（发育生物学专业论文）拟南芥体细胞胚胎发生的机理研究.pdf

中英文缩略表 英文缩写英文全称中文解释 l b m i r n a m m l v r t n p a o d p c r p h r i f r n a r n a s e a r t p c r s a m s d s s s c s s d n a s t e t e 啊s l u r i a - b e r t a n im e d i u ml b 培养基 m i c r o r n a m o l o n e ym u r i n el e u k e m i av i r u s r e v e r s et r a n s c r i p t a s e n - 1 - n a p h t h y p h t h a l a m i ca c i d o p t i c a ld e n s i t y p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p o n d u sh y d r o g e n i i r i f a m p i c i n 。 i u b o n u c l e i ca c i d r i b o n u c l e a s ea r e v e r s e t r a n s c r i p t i o np c r s h o o ta p i c a lm e r i s t e m 小分子r n a 鼠白血病病毒逆转录酶 n - 1 萘基邻氨甲酰苯甲酸 光密度 聚合酶链式反应 氢氧离子浓度指数 利福平 核糖核酸 核耱核酸酶a 反转录p c r 茎端分生组织 十二烷基硫酸钠 标准柠檬酸盐溶液 鲑精d n a s o d i u mc h l o r i d e ，t r i s c i ， 氯化钠、t r i s c i 、e d t a e d t ab u f f e r t r i s c 1 ，e d t ab u f f e rt r i s ( 3 1 e d t a 缓_ 冲液 t r i s h y d r o x y m e t h y la m i n o m e t h a n e三羟甲基氨基甲烷 t w e e n - 2 0 p o l y o x y e t h e n e - 2 0 s o r b i t u m x - g a l y e p 5 - b r o m o m - c h l o r o 一3 - i n d o x y l - d g a l a c t o p y r a n o s i d e y e a s te x t r a c ta n dp e p t o n em e d i u m 聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂 酸酯 5 一溴4 氯- 3 ，吲哚一p - d 一半乳 糖苷 y e p 培养基 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所 取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个 人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同 意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：蕴肆 导师签名燃 1 9 期：剐 山东农业大学博士学位论文 拟南芥体细胞胚胎发生的机理研究 专业：发育生物学 指导教师：张宪省教授 博士研究生：苏英华 摘要 植物的各种器官、组织以及悬浮培养的细胞和原生质体均可诱导形成类似合子胚的 结构，但它们与合子胚起源不同，称为胚状体( e m b r y o i d ) 。由体细胞发生的胚状体称 为体细胞胚( s o m a t i ce m b r y o ，s e ) 。体细胞胚胎发生是植物发育过程中的特殊现象， 并在一定程度上重现了合子胚形态发生的特性，是植物细胞潜能完全表达的一种方式。 因此，研究体细胞胚胎发生与发育的机理对于揭示细胞全能性与研究合子胚的分化和发 育具有重要意义。本论文着重研究了拟南芥体细胞胚胎发生和发育的分子基础，研究结 果为理解体细胞胚胎发生的分子机理提供了重要信息。主要研究结果如下： 1 体细胞胚胎发生 体细胞胚的产生首先需要胚性愈伤组织的形成，这个过程是在外源生长素的作用下 完成的。除去外源生长素，在愈伤组织表面诱导形成突起状的体细胞原胚，然后体细胞 原胚两侧产生子叶原基，最终形成具有两片子叶、胚轴和胚根的成熟体细胞胚。 2 胚特征基因的表达 通过胚特征基因l e c l ，l e c 2 ，f u s 3 ，p e l l 和a b l 3 的表达模式分析，发现它们的表达 去除激素的体细胞胚诱导阶段表达明显上调。利用g 矾；报告基因x e 丁l e c 2 基因的表达进行 了分析，结果显示它在体细胞原胚形成的早期开始表达，以后集中在子叶原基和子叶中 表达。说明在体细胞胚再生过程中，胚特征基因的表达受到调节。 3 r e u s 和c l v 3 基因的表达 为了研究体细胞胚胎发生和发育过程中干细胞的起始，我们对删口c z 乃的表达模 式进行了分析。研究结果显示，体细胞胚发生早期，在胚性愈伤组织表面4 - - 一6 层细胞( 组 织中心) 中首先检测到彤u 法因的表达。然后在新形成的体细胞原胚表面1 - - 3 层细胞中 出现干细胞特征基因c l v 3 的表达，并在此位置形成体细胞原胚的突起状结构。体细胞 拟南芥体细胞胚胎发生的机理研究 胚发育过程中，两基因的表达均逐渐集中在子叶之间的苗端分生组织中。诱导反义w u s 基因表达，体细胞胚的产生受到抑制，胚发育基因的表达也受到影响。表明在体细胞胚 发生过程中，组织中心的细胞先于干细胞形成，朋，赃此过程中起关键作用。 4 生长素极性运输及分布 体细胞胚胎发生需要生长素诱导。生长素在体细胞胚胎发生过程中呈极性分布。如 果在诱导过程中添加生长素极性运输抑制剂n p a ，不仅破坏了生长素的极性分布，还影 响了w u s 的表达，最终不能产生体细胞胚。生长素外运蛋白p i n l 在体细胞胚发生过程中 呈极性定位。体细胞胚胎发生早期，p i n l 在即将产生体细胞原胚的位置表达。共定位分 析显示，p i n l 与w u s 的表达区域在体细胞胚胎发生早期部分重叠，而在发育后期分离， 即p i n l 向着即将产生子叶的部分集中，而删u 集中于子叶之间的苗端分生组织。因此， 生长素极性运输及分布亦影响体细胞胚胎发生。 5 不同浓度生长素的作用 能够诱导体细胞胚产生的生长素浓度具有一定的范围。如果我们在诱导阶段施加过 高和过低浓度的生长素，均不能诱导产生体细胞胚，并且也不能诱导其他器官的产生， 只能形成不同形态的愈伤组织。而在不施加生长素的情况下，只是初级体细胞胚的继续 发育，产生更多的叶和根。进一步的研究观察到在过高或过低浓度的生长素条件下，生 长素极性的重新分布难以发生，并且w u s 的表达模式亦受到影响。说明生长素极性分布 的重新建立和组织中心的形成受生长素浓度的调节。 本研究结果表明，在体细胞胚的发生和发育过程中，生长素的极性运输和组织中心 细胞与干细胞的形成起关键作用，它们通过启动胚特征基因表达，最终决定体细胞原胚 的产生，进而继续发育形成成熟体细胞胚。 关键词：拟南芥生长素极性分布苗端分生组织干细胞体细胞胚胎发生 2 山东农业大学博士学位论文 s t u d yo nt h em e c h a n i s m so fs o m a t i ce m b r y o g e n e s i s i na r a b i d o p s i s m a j o r ：d e v e l o p m e n t a lb i o l o g y s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rz h a n gx i a n s h e n g p h dc a n d i d a t e ：s uy i n g h u a a b s t r a c t t h ez y g o t i ce m b r y o - l i k es t r u c t u r ec a l lb ei n d u c e df r o mp l a n to 珞a n s ，t i s s u e sa n dc e l l s t h e i n i t i a t i o no ft h i ss t r u c t u r e ，c a l l e ds o m a t i ce m b r y o ，i sd i f f e r e n tf r o mt h a to fz y g o t i ce m b r y o s o m a t i ce m b r y o g e n e s i si sa ni m p o r t a n tw a y t og e n e r a t ew h o l ep l a n t s t h ed e v e l o p m e n t a l p r o c e s so fs o m a t i ce m b r y or e s e m b l e st h a to fz y g o t i co n e ，p r o b a b l yd u et oc o n s e r v e dc e l l u l a r a n dm o l e c u l a rm e c h a n i s mb e t w e e nt w op r o c e s s e s t h u s ，s o m a t i c e m b r y o g e n e s i sh a sb e e n r e c o g n i z e da sap o t e n t i a lm o d e lf o rs t u d y i n gt h ep l a n tc e l lt o t i p o t e n c ya n dt h ed e v e l o p m e n t a l e v e n t si np l a n te m b r y o g e n e s i s h e r e ，w ef o c u so ns t u d y i n gt h em e c h a n i s m so ft h es o m a t i c e m b r y o ( s e ) i n d u c t i o ni na r a b i d o p s i s t h em a i nr e s u l t sa r e a sf o l l o w s ： 1 s o m a t i ce m b r y o g e n e s i s t oi n d u c et h es e s ，t h ed i s c s l i k ee m b r y o m cc a l l iw e r ei n d u c e di nt h ep r e s e n c eo fa u x i n b yr e m o v a lo fa u x i n ，t h es o m a t i cp r o e m b r y o so c c u r r e do nt h ee d g e so ft h ee m b r y o m cc a l l i i n s i d e t h e n ，c o t y l e d o np r i m o r d i aw e r eo b s e r v e do nt h es o m a t i cp r o e m b r y o s e v e n t u a l l y , m a t u r es o m a t i ce m b r y oi sc o m p o s e do ft o r y l e d o n s ，h y p o c o t y la n dr a d i e e l 2 e x p r e s s i o np a t t e r n so fs e v e r a lg e n e si n v o l v e di ne m b r y o g e n e s i s s e v e r a lg e n e si n c l u d i n gl e c l ，l e c 2 ，f u s 3 ，p e l la n da b l 3 ，a r ei n v o l v e di nz y g o t i c e m b r y od e v e l o p m e n t t h ee x p r e s s i o n so ft h e s eg e n e sd u r i n gs o m a t i ce m b r y o g e n e s i sw e r e d e t e r m i n e db ys e m i - q u a n t i t i v er t - p c r t h er e s u l t ss h o w e dt h a tl e c l ，l e c 2 ，f u s 3 ，p e l l a n da b l 3g e n e sa p p e a r e dt ob eu p r e g u l a t e da t2d a y sa f t e rt h ee m b r y o m cc a l l it r a n s f e r r e dt o t h ea u x i n f r e el i q u i dm e d i u m f u r t h e r m o r e ，l o c a l i z a t i o no fl e c 2t r a n s c r i p t sw a sa n a l y z e db y p l e c 2 ：b e t a - g l u c u r o n i d a s e ( o u s ) e x p r e s s i o n t h el e c 2g e n ee x p r e s s i o nw i t sd e t e c t e di n 3 拟南芥体细胞胚胎发生的机理研究 s o m a t i cp r o e m b r y o s t h e n ，t h es i g n a l sw e r ed e t e c t e di nt h ec o t y l e d o np r i m o r d i aa n dm a t u r e c o t y l e d o n so fs e s , i n d i c a t i n gt h a te x p r e s s i o np a r e m so ft h eg e n e si n v o l v e di nz y g o t i c e m b r y o g e n e s i sa r er e g u l a t e dd u r i n gs ei n d u c t i o n 3 e x p r e s s i o np a t t e m so fc l y 3 a n dw u s t os t u d yt h ei n i t i a t i o no ft h es t e mc e l l sf o rs o m a t i ce m b r y o g e n e s i s ，w ee x a m i n e dt h e e x p r e s s i o np a t t e r n so fc l v 3a n dw u sw h i c hw e r er e p o r t e dt oe x p r e s si nt h es h o o ta p i c a l m e r i s t e m ( s a m ) d u r i n ge m b r y o g e n e s i s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tl o c a l i z a t i o no ft h ew u s t r a n s c r i p t sw a si d e n t i f i e di nag r o u po fu n d i f f e r e n t i a t e dc e l l sb e l o wl a y e r s ( l ) 4 - 6 ，w h i c h w e r ec a l l e do r g a n i z i n gc e n t e rc e l l sa tt h ee a r l ys t a g eo fs o m a t i ce m b r y o g e n e s i s t h e n ，t h e c l v 3s i g n a l sw e r ea c c u m u l a t e di nl1 - - 3o fp r o e m b r y o s w h e nt h ec o t y l e d o n se m e r g e d ，t h e c l v 3a n dw u s t r a n s c r i p t sw e r ed e t e c t e di nt h es h o o tm e r i s t e mo fs o m a t i ce m b r y o s f u r t h e r s t u d ys h o w e dt h a tt h et r a n s g e n i ct i s s u e sw i 缸la n t i s e n s ew u se d n ac o u l dn o tg e n e r a t e e m b r y o s m o r e o v e r ，t r a n s c r i p t so fs e v e r a lg e n e si n v o l v e di ne m b r y o g e n e s i sc o u l dn o tb e d e t e c t a b l ei nt h e s ec u l t u r e dt i s s u e s t h u s ，t h er e s u l t si n d i c a t et h a tt h eo r g a n i z i n gc e n t e ri s i n d u c e de a r l i e rt h a ns t e mc e l l sd u r i n gs ei n d u c t i o n , a n dw u se x p r e s s i o ni se s s e n t i a lf o rt h e s ef o r m a t i o n 4 a u x i np o l a rt r a n s p o r ta n dd i s t r i b u t i o n a u x i ni se s s e n t i a lf o rs o m a t i ce m b r y o g e n e s i s w ef o u n dt h a ta u x i np o l a rd i s t r i b u t i o n o c c u r r e d d u r i n g t h es ei n d u c t i o n p r o c e s s i ft h ea u x i n t r a n s p o r t i n h i b i t o r n - 1 - n a p h t h y l p h t h a l a m i ca c i d ( n p a ) w e r ea d d e di nl i q u i dm e d i u mc o n t a i n i n g2 , 4 一d ，a u x i n p o l a rd i s t r i b u t i o na n de x p r e s s i o np a r e mo fw u s w e r ed e s t r o y e di nt h ee a l l i ；a n da f t e r1 4 - d a y c u l t u r e ，t h es e sw e r ef a i l e dt ob ei n d u c e d a u x i np o l a rd i s t r i b u t i o nm i g h tb ei n v o l v e di n p i n - d e p e n d e n tt r a n s p o r t p o l a rl o c a l i z a t i o no fp i n 1w a so b s e r v e di n t h ec e l l st h a tw o u l df o r m p r o e m b r y o s t h ec o - e x p r e s s i o na n a l y s i ss h o w e dt h a tt h ew u se x p r e s s i o nd o m a i np a r t i a l l y o v e r l a p p e dt h ep i n le x p r e s s i o no n ea tt h ee a r l ys t a g eo fs ei n d u c t i o n l a t e r , p o l a r l o c a l i z a t i o no fp i n1f l e wt ot h er e g i o ni nw h i c hc o t y l e d o np r e m o r d i aw o u l db ep r o d u c e d ，a n d w h e r e a sw t j sw a sc o n s t i t u t i v e l ye x p r e s s e di nt h ec e l l so fo r g a n i z i n gc e n t e ri nt h es h o o t m e r i s t e m t h u s ，t h er e s u l t ss u g g e s tt h a ta u x i np o l a rt r a n s p o r ta n dd i s t r i b u t i o np l a yi m p o r t a n t r o l e sd u r i n gs o m a t i ce m b r y o g e n e s i s 5 e f f e c to fd i f f e r e n tl e v e l so fa u x i n 4 山东农业大学博士学位论文 i tw a sf o u n dt h a ta p p r o p r i a t el e v e lo fa u x i nw a sc r i t i c a lf o ri n d u c t i o no fs e s a to t h e r l e v e l so fa u x i n ，s ec o u l dn o tb ei n d u c e d ，a n dw u se x p r e s s i o np a 熊e mw a sa l t e r e d t h e s e r e s u l t si n d i c a t et h a tr e o r g a n i z a t i o no fa u x i np o l a rd i s t r i b u t i o na n df o r m a t i o no fo r g a n i z i n g c e n t e rr e q u i r e st h ea p p r o p r i a t el e v e lo fa u x i n i nt h i ss t u d y , t h er e s u l t ss u g g e s tt h a ta u x i np o l a rt r a n s p o r ta n df o r m a t i o no fo r g a n i z i n g c e n t e rc e l l sa r ee s s e n t i a lf o ri n d u c t i o no fs e s a n dw u sm a yf u n c t i o nt h r o u g hp r o m o t i n g e x p r e s s i o n so fg e n e si n v o l v e di ne m b r y o g e n e s i sd u r i n gs o m a t i ce m b r y o g e n e s i s k e yw o r d s ：a r a b i d o p s i s ，a u x i np o l a rd i s t r i b u t i o n ，s h o o ta p i c a lm e r i s t e m ，s t e mc e l l ， s o m a t i ce m b r y o g e n e s i s 拟南芥体细胞胚胎发生的机理研究 1 前言 被子植物经过双受精过程形成一个单细胞的合子。合子是新的世代发生的起点。在 有性繁殖的高等植物中，受精前的卵细胞在代谢上处于相对静止的状态。卵细胞在与精 子融合之后受到激活，启动胚胎发育过程。植物的胚胎早期发育是伴随着细胞分裂而进 行的，所涉及的重要生物学过程包括合子激活、极性建立、模式形成和器官发生等。而 胚胎发育后期主要是储藏物质的累积，为种子能够耐受长时间的干燥储藏做准备。 由于合子胚的发生是在胚囊中进行的，对早期合子胚的研究非常困难。体细胞胚胎 发生为研究植物的胚胎发生提供了理想替代系统。在合适的培养条件下，植物体细胞会 模仿胚胎发育过程产生体细胞胚。同时，体细胞胚胎发生又具有其特点：单细胞或一群 细胞被诱导不断再生非合子胚，并进一步发育形成完整植株。在自然条件下，这个发育 过程一般不可能发生。但通过组织培养，体细胞胚胎发育非常频繁，成为除器官发生以 外再生完整植株的又一条途径。植物体细胞胚胎发生具有普遍性( o a j ，2 0 0 4 ) 。 1 1 植物胚胎发育过程 被子植物的卵细胞在受精之后形成二倍体的受精卵( 合子) 。受精过程激活了卵细 胞，在此后的几个小时里合子细胞开始伸长，随后进行第一次分裂。多数植物中合子的 第一次分裂是横向不均等分裂。一般说来，植物胚胎的极性很可能在卵细胞形成时就已 经建立。这种极性主要表现为卵细胞在胚囊中的位置关系和细胞内细胞器的分布。但是 对于这一极性究竟是如何建立和维持的，并在多大程度上影响了胚胎的极性尚不清楚。 分裂产生的两个子细胞靠合点端的称为项细胞( a p i c a lc e l l ) ，靠珠孔端的称为基细胞 ( b a s a lc e l l ) 。大多数情况下，顶细胞体积较小，细胞质浓厚，将来发育成胚本体；基细 胞细长且含有较大的液泡，细胞质稀薄，将来多数发育成胚柄( 图1 1a ) 。在拟南芥等 一些双子叶植物中，顶细胞的第一次分裂是纵向的，然后两个细胞同时发生一次横向分 裂，形成四细胞的结构：与此同时，基细胞出现两次分裂，形成三个细胞。此时，由顶 细胞分裂形成的四个细胞被称为胚体( e m b r y op r o p e r ) ，而由基细胞分裂形成的三个细 胞被称为胚柄( s u s p e n s o r ) 。从合子第一次分裂至此被称为原胚( p r o e m b r y o ) 形成阶段。 1 1 1 合子极性的建立 在许多高等植物中，由于受到周围的母体组织和细胞的影响，胚囊、卵细胞和合子 6 山东农业大学博士学位论文 显然均是极性化了的。在胚珠中的合点珠孔轴向通常决定了胚胎中顶基向纵轴的形成。 由此可见，由母体组织来的信息在合子胚胎发生中可能起重要的作用。由于墨角藻 ( f u c u sv e s i c u l o s u s ，一种褐藻) 的合子和胚胎的操作方便，已使之成为研究胚胎发育早 期极性建立的一个很好的实验系统( 白书农，2 0 0 3 ) 。目前关于合子极性建立的认识主 要来源于对墨角藻的研究。因外界环境因子梯度( 如单侧光或两侧光强不同) 的作用而 建立的极性有一个从受精后开始阶段的不稳定( 4 - - - 1 0h ) 到逐步稳定( 1 0 - - 1 4h ) 的 过程，最后建立的极性在形态上表现出来( 1 4 - - - 1 8h ) 。这最终导致胚胎最初的2 个细胞 的分化，背光的形成假根，向光的形成原植体。在此过程中已发现一系列细胞生物学上 的变化，如见到的第一个稳定的不对称现象是在假根端首先积累f 肌动蛋白。合子胞质 q 日c a 2 + 的浓度梯度对于维持假根的顶端生长也十分重要，如使胞内的c a 2 + 浓度梯度消失， 则假根的形成受到抑制( g o o d n e ra n dq u a t r a n o ，1 9 9 3 ；k r o p f , 1 9 9 7 ) 。另外，利用激光技 术对墨角藻二细胞期胚胎进行显微操作的实验也证实细胞壁在维持这种两极的生长方 式中具有重要的作用( b e r g e re ta 1 ，1 9 9 4 ) 。 人们将墨角藻假根伸出之前的分化过程分为极性诱导( p o l a r i t yi n d u c t i o n ，受精后1 0 小时之内) 、轴向固定( a x i sf i x a t i o n ，受精后1 0 1 2 d x 时) 、生长( g r o w t h ，受精后1 0 d x 时之后) 和分裂面的排列( d i v i s i o np l a n ea l i g n m e n t ，受精后1 3 1 6 d x 时) 等四个时期。 而极性诱导时期又被分为两个阶段：轴向选择阶段( a x i ss e l e c t i o n ) 和轴向增强阶段( a x i s a m p l i f i c a t i o n ) 。关于墨角藻合子极性建立的研究主要集中在极性诱导时期。 目前观察表明，墨角藻的卵细胞是没有极性的，它的卵细胞没有细胞壁，细胞中心 有一个核，核的周围是均一分布的细胞质。最早的诱发因素被认为是精细胞的进入。由 于精细胞的进入，使得f 肌动蛋白在细胞内的分布发生变化，此时有些f 肌动蛋白在精 子进入的地方积累，从而诱导一系列的轴向建立反应。虽然精细胞进入最早诱导轴向建 立反应的证据还有待进一步积累，但目前看来f 肌动蛋白分布的变化确实是最早发生的 打破均衡的事件。这发生在受精4 d , 时之内。在这个阶段，光照方向、重力等环境因子 都对合子轴向的选择起重要作用。但值得注意的是，同样的环境条件并不能使未受精的 卵细胞建立极性。而且，目前对环境条件在极性诱导中的作用机制基本上一无所知。在 此之后( 大约在受精后4 1 0 d 时之间) ，细胞内发生了一系列变化：如胶质物向假根将 出现的方向定向沉积，细胞内囊泡向该方向的运输，在该方向出现由胞外向胞内的离子 流，在两极出现可测量的p h 梯度，并在该方向的细胞膜上出现二氢蝶啶受体 ( d i h y d r o p y r i d i n er e c e p t o r ) 等。到了这个阶段，一般被认为极性诱导完成。 7 拟南芥体细胞胚胎发生的机理研究 植物合子的极性建立情况与墨角藻可能会有不同，因为植物的卵细胞在体内就生活 在一个极性明显的胚囊之中。受精卵在一开始其细胞结构就是非对称的，但这种结构上 的非对称性对以后分化将产生什么样的影响目前基本上一无所知。 1 1 2 顶细胞的发育及胚体的形成 拟南芥、荠菜和油菜等十字花科植物的早期胚胎发育的分裂模式十分有规律，几乎 可以跟踪分裂之后每一细胞的命运。以拟南芥为例，合子第一次分裂所产生的顶细胞为 胚性细胞。该细胞经过严格的程序化分裂与分化过程形成胚体。单一的顶细胞首先要进 行连续2 次纵向分裂，产生包含4 个细胞的四分体胚；紧接着每个细胞进行1 次横向分裂， 产生由8 个细胞组成的八分体胚( 图1 1b ) ，当形成8 细胞原胚后，细胞分裂就出现了分 化分裂。8 。细胞原胚进行的细胞分裂有其确定的分裂方向平周分裂，这是典型的分化分 裂，形成8 个外层的原表皮细胞和8 个内层细胞，得到包含1 6 个细胞的早期球形胚( 图l - 1 c ) 。原表皮层在此后的分裂过程中几乎都是垂周分裂，产生覆盖胚胎和未来成体植物整 个表面的表皮层；而内层的8 个细胞则既可以平周分裂，也可以垂周分裂，产生内部的 皮层细胞、原维管束和髓薄壁细胞( 图1 1d 和1 1e ) 。这些细胞呈现有规律的排列。 可以看出，当胚胎发育到早期心形胚时期时( 图1 1f ) ，尽管器官模式还不明显， 组织模式却已经基本建立。胚胎形态从球形胚过渡到心形胚时发生巨大变化，是细胞区 域化和功能化的重要时期，是胚胎发育中的器官发生或器官原基的形成过程，可视为伴 随于细胞分裂的系列区域化和功能化的行为。植物胚胎自上而下可分为3 个区域：上 区包括子叶、上胚轴和顶端生长点；中区包括下胚轴；下区包括根生长点和根冠。 同时，这一时期的胚胎已经具有了解剖学上可以区分的项基轴分化，可以认为胚 体已经具备轴向性。在此之前所有细胞的分裂是相对同步进行的( 不是绝对的细胞周期 同步) ，而此后的分裂则明显表现为非同步性。例如在将要形成子叶和根原基的位置上 细胞分裂速率明显比周边细胞快，由此启动了这些部位上的器官发生。到心形胚时，由 于子叶和根的形成及其定向生长，胚体的形状逐渐呈现心形( 图1 1f ) 和鱼雷形。 值得一提的是，1 6 细胞阶段的胚胎( 图1 ic ) 在器官发生上是一个非常关键的时 期。首先随着球形胚体积的增大，表皮原细胞也不断进行垂周分裂，逐步发育为原表皮。 此时周围区域的细胞分裂增多，胚胎变扁，逐渐形成两侧对称，即发生极性化。原表皮 层下面出现平周分裂和垂周分裂，很快在靠近合点端的两侧处，细胞分裂的频率进一步 增加，两者间的细胞分裂则频率降低，主要是不断的垂周分裂使两侧隆起，形成子叶原 8 m 东农业大学博士学位论文 基。位于子叶原基之间的几个细胞仍没有分化，将来它们发育为胚胎的苗端生长点。子 叶开始发生的时候，胚胎下部的一系列细胞继续分裂和分化，逐步成为胚胎的艇轴或下 胚轴，从而形成了心形胚( 图1 - lf ) 。此时与子叶原基相对的一端，来自基细胞衍生细 胞的胚根原发生出根皮层原始细胞，与其紧靠的顶细胞衍生细胞开始向晟初的原形成层 分化，细胞开始伸长，井开始液泡化过程。 当心形胚进一步发育时，子叶原基发育成幼小的子叶，予叶和将来称作下胚轴的主 轴的伸长而形成鱼雷胚t 这时在于叶之间的心形胚形成时没有分化的几个细胞恢复分 裂，并且分裂的频率快速增加从而形成小丘状结构胚轴的顶端分生组织。 早在心形胚形成后期，胚的近基端，由部分基细胞衍生细胞和顶细胞近基端的部分 衍生细胞共同发生根端，随着子叶及其以下部分未来的下胚轴的伸长，来自基细胞衍生 细胞的细胞逐步分化成根冠表皮原，然后进一步分化出根冠和根的表皮：而来自项 细胞衍生细胞的则为根端( 图l - lg ) 。 田1 - i 取于叶植物扭南芥的胚胎搅育过程。 ( a ) 台于经过第一扶分裂，产生l 十顶细胞( 浅绿色) 和一个基细胞( 白色) ： ( b ) 八丹体胚，ul 和il 分别代表八分体的j 层和下层备4 十细胞： ( c ) i 汹胞球形胚：8 细胞胚的所有细胞经过i 冼平间分裂产生包吉8 个细胞的表皮原和8 十细胞的内部组组； ( d ) 球形胚晚期； ( e ) 早期心形胚； ( f ) 心形胚l 于叶和胚根原基b 经出现 ( g ) 成鹅胎发育m 成的幼苗。 軎种鲠色代表胚中不周的区域：表皮，拽蓝色( g 中消失) ；胚的上面和下面的区域分别用深绿色和棕色代表； 罾旧飞弋 0 回目日 戳目目马 西口 拟南芥体细胞胚胎发生的机理研究 根端分生组织用红色表示；苗端分生组织用蓝色表示参照( b e r l e t ha n dc h a t f i e l d , 2 0 0 2 ) f 虹r c1 - 1e m b r y o g e n e s i so f d i c o t y l e d o n a r yp l a n t s ( a r a b i d o p s i a ) ， ( a ) t h ef i r s td i v i s i o no f t h ez y g o t e ，p r o d u c i n g8 1 1a p i c a lc e l l ( 1 i g l l f l yg r e e n ) a n dab a s a lc e l l ( w h i t e ) ； ( b ) o e t a n ts t a g ee m b r y o , u t a n d1 tr e f e rt o 蛳u p p e ra n dal o w e rt i e ro f t h eo c t a n tr e s p e c t i v e l y ； ( c ) a1 6 - c e l lg l o b u l a re m b r y o ：d e r i v e df r o m 锄8 - c e l le m b r y oa f t e rap e r i c l i n a id i v i s i o ni ne v e r yc e l l ； 【d ) l a t eg l o b u l a re m b r y o ； ( e ) e a r l yh e a r t - s h a p e de m b r y o ； ( f ) h e a r t - s h a p e de m b r y o ，w i t hv i s i b l ec o t y l e d o n 加dr o o tp r i m o r d i a l ； ( g ) s e e d l i n gf r o mm a t u r ee m b r y o c o l o r si d e n t i f yc o r r e s p o n d i n gr e g i o n si n e m b r y oa n ds e e d l i n g e p i d e r m i s , l i g h t l yb l u e ( m i s s i n gi ng ) ；a p i c a b b a s a l s u b d i v i s i o n ；u p p e ra n dl o w e rt i e rd e s c e n d a n t si nd a r kg r e e na n db r o w n ，r e s p e c t i v e l y t h em o s td i s t a lp a r to ft h er o o t m e r i s t e m ( r e d ) o r i g i n a t e sf r o mt h eu p p e r m o s ts u s p e n 嗣t r rc e l l ；s h o o ta p i c a lm e r i s t e m , d a r kb l u e 1 1 3 基细胞的发育 在顶细胞分裂分化的同时，基细胞经过重复横向分裂产生9 1 1 个细胞( 图1 1b ) 。 如前所述，最上层的细胞，即胚根原细胞，参与胚根的发生。该细胞经过一次不对称的 分裂，形成大小不同的2 个细胞。上层较小的镜片形细胞将来发育为根尖组织中心( r o o t m e r i s t e mo r g a n i z i n gc e n t e r ，r o c ，或称为静止中心) ，而下层的子细胞为根冠中央区细 胞。基细胞分裂产生的子细胞，除胚根原细胞之外，其它所有细胞均不参与胚的形成， 而是共同构成胚柄，将胚胎与珠孔端的母体组织连在一起，并在心形胚后期开始进入程 序化死亡而退化。 虽然胚柄在整个胚胎发育的过程中存在时间比较短，但这种结构却对于原胚的生长 发育提供营养和植物激素，并对整个胚的生长平衡以及胚的极性建立有非常重要的作 用。 从胚柄发育到原胚的潜能看，胚柄细胞含有原胚细胞所具有的全部原始信息，但在 胚胎发育过程中，胚柄的发育受到了抑制。从根本上说，顶细胞与基细胞的差别只是细 胞质含量的差别，也就是说抑制胚柄发育的信号可能位于细胞质中，也可能是顶细胞产 生原胚时产生的。由于细胞命运的决定同时也依赖于位置效应，完全由顶细胞预先存在 的细胞发育程序决定的。但是体细胞胚的发育过程中没有胚柄的形成，使它的胚胎发育 过程与合子胚的发生过程有一些差异，这种差异就在胚柄上。因此可以断定胚柄在胚的 1 0 山东农业大学博士学位论文 发育过程中不起决定性的作用，但它确实是在胚胎发育中起到了不可缺少的作用，即使 胚柄只有一个细胞，也可能是维持极性所必需的。在整个合子胚内部，存在一种生长调 节平衡，来维持原胚与胚柄的发育状态，在发育早期的胚柄细胞中，蛋白质与r n a 合成 水平比原胚中还高，为原胚的发育提供营养，当子叶形成后，由于子叶具备了储存营养 的功能，胚柄便失去了存在的意义。但胚柄的异常突变，必然会引起原胚形成发生缺陷。 1 2 植物胚胎发育的分子调控 胚胎发育调控分子机理的研究开始于2 0 世纪9 0 年代。研究胚胎发育调控分子生物学 的方法与研究其他方面分子生物学的相同，也是通过筛选突变体，进而筛选特异蛋白， 分离有关m r n a 和基因。用的植物材料最多的也是分子生物学中应用最广的模式植物 拟南芥( a r a b i d o p s i s ) 。利用遗传学方法研究胚胎发育的模式形成和分生组织建立 等方面已经取得了很多重要进展，现己克隆了约3 0 个相关基因被克隆。在这些基因中， 有的参与了胚胎发