源性超过5 5 以上，则为同一亚族成员：同源性大于8 0 ，归为等位 基因；而大于9 7 韵则认为是等位基因的变异体，以末尾加v 表示，例如；c y p 6 8 2 v 1 ， 即为c y p 6 8 2 的等位基因的第一个突变体；用正体大写代表蛋白质，例如：c y p 6 b i ； 斜体则表示p 4 5 0 基因，等等。 上述法则中也有例外的情况。譬如：二色高梁中的钝叶鼠曲草醇1 4n 一脱甲基 酶c y p 5 1 与酵母和大鼠的羊毛甾醇1 4d 一脱甲基酶的同源性只有3 2 和3 6 ，但是 由于它们具有相似的底物和催化相同的反应，因此将它们都归为了c y p 5 1 家族。 由于细胞色素p 4 5 0 基因家族的数目正在不断增加，家族内部也在不断扩充；因 此对于细胞色素p 4 5 0 系统命名方面的研究还在进行之中。 3 细胞色素p 4 5 0 的结构特征、分布与主要功能 3 1 细胞色素p 4 5 0 的结构特征 细胞色素p 4 5 0 是一簇结构、性质相似而又有差异，分子量在4 6 6 0 k d a 之间， 由基因超家族编码的含血红素和硫羟基的结合蛋白。 虽然细胞色素p 4 5 0 家旗成员之间的一级结构差异较大，氨基酸序列同源性很低， 有时甚至不足2 0 ，只有3 个绝对守恒的氨基酸。但越来越多的证据( 特别是细胞 色素p 4 5 0 晶体结构) 表明，细胞色素p 4 5 0 的空间结构( 拓扑异构图和结构折叠) 具 有高度的保守性。 在结构上它具有一个非共价键结合的血红素和环绕离度保守的半胱氨酸的一段 2 6 个氨基酸残基的保守序列：f x x _ g x x x c x - g ，并构成了细胞色素p 4 5 0 的活性中 心。其中的一个半胱氨酸提供血红素铁的第5 配体。当血红素铁接受电子被还原后再 和c 0 结合，将产生所有p 4 5 0 的标志性光谱在4 5 0 h m 处有一个特征性的吸收峰。 5 野桑蚕细胞色素p 4 5 0 肇闪的 ! j 究 第一章细胞色素p 4 5 0 与昆虫的代谢抗性 通常的细胞色素p 4 5 0 有4 个b 一折叠、大约1 3 个。一螺旋；其中螺旋i 上包含 有高度保守的苏氨酸( t ) ；螺旋k 含有完全保守的e x x - r ，可能参与稳定结构，位 于血红素近侧；并且，螺旋i 和上述细胞色素特征性保守序列区域常被用来设计和合 成简并引物。 3 2 细胞色素p 4 5 0 的分布 迄今为止，在各种动植物、真菌、细菌中都发现有细胞色素p 4 5 0 的存在。一般 在原核生物中，细胞色索p 4 5 0 游离于胞质中，为一种可溶性蛋白；而在真核生物中， 作为一种膜结合蛋白，主要分布在内质网核线粒体内膜上。并且。各种细胞色素p 4 5 0 之间存在着明显的差异性，即使同一生物的同一组织也发现有多种不同的细胞色素 p 4 5 0 。 哺乳动物体内，细胞色素p 4 5 0 在肝脏中含量最为丰富，除此之外在皮肤、肺、 消化道、肾脏、肾上腺皮质和髓质、睾丸、卵巢、主动脉和血小板等部位都有存在； 有研究表明，肝脏组织中的细胞色素p 4 5 0 含量明显高于心肌组织。目前已知，在家 蝇、蝗虫、按蚊、蜚蠊、北美黑尾凤蝶等几十种昆虫中都有细胞色素p 4 5 0 的分布。 昆虫的许多器官，如：中肠、脂肪体、马氏管甚至头壳中也有分布。有研究表明，六 龄的棉红铃虫的不同组织中，中肠含量最高，脂肪体次之，体壁最低。而鱼类则主要 分布于肺、肾、鳃。 1 9 6 9 年，d s f r e a r 等人首次报道了在棉花中有细胞色素p 4 5 0 存在。此后发现， 小麦、蓖麻、大豆、薯类等植物中都有细胞色素p 4 5 0 存在。研究表明，细胞色素p 4 5 0 存在与高等植物的微粒体、质膜、高尔基体膜、( 液泡、叶绿体和线粒体) 等多处膜 结构，其中微粒体中含量最高。并且，同一种植物在不同的部位，同一部位在不同的 发育时期，细胞色素p 4 5 0 的分布和含量均不同。一般叶多于花，而花多于茎。 而自1 9 6 7 年a p p l e b y 偶然从根瘤菌假菌体中发现细胞色素p 4 5 0 ，首次证明细菌 中存在细胞色素p 4 5 0 之后，在真菌等微生物中也都发现了细胞色素p 4 5 0 。 此外，有的细胞色素p 4 5 0 基因在生物生长的各个阶段都有表达，而有的却在个 体生长发育的特定阶段特定的组织中表达，或被特定的外源、内源物质所诱导才表达； 同时，表达的水平也呈现多样性。即就是说，细胞色素p 4 5 0 的基因表达具有组织和 发育阶段的特异性。 6 野桑蚕细胞色素p 4 5 0 基因的研究第一章细胞色素p 4 5 0 o 昆虫的代谢抗r 3 3 细胞色素p 4 5 0 的主要功能 细胞色素p 4 5 0 不仅负责活化氧分子，同时还负责与底物结合，并决定酶系底物 的专一性，在整个酶系的功能作用中起着关键的作用。它在具有还原性辅酶i l 和分子 氧的情况下，能够与底物结合并进行电子传递，代谢各种内源性物质( 激素、脂肪酸、 类固醇等) 和外源性物质( 药物、植物、植物次生物质、植物毒索以及环境污染物) 。 在真核生物中，各型细胞色素p 4 5 0 有着各自不同的底物和特异的功能，参与了 不同的代谢反应。定位于细胞微粒体分级中的p 4 5 0 酶系，主要作用是对外源性物质 的代谢，这种功能对生物体而言大多数情况下是起解毒作用的，因而常将p 4 5 0 酶系 归为解毒酶。 4 昆虫细胞色素p 4 5 0 的重要功能 至今，人们发现昆虫p 4 5 0 酶系主要存在两大功能类型：1 、针对内源性物质，主 要是对昆虫激素( 包括蜕皮激素、保幼激素、信息激素等) 、脂肪酸、甾醇、碳氢化 合物等的生物合成与分解，维持生物体芷常的生理功能；2 、针对外源性物质：对植 物毒素等植物次生物质和杀虫剂等化合物的解毒与活化作用。 许多事例表明细胞色素p 4 5 0 酶系对杀虫剂以及植物毒素的代谢作用是大多数昆 虫产生抗药性和对寄主植物适应性的主要机制。 4 1 昆虫细胞色素p 4 5 0 催化内源性物质的代谢 近2 0 年的研究发现，细胞色素p 4 5 0 酶系对昆虫许多内源性物质的代谢中起重要 作用。有些昆虫的细胞色素p 4 5 0 具有代谢保幼激素j h 、保幼激素类似物、和抗保幼 激素物质的相关功能；不仅如此，很多证据表明，昆虫细胞色素p 4 5 0 ( 例如定位于 细胞线粒体的) 与昆虫体内蜕皮甾醇、脂肪酸的代谢以及昆虫体内碳氢化合物的合成 密切相关，而在昆虫信息激素的代谢中起作用的很多细胞色素p 4 5 0 中很多具有高度 的特异性。 4 2 昆虫细胞色素p 4 5 0 对外源物质的代谢 定位于细胞微粒体中细胞色素p 4 5 0 ，主要作用是对外源物质的代谢，而这种 功能对生物体而已大多起代谢解毒作用，所以常将此类细胞色素p 4 5 0 归为解毒酶。 野桑蚕细胞色素p 4 5 0 基州的研究第一帝细胞也寨p 4 5 0 。j 昆虫的代谢抗r 许多事例表明，细胞色素p 4 5 0 酶系对杀虫剂以及植物毒素的代谢作用是人多数 昆虫产生抗药性和对寄主植物适应性的主要机制。 4 2 i 昆虫细胞色素p 4 5 0 在昆虫对寄主植物适应性中的作用 细胞色素p 4 5 0 在植物与草食性昆虫的相互斗争中发挥了重要的作用：l 、所有的 植物都会合成一定的防御化合物，这些化合物对昆虫来说存在一定的毒性，可以使昆 虫致死或使昆虫发育或繁殖异常。而植物在形成植物毒素的过程中，需要自身细胞色 素p 4 5 0 的催化：2 、昆虫为了取食，则必须有一定的适应机制。长期的进化，使昆虫 对大量的植物次生性物质进行了长期的不断适应，形成了多种适应对策：行为的、生 理或生化的、避毒、贮毒、排毒或解毒，其中代谢解毒是大多数昆虫对植物次生物质 的重要适应机制。利用自身细胞色素p 4 5 0 酶系的代谢作用降解植物毒素等植物次生 物质，就是昆虫适应植物不断变化的普遍现象。 近3 0 年来的研究表明，大多数的研究结果支持p 4 5 0 酶系在植物毒素解毒中起重 要作用。有3 个系统提供了细胞色素p 4 5 0 参与昆虫对寄主植物防御物质代谢相关的 荧型信息： 1 、果蝇一仙人掌系统。仙人掌防御物质对大多昆虫有毒，而有几种果蝇却能在 其上正常地生活并取食它。研究表明，果蝇的细胞色素p 4 5 0 的诱导可能是这种适应 性的主要机制。 2 、呋哺香豆索- - c y p 6 b 家族系统。昆虫细胞色素p 4 5 0 酶系与寄主植物适应性的 关系研究最为深入的是c y p 6 b 家族。从一系列有关呋喃香豆素与昆虫c y p 6 b 家族关系 的实验表明：具有对某一特定化学成分的高诱导活性是为草食者具有对含这类化学成 分寄主的一种适应机制。 3 、烟草天蛾一烟碱系统。实验证明，烟草天蛾细胞色素p 4 5 0 的诱导与尼古j 。消 耗呈直接因果关系。 4 2 2 昆虫细胞色素p 4 5 0 在昆虫抗药性中的作用 1 9 6 0 年s u n 和j o h n s o n 发现有些化合物能抑制艾氏剂的环氧化作用和硫磷酸酯 杀虫剂的活化作用，由此推测抗性可能与细胞色素p 4 5 0 有关。 以后的研究进一步证实，许多生物的细胞色素p 4 5 0 酶系对环戊二烯类杀虫剂( 七 氯、艾氏剂等) 的环氧化反应表现出催化活性。并且，很多实验表明昆虫细胞色素 p 4 5 0 还能催化活化含有p = s 基团硫代磷酸酯类杀虫荆、降解有机磷类杀虫剂，对天 g 蚶朵盘细胞色索p 4 5 0 摹因的研究 第一章细胞色素p 4 5 0 与昆虫的代谢抗 然或合成的拟除虫菊酯表现出较强的降解代谢能力，等等。 两在细胞色素p 4 5 0 酶系离体的测定中，又发现了细胞色素p 4 5 0 酶系在抗药性中 极为重要的直接证据。研究表明，因为杀虫剂可以通过一个或几个微粒体氧化途径被 降解，所以通过细胞色素p 4 5 0 酶系活性增加的机制产生抗性的昆虫，除增强了对靶 标杀虫剂的代谢外，还会加强对靶标杀虫剂结构并不相关的杀虫剂的代谢。这些同时 证明，大多数重要害虫对杀虫剂产生高水平抗性和交互抗性的主要原因，在于昆虫细 胞色素p 4 5 0 酶系对杀虫剂代谢的代谢作用的增强。 5 细胞色素p 4 5 0 介导的昆虫代谢抗药性的分子机制 5 。1 昆虫的主要抗药性机制与代谢抗药性 外源物质( 杀虫剂等) 主要以以下途径进入昆虫体内：l 、通过表皮渗透；2 、通 过气孔或节间膜渗透；3 、通过取食进入。而杀虫剂等一旦进入昆虫体内以后，则：1 、 有些直接到达作用部位，引起昆虫中毒、死亡；2 、有些储藏或累积在脂肪体等器宫 中；3 、有些在解毒酶的作用下，降解为无毒物质并排除体外：或与解毒酶结合，而 被分隔( s e q u e n s t r a t i o n ) ；4 、有些被活化成更毒的杀虫剂；4 、有些被直接排出体 外。上述的任何一个环节发生变化，都由可能导致昆虫产生抗药性。 已有的研究成果认为，昆虫最主要抗药性机制是：表皮穿透作用降低；虫体对杀 虫剂代谢作用增强( 代谢抗性) 以及杀虫剂作用部位敏感度降低( 靶标抗性) 。 代谢抗药性则主要指由于解毒酶活性的增高而使杀虫剂代谢加速而产生的抗性。 产生代谢抗药性的主要原因在于解毒酶的作用。 目前，涉及到昆虫抗性的解毒酶主要有以下三类：1 、非专一性酯酶类；2 、谷胱 甘，噍暮一转移酶；3 、细胞色素p 4 5 0 单加氧酶系。这些酶系中的每一个酶系的组成部 分及其量的改变均可以改变对杀虫剂的解毒作用。 其中，昆虫体内多功能氧化酶中起末端氧化作用的细胞色素p 4 5 0 的含量及活性 的增加被普遍认为是昆虫对杀虫剂，特别是拟除虫菊酯类杀虫剂抗性的主要原因之 一，并与昆虫交互抗性的产生密切相关。 9 野桑盘细胞色素p 4 5 0 基围的研究 第一章细胞色素p 4 5 0 与昆虫的代谓j 抗抖 5 2 细胞色素p 4 5 0 介导的昆虫代谢抗药性的分子机制 代谢抗性的化学本质是杀虫剂代谢活性的增强，从生理生化的本质上来说是相关 酶在质或量上的改变，其可能涉及的机制包扩：酶基因的扩增、突变及转录的增强等。 从昆虫产生代谢抗药性的分子机制方面来看：酯酶、谷胱甘肽s 一转移酶对杀虫 剂产生抗性是预适应的，即昆虫种群本身就有一部分具有抗性基因，抗性的产生与基 因扩增有关：而细胞色素p 4 5 0 酶系则被某些杀虫剂或药剂诱导丽产生，是昆虫接触 杀虫剂以后的一种适应性反应，是后适应。因此，昆虫细胞色素质的差异比量的差异 更重要。 至今的研究，还没有发现细胞色素p 4 5 0 介导的昆虫抗性是由基因扩增所引起。 这点与蚜虫和蚊虫等醑酶介导的抗性不同；已有很多证据表明调控基因的突变引起了 细胞色素p 4 5 0 超量表达，这则极有可能是细胞色素p 4 5 0 介导抗性的主要机制。 根据已有的研究成果，细胞色素p 4 5 0 介导的昆虫抗药性的可能机制如下： 5 2 1 细胞色素p 4 5 0 的超量表达 许多研究结果表明，细胞色素p 4 5 0 相关的抗性昆虫往往表现出某种细胞色素 p 4 5 0 的超量表达。异源表达的c y p 6 a i 、c y p 6 d i 、c y p 6 a 2 、c y p l 2 a i 等具有对杀虫剂 代谢的活性，表明细胞色素p 4 5 0 的超量表达在这些杀虫剂抗性形成中起作用。并且， 家蝇对拟除虫菊酯和果蝇对d d t 的抗性模型很好地支持了上述假说。 有关细胞色素p 4 5 0 超量表达的遗传基础目前了解得还不够全面，而调控基因的 变异被认为是细胞色素p 4 5 0 超量表达的主要原因。一些事实说明，抗性昆虫p 4 5 0 的超量表达很可能是反式遗传因子作用的结果。 5 2 2 细胞色素p 4 5 0 氨基酸残基的改变 细胞色素p 4 5 0 氨基酸残基的改变也可能导致抗药性。通过比较果蝇的不同抗性 水平的3 个品系的c y p 6 8 2 序列，发现存在3 个氨基酸替换( r 3 5 5 s 、l 3 3 6 v 、v 4 7 6 l ) ， 推测这3 个氨基酸突变可能影响c y p 6 a 2 活性位点的结构。异源表达实验表明，这些 突变虽然没有改变c y p 6 a 2 对睾丸激素的活性，但却增强了对7 一乙氧香豆素、7 一苯 酰氧基香豆素，特别是对d d t 的代谢活性。由此认为，氨基酸替换可能与昆虫p 4 5 0 介导的抗药性有关。 从l p r 以及其他4 个家蝇晶系的c y p 6 d i 序列对比分析发现，氨基酸序列有歧异 野桑盘细胞乜采p 4 5 0 挂h 的例究第一章自胞也豢p 4 5 01 ，昆虫的代谢抗 的部位，大多在第6 家族细胞色素p 4 5 0 的两个高度可变区，并且大多位于底物结合 区。这些c y p 6 d 1 的氨基酸差异是否的确会导致对除虫菊酯杀虫剂催化活性的不同， 还有待于进步研究。 到目前为止，有关于细胞色素p 4 5 0 氨基酸残基的替换改变导致昆虫抗药性的改 变还是一种理论假设，还没有充足的证据。 5 2 3 细胞色素p 4 5 0 的超量表达和氨基酸替换联合作用 细胞色素p 4 5 0 的超量表达对家蝇和果蝇抗药性的形成具有重要作用，而果蝇的 抗药性有可能是c y p 6 a 2 的超量表达和氨基酸替换联合作用的结果，即抗性昆虫超量 表达了对杀虫剂具有较高催化效应的c y p 6 a 2 等位基因。 有研究表明，p 4 5 0 的超量表达可能降低昆虫的适合度，因为超量表达的细胞色 素p 4 5 0 可能同对具有针对内源性激素分子的功能。丽氨基酸替换可能对昆虫的适合 度影响较小，因此导致抗性的氨基酸替换一旦在种群中固定下来。将可能促进超量表 达机制的丧失。 6 结束语 细胞色素p 4 5 0 具有重要的生物学功能，其与昆虫抗性的关系成为研究人员注目 的一个热点。 虽然人们在酶水平上对细胞色素p 4 5 0 有了不少的认识，已经了解了它的部分基 本结构特征、功能和作用机制；但是由予其结构类型、分布与功能的多样性，依靠传 统的研究手段，要完全明了其所有的类型、功能和作用机制几乎不可能。以往细胞色 素p 4 5 0 的研究范围还仅仅局限于果蝇、家蝇、按蚊、德国小蠊等环境卫生害虫和棉 红铃虫等极少数农业害虫；人们对于细胞色素p 4 5 0 介导昆虫代谢抗药性的分子机制 的认识，大多仍然处于一个推测和假设的阶段。 而今，基因组学、蛋白组学、生物信息学和分子生物技术的飞速发展，为我们研 究昆虫细胞色素p 4 5 0 提供了许多全新的研究方法和手段。利用异源表达系统，大量 表达和纯化目的细胞色素p 4 5 0 蛋白，使得我们能够突破昆虫细胞色素p 4 5 0 量少、分 型多、分离困难的瓶颈。并且按蚊、果蝇等昆虫基因组计划的完成，使得全面认识昆 虫细缒色素p 4 5 0 的功能及其代谢抗药性的分子机制成为了可能。 野桑蚕细胞色素p 4 5 0 基因的研究笫一毋细胞色素p 4 5 0j 昆虫的代诩抗悱 目前，家蚕的基因组框架图也已经完成：n c b i 国际数据库中，已经有了大量有 关家蚕的生物数据。而大部分农业害虫都集中鳞翅目，家蚕是国际昆虫协会确定的鳞 翅目昆虫的代表，遗传背景清楚，是一种非常理想的模式生物。相信以家蚕作为模式 生物，利用全新生物信息学、分子生物学等手段，来全面地研究细胞色素p 4 5 0 ，必 然会在人们对昆虫抗性分予机制和其他生理机制的认识中发挥重要的作用。 野菜盘细胞色素p 4 5 0 基因的研究第二章昆虫细胞色素p 4 5 0 基因的分子生物学研究驶n 桑备中的进刷 第二章昆虫细胞色素p 4 5 0 基因的分子生物学研究及在 桑蚕中的进展 摘要：本文主要从基因角度出发，介绍了昆虫细胞色素p 4 5 0 基因的结构特征、多 样性与遗传多态性以及昆虫细胞色素p 4 5 0 基因表达调控与异源表达方面的分子生物 学研究进展。最后简要介绍家蚕基因组框架图完成后，桑蚕细胞色素p 4 5 0 基因的研 究进展。 关键词：细胞色素p 4 5 0 基因昆虫分子生物学桑蚕研究进展 细胞色素p 4 5 0 是细胞色素p 4 5 0 酶系的末端氧化酶，起到与底物结合( 决定底物 与产物性质) 以及从n a d p h 传递电子到n a d p h 细胞色素p 4 5 0 还原酶的重要作用是 细胞色素p 4 5 0 酶系的关键酶之一。它与昆虫激素等内源物质代谢和外源环境物质、 农药等的代谢有着密切关系，许多证据表明细胞色素p 4 5 0 酶系介导的昆虫抗性是大 多数昆虫产生抗药性和对寄主植物适应性的主要机制。 昆虫抗性所引发的社会问题及人们对抗性机制认识的不断深入，促进了昆虫细胞 色素p 4 5 0 研究的发展。特别是近年来，随着分子生物技术以及基因组学、蛋白组学、 生物信息学等学科的发展，许多种昆虫细胞色素p 4 5 0 在分子水平得到了分离和鉴别， 对其基因结构、蛋白质功能和作用机制也有了比较深刻的认识。 1 昆虫细胞色素p 4 5 0 基因结构特征 1 1 昆虫细胞色素p 4 5 0 基因的内含子一外显子结构 目前根据昆虫基因组克隆的核酸序列分析表明，大多数细胞色素p 4 5 0 基因是断 裂基因。多数昆虫细胞色素p 4 5 0 基因都含有内含子。 家蝇c y p 6 家族中的c y p 6 a 1 、6 a 3 ，6 a 4 、6 a 5 , 6 c l 和6 c 2 均有1 个长度为5 7 1 2 5 b p 的内含子，且插入位点相同，将细胞色素p 4 5 0 蛋白的1 个高度保守位点谷氨 酸( 3 6 1 ) 的密码子隔断。而与家蝇c y p 6 家族进化关系较近的家蝇c y p 3 家族基因中却 含有1 2 个内含子，并且没有和家蝇c y p 6 f 1 1 相同插入位点的内含子。家蝇c y p 6 d t 则 蚶桑盘细胞也求p 4 5 0 暴斟的研究第二章昆虫细胞色素p 4 5 0 慕凶的分子生物学研究及d 桑盂中的丝t 艟 具有3 个长度分别为6 4 、6 6 和7 4 b p 的内含子。 北美黑尾风蝶c y p 6 b i v 3 具有一个4 7 i b p 的内含子，其插入位点甘氨酸( 4 4 5 ) 靠近 与p 4 5 0 血红素结合区相邻的半胱氨酸残基。而从北美黑尾风蝶中分离的同族c y p 6 8 3 则有和c y p 6 b i v 3 位置相同的内含子。 黑腹果蝇c y p 6 a 2 曾一直被认为是昆虫中难一不禽内含子的细胞色素p 4 5 0 基因。 1 9 9 6 年，s a n e r 等从黑腹果蝇基因组d n a 和反转录c d n a 中克隆了c y p 6 a 2 。经测序发 现了个具终止密码子结构的内含子，固定存在于抗性品系( o r r ) 和敏感品系( f l r 3 ) 的c y p 6 a 2 中。d m n k o v 等( 1 9 9 7 ) 进一步发现，黑腹果蝇删2 定位于染色体i 的右 臂4 3 a l 一2 位置，包含两个外显子和中间一个6 9 b p 的内含子。 值得注意